Obtención de bioetanol a partir de hojas de papel de reciclo utilizando dos diferentes

microorganismos: aplicaciones de la biotecnología.

Obtention of bioethanol from recycled paper sheets using two different microorganisms:
applications of biotechnology.

Vladimir Allex Martínez-Rojas* Miguel A. Flores-Telona, Víctor F. Huerta-Valencia, Edgar

Lopez-Rivera, Julio C. Molina-Delgado, Manuel Rodriguez-Castillo.

Licenciatura en Quimica Farmaceutica Biológica de la Universidad Autonoma Metropolitana Unidad

Xochimilco.
Primera publicación 08 abril del 2011.

Resumen

En el presente trabajo se implementó un proceso dividido en dos etapas: bioconversión de

los carbohidartos contenidos en el papel a azúcares fermentables por medio de
Cellulomonas sp y la utilización de estos azúcares mediante una sacarificación enzimática
para la obtención de bioetanol por medio de Saccharomyces cerevisiae. Se utilizaron 3
medios como fuentes de carbono: hojas de papel, carboximetilcelulosa como inductores de
la síntesis de enzimas celulíticas y glucosa como represor. En la primera etapa la bacteria se
incubó a 37ºC/120 rpm, se tomaron muestras cada tres horas, las muestras fueron
analizadas para medir de forma indirecta el crecimiento mediante la cuantificación de
proteínas, y actividad enzimática de celulasas. La fermentación se detuvo a las 48 h. En la
segunda etapa del proceso se utilizaron las enzimas para degradar papel de reciclo el cual se
incubó con las enzimas durante 72 h a 50ºC obteniéndose azúcares fermentables, utilizados
por la levadura Saccharomyces cerevisiae para la producción de bioetanol, dicha
fermentación se llevó acabo a 72 h a 28ºC.

Palabras claves: papel reciclado, Cellulomonas sp. Saccharomyces cerevisiae. Bioetanol,

fermentación.
Abstract.

In this work we implemented a two-stage process: bioconversion of carbohidartos

contained in the paper to fermentable sugars by Cellulomonas sp and use of these sugars by
enzymatic saccharification for bio-ethanol by Saccharomyces cerevisiae. Three media were
used as sources of carbon sheets, carboxymethylcellulose as inducers of enzyme synthesis
and glucose as a repressor cellulite. In the first stage, the bacteria were incubated at 37 °
C/120 rpm, samples were taken every three hours, the samples were analyzed for growth
indirectly by quantifying protein and enzymatic activity of cellulases. Fermentation was
stopped at 48 h. In the second stage of the process used enzymes to degrade paper recycling
which was incubated with enzymes for 72 h at 50 ° C obtaining fermentable sugars, used by
the yeast Saccharomyces cerevisiae to produce ethanol, said fermentation was carried out at
72 has 28 º C.

Keywords: recycled paper, Cellulomonas sp. Saccharomyces cerevisiae. Bioethanol,

fermentation.

1. Introducción surgieron los llamados biocombustibles

(combustibles de origen orgánico)
Desde mediados del siglo XX se impulsó
provenientes de la biomasa, o materia
el desarrollo de energías alternativas
orgánica que constituye a todos los seres
basadas en recursos naturales renovables
vivos del planeta. Esta materia orgánica
y menos contaminantes; debido al alto
puede provenir de cultivos como caña de
costo del petróleo, la tendencia a que siga
azúcar, maíz, sorgo, yuca y otros, usados
aumentando, así como la disminución de
para producir etanol, y, los aceites
los reservas naturales ha afectado la
provenientes de palma africana, soya,
seguridad energética mundial. Los países
higuerilla, jatropha curcas, colza y otras
no productores de petróleo se han visto
plantas, además de fuentes alternativas
forzados a gastar una parte significativa
con alto contenido de celulosa como el
de sus presupuestos en la importación de
papel de reciclo el cual es un desecho que
combustibles de origen fósil. Así
se esta evaluando para producir biodiesel.
En el presente trabajo se implementó un horas. Saccharomyces cerevisiae fue
diseño experimental para la obtención de otorgada por la Dra. Angélica Gutiérrez
bioetanol a partir de papel de reciclo. Se (Departamento de Biotecnología de la
inoculo la bacteria Cellulomonas Universidad Autónoma Metropolitana
flavigena en un medio mineral que Unidad Xochimilco) que fue cultivada en
contenía el papel de reciclo como fuente un medio YPD compuesto por (g/l):
de carbono para la producción de enzimas glucosa 0.5; extracto de levadura 0.3;
celulasas, posteriormente estas enzimas se peptona 0.5; fosfato diamónico 0.025.
utilizaron para sacarificar papel de reciclo Que fue incubada a 28 ° C a 150 rpm.
y obtener azucares fermentables que
2.2 Tratamiento del papel
fueron utilizados por la levadura
Saccharomyces para la producción de
El tratamiento del papel se realizó por una
bioetanol.
hidrolisis ácida, para ello se pesó el
equivalente a 50 g de papel, se cortó en
2. Material y métodos
pequeños trozos y se molieron en una
2.1 Cepas y medios de cultivo licuadora, enseguida la extracción de la
tinta se llevó a cabo con 200 mL de una
Cellulomona flavigena fue otorgada por
mezcla metanol-acetona (40-60) y el
la Dra. Angélica Gutiérrez (Departamento
exceso de solventes se eliminó con agua
de Biotecnología de la Universidad
destilada, posteriormente la pulpa
Autónoma Metropolitana Unidad
obtenida fue secada en una estufa a 50 °C
Xochimilco) que fue cultivada en un
durante 1 hora y nuevamente se molió en
medio mínimo compuesto por (g/l): NaCl
una licuadora, enseguida se coló el papel
5.5; (NH4) SO4 2.5; CaCl2 0.1; MgSO4
para obtener una muestra más
0.1, extracto de levadura 2; fuente de
homogénea, y se continuo con la
carbono 2.5 que se empleo papel de
hidrolisis que se realizó con 200 mL de
reciclo como sustrato propuesto;
agua a pH 6 (ajustada con ácido cítrico)
carboximetilcelulosa como medio
durante 10 minutos a 900 rpm;
inductor y glucosa como medio represor
posteriormente se colocó la pulpa de
los medios fueron incubados a 37° C a
papel hidrolizado en una charola para ser
150 rpm; tomando muestras cada tres
secada en una estufa durante 24 h a 50
°C; el papel hidrolizado una vez más fue
molido para obtener un sustrato más fino
y se pesaron 5 g para colocarlos en el
medio de cultivo. Se determinó el
crecimiento de C. flavigena en los medios
de glucosa y papel empleando el método
de densidad óptica leyendo las muestras a
una longitud de onda a 550 nm.
Las muestras de carboximetilcelulosa y
papel se centrifugaron a 10 000 rpm
durante 10 minutos; tomando los
sedimentos para después lavarlos y
resuspenderlos en solución isotónica de
cloruro de sodio al 0.9 %. A estas
muestras se analizaran por el método de
Bradford (Bradford, 1976) para medir el
para degradar papel de reciclo el cual se
incubó con las enzimas durante 72 h a
50ºC obteniéndose azúcares fermentables,
los cuales fueron utilizados por la
levadura Saccharomyces cerevisiae para
la producción de etanol, la levadura se
incubó a 28ºC durante 72h, su
crecimiento se monitoreó midiendo por
densidad óptica y el consumo de azucares
por el método del ácido dinitrosalicílico.
3. Resultados y discusión
Determinación de crecimiento de
Cellulomonas flavigena mediante D. O.
4.50E+09

crecimiento bacteriano en el paquete 4.00E+09

[] BACTERIANA (bacterias/ml)

celular. Para determinar la cantidad de 3.50E+09

azucares reductores liberados de la 3.00E+09

actividad enzimática por medio de la 2.50E+09

CMC
técnica del ácido dinitrosalicilico (DNS). 2.00E+09
Glucosa
(Miller, 1959) 1.50E+09

1.00E+09

2.3 Producción de bioetanol 5.00E+08

0.00E+00
En la segunda etapa del proceso para la 0 20 40 60
Tiempo (h)
producción de bioetanol se utilizaron las
enzimas obtenidas en la primera etapa Grafica 1. Grafica de crecimiento de
Cellulomonas flavigenas.
Determinación del crecimiento de Determinación de la actividad
Cellulomonas flavigena mediante la enzimática mediante la estimación de la
estimación de proteínas totales en el concentración de azúcares reductores
paquete celular
1.00 10000

0.90 9000

Actividad enzimática UI (Mm/mL)/min

0.80 8000

0.70 7000
Absorbancia (595 nm)

0.60 6000
Papel
0.50 Papel 5000
CMC
CMC
0.40
Glucosa 4000
0.30
3000
0.20
2000
0.10
1000
0.00
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (h) 0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (h)
Gráfica 2. Curva de crecimiento de
Grafica 4. Determinación de la actividad
Cellulomonas flavigena determinado mediante la
enzimática (UI). UI definida como la cantidad de
técnica de Bradford, en los tres diferentes medios
enzima necesaria para liberar una µmol de azúcar
de cultivo.
reductor por mL en un minuto .

Cuantificación de proteínas totales

En la primer gráfica se observa un control
extracelulares
inmediato de las feses del crecimiento de
0.1

0.09 Cellulomonas flavigena mediante un

0.08
control inmediato por medio de D.O, el
0.07
Absorbancia (595 nm)

0.06
cual confirmo la fase estacionaria de la
0.05 Papel fermentación. En la determinación de
0.04
CMC
crecimiento bacteriano por la técnica de
0.03

0.02 Bradford mostrada en la gráfica dos los

0.01
datos confirman que hubo un buen
0
0 10 20 30 40 50 60 crecimiento en nuestro sustrato propuesto
Tiempo (h)

comparado con el medio inductor y el

Gráfica 3. Cuantificación de proteínas
medio represor.
extracelulares de Cellulomonas flavigena al crecer
en papel y CMC como fuentes de carbono, La gráfica tres muestra los valores
determinado mediante la técnica de Bradford.
obtenidos tras la cuantificación de
proteínas totales extracelulares, se determinara por medio de una
observa una mayor cantidad de proteínas cromatografía de gases (FID) con lo cual
en el medio con papel con respecto al concluye el presente trabajo.
medio inductor.
5. Referencias
En la determinación de la actividad
1. C. Asha Poorna, P. Prema. (2007)
enzimática los valores sugieren una
Production of cellulase-free endoxylanase
mayor actividad (UI) en el medio
from novel alkalophilic thermotolerent
inductor, y en cuanto al medio con papel
Bacillus pumilus by solid-state
se ve disminuida dicha actividad.
fermentation and its application in
4. Conclusiones wastepaper recycling; Bioresource
Technology 98, 485–490.
El papel de reciclo fue una buena fuente
de carbono para el crecimiento
Cellulomonas flavigena y así la
2. Idania Valdez-Vazquez, Richard
producción de celulasas, siempre y
Sparling, Derek Risbey, Noemi
cuando exista un previo tratamiento de
Rinderknecht-Seijas, He´ctor M. Poggi-
dicho papel. Con esto se contribuye al
Varaldo. (2005) Hydrogen generation via
desarrollo de fuentes alternativas de
anaerobic fermentation of paper mill
energía, así como a la conservación del
wastes; Bioresource Technology 96,
medio ambiente.
1907–1913.
La primera etapa del proyecto se realizo
satisfactoriamente obteniendo las enzimas
celulolíticas necesarias para la de 3. Amtul Jamil Sami, M. Waheed
gradación del papel y posteriormente la Akhtar,* Nadeem Nawazish Malik and
obtención de azúcares fermentables. Bashir Ahmad Naz. (1988) Production of
free and substrate-bound cellulases of
Esto dio pauta a la siguiente etapa del
Cellulomonas flavigen; Enzyme Microb.
trabajo de investigación que es la
Technol, vol. 10.
producción de bioetanol que es el
principal objetivo. Esta etapa sigue en
desarrollo, la presencia de bioetanol se
4. Yuya Yamashita, Chizuru Sasaki, 8. Babu, K.R., Satyanarayana, T., 1996.
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