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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

CURSO PRÁCTICO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

PRÁCTICA:

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA.

ALUMNA:

HUITRÓN LÓPEZ CINDY

GRUPO:

5QV1

SECCIÓN:

I

PROFESOR:

RIVAS FARIAS ARTURO FECHA DE REALIZACION:

10 de marzo de 2012

FECHA DE ENTREGA:

16 DE MARZO DE 2012-03-10

SITUACIÓN ESCOLAR:

ALUMNA REGULAR

  • INTRODUCCIÓN.

Una molécula con una carga eléctrica neta se desplazará en un campo eléctrico. Este fenómeno, conocido como electroforesis ofrece un procedimiento para separar proteínas y otras macromoléculas. La velocidad de migración (v) de una proteína depende de la Fuerza del campo eléctrico (E), la carga neta de la proteína (z) y el coeficiente de fricción (f) V=Ez/f Las separaciones electroforéticas se realizan casi siempre sobre geles porque sirven como tamiz molecular que potencia la separación. Las moléculas más pequeñas que los poros del gel se desplazan más fácilmente, mientras que las mayores permanecen casi inmóviles. La dirección del flujo es vertical descendente. La electroforesis se lleva a cabo en un bloque delgado, vertical de poliacrilamida (Fig 1).

 INTRODUCCIÓN. Una molécula con una carga eléctrica neta se desplazará en un campo eléctrico. Este

Fig. 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida (A) Aparato de electroforesis en gel (b) La acción de tamizado de un gel poroso separa las proteínas de acuerdo con su tamaño, moviéndose la más pequeña

Estos geles son formados por la polimerización de la acrilamida entrecruzada por metilenbisacrilamida (Fig 2), son el soporte preferido para la electroforesis porque son inertes químicamente.

 INTRODUCCIÓN. Una molécula con una carga eléctrica neta se desplazará en un campo eléctrico. Este

Fig 2. Formación de un gel de poliacrilamida

Las proteínas se pueden separar de acuerdo con sus masas moleculares, en condiciones desnaturalizantes. La mezcla de proteínas se disuelve en SDS detergente aniónico que rompe casi todas las interacciones no covalentes en las proteínas nativas. También se añade mercaptoetanol o ditiotreitol para reducir puentes de disulfuro. Los aniones SDS se unen a la cadena principal a razón de un anión SDS por cada dos residuos de aminoácido. El complejo SDS con una proteína desnaturalizada tiene una gran carga negativa, que es aproximadamente proporcional a la masa de la proteína, y no es muy diferente a la nativa. Estos complejos se someten a electroforesis.

Las proteínas se pueden separar de acuerdo con sus masas moleculares, en condiciones desnaturalizantes. La mezcla

Fig 3. Dodecil sulfato de sodio

Después se pueden visualizar en gel tiñéndolas con plata o un colorante como azul de coomassie, que revelan una serie de bandas. Cuando se tiñe con azul de coomassie basta 0.1 µg de proteína para dar una banda diferenciada y con la de plata, se puede distinguir incluso una cantidad menor.

OBJETIVOS.

Efectuar una separación de proteínas de tres muestras por electroforesis en gel de

poliacrilamida. Determinará cuál es el tamaño óptico del poro del gel para la mejor separación de cada una de las muestras.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME.

Las proteínas se pueden separar de acuerdo con sus masas moleculares, en condiciones desnaturalizantes. La mezcla

7.5 %T

Las proteínas se pueden separar de acuerdo con sus masas moleculares, en condiciones desnaturalizantes. La mezcla

10 %T

Las proteínas se pueden separar de acuerdo con sus masas moleculares, en condiciones desnaturalizantes. La mezcla

12.5 %T

Las imágenes son de geles prestados (7.5 y 12.5) por el profesor para observar lo esperado en la práctica y el 10% fue de un grupo de la mañana que el profesor también en su momento nos enseño, las pongo como representación y para complementar la práctica.

  • 1. Llenar la siguiente tabla.

Tabla 1. Movilidades electroforéticas relativas.

   

Movilidad.

%T

Suero

Clara de huevo

Yogurt

7.5

0.8056

0.3879

0.6115

10

0.5449

0.2643

0.4446

12.5

0.3271

0.1449

0.2804

  • 2. Complete la tabla 2 con los valores promedio de la distancia recorrida para cada proteína y las movilidades electroforéticas relativas (M).

Tabla 2. Movilidad electroforética relativa en log (M*100)

 

%T

Movilidad [log(M*100]

   

Suero

Clara de huevo

Yogurt

7.5

1.9061

1.5887

1.7864

10

1.7363

1.4221

1.6479

12.5

1.5146

1.1611

1.4477

Tabla 3. Número de bandas.

 
   

Número de bandas

 
 

%T

Suero

Clara de huevo

Yogurt

 

7.5

17

10

5

 

10

17

12

9

 

12.5

21

13

10

  • 3. Con los valores del logaritmo de la movilidad electroforética relativa (M) de la proteína elegida en cada muestra, construir la gráfica de ferguson colocando en el eje de las ordenadas el logaritmo de las movilidades electroforéticas relativas y en el eje de las abscisas el %T. Usar un solo grafico para todas las proteínas seleccionadas.

Gráfica de Ferguson.

1 2 1.5 Suero 2.5 0 0.5 Clara Yogurt y = -0.1958x + 2.1105 y =
1
2
1.5
Suero
2.5
0
0.5
Clara
Yogurt
y = -0.1958x + 2.1105
y = -0.2138x + 1.8182
y = -0.1694x + 1.966
Log (M*100)
12.5
7.5
10

% T

Gráfico 1.- Gráfica de Ferguson comparando tamaño y movilidad de partícula.

  • 4. Concluya acerca del tamaño molecular relativo de las proteínas y sus cargas eléctricas relativas al pH del regulador de trabajo.

El tamaño molecular relativo de las moléculas lo podemos concluir a partir de las pendientes de las rectas en la gráfica de Ferguson. Aunque dichas pendientes tienen valores negativos, tomamos su valor absoluto para poder compararlas. Por lo tanto podemos observar que el suero humano tiene el peso molecular relativo más grande, seguido por el yogurt y siendo la clara de huevo la proteína con peso molecular relativo más pequeño de las tres muestras trabajadas.

Las cargas eléctricas relativas de las moléculas las podemos comparar a partir de las ordenadas al origen de las rectas en la Gráfica de Ferguson. Los valores de la ordenada al origen no corresponden al valor de la carga, sólo nos haces referencia de qué moléculas tienen más carga. En el caso de la práctica, sabemos que todas las proteínas utilizadas tienen carga negativa debido a que corren hacia el ánodo y no se desnaturalizan en el pH trabajado debido a que se encuentran en un rango de pH regulado. Con respecto a las proteínas trabajadas, el suero humano es la proteína que posee una mayor carga eléctrica, seguida por el yogurt y siendo la clara de huevo la proteína con menor carga eléctrica.

  • 5. Diga cuál %T recomienda para la separación de las proteínas de cada muestra, ¿por qué?

Muestra

%T recomendado

Suero sanguíneo

12.5

Leche

12.5

Clara de huevo

12.5

Consideramos éstos %T como el tamaño óptimo de poro del gel para cada muestra en base al número de bandas que se observaron en el gel. Un mayor número de bandas nos indica que tiene un mayor poder de resolución, por lo tanto, la separación de las proteínas en éste tamaño de poro será más efectiva.

  • 6. Escriba la reacción completa para la

copolimerización de la acrilamida y la

bisacrilamida por radicales libres, ¿Qué función tiene el TEMED y el persulfato de

amonio?

La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis- acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros.

Las concentraciones óptimas de persulfato amónico y TEMED dependen de la concentración de acrilamida. Una concentración demasiado baja puede traducirse en que parte del monómero no polimerice; por el contrario, un exceso de catalizador origina un número elevado de cadenas de acrilamida anormalmente cortas.

La polimerización se detiene cuando desaparecen los radicales libres del medio; entre los agentes que producen su desaparición con mayor eficacia se encuentra el oxígeno molecular, por lo que todas las disoluciones se deben desgasificar enérgicamente antes de formar el gel.

Clara de huevo 12.5 Consideramos éstos %T como el tamaño óptimo de poro del gel para

Fig.4. Reacción de copolimerización de la acrilamida y la bisacrilamida

  • 7. Mencione una aplicación de la electroforesis preparativa y una de la electroforesis analítica.

    • a) Electroforesis preparativa

Se puede aplicar en la preparación y purificación de (por extracción de bandas del gel) moléculas y fragmentos de DNA y RNA

  • b) Electroforesis analítica

Permite realizar algunos tipos de diagnósticos, conocer la composición de un preparado proteico heterogéneo, monitorear un proceso de purificación, estimar Peso molecular, etc.

  • 8. Defina las velocidades de migración y movilidad electroforética.

    • a) Velocidad de migración

En electroforesis, el movimiento de una molécula tiene una determinada velocidad conocida como velocidad de migración. Dicha velocidad de migración es un valor característico de la molécula y del campo eléctrico. Sus unidades son cm/S. La velocidad de migración aumentará con la subida del campo eléctrico generado por una fuente exterior al sistema (Voltaje).

También cabe mencionar que la velocidad de migración en un sistema electroforético será inversamente proporcional a la viscosidad del medio y proporcional a la carga neta de la molécula.

  • b) Movilidad electroforética (μ)

La movilidad electroforética es la constante de proporcionalidad entre la velocidad del ión y la

fuerza del campo eléctrico.

Velocidad de migración cm S

1

Fuerza del campo eléctrico V cm

1

La movilidad es proporcional a la carga del ión e inversamente proporcional al coeficiente de fricción.

  • 9. Defina electroferograma.

Cuando se realiza una electroforesis capilar (CE) o electroforesis de zona (ZCE), la separación se lleva a cabo en el interior de un tubo capilar con un diámetro interno inferior a 0.1nm y una longitud de 50cm a 1m. La técnica tiene un gran poder de resolución; además, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual modo que en una cromatografía en columna.

Esto contrasta con la electroforesis en gel, donde se necesitaban etapas separadas para hacer visibles las bandas después de la separación. En lugar de esto, ahora obtenemos una gráfica de la respuesta en función del tiempo. Estos gráficos se denominan electroferogramas. Otros nombres son electroforetograma, electro-ferograma y, simplemente, ferograma.

  • DISCUSIÓN.

En la presente práctica realizamos la separación de proteínas por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida. Para poder llevar a cabo dicha separación tuvimos que preparar el soporte el cual está conformado del gel separador y del gel empacador.

Para el gel separador cada equipo preparó un sistema con concentración diferente de acrilamida (realizando las mediciones de las soluciones de manera cuidadosa debido a que

son sustancias neurotóxicas). La razón porque se prepararon diferentes concentraciones de acrilamida se debe a que al mismo tiempo se está variando la concentración final de bisacrilamida en el medio. Como ya se mencionó anteriormente, una alta concentración de bisacrilamida tiene como resultado que el tamaño del poro del gel sea pequeño debido a que hay un mayor número de entrecruzamientos entre las cadenas de poliacrilamida. Dicha reacción fue catalizada por el TEMED (tetrametiletilendiamina) que brinda radicales al medio para que la reacción de polimerización entre acrilamida y bisacrilamida sea más rápida. En el momento de hacer la mezcla de acrilamidas con el TEMED se tuvo un especial cuidado de no formar burbujas debido a que el oxígeno presente e el aire inhibe la polimerización, es por esto que es un paso importante adicionar agua hasta cubrir la superficie del gel cuando ya lo colocamos dentro de su marco para formar una especie de sello que impida el paso del aire.

Posteriormente preparamos el gel empacador y lo adicionamos hasta el borde de las placas después de que el gel empacador hubiera polimerizado, colocando también el peine formador de pozos. Cuando el gel empacador polimerizo colocamos las placas en la cámara donde se llevaría a cabo la electroforesis cuidando de sellarla perfectamente sin que hubiera ningún tipo de fuga para poder colocar de forma segura la sustancia reguladora, cuidando de que no quedaran burbujas de aire ente ésta y el gel. Ya habiendo montado la cámara aplicamos las muestras (25 µL) en los pozos formados con el peine. Las muestras ya se encontraban mezcladas con azul de bromofenol, el cual no tiñe a las proteínas, pero nos ayuda a poder observar como van corriendo las proteínas conforme transcurre el tiempo de separación. Conectamos los electrodos a la fuente de poder y a la cámara electroforética y graduamos el voltaje a 80V mientras las muestras se encontraban en el gel empacador, aumentando el voltaje hasta 180V cuando penetraron al gel separador. Es aquí donde podemos observar la razón de colocar dos geles: el gel empacador permite que las proteínas se compacten y entren al mismo tiempo al gel separador y puedan así partir desde un mismo punto para poder después evaluar su distancia promedio recorrida. Cuando conectamos los electrodos, aunque no podíamos observar a simple vista que se estaba llevando a cabo la separación, podíamos comprobarlo debido a que en la cámara hay dos alambres que burbujean al momento de pasar la corriente eléctrica, esto es, liberan H 2 y O 2 debido a que se produce una electrolisis por el paso de la corriente eléctrica. También, podemos deducir en el corrimiento, que las proteínas trabajadas tienen cargas negativas debido a que se dirigen hacia el ánodo (con carga +) de la cámara electroforética. Cabe mencionar, que en el momento del corrimiento, aunque sabemos que al aumentar el voltaje aumente la velocidad de migración de las partículas. Cuando las muestras corrieron aproximadamente 1cm antes del borde inferior del gel, apagamos la corriente eléctrica. Inmediatamente retiramos nuestros geles para poder medir las distancia recorridas por el azul de bromofenol. Después fijamos las proteínas separadas por medio del TCA, ya que, aunque ya no hay una corriente eléctrica que impulse a las proteínas, toda vía siguen teniendo cierta movilidad (mínima); dicho TCA las desnaturaliza y brinda un medio ácido, pudiendo observar dicho cambio por medio de un cambio de color del azul de bromofenol a un tono amarillo. Cabe aclarar que la gelificación tardo cuarenta y cinco minutos debido a que los reactivos ya habían pérdido ciertas propiedades, o por estar mucho tiempo almacenados, por lo que otro fenómeno no esperado fue el de que se nos formó una burbuja y provocó una invaginación lo que hizo que no corriera un poquito mas, sin embargo si observamos el efecto de separación de las proteínas involucradas asi como sus respectivas bandas. Cuando las proteínas ya se encontraban fijas pudimos teñirlas con Azul de Coomassie, el cual nos permitiría observar el número de bandas (o de proteínas) separadas. Posteriormente adicionamos un poco de agua destilada para eliminar el exceso de colorante y poder identificar con una mayor claridad las bandas.

Al comparar los geles observamos que en los geles donde el %T era mayor, la distancia recorrida por las proteínas había sido menor debido a que el tamaño del poro era pequeño, pero mostraban un mayor número de bandas para cada compuesto. A partir de esto pudimos concluir que el mejor tamaño de poro para el suero sanguíneo corresponde a 12.5%T y siendo para el yogurt 12.5 %T y la clara de huevo 12.5%T; ya que permite que haya una mejor separación de las proteínas.

Por medio del cálculo de las distancias recorridas pudimos calcular las movilidades electroforéticas relativas promedio (M) para poder construir la Gráfica de Ferguson. Las movilidades graficadas a cada %T tienen una tendencia lineal con pendiente negativa. Por medio de regresión lineal obtuvimos los valores de la pendiente de cada recta y su valor de ordenada al origen. Llevamos a cabo esto debido a que la pendiente de las rectas nos da una idea del tamaño molecular relativo de la proteína y la ordenada al origen nos permite comparar la carga total relativa. En nuestro caso determinamos que el suero sanguineo tiene la proteína con mayor tamaño molecular relativo, al igual que una mayor carga total relativa, seguido por el yogurt y por último la clara de huevo.

CONCLUSIONES.

Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida.

Se lograron separar las proteínas de cada una de las muestras utilizadas.

Se realizó una gráfica de Ferguson para poder ver que proteína tenía el mayor tamaño.

La proteína más grande es la del suero sanguíneo, seguido por el yogurt y finalmente

por la clara de huevo. Con la gráfica de Ferguson también se determinó sus cargas teniendo la mayor carga el suero humano, seguido por el yogurt y finalmente por la clara de huevo.

Se determinó el número de bandas para cada muestra que pueden ver en la tabla No.

3.

Se concluyó que el tamaño del poro óptimo para la buena separación de cada una de

las proteínas es de 12.5 %T Si las proteínas estuvieran mezcladas el tamaño de poro óptimo para su buena separación sería de 7.5 %T.

El TEMED es un catalizador que brinda radicales libres al medio los cuales permiten que la reacción de polimerización se lleve a cabo de una manera más rápida.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

http://www.micro.ucr.ac.cr/13_PAGE.pdf

http://webpages.ull.es/users/fcorzo/electroforesis/Texto%20htm/08.htm http://fbio.uh.cu/enzimol/Archivos/electroforesis.ppt#266,11,Diapositiva 11

http://www.ing.ula.ve/~analui/Archivos/Electroforesis.pdf

http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml#ele Harris, Daniel C. Análisis Químico Cuantitativo. Editorial Reverté S.A. 2ª Edición; pag. 749

Rubinson, Kenneth A & J.F. Rubinnson. 2001. Análisis Instrumental. Editorial Prentice Hall. Madrid, España; pag. 722-730