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PLAN

Applications de la Chromatographie d’ xclusion E Stérique à la caractérisation de systèmes macromoléculaires au sein de l’ unité mixte CNRS-bioMérieux CNRSCatherine Ladavière, Ladavière Bertrand de Lambert, Carole Chaix, Marie-Thérèse Charreyre, Thierry Delair, Christian Pichot
Système macromoléculaire et Immuno-virologie Humaine UMR 2142 Ecole Normale Supérieure de Lyon 46, allée d'Italie 69364 Lyon
http://www.ens-lyon.fr/CNRS-bioMerieux

• A propos de Polymères…

• Chromatographie d’ Exclusion Stérique (CES)

• Applications de la CES

Les Polymères
Définition : substances généralement organiques ou semi-organiques, On distingue :
caractérisées par la répétition d'un ou plusieurs types de motifs monomères. • les homopolymères (linéaires, ramifiés) = polymères constitués par l'association d'un seul motif monomère
A A A A A A A A C A A A A A A

Les Polymères
Les propriétés des polymères dépendent :
• du type d'assemblage de ces monomères • du degré de polymérisation ou longueur des chaînes (A)n

:

• de la distribution des longueurs de chaînes : Polymérisation radicalaire :
Amorçage
A
kd

2R
ka

R + M

R M
kp

• les copolymères, la polymérisation s'effectue avec deux ou plusieurs monomères différents
B A B B A A

Propagation

R M + M n

R M

n+1
R M M R 1 2

distribution des longueurs de chaînes Caractère aléatoire

• les polymères réticulés (gels), les macromolécules s'enchaînent dans les trois directions de l'espace
B B A A A B A A B A B B

Terminaison R

M

1

+ R M

2

kt

• •

R M H + R M 2 1

Transfert

R M

1

+ X

Y

ktr

R M X + Y 1

Les Polymères
Comment caractériser la largeur de cette distribution ? ? A l’ aide de différentes moyennes ? en nombre : Mn = ? niMi/ ? ni ? Très sensible à la présence de petite quantités de macromolécules de

Principales méthodes de détermination des masses molaires, de Ip
Méthodes Analyse des extrémités de chaînes (RMN) Osmométrie Diffusion de la lumière Spectrométrie de masse MALDI-TOF CES 103 - 106 102 - 105 Mw Mn, Mw, Ip Domaines de masses molaires (g/mol) < 104 Mn Mn Valeurs moyennes

faible masse

? en masse : Mw = ? niMi2/ ? niMi ? Les macromolécules de forte masse ont une influence prépondérante ? Indice de polymolécularité (ou distribution) : Mn • Ip = 1, échantillon isomoléculaire • Ip connaître : masses molaires moyennes, indice de Paramètres à ?, hétérogénéité en masse molaire ? polymolécularité Ip = Mw /

104 - 105

102 - 106

Mn, Mw, Ip

1

chlorure de méthylène) • Détecteurs les plus courants : .Principe ? Gel réticulé ou phase stationnaire gonflé par la phase mobile Elution ? ? • Mesure des masses molaires moyennes.son efficacité. définie par son nombre de plateaux théoriques : Np = 16Ve² (w : largeur du pic) (? 40 000/m) /w² La granulométrie des billes de gel est importante car la finesse accroît les résolutions chromatographiques. de Ip • Fractionnement possible des échantillons de polymère • Récupération totale de l’ échantillon • Simplicité.Chromatographie d’ Exclusion Stérique .organiques : gel de polymère réticulé styrène / divinyl benzène (gel semirigide) ? solvants organiques uniquement (THF.Dispositif Phase mobile Réservoir de solvant 20µl-200µl Pompe Colonne Détecteur • Echantillon 1-4 g/l Chromatogramme • • Pompe haute pression 0/400bars (débit ? 1ml/min). densité plus importante (? particule de 10µm pour les gels les plus performants) Superposition au phénomène d’ exclusion stérique d’ effet un parasite : l’ adsorption sur les parois des pores (observée surtout avec les gels minéraux tels que la silice. Rapidité Gel = bille sphérique poreuse Colonne Elution par ordre décroissant de taille Ve Essor considérable depuis les 1ers appareils commerciaux (1964 en France) Fractionnement ou séparation selon le volume hydrodynamique des chaînes en solution = Chromatographie d’ Exclusion Stérique . rigides. volume de perméation K > 1. pénétration nulle. mais phénomènes d’ adsorption parasite .Principe Exclusion stérique d’ une macromolécule Vélution = Vo + Vaccessible = Vo + KVp K=0 0<K<1 K=1 Volume intergranulaireVolume poreux total Volume Volume intersticiel du gel Volume mort Volume de solvant V0 Vp Vg Signal Pour un soluté : Vélution = Vo + Vaccessible = Vo + KVp K = degré de pénétration dans le volume poreux K = 0.Remarques • Colonne caractérisée par : .minérales : silices greffées ou non ? solvants organiques ou eau. défini par un mélange de différents gels de porosités différentes (10Å à 106Å ) . toluène. phénomène parasite d’ adsorption V0 V0 + KVp V0 + Vp Signal Ve Chromatographie d’ Exclusion Stérique . ? C) • La phase mobile doit être un bon solvant du polymère (affinité du polymère forte pour le solvant et très faible pour le gel) et un bon agent gonflant du gel La température n’ affecte que très peu le mécanisme de fractionnement • 2 . Temps d’ analyse de qq 10aines de minutes • Billes sphériques poreuses : . volume d’ exclusion totale K = 1. tendance actuelle de modification des silanols) Chromatographie d’ Exclusion Stérique .réfractomètre différentiel (différence d’ indice de réfraction de l’ éluat et du solvant. DMF.Principe Volume total d’ une colonne chromatographique (VT) Chromatographie d’ Exclusion Stérique .Intérêts Chromatographie d’ Exclusion Stérique (CES) ou Chromatographie par Perméation de Gel (CPG) Chromatographie d’ Exclusion Stérique .un domaine de masses molaires. pénétration totale.

Porteur de fonctions réactives Applications dans le diagnostic médical 3 .(Ma+1)étalon Donc : M? K a? 1 .M Etalons Vo Vo+ Vp Ve (ml) Ve (ml) Indépendance de la nature chimique.5mm. 30cm Applications de la CES à 2 systèmes POLYMERE CONJUGUES POLYMERE – MOLECULES BIOLOGIQUES Solvant Nature Polystyrène réticulé par du divinylbenzène Polystyrène sulfoné Copolymère hydroxylé Poly(hydroxyéthylméthacryl ate) Silice pure Silice greffée Silice + polymère adsorbé Nom commercial (fabricant) Ultrastyragel (Waters) Microstyragel (Waters) Shodex A 800 (Showa Denko) TSK – gel (Toyo Soda) PL –gel (Polymer Laboratories) Shodex OH-pak (Showa Denko) Shodex ion-pak (Showa Denko) TSK – gel PW (Toyo Soda) PL – aquagel (Polymer Laboratories) Ultrahydrogel (Waters) Lichrospher (Merck) Microbondagel (Waters) Synchropak catsec (Synchrom) Oligonucléotides (6000 g/mol) Peptides (2 500g/mol) Organique Aqueux + Tous Protéines (27 000 g/mol) .Moyennes - h (= k? n) hi ? Ci = ni. d’ un viscosimètre en série où ? Soit K et a de la relation empirique de Mark-HouwinkSakurada pour un étalon et l’ échantillon (relation valable pour 1 Tre. 7.M = [? ]étalon.2mm.Ma [? ]. (solvant. 9.Etalonnage Etalonnage « universel » Nécessité de connaître : ? Soit [? ]i.Ma+1 à Ve : [? ].M = K.Métalon K.Linéaire .M (Flory-Fox) ln [? ]. Longueur. 1 solvant) Chromatographie d’ Exclusion Stérique .Mi MM ? [? ] = K.Etalonnage Correspondance Ve / Masse molaire Chromatographie d’ Exclusion Stérique . ? int. débit) de Ve d’ étalons très isomoléculaires et de masse molaire connue lnMi ? Etalonnage « universel » ? Basé sur le volume hydrodynamique des chaînes en solution VH ? [? ].Ma+1 = K étalon.Colonne Tube d’ acier inoxydable ? ext.(M ) étalon étalon K a? 1 Vi Ve (ml) Mn = ? niMi/ ? ni = ? hi/ ? (hi/Mi) Mw = ? niMi2/ ? niMi = ? hiMi/ ? hi Ip = Mw / Mn Chromatographie d’ Exclusion Stérique .Chromatographie d’ Exclusion Stérique . de la forme et de la structure de l’ échantillon Mais dépendance avec le système soluté / solvant / gel considéré (échantillons et étalons doivent être d’ une série homologue).Etalonnage Correspondance Ve / Masse molaire ? « Le plus simple » : ? mesures dans les mêmes conditions chromatog. Masses molaires relatives VH ? ? Ve ? . mais MM ? Chromatographie d’ Exclusion Stérique .

Véron.5 O C C O O O CH3 H2 N CH2 CH CH CH 0.Evolution des agrégats t=0 t = 3j 37°C Mn = 20 000g/mol Mn = 67 000g/mol Elution dans le volume mort. ? CES + Spectromètre UV .3 .Delair.Caractérisation des conjugués • Colonne : UH 500 (Waters) Pompe et injecteur automatique Kontron • Eluant : Tampon phosphate 0. T. NaCl 0.05M pH 7 Protéines : 5% (v/v) de DMSO anhydre + 95% de tampon Phosphate 0.Ladavière.5 O C C O O CH3 OH NH ? CES + réfractomètre différentiel ? Suivi de polymérisation radicalaire contrôlée 5 . pas de séparation Pic exclu = 20% 6% Agrégation réversible : physique et non chimique 4 . 1997. A.) C. 65.Mandrand. 2567-2577. 37°C Molécule biologique P(AMVE) CONJUGUE ? CES + spectromètre UV + réfractomètre différentiel + détecteur de diffusion de la lumière ? Analyse de conjugués ? Analyse d’ une désagrégation / dégradation de polymère Conditions opératoires : ODN : 95% (v/v) de DMSO anhydre + 5% de tampon Borate 0.1M pH 6.Domard. L. du pH..1M pH 6.5 0.Pichot.8 sel qd macromolécules chargées pour ? f.Caractérisation des conjugués - MM? Influence de la nature.8 ? CES + réfractomètre différentiel + détecteur de diffusion de la lumière + viscosimètre ? Suivi de l’ évolution d’ une conformation macromoléculaire ? CES + Spectromètre UV .40 min.PLAN ? CES + spectromètre UV ? Rendements de greffage de molécules biologiques sur un polymère ? Suivi d’ une modification chimique de molécule biologique ? Stabilités d’ une molécule biologique et de son conjugué. évolution d’ agrégats ? Effet parasite à l’ exclusion stérique ? CES + Spectromètre UV . J.45µm (Millipore) • Détection UV : 260 nm Rdt = Aire du conjugué Aire du + conjugué Aire de la molécule biologique libre Suivi du rendement de greffage Nombre de molécules biologiques par chaîne de polymère + Cinétique de la réaction de greffage (Rdt = f(tps)) Temps de rétention (min.S. B. et de la force ionique du tampon de greffage à 260nm Conjugué Signal (mV) Molécule biologique libre • Débit : 0.A.5 ml/min • Filtration 0.5M Peptides : 5% (v/v) de DMSO anhydre + 95% de tampon Tris 0.5 0.1M pH 9.Réaction de greffage Molécule biologique CH2 CH CH CH 0.P. i.Influence de la MM du polymère - ? CES + Spectromètre UV . C.et écranter les forces électrostatiques ? CES + Spectromètre UV .

0 15.0 18.20 7.60 8.0 18.0 21. milieu de greffage 100 mAbs 75 75 15. B.0 27.Delair Bioconjugate Chemistry.0 27. A.0 -5.0 12.Delair.Ladavière. F.5 ml/min • Filtration 0.0 24.Mandrand. 9.0 9. B.0 24.45µm (Millipore) • Détection UV : 220 nm 75.27:3 19.0 30. 6977-6980.0 min 3.Suivi de polymérisation Polymérisation radicalaire contrôlée par le procédé RAFT (Transfert Réversible par Addition Fragmentation) 7j à 37°C.20 Ip = 1.0 9.0 22.0 29.Delair.1M pH 6.79:1 40 ? 20 20 19.0 18.0 21.Mandrand.11:1 15. 32. 655-661.P.8 • Débit : 0.20 6.0 21.Pichot.Ladavière. 1998. 1998.0 29. J.60 6.25 M Ip = 1.0 3.A.0 24.Mandrand.0 24.Suivi de polymérisation • • • • • Colonne : Styragel HR 4E (Waters). A..Effet parasite Adsorption de conjugués polymère .0 15. C.5 min 18.0 mAbs 60.0 12.Elaïssari.0 9.0 15.0 24. C.0 12.Suivi d’ une modification chimique de peptide Ajout de 3 lysines en N-terminal 150 mAbs ? CES + Spectromètre UV .30 n théo.5 Pics liés à la dégradation de la protéine non greffée 16.65:1 NH2 CH2 4 N C C H H O 120 100 80 80 21.0 ? : Conjugué polymère-molécule biologique ? : Molécule biologique n’ ayant pas réagi ? : DMSO RdtS23G = 17% RdtK26G = 77% ? : Conjugué polymère-molécule biologique ? : Molécule biologique n’ ayant pas réagi OH C.Stabilité des protéines et des conjugués t=0 100 mAbs 15.0 29.40 6.0 0.0 9.00 7.40 8. 5457-5459.0 12.80 9. 32.P.0 7. 35°C Eluant : THF Calibration : Poly(N-acryloylmorpholine) Débit : 1 ml/min Réfractomètre différentiel (2410 Waters) Mn (g/mol) ? CES + Réfractomètre différentiel .0 6.CES + Spectromètre UV . 5559-5562.Domard.80:3 RAFT 11.Domard.A.1M pH 6. A. A.5% SDS (en masse) • Débit : 0. 72..0 21. (1998)) Macromolecular Symp.0 -20 -20 min 3.0 6.0 18. (1999) . Mn = 30 700 g/mol. T. 291-307.protéine 150 mAbs 21.Pichot.60 Minutes 7.38:3 50.0 15.0 12. 927-936.0 -50 0.0 mAbs 50. C. B.0 27.0 29.Suivi de polymérisation - 50000 ? Mpic (g/mol) Poly(N-acryloylmorpholine) ou P(NAM) 30000 40000 30000 20000 10000 Calibration P(NAM) Calibration P(St) Diffusion de la lumière ? ? 30 40 50 60 N O ? n MM? ??? 10.45µm (Millipore) • Détection UV : 280 nm • • DT DT DT DT -10 0.84:2 ? • Colonne : Shodex Protein KW-803 (Waters) Pompe et injecteur automatique Kontron • Eluant : Tampon phosphate 0.Lorenzo.0 ? 20. 143.00 20000 O ? 10000 70 80 0 10 30 50 70 90 Conversion (%) Conversion (%) 0.20 8.0 15.40 7. Si O OH Adsorption de la protéine ? +SDS ? CES + Spectromètre UV . T.0 18.Delair. 655-661.0 6. Ip = 1.Ladavière.0 29.0 6. 33.. (1999) .70:1 Protéine seule 60 60 45 30 ? min 3. Mn = 31 200 g/mol.02:2 120 ?? ? 9. C. 71.15 Ip = 1.0 27. 1999. J.0 15.00 Signal (mV) 5.0 29. (Macromolecules.0 9.0 24.0 -5 0. C.Domard. B.81:2 • min 21. 1565-1572.5 37.0 Rdt = cst 7.0 15.0 18.00 8.5 ml/min • Filtration 0. T.0 40. (1999) .0 mAbs Protéine greffée Protéine 15.0 21.0 6.0 0 0 10.0 0.0 3.0 60 60 40 9.0 27. 243-245. 31.0 -5.0 21.00 6.08:1 100 ? • Colonne : UH500 (Waters) Pompe et injecteur automatique Kontron • Eluant : Tampon phosphate 0. A.0 • Conventionnelle 50.80 7.0 29.0 27.70:2 ? Distribution étroite ? Prévision des masses molaires par le rapport [M]/[Agent de contrôle] ? MM = f(conversion) linéaire 15.S.0 12.0 12.65:2 37.30:2 ? 30.0 -50 0.8.S. Mn = 25 950 g/mol.66:1 ? CES + Réfractomètre différentiel .0 27. 9. C.0 9.00 6.0 12.05M pH 10 35 000g/mol • Calibration P(NAM) ? Diffusion de la la lumière (MM absolue) • Calibration P(NAM) ? Calibration P(St) (VH ? ) 5 .22:1 11. 32. 0.Mallet Bioconjugate Chemistry.80 8. 1999. ? Eluant pour diff. (1999)) ? CES + Réfractomètre différentiel .0 15.5 ? min 22.0 17. (2000) . 2071-2074.0 min 3.0 A vérifier par CES… Stabilité protéine greffée > seule Rizzardo et col.00 ? ? ? ? Mn = 15 600 g/mol.0 24.0 0.Ladavière.Novelli-Rousseau.0 45 Pics liés à la dégradation 30 Ajout dans le milieu réactionnel d’ agent de contrôle qui permet une un diminution de la concentration en radicaux et une croissance simultanée de toutes les chaînes 15 15 16.5 Protéine greffée sur le polymère 30.0 9.5 -5. de la lumière : Tpn acide borique / NaOH 0.Mandrand.0 3.0 6.0 6. T.

Conjugués Polymère/ODN C.8 0. A.14 Exclusion de UH 2000 : 7 000 000g/mol conjugués agrégats UV 260nm ODN libre Réfractomètre Différentiel Poubell e Informatiqu e Diffusion de la lumière Détecte ur UV Détecteur 90° RI Mn.08 0. n Réservoir d’ éluant Pomp e Dégazeur AUX.Q.45µm (Millipore) 0 5 7 9 11 13 15 17 Volume d'élution (ml) • Réponses différentes des détecteurs • Très mauvaise séparation entre les trois espèces.0. Wyatt) • Débit : 0.1 0 10 12 14 16 18 20 22 24 Volume d'élution (ml) Volume d'élution (ml) Tpn acide borique / NaOH 0.8 : les chaînes sont sous forme de bâtonnets rigides Exemple de chromatogramme ? P ? 8 . en pelote .05M pH 10 La température abaisse la quantité d'agrégats mais.8 0.8 ? a ? 1 : les chaînes sont plus rigides et moins aptes à se mettre en pelote .Domard.04 0.05M pH 10 (n = 1.8 : les chaînes sont repliées sur elles-mêmes.4 0.Dégradation de polymère Masse molaire du polymère observée très élevée par rapport à celle attendue ? Variation de la réponse du détecteur de diffusion de la lumière en f(Tre) Agrégat s ? Variation de la réponse du réfractomètre différentiel en fonction du temps.Dispositif CES + Réfractomètre différentiel + Diffusion de la lumière . 231-241.5 ml/min • Filtration 0.Agrégation de polymèreCES + Réfractomètre différentiel + Diffusion de la lumière .Ladavière. Wyatt) • Réfractomètre différentiel (modèle 410 Waters) • Détecteur de viscosité différentielle (H 502B Viscotek) • Débit : 0. … il y a également une dégradation du polymère ? CES + RD + Diffusion de la lumière + Viscosimètre .Delair.1 ? a ? 1. 65. 90°. a compacte expansée 0 Paramètre x 6 ..Suivi de l’ évolution d’ une conformation macromoléculaire • Colonnes : UH 500 + UH 2000 (Waters) • Eluant : Tampon acide borique / NaOH 0. 1999.Mandrand.5 0.Suivi de l’ évolution d’ une conformation macromoléculaire Mark-Houwink-Sakurada : [? ] = K..05M pH 10 0.0.CES + Réfractomètre différentiel + Diffusion de la lumière . Mw.6 Détecteur à 45° 1 0.Pichot.4 0.3 ? a ? 0.05M pH 10 (n = 1.1 0. C. Rg • Colonnes : UH 500 + UH 2000 (Waters) • Eluant : Tampon acide borique / NaOH 0.338) • Diffusion : 45°. B. T.06 0.6 0. dn/dc. pas de mesure possible de masses molaires CES + Réfractomètre différentiel + Diffusion de la lumière .3 0.02 Injecteu r Colonnes 0. à 130°C 0.7 MM ? 10h 5h 1j 1. Ip. 90° Detector 0.2 100°C 130°C 17 19 21 23 25 1h Tpn acide borique / NaOH 0.2 MM ? 37°C 5 h 0. l4 .12 0.5 ml/min • Réfractomètre différentiel (410 Waters) • Spectromètre UV (484 Waters) • Filtration 0. 135° (miniDawn.338) • Diffusion : 90° (Dawn.? ? r ?? ? ? ? ? P / ? P ? 1? 0 ? ?? ? ? ? ? ? C ? ?C ? ? ? / ? 0 ? 1? ? ? ? ? C ? ?C ? ? ? ? ? 0 Réfractomètre Viscosimètr Diffusion de e la lumière à 90° C. Polymer Degradation and Stability.Ma a = facteur de forme reflète la conformation des macromolécules en solution : .2 0 7 9 11 13 15 Réponse RI P(AMVE) 0.45µm (Millipore) ? CES + RD + Diffusion de la lumière + Viscosimètre .

volume 1. 1999. Traité Analyse et Caractérisation. 1991. Springer. Berlin. characterisation by SEC and FFF. ACS Symposium Series 521.Conclusion CES = Technique rapide et simple qui permet d’ analyser : ? le greffage de molécules biologiques sur polymère. 7 . ? « Chomatography of polymers » . les conjugués obtenus. H. ? Techniques de l’ Ingénieur. B. Groupe Français d’ Etudes et d’ applications des Polymères. Theodore Provder. des stabilités ? la modification chimique de molécule biologique ? le suivi cinétique d’ une polymérisation radicalaire contrôlée ? la désagrégation ou la dégradation d’ polymère un ? les changements de conformation macromoléculaire … Bibliographie ? Initiation à la Chimie et à la physico-Chimie Macromoléculaires. ? « HPLC of polymers » .Trathnigg. New York.Pasch. « Physico-Chimie des polymères » .« Chromatographie d’ exclusion stérique » . par James Lesec.