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UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA

DEPARTEMENTO ACADMICO DE ACUICULTURA

INFORME DE PRACTICA: CULTIVO DE UNA MICROALGA (Dunaliella SP) MEDIANTE LA TCNICA DE LA MASIFICACION

CURSO

: ACUICULTURA I

PIURA - PERU

INTRODUCCION
Son llamadas microalgas a una gran cantidad de especies que constituyen el fitoplancton que abarca desde organismos auttrofos hasta microflagelados y microciliados auxtrofos. Su posicin taxonmica ha sido de gran polmica entre botnicos y zologos, como ejemplo podemos mencionar el grupo de los dinoflagelados, conocidos por unos como microalgas y por otros como protozoarios. Estas especies aportan un alto contenido nutricional para peces, crustceos y moluscos, adems de ofrecer facilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio como en produccin a gran escala con fines comerciales. Debido a esto es necesario cultivar los diversos tipos de microalgas dndoles las condiciones y enriquecindoles con los nutrientes necesarios para darle mayor calidad a nuestros cultivos hidrobiologicos.

CULTIVO DE UNA MICROALGA MEDIANTE LA TCNICA DE LA MASIFICACION DUNALIELLA SP 1.- DESCRIBA DETALLADAMENTE LA COMPOSICIN DEL MEDIO DE CULTIVO GUILLARD TABLA DEL MEDIO DE GUILLARD F/2 (J. STEIN, 1979) Nutrientes Mayores NaNO3 7.5 NaH2PO4.H2O 0.5 NH4Cl 2.65 Na2SIO3.9N2O 3 Solucin Primaria % w/v % w/v % w/v % w/v (calentar para disolver)

Usar 1 ml de stas soluciones por litro de agua de mar, para preparar el medio F/2. Sugerencia: preparar el NaNO3 junto con NaH2PO4 . H2O en 100 ml Metales Traza CuSO4.5H2O ZnSO4.7 H2O ZnCl2 CoCl2.6H2O MnCl2.4H2O Na2MnO4.2H2O Solucin Primaria 0.98 % w/v 2.2 % w/v 1.05 % w/v 1.0 % w/v 18 % w/v 0.63 % w/v

Es conveniente hacer las soluciones primarias en forma individual, y con una concentracin menor de 106 mas concentrada que en el medio F/12 Solucin Primaria De Metales Traza A. Con Secuestrante Frrico (Cloruro Frrico): Disolver 5g del secuestrante frrico en 900 ml de agua destilada y aadir 1 ml de cada una de las soluciones primarias de metales traza preparados anteriormente; aforar a un litro y asegurar que el pH quede cerca de 4.5. use 1 ml de esta solucin por cada litro de agua de mar para hacer el medio de cultivo. Agua de mar filtrada (5, 10, etc.) y de ser posible irradiada con UV B. Con EDTA y Cloruro Frrico (FeCl.6H2O): disuelva 3.15 g de FeCl.6H2O 4.36 de EDTA (Na2) en 900 ml de agua destilada, agregue 1 ml de cada una de las soluciones stock primarias de metales traza y afore a 1 litro, asegure un pH de 2.0

Use 1 ml de esta solucin por litro de agua de mar para preparar el medio f/2 Solucin Primaria De Vitaminas Solucin primarias de Biotina: se prepara a partir de cristales de Bl, disolver 10 mg de Biotina en 96 ml de agua destilada. Haga esta solucin ligeramente cida para ser autoclavada y mantngase en un congelador. Solucin de Vitamina B12: A partir de Cyanocobalamina U.S. de 100 mg/ml solucin inyectable. Tomar 1 ml y aforarlo en 100 ml de agua destilada. La solucin se acidifica para ser autoclavada y se congela. Tomar 1ml de la solucin primaria de Biotina y 0.1 ml de la solucin stock primaria de B12, aforar a 100 ml con agua destilada y aadir 20 mg de Tiamina HCl. Se pueden preparar ampolletas de 2,5 10 ml y almacenarlas estriles (acidificas) en el congelador. Use ml de esta solucin por cada litro de agua de mar para preparar el medio f/12 Preparacin del Buffer Tris Tome 50 g de tris y disulvase en 200 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.2 en HCl. Use de 1 a 5ml por litro de medio antes de la autoclave, ajustando el pH a 7.4 (recomendado usar 1 ml por litro cuando el pH del medio es 7.9 8.2) TABLA DEL MEDIO DE CULTIVO (AGUA DULCE) (Guillard, In: Stein, 1979) Guillard comunicacin personal a J. Steinn, 1973. Handbook of phycological methods, Culture Methods and Growth Measurements. Cambridge at the University Press: 448 pp a. Macronutrientes: CaCl2.H2O 36.76 g/l MgSO4.7H2O 36.97 g/l NaHCO3 12.60 g/l K2HPO4 8.71 g/l NaNO3 85.01 g/l Na2SiO3.9H2O 28.42 g/l De esta solucin rotulada como a se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada. b. Micronutrientes: Na2EDTA FeCl3.6H2O CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O CoCl2.6H2O 4.36 g/l 3.15 g/l 0.01 g/l 0.022 g/l 0.01 g/l

MnCl2.4H2O Na2MoO4.2H2O

0.18 g/l 0.006 g/l

c. Vitaminas: Thiamine. HCl 0.1 mg/l Biotin 0.5 g/l Cyanocobalamina 0.5 g/l De esta solucin rotulada como c, se obtiene 1 ml y se adiciona a 1 litro de agua esterilizada d. Tris: Tris (Hydroxymethyl) Aminomethano 50 g./200 ml H2O destilada (Cuando el cultivo se encuentra axnico el tris puede reemplazarse por Glycylaglycine). De esta solucin rotulada como d, obtener 2 ml y adicionar al litro de agua esterilizada que se esta preparando en cultivo, se debe hacer ajuste de pH a 7.2 con HCl cuidadosamente para no obtener el pH cido. Solucin Bsica de Nutrientes NaNo 75 mg Po4H2NaH2O 5 mg SiO2Na29H2O 15 30 mg Solucin de Metales Traza Na2EDTA Cl3FeGH2O So4CuSH2O So4Zn7H2O Cl2Mn4H2O MoO2Na22H2O Cl2Co6H2O 4.36 mg. 3.15 mg 0.01 mg 0.022 mg 0.018 mg 0.006 mg 0.01 mg

Solucin de Vitaminas Cianolobalamina (B12) 0.5 mg Tiamina Mc (B1) 0.1 mg Biotina (vit. M) 0.5 mg 2. DESCRIBA PUNTUALMENTE TODO EL SISTEMA ACONDICIONAMIENTO REALIZADO EN EL CULTIVO DE MICROALGAS. DE

Para el cultivo de la microalga Dunaliella sp y para las dems microalgas, se llevo a cabo un acondicionamiento muy cuidadoso, dado que cualquier negligencia cometida en el acondicionamiento podra ocasionar el fracaso de nuestros cultivos.

Materiales Biotero Fluorescente Termmetro Inculo o cepa Aireador 1 pali globo Cocina elctrica

Botellas de vidrio y plstico de 500 ml, 1500 ml y 3000 ml Sustancias Madres: Nitrgeno y Fsforo Agua de mar esterilizada Pipetas Fiolas

En El Biotero Este inicialmente presentaba el inoculo o cepa de donde se extraera las muestras para el cultivo, y que posteriormente albergara a todos los cultivos de las microalgas a cultivar. Acondicionamiento Qumico Desinfeccin.- se llevo a cabo en las botellas a utilizar que fueron de vidrio y plstico. Las botellas de vidrio y de plstico fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio o leja, detergentes, las cuales fueron necesarias colocarles un tapn hecho de algodn para evitar el ingreso de microorganismos. Esterilizacin.- sta se llevo a cabo en el agua de mar a usar, para esterilizarla solo era necesario dejar que el agua haga un pequeo burbujeo, sin dejarlo que ebullicione debido a que se precipitaran los fosfatos y las sales minerales, si esto suceda, era necesario volver a esterilizar una nueva muestra de agua. Acondicionamiento Fsico En el interior del biotero se acondiciono un fluorescente el cual estaba iluminado las 24 horas del da, con el propsito de dar energa e iluminacin a los cultivos para realizar la fotosntesis. Tambin se coloco un termmetro para poder llevar el control diario de la temperatura. Fue necesario obtener un aireador o agitador, el cual al final de la manguera del aireador se le coloco un pali globo para que pueda tener las condiciones necesarias de aireacin a los cultivos, de la misma manera evitar la sedimentacin de las microalgas. 3.- CMO SE HA LOGRADO CONTROLAR LA CONTAMINACIN DE SU CULTIVO? Se logro controlar la contaminacin del cultivo de Dunaliella sp, debido a las siguientes razones: El medio de cultivo que se uso fue el medio de cultivo Guillard. Para cada botella de cada masificacin se coloc un tapn de algodn el cual evitaba el ingreso de microorganismos, solamente se permita el paso de la manguera del aireador.

Las botellas fueron desinfectadas con Hipoclorito de Sodio o leja, con detergentes, alcohol. Al momento de realizar la masificacin, la persona que manipulaba los cultivos tena que estar en buen estado de salud, as como evitar los estornudos, evitar el habla, evitar el acercamiento del inculo con la cara o boca. Las pipeta y la fiola deban estar desinfectadas El agua de mar a usar para las masificaciones deban de estar completamente estriles. Durante las 24 horas del da el cultivo permaneca en el interior del biotero, el cual solamente se sacaba para llevar a cabo la siguiente masificacin.

4.- CUL HA SIDO EL EFECTO DE LA TEMPERATURA REGISTRADA DURANTE EL EXPERIMENTO, SOBRE EL DESARROLLO DE CULTIVO DE LA MICROALGA? 1er Experimento Se realiz un primer experimento el cual se dejaron los cultivos en la parte externa del laboratorio, para lo cual se llevo a cabo los mismos procedimientos de cultivo, usando la misma tcnica. Estos cultivos fueron depositados en el interior de una tolda para darle mayor temperatura, tambin se les coloco fluorescentes a medio metro de distancia de los cultivos, pero se noto diferentes cambios de temperaturas muy bruscos que variaban de 24C a 32C, y como consecuencia ocasiono la decoloracin de las microalgas, de un color verde plido a un color transparente en solo pocos das ocasionando el colapso y fracaso de los cultivos por lo que se vio la necesidad de volver a cultivar pero esta vez se tuvo un mayor control de temperatura debido que los cultivos fueron colocados en el laboratorio en el interior de un biotero. 2do Experimento en el Laboratorio Durante el tiempo que duro el 2do experimento, la temperatura ha sido un factor fsico muy importante para el desarrollo de la microalga, debido que su efecto ha sido satisfactorio, ya que se mantuvo dentro del rango ptimo para el desarrollo de la microalga cultivada. La temperatura registrada se mantena en el rango de 25 27 C, el cual permiti que las microalgas se reproducieran satisfactoriamente, en el transcurso de los das se noto el cambio de la coloracin de verde plida a otra coloracin verde oscura. El cual indicaba que el cultivo marchaba en buenas condiciones. Esta temperatura se dio gracias a la iluminacin de los fluorescentes colocados en el interior del biotero. 5.- DESCRIBA DIARIAMENTE EL DESARROLLO DEL CULTIVO (PUNTUALICE LA VARIACIN DEL COLOR ) DESPUS DE CADA MASIFICACIN.

MASIFICACINES DE Dunaliella SP 1ERA MASIFICACION A 500 ml (10/11/2004) 1 ml de Nitrgeno para 500 ml de agua de mar 1 ml de Fsforo para 500 ml de agua de mar 160 ml del inculo de Dunaliella sp 350 ml de agua de mar Das 10/11/2004 11/11/2004 12/12/2004 15/11/2004 16/11/2004 17/11/2004 Temperaturas 9:00 a.m. 11:00 a.m. 4:00 p.m. 6:00 p.m. 26 C 27 C 25 C 27 C 26 C 26.5 C 26 C 26.5 C 25.5 C 26 C 26 C 27 C

Cuando se llevo a cabo la primera masificacin se noto que el color era verde plido, y a medida que iban pasando los das se observaba que la coloracin de las microalgas de nuestra especie Dunaliella sp. iba tomando la coloracin verde mas intenso y al mismo tiempo se notaba la evaporacin del agua. 2 MASIFICACION 1500 ml (17/11/2004) 2 ml de Nitrgeno para 1000 ml de agua de mar 2 ml de Fsforo para 1000 ml de agua de mar Se evaporo 20 ml de agua por lo que se cont con 490 ml del inculo de Dunaliella sp de la primera masificacin 1000 ml de agua de mar Temperaturas Das 9:00 a.m. 11:00 a.m. 4:00 p.m. 6:00 p.m. 17/11/2004 26 C 27 C 18/11/2004 25 C 27 C 19/12/2004 26 C --22/11/2004 26 C --23/11/2004 25.5 C 26 C 24/11/2004 27 C 27 C 3 MASIFICACION 3000 ml (24/11/2004) 3 ml de Nitrgeno para 1500 ml de agua de mar 3 ml de Fsforo para 1500 ml de agua de mar Se evaporo 55 ml de agua por lo que se cont con 1435 ml del inculo de Dunaliella sp de la primera masificacin 1500 ml de agua de mar

Das 24/11/2004 25/11/2004 26/12/2004 29/11/2004 30/11/2004 01/12/2004 02/12/2004 03/12/2004 06/12/2004 07/12/2004 08/12/2004

Temperaturas 9:00 a.m. 11:00 a.m. 4:00 p.m. 6:00 p.m. 26 C 27 C 26 C 27 C 26 C --26 C --26 C 26 C 26 C 27 C 26 C 26.5 C 26 C 27 C 26 C 27 C 26 C 27 C 26 C 27 C

Porcentaje de Evaporacin de agua en las Masificaciones 1era Masificacin (500 ml) De los 510 ml de la 1ra masificacin se evaporo 10 ml de agua quedando 490 ml de agua, entonces tenemos 510 ml -------------------100 % 490 ml ------------------- x x = 96 %, entonces se evaporo el 4% del total de agua 2da Masificacin (1500 ml) 490 ml + 1000 ml de agua = 1490 ml de agua De los 1490 ml de la 2da masificacin se evaporo 55 ml de agua quedando 1435 ml de agua, entonces tenemos 1490 ml -------------------100 % 1435 ml ------------------- x x = 96.31 %, entonces se evaporo el 3.69% del total de agua 3ra Masificacin (3000 ml) 1435 ml + 1500 ml de agua = 2935 ml de agua De los 2935 ml de la 2da masificacin se evaporo 105 ml de agua quedando 1435 ml de agua, entonces tenemos 2935 ml -------------------100 % 2830 ml ------------------- x x = 96.42 %, entonces se evaporo el 3.58% del total de agua

CONCLUSIONES GENERALES El cambio de color es un factor determinante del progreso del cultivo, a mayor coloracin verde, la Dunaliella sp se esta desarrollando en mejores condiciones ambientales. La temperatura debe de ser estable, no debe de existir cambios bruscos de temperatura, ya que esto podra ser mortal para las microalgas Cuando se da un acondicionamiento adecuado y se evita la contaminacin, el cultivo progresa grandemente. Se recomienda trabajar en laboratorio, siendo mejor colocar los medios de cultivo en el interior de un bioterio, controlando la temperatura constantemente Se recomienda que la persona que manipulea las masificaciones no debe de estar enferma, ni acercar las cepas y cultivos cerca de la cara o boca debido a los microorganismos que poseemos y que podran contaminar el cultivo Para evitar la contaminacin se debe tener como principio general la desinfeccin de los materiales a usar como botellas, fiolas, pipetas, etc; asi como la esterilizacin del agua de mar para el caso de la Dunaliella sp

DISCUSIONES A mayor volumen de masificacin se obtendr menores cantidades de evaporacin de agua. No se debe de hacer hervir el agua porque si esto sucede el agua quedar inactiva para la masificacin. Cuando se llevo a cabo el primer experimento colocando los medios de cultivos en la parte exterior del laboratorio, resulto la muerte total de las microalgas debido a que no se pudo tener un control de la temperatura. No se logro determinar la absorvancia y tramitancia debido que el laboratorio principal no se encontraba en las condiciones bsicas para llevar a cabo estas determinaciones, adems no se poda tener acceso a los equipos necesarios. Al finalizar las practicas de masificaciones, se logro obtener volmenes mayores de inculos, los cuales deben de ser aprovechados y no dejarlos morir.

BIBLIOGRAFA http://www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S02.htm#tbl13 http://www.cibnor.mx/colecciones/malgas/eintro.php www.google.com www.yahoo.com http://www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S00.htm Manual de produccin de algas; SENAIM Gilbert Bernab (1988) Acuicultura. Vol. 1, 681 pg

ANEXOS
1. CONSIDERACIONES GENERALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS Muchos factores contribuyen para el desarrollo ptimo de los cultivos de microalgas, algunos de stos afectan las caractersticas del crecimiento. Los recipientes de cultivo ms comnmente usados son de materiales no txicos como las cajas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plstico, madera y concreto son los ms recomendables, incluyendo los estanques rsticos en reas rurales son los sistemas ms econmicos. En cultivos masivos la aireacin es un factor muy importante para la homogenizacin de los nutrientes y para evitar la sedimentacin de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse en lugares donde el agua no se mezcla, esto tambin depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado retarda el crecimiento. Otro factor importante es la penetracin de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz insidente no es suficiente para la fotosntesis, hasta el fondo del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetracin de la luz es ms efectiva, pero se debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a gran escala es recomendable la inyeccin de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosinttico. El crecimiento y la divisin celular son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperodo (horas de iluminacin y oscuridad) en relacin tambin a la

temperatura, por ejemplo en Diatomeas a 20C y 1,000 lux se obtiene un crecimiento favorable. Tabla N 1: Caractersticas De Algunas De Las Especies De Algas Unicelulares Utilizadas En Acuacultura (Coll-Morales J., 1983) TEMPERATURA DIAMETRO OPTIMA 25C MEDIO 10.4 >20 17.8 5 18.4 10 10.2

GENERO Phaeodactylum (diatomea) Skeletonema (diatomea) Dunaliella (cloroficea) Chlorella (cloroficea) Tetraselmis (cloroficea) Monochrysis (crisoficea) Isochrysis (crisoficea)

CICLO 10 h

13.1 h 18C 24 h 7.7 h 18 h 16C 25C 18C

15.3 h 2025C 30.2 h 20C

Estas especies se han utilizado en acuicultura marina dados su valor nutritivo y digestibilidad, adems de su capacidad para crecer en cultivos masivos. La duracin del ciclo celular como los requerimientos de temperatura son susceptibles de variacin mediante seleccin de variedades.

TABLA N 2 Requerimientos PRINCIPALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS

REQUERIMIENTOS Fsicos Luz Temperatura Salinidad pH Redox Nutritivos C O, H N P S

COMPUESTOS QUIMICOS

VALORES 2,000 4,000 lux 15 22C 0.37 79

CO2CO3 O2H2O N2NH4+ NO3 PO4 SO4

g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml mg/100 ml g/100 ml g/100 ml

Na, K, Ca, Mg Sales Fe, Zn, Mn, B, Br, Si Sales Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Sales Al, et B12, tiamina, Vitaminas biotina

En esta tabla N 1 se exponen los requerimientos principales de los cultivos de microalgas y sus valores aproximados. En cada caso habr que estudiar los requerimientos particulares de la especie y de la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar, por lo que estos datos son slo orientacin (Kinne, 1979). En la tabla N 2 se muestran las caractersticas de algunas de las especies de microalgas unicelulares utilizadas en acuacultura para la nutricin de moluscos y crustceos.

Adems del control de los parmetros antes mencionados es necesario considerar que para el establecimiento de un sistema de produccin de alimento vivo es importante el dominio de las tcnicas de aislamiento, purificacin y mantenimiento de cepas, as como el conocimiento de la fisiologa, ciclo de vida, bioqumica, etc. de las especies para determinar su factibilidad de cultivo y sobre todo su contenido nutricional para poder llevarse a niveles masivos de produccin para fines acuaculturales. La Tabla 8 muestra algunos de los principales requerimientos de los cultivos de microalgas. 2. MEDIOS DE CULTIVO Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las frmulas para enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales que permitan resultados constantes en contraste con los resultados tan variables que brinda el uso del agua de mar natural que entre otros factores depende del lugar donde se colecta sta, y el tiempo de almacenamiento de la misma. Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se ha mencionado, brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento, las principales frmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen-Nelson; el medio de EndSchereiber de 1934, hasta frmulas especficas para familias como la frmula del Laboratorio Haskins de Nueva York para diatomeas, Provasoli et al., 1975; Matthiesen & Thorner, 1966; McIachlan, 1973; Guillard F., 1973; Droop, 1975, 1979; Schoene, 1982, etc. Las principales formulaciones de los medios de cultivo, tanto de mantenimiento de cepas como de produccin masiva (minerales, enriquecidos y orgnicos), se describen desde la Tabla 9 hasta la Tabla 16. El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relacin de las condiciones fisicoqumicas del medio. En trminos generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento el carbono, Nitrgeno, Fsforo, Silicio,

Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en cantidades relativamente grandes, mientras que los llamados micronutrientes (Fierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores cantidades. Existen otros medios que incluyen en su composicin sustancias orgnicas (vitaminas, aminocidos) necesarios para aquellas especies de microalgas Auxtrofas, es decir que no sintetizan por medio de la fotosntesis este tipo de compuestos y resultan factores que pueden limitar su crecimiento; tal es el caso de Platimonas, Chrysophytas y algunas Bacillariophyceas. 3. TECNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION Muchos mtodos se han desarrollado para obtener cultivos monoespecficos (de una sola especie) y axnicos (libres de contaminantes). A continuacin se brinda una breve descripcin de algunos de los principales mtodos que se utilizan para aislar y purificar microalgas (O. Umebayashi, 1975) (Fig. 1). 1) Aislamiento Pipeteo capilar: Se utiliza para separar microalgas mayores de 10, mediante una pipeta construda con un tubo capilar, a travs del microscopio ptico se pesca las clulas y se separan en pequeas gotas de nutrientes colocados alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escabados. Rayado de Placas de Agar: Se transfieren pequeas gotas de plancton con una asa de siembra, extendiendo por estras (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara con una solucin nutritiva para microalgas y con una relacin de 11.5% w/v de agar disuelto en el medio nutritivo, se incuba la placa bajo iluminacin a 1820. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado sembrando por estras o bien, se transfiere a medios lquidos en subcultivos sucesivos para su purificacin, de tal manera que en cada dilucin se reduzca el nmero de organismos en una gota, es recomendable combinar la tcnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tubo inclinado

para obtener cultivos clonales (de una sola colonia o clula) y poder establecer el cultivo monoespecfico. Despus de 10 das, pequeas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que se pueden transferir mediante el Mtodo de Hocking o de la micropipeta a medios lquidos. 2) Purificacin Como ya se mencion al describir las tcnicas de aislamiento, estas mismas nos permiten purificar el cultivo a travs de las resiembras clonales sucesivas, pero adems es recomendable entre otros mtodos el uso de antibiticos para eliminar otros microorganismos, generalmente de tipo bacteriano que estn contaminando el cultivo de microalgas de nuestro inters. En el inciso 5 de este mismo captulo correspondiente a Mtodos de Esterilizacin se amplian las alternativas.