ELECTROFOREZA ADN IN GEL DE AGAROZA

Electroforeza este un fenomen fizico-chimic de deplasare a particulelor purttoare de sarcini electrice, sub influenta unui camp electric. Electroforeza in geluri de agaroza si poliacrilamida este o metoda standard de separare, identificare si purificare de fragmente de ADN. De obicei electroforeza in gel de agaroza se realizeaza pentru moleculele mari de ADN (200 bp -50 kb), n timp ce pentru fragmente mai mici de ADN (5-500 pb) se foloseste gelul de poliacrilamida.

Avantajele electroforezei in gel de agaroza:

Prepararea usoara, rapida a gelurilor de agaroza. Costuri reduse. Nu se produce denaturarea probelor. Agaroza este mai putin toxica decat poliacrilamida. Probele pot fi recuperate in vederea unor analize suplimentare.

ADN

__

Putere Power ADN-ul este incarcat negativ In prezenta unui camp electric ADN-ul va migra catre polul pozitiv (anod)

Mobilitatea electroforetica depinde de marimea si forma moleculelor

ADN mica mare

Putere

Agaroza amestec de poliglucide obtinute din agar. Agarul se extrage din specii de alge rosii (Rodophyta). Agaroza sub forma de pudra disponibila comercial nu este complet pura (poate fi contaminata cu alte poliglucide, saruri, proteine). Gradul de contaminare poate afecta migrarea ADN-ului.
Exista si agaroze modificate chimic care au temperatura de topire mai coborata (low melting agarose) fara pierderea rezistentei mecanice a gelului. Sunt utile pentru electroforeza preparativa cand se recupereaza ADNul din gel, prin retopirea acestuia.

D-galactoza

3,6-anhidro L-galactoza

Prepararea gelului de agaroza

Prepararea gelurilor se face prin topirea agarozei (pe baie de apa), in tamponul de electroforeza dorit, pana la obtinerea unei solutii clare, transparente. Aceasta solutie se toarna in matrita care va da forma gelului (dupa racire si solidificarea agarozei). Tampoanele sunt preparate ca solutii stoc concentrate si sunt pastrate la temperatura camerei. Solutiile tampon contin EDTA la pH 8 si tris-acetat (TAE) sau trisfosfat (TPE) sau tris-borat (TBE). Pentru ADN denaturat tampon alcalin cu EDTA si NaOH.

tampon

agaroza

Se prepara tamponul de electroforeza din solutia stoc, intr-o cantitate suficienta pentru a umple cuva si pentru prepararea gelului. Se toarna volumul de tampon, care reprezinta volumul gelului, intr-un flacon Erlenmeyer fara a depasi jumtate din capacitatea vasului. Se adauga pudra de agaroza. !!! Din acelai volum preparat se va folosi tamponul de electroforeza atat pentru prepararea gelului, cat si cel destinat cuvei pentru migrare. Micile diferente de pH sau de concentratie ionica pot crea fronturi in gel, care afecteaza mobilitatea fragmentelor de ADN. Agaroza se dizolva complet pana devine o solutie limpede, transparenta.

APARATUL DE ELECTROFOREZA SI ACCESORIILE UTILIZATE

sursa de putere (redresor)

capac

cuva matrita piepteni

Matrita de turnare a gelului este o placa dreptunghiulara din Plexiglas (sau sticla) de dimensiunile gelului care trebuie turnat. Pentru a putea turna gelul marginile placii se prind cu banda adeziva. Pieptenii sunt obiecte cu dinti dreptunghiulari ce se monteaza pe matrita inainte de turnarea agrozei lichide astfel incat dupa solidificarea gelului sa se formeze godeurile in care se vor pipeta probele ADN. Godeurile nu strabat intreg gelul ci numai o parte.

Se toarna solutia de agaroza in matrita si se lasa sa se ntreasca. Gelurile preparate cu agaroza cu punct de topire scazut precum si cele cu o concentratie a agarozei sub 0,5% trebuie racite la 4oC i migrate in camer rece.

Dupa racire la 60oC se adauga solutia de bromura de etidiu (EtBr) 0,5 g/ml si se amesteca bine. !!!Colorarea cu EtBr se poate face si dup migrare. !!!Multi experimentatori prefera sa nu contamineze cuva de electroforeza cu EtBr. Se pare ca benzile formate in absenta EtBr sunt mai precise. De aceea se prefera colorarea ulterioara a gelurilor, desi aceasta procedura prezinta dezavantajul ca benzile nu pot fi urmarite in diferite stadii n cursul migrarii.

Dupa solidificarea gelului se scot pieptenii. Se aseaza gelul cu placa pe care se afla pe platforma cuvei de electroforeza. Se umple cuva cu tampon de electroforeza astfel incat gelul sa fie acoperit cu un strat aproximativ de 1 mm lichid.

Cuva de electroforeza un recipient de Plexiglas transparent prevazut cu o platforma orizontala in mijloc pe care se aseaz gelul dupa turnare. La cele doua capete ale cuvei se gasesc electrozii de platina. Cuva are un capac care se monteaza inainte de inceperea migrarii.

Gelul asezat in cuva de migrare, in tamponul de electroforeza

ADN

tampon

Catod (-)

Anod (+)

Tampoanele de incarcare sunt mai dense decat tamponul de migrare, ceea ce creaza un avantaj in timpul incarcarii probelor in godeuri. Probele se pipeteaz la baza godeurilor inlocuind treptat volumul de tampon (mai usor) din godeu, fara a difuza puternic in stratul de lichid ce acopera gelul. Colorantii (ex. albastru de bromfenol) folositi migreaza electroforetic, spre anod.

Se prepara probele pentru migrat, in tuburi de microcentrifuga, in raport de 1:5 (v/v) tampon de incarcare (stoc). Probele de ADN sunt preparate in tampoane colorate pentru a urmari vizual procesul de migare.Cu o micropipeta automata se aplica fiecare proba in cate un godeu iar probele cu markeri se aplica n ultimul godeu.Volumul maxim de incarcare este determinat de volumul godeului (ex, 5 mm x 5 mm x 1,5 mm), aprox. 37,5 l.

Cand capacul este montat, electrozii fac contact cu mufele din capac la care sunt legate cablurile electrice, care fac legatura cu sursa de putere. Se inchide capacul cuvei si se conecteaz cablurile electrice [rou la A (+) si negru la C (-)]; Se programeaza sursa de putere la parametrii doriti (sa nu depaseasca 5 V/cm) si se porneste migrarea. Dupa pornire, la nivelul godeurilor sunt generate bule iar dupa cateva minute frontul de tampon (albastru de bromfenol) trece din godeu n gel in directia catodului.


Catod (-)

ADN

Anod (+)

Cand frontul de albastru de bromfenol se apropie de capatul gelului se opreste sursa de putere si se deschide capacul. Daca gelul a fost colorat deja cu EtBr (la preparare) se examineaza cu ajutorul unui transiluminator si se fotografiaza.

Daca nu a fost colorat, gelul trebuie colorat n acest stadiu cu sol de EtBr 0,5 g/ml, timp de 30-45 min. EtBr se leaga la ADN si sub actiunea luminii UV permite vizualizarea acestuia in gel. Atentie!!!! EtBr este un agent puternic mutagen si un toxic moderat. Pentru manipulare se vor folosi manusi.

Transiluminatorul UV - un aparat cu lampi UV ( = 254, 302 respectiv 365 nm) ce asigura iluminarea gelurilor (de dedesubt). Aceste aparate sunt prevazute cu un ecran protector deasupra gelului care ecraneaza razele UV daunatoare pentru ochi.

Aparatul de fotografiat asigura pastrarea imaginii modelului de benzi, obtinut n gel in urma migrrii. Bromura de etidiu isi pierde repede fluorescenta in UV de aceea fotografierea gelului imediat dupa migrare este obligatorie. Analizorul de imagini imaginea preluata optic de pe transiluminator este transformata si pastrata digital de un computer. Este un echipament relativ scump care insa prezinta avantaje, cel mai important fiind acela ca pe piata exista softuri care pot prelucra imaginea i furniza informatii extrem de utile cum ar fi marimea fragmentelor ADN din diferite benzi sau cantitatea de ADN pentru fiecare banda.

Vizualizarea ADN

ADN marker

Probe

2000 1500 1000 750 500 250