GENERALIDADES

HISTOLOGIA
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

INTRODUCCIÓN
Las técnicas histológicas son una serie de pasos a través de los cuales una muestra de tejido llega a transformarse en delgados cortes coloreados capaces de ser observados y estudiados en el microscopio. Obtención - Proveer el material para su estudio al microscopio Fijación - Preservar el material Deshidratación e Inclusión por parafina - Humedecer el material en un medio fácil de cortar en fetas muy delgadas Corte - Lograr láminas muy delgadas que sean atravesadas por la luz Coloración - Visualizar los tejidos Montaje - Preservar el corte, manteniéndolo aislado del aire y deshidratado.

Obtención
El material a utilizar puede ser extraído de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano. La obtención consiste en la provisión del material que se desea estudiar a través del microscopio. El método seleccionado debe ser el adecuado para cada tipo de material. El material humano puede obtenerse a partir de: o Necropsias: Son las piezas que se obtienen de un cadáver; deben ser inmediatamente congeladas o fijadas para evitar fenómenos de autodestrucción. o Biopsias: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida, los cuales derivan en un diagnostico patológico. Existen varios tipos de biopsias: o Biopsia incisional: se realiza seccionando con instrumentos cortantes como el bisturí. o Biopsia por punch: el punch es un instrumento filoso que se utiliza para tomar biopsias de piel. o Biopsia por punción: se realiza con agujas es del tipo intramuscular (microbiopsia). o Biopsia endoscópica: se hace a través de endoscopio. o Resección quirúrgica: Son tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos inflamados). o Citologia exfoliativa: Se recoge material desprendido espontáneamente o en forma inducida de las superficies de los órganos. Es un método menos invasivo que la biopsia.

Fijación
La fijación tiene por objeto matar las células y tratar de conservarlas en el estado en el que se encontraban durante la vida. Con la fijación se trata de conservar la estructura morfológica y química de las células y tejidos que tenían en el estado vivo, estabilizando las proteínas y creando enlaces cruzados (se utiliza fijador de glutaraldehido o formaldehído) y evitar un mínimo de modificaciones. Es por eso que se debe realizar inmediatamente luego de extraer las células del organismo: la fijación debe penetrar con extremada rapidez. De esta manera, facilita la realización posterior de procedimientos de coloración o de identificación para el conocimiento de la constitución íntima del material y evita la multiplicación microbiana y los procesos de autolisis donde la célula cambia su PH activando enzimas que degradan a la célula. El fijador va a estar determinada por el tipo de investigación histológica que se pretenda realizar: o Fijadores químicos: o Fijadores simples: Están constituidos por una sola sustancia química. El más usado es el Formol al 37% - 40%. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos. o Fijadores compuestos (o mezclas fijadoras): En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. o Fijadores físicos: o Desecación (evapora el agua de los tejidos). o Calor (desnaturaliza la estructura proteica, por lo cual casi no se lo emplea). o Congelación (preservan la composición química) o Frío.

Es importante recordar: - En caso de no saber cual es el fijador ideal para una determinada muestra de tejido, debe utilizarse formol. - Nunca debe emplearse el formol puro, sino diluido al 10%. - El tiempo de fijación debe oscilar entre 12 y 36 horas. - Para la correcta fijación de una muestra, ésta no debe superar el tamaño de 1cm de lado.

están embebidas en agua. Coloración La falta de colores y contrastes en las estructuras celulares no permite visualizar prácticamente ningún componente del corte histológico. se debe usar cortes por congelación. o después de haberlas lavado. Los cortes de parafina se extienden. Luego al preparado hay que pasarlo por solventes intermediarios como xileno que producen un proceso de aclaración. Para el material elástico se utiliza coloración con orceína y fucsina . Para conservar lípidos neutros. Entre los componentes aniónicos se ubican los grupos fosfatos de los ác. La capacidad de los componentes catiónicos de reaccionar con el colorante ácido se llama ACIDOFILIA. o sea quienes poseen carga negativa.resorcina. cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y. La capacidad de los componentes a reaccionar con el colorante catíonico se llama BASOFILIA. Ante este método de tinción se pierden componentes solubles. que son sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. donde una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado. que en el proceso de tinción con H-E se diluyen. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Luego de impregnar al tejido. impidiendo que sean penetradas por la parafina. La tinción o coloración se efectúa con dos propósitos: posibilitar el estudio morfológico o estructural de las estructuras observadas o para identificar a un determinado tipo de molécula o sustancia presente.GENERALIDADES HISTOLOGIA TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Deshidratación e Inclusión por Parafina Para la obtención de cortes finos es indispensable que el tejido haya sido previamente endurecido hasta un cierto punto. Se reconocen dos tipos de colorantes: básicos y ácidos. La mayoría de los colorantes citológicos o histológicos son de naturaleza orgánica. gran parte del citoplasma y los tiñe de color rosado. Las coloraciones pueden ser: Ortocromáticas. Durante el proceso de coloración y fijación con H-E suele perderse parte de la composición química y morfológica de la célula. Para las técnicas más frecuentes se emplea el método de inclusión: El tejido se impregna en un material que le confiere una consistencia: la parafina. se deja solidificar a la parafina con el tejido incluido. previamente desengrasados. al obtenerlos del micrótomo. constituyendo los bloques o tacos histológicos. Cuanto mayor sea la firmeza del Tejido. Dentro de los componentes catiónicos de la célula se reconocen los elementos fibrilares del espacio intercelular. Es por esto que la hematoxina tiñe de color azul violáceo al núcleo por la presencia de ADN (con grupos fosfatos) y al RER por producir proteínas que proseen grupo carboxilo. Es por eso que el método de coloración que se utilice será determinado por el tipo de estructura a estudiar bajo el microscopio. También existen colorantes neutros. iones moléculas pequeñas y los lípidos neutros en el proceso de inclusión por el accionar de los alcoholes. Nucleicos y los grupos carboxilo de las proteínas. Las piezas al ser retiradas del fijador. en primer lugar. El colorante complementario ácido (eosina) con una carga negativa (-) que reacciona con los componentes catiónicos de la muestra. en agua tibia contenida en un cristalizador. los tejidos fijados se deshidratan en alcoholes de concentración creciente de manera escalonada y pausada para evitar alteraciones bruscas. En ese mismo agua se introducen portaobjetos. Para conservar las estructuras de membrana se utilizan colorantes con metales pesados como el permanganato. solventes orgánicos y parafina. Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que constan de una navaja muy afilada que secciona el taco histológico y proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. con la ayuda de una aguja histológica.4 micrones. más delgada resultara el corte histológico. Los tejidos deben ser cortados en láminas delgadas para posibilitar su observación con el microscopio. Los cortes más corrientes son los de 2. Con el fin de endurecer los tejidos existen dos métodos principales: la congelación o la inclusión. se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuación se lo levanta. fijado en formalina y colorantes que disuelvan grasas. Cortes La inclusión permite la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. 2 . en donde los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante empleada o metacromáticas. Por lo tanto. La coloración rutinaria más empleada es la combinación de un colorante básico catiónico (hematoxilina) con una carga positiva (+) que reacciona con los componentes aniónicos de la célula. Por último se coloca al preparado en una estufa con parafina fundida.

El cultivo puede ser: o Células aisladas que no están más organizadas en un tejido. Periódico (HIO4) oxida los grupos hidroxilos y se forman grupos aldehído. La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. También requiere de la administración de una temperatura ideal para la multiplicación celular (37. que al mismo tiempo le confiere un índice de refracción semejante al del vidrio. mientras que para la tinción supravital se agrega el colorante a las células o el tejido vivo posterior a su extracción. El rojo neutro (tiñe mitocondrias) y el verde Jano (tiñe distintos subtipos de leucocitos: se utilizan para el estudio de glóbulos blancos. Para el montaje. dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro. Luego de la obtención de la muestra. Estas técnicas se usan tanto en MO como en ME. 3 . Se llamarán histoquímicas (tejidos) o citoquímicas (célula) aunque ambos términos se usan como sinónimos. En la tinción vital se inyecta el colorante en el animal vivo. se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto. la utilización de los mismos posterior a la extracción requiere de grandes cuidados: o El cultivo del tejido: Se utiliza para el estudio de poblaciones celulares fuera del organismo. o La reacción de PAS (Peryodic Acid Shiff): tiñe carbohidratos y macromoléculas con abundancia de carbohidratos: se usa para detectar la membrana basal ubicada en los tejidos de los epitelios y fibras reticulares del tejido conjuntivo. o Cultivo de órganos que pueden ser explantados de órganos embrionarios u órganos totalmente desarrollados (en este tipo de cultivo se intenta mantener la estructura y función normal del órgano). MUESTRAS VIVAS Métodos de observación a células vivas Hay muchas ventajas en el estudio de células y tejidos vivos. se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo. Manipulación experimental de células vivas Algunos colorantes son captados por algunas células vivas. localización y cuantificación de una sustancia en un tejido o célula. El cultivo requiere una serie de cuidados como la mantención del frasco de reactivo estéril. o El reactivo de Shiff: es un colorante básico que reacciona con los grupos aldehído presentando una coloración roja y es la base de las reacciones de PAS y Feulgen. basándose en una marca radiactiva. El complejo antígeno anticuerpo así formado puede localizarse e identificarse en las muestras tisulares o citológicas a estudiar. o Inmuno histoquímica: El cuerpo puede reaccionar ante antígenos y formar anticuerpos (proteínas que circulan por la linfa y la sangre y son los encargados de proteger al organismo) específicos que se unen al antigeno.GENERALIDADES HISTOLOGIA TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Montaje Luego de la coloración. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Bálsamo de Canadá. o Radio Autografía: Provee información de la morfología y aspectos dinámicos de la célula.5ºC). El principal método se basa en que el ác. o La reacción de Feulgen: es utilizada para la determinación de ADN: en la reacción las purinas de las desoxirribosas del DNA se separan y por medio de una hidrólisis se forman grupos aldehídos. Métodos histoquímicos Los métodos histoquímicos hacen referencia a la utilización de técnicas físicas o químicas sobre los preparados histológicos para la identificación. La aclaración se realiza con xilol o carboxilol. con lo que se identifican los marcadores antigénicos característicos de distintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular y se determina el tipo de célula involucrado en la muestra. hay que mantener al tejido en una solución que tenga una composición similar a los líquidos titulares agregando un medio nutritivo y antibióticos para disminuir el problema de infecciones bacterianas. sin embargo. El azul tripán y el carmín de litio son partículas utilizadas para el estudio de fagocitosis. En los métodos inmunohistoquímicos se marca al anticuerpo de modo que este se vuelva visible con un colorante fluorescente que absorbe la luz ultravioleta (UV) y emite luz verde. Además se puede seguir los desplazamientos de toda la célula y su posterior destino en el organismo. La utilización de tejidos vivos es limitada ya que el espesor de las muestras impide el pasaje de luz a través del microscopio generando poca refracción. o Cultivo de tejido que implica la transferencia de una porción de tejido embrionario o explantado a un medio de cultivo. Es posible a partir de esta técnica obtener información directa de un sitio dentro de la célula donde se sintetiza un producto y los componentes químicos que lo forman.

Microscopio de contraste de fase Los tejidos que no son coloreados producen muy poco contraste pero producen un desfasamiento en las longitudes de onda. binocular. o Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. o Platina: Lugar donde se deposita la preparación. La función del microscopio es ampliar la imagen de modo que la retina capte esa separación. El microscopio de contraste de fase permite así observar la sustancia sin colorear y se aplica para el estudio de células vivas. al girar. Esto hace que la imagen no se forme en un único punto y aparece una distorsión. las cuales a través del microscopio de contraste de fase se pueden transformar en diferencias de fases generando un distinto color que pueden ser captadas por el ojo humano. Cada color tiene un foco distinto y experimenta una desviación distinta. etc. 4 . cambiar los objetivos. o Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Microscopio de luz ultravioleta Este microscopio presenta una longitud de onda más corta por lo que se puede alcanzar un mayor poder de resolución. Microscopio de fluorescencia Algunas sustancias tienen la propiedad de fluorecer. o Índice de refracción: es la medida de la velocidad de dispersión de una onda luminosa que atraviesa un medio. Este defecto se corrige combinando adecuadamente una lente convergente con otra divergente de distinto índice de refracción (flint . Aun así la resolución que pueda llegar a captar estará determinada por la longitud de onda de la luz y de factores como el espesor de la muestra y la calidad de su fijación. Puede ser monocular. Amplía la imagen del objetivo. Permite. Microscopio de luz polarizada Cuenta de un filtro polarizador y otro analizador que pueden rotarse y la diferencia entre sus ángulos se usa para ver como afecta la luz polarizada (fuente lumínica) a la estructura. Los distintos colores de la luz tienen distintas velocidades dentro del material de las lentes y por lo tanto distinto índice de refracción. o Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. En todos los casos se comienza con el microscopio óptico.se utiliza para detectar ADN. En el microscopio de fluorescencia se ilumina el preparado con intensa luz de longitud de onda capaz de activar el colorante fluorescente. El poder de resolución es inversamente proporciona al límite de resolución o Aumento: Es la relación entre el tamaño de la imagen y del objeto. o Límite de resolución (aa’): es la distancia que separa a dos objetos para que se vean separados. o Aberración cromática: Se origina debido a que la luz no es monocromática. o Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.GENERALIDADES HISTOLOGIA TÉCNICAS HISTOLÓGICAS MICROSCOPÍA Microscopía Óptica Los métodos histológicos se clasifican en dos grupos: los que se basan en la observación de células vivas y los que analizan en base a material muerto. Marca anticuerpos. ARN y proteínas. o Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o sea de emitir luz de otra longitud de onda cuando se las ilumina.grown). o La apertura numérica (NA) = N* Sen α: Es el ángulo máximo de luz emitido por el condensador y puede llegar a ser captado por el objetivo. o Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Las estructuras fluorescentes se destacan sobre un fondo oscuro. o Sistema mecánico o Soporte: Mantiene la parte óptica. Partes de un Microscopio óptico o Sistema óptico o Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. El poder de resolución es la distancia que debe haber entre dos objetos para que se vean separados y no parezcan un solo objeto. o Tornillos de enfoque: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto. o Aberración esférica: Cuando la lente no es perfectamente esférica la convergencia de los rayos hace que la imagen no se forme en el mismo punto. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. Amplía la imagen de ésta. La imagen esta determinada por la absorción de la luz UV por las moléculas de la muestra .

Microscopio electrónico Se remplaza la luz visible por un haz de electrones que permite un mayor poder de resolución. 1 mm = 0. buen poder de resolución y claridad en los cortes finos. Se basa en la iluminación del preparado por un condensador especial que emite una luz intensa de forma oblicua. . Es por eso que se requiere de cortes ultra finos.001 m= 10^-3m 1um = 0.GENERALIDADES HISTOLOGIA TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Microscopio confocal Permite la visualización de una muestra biológica en 3 dimensiones. La imagen que se forma se registra por proyección en una pantalla fluorescente o en una película fotográfica. Se utiliza para la identificación de bacterias en un fondo oscuro donde se aprecian como imágenes brillantes.000000001 m = 10^-6 m 1 Å= 0. Se basa en una fuente lumínica láser.000000000001m = 10^-12m 5 . Microscopio de campo oscuro Produce contraste en materiales no teñidos.0000000001 m = 10^-10m 1pm = 0. La formación de la imagen se forma por la ausencia de estos electrones y la ausencia de estos depende del espesor del objeto.000001 m =10^-6 m 1nm = 0.

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