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PRCTICA 2

CUANTIFICACIN DE AMINOACIDOS (MTODO DE NINHIDRINA)

INTRODUCCIN

Hace muchos aos, Ruhemann demostr que los aminocidos y la ninhidrina reaccionan con gran sensibilidad para dar un compuesto prpura, ahora conocido como prpura de Ruhemann. El ensayo se basa en la reaccin con ninhidrina del grupo amino de aminocidos libres y de los grupos amino de la molcula protenica. Este proceso transcurre en varias etapas. En un principio, como resultado de la interaccin del aminocido con la ninhidrina se forma una base de Schiff. Luego sta sufre un reagrupamiento, se descarboxla y se descompone en aldehdo y aminodicetohidrindeno como se observa en la siguiente figura:

El aminodicetohidrindeno se condensa con otra molcula de ninhidrina ms y el compuesto formado, al enolizar, toma un color violeta azul. Esta reaccin se verifica segn el esquema siguiente:

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En presencia de disolventes orgnicos (acetona, etanol etc.) en los cuales se prepara la disolucin de ninhidrina, la reaccin transcurre del modo siguiente:

El producto de esta reaccin contiene en su composicin el radical R- del aminocido inicial que provoca diferentes coloraciones (azul claro, violeta, roja y amarilla) en los compuestos que surgen en la reaccin entre los aminocidos y la ninhidrina. Aunque los aminocidos forman el prpura de Ruhemann bajo condiciones apropiadas (pH cercano a 5.0), los aminocidos prolina e hidroxiprolina dan solamente un producto amarillo-caf.

OBJETIVO Cuantificar el contenido de aminocidos libres de una muestra problema por el mtodo de ninhidrina. Analizar las caractersticas fisicoqumicas de los aminocidos y los fundamentos qumicos en los que se basa la cuantificacin de aminocidos por el mtodo de ninhidrina.

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Material
10 tubos de ensayo de 15 X 100 mm 3 pipetas de 1 ml y 3 de 5 ml 1 espectrofotmetro 1 gradilla 1 parrilla elctrica 2 vasos de precipitados de 250 ml 1 piseta con agua destilada 1 vaso de precipitados de 500 ml o vaso metlico

Reactivos
Muestra problema de aminocidos. Patrn de Leucina 100 g/ml. Reactivo de Ninhidrina 2% en metilcelosolve.

MTODO

1. Prepare los tubos con las soluciones indicadas segn la siguiente tabla. Utilice como muestra problema el extracto acuoso separado en la prctica 1 seccin A:

REACTIVO ( ml ) Patrn de Leucina 100 g/ml Agua destilada Muestra problema Reactivo de Ninhidrina 2%

Blanco 1.0 1.0

1 0.1 0.9 1.0

2 0.2 0.8 1.0

3 0.3 0.7 1.0

TUBO 4 5 0.4 0.5 0.6 0.5 1.0 1.0

6 0.6 0.4 1.0

7 0.9 0.1 1.0

8 0.9 0.01 1.0

2. Mezcle suavemente los tubos y tpelos con papel aluminio.

3. Incbelos en bao Mara a ebullicin durante 15 minutos. Transcurrido el tiempo enfrelos sumergiendo los tubos en un poco de agua fra cuidando que no se contaminen con el agua.

4. Agregue a cada tubo 5 ml de etanol al 50 % a cada tubo y agite.

5. Obtenga en el espectrofotmetro la A570 de las mezclas de la curva patrn y de los problemas (Tubo 7 y 8), calibrando con el contenido del tubo 1 (blanco de reactivos). 6. Con los resultados construya una curva patrn graficando g de protena vs absorbancia, en ella interpole el valor de absorbancia del tubo problema para determinar: la concentracin de aminocidos en 0.1 y 0.01 ml de la muestra y

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la concentracin total de aminocidos de la muestra problema en mg por gramo de tejido.

CUESTIONARIO

1.- Puede considerarse que un solo aminocido ya sea polar, no polar, bsico o cido, reacciona siempre solo con dos molculas de ninhidrina? Siempre se mantiene esta relacin estequiomtrica?

2.- Pueden reaccionar con las molculas de ninhidrina los grupos amino libres presentes en las cadenas laterales de Lisina, Glicina, Asparagina y Glutamina?

BIBLIOGRAFA Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitative of microquantities of protein. Anual Biochem. 72 248.

Chechetkin A.V.; Voronianski, V.I.; Pokusay, G.G. 1984. Prcticas de Bioqumica del ganado y aves de corral. Editorial Mir, Mosc.

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Reactivos Prctica 2 Solucin Patrn de Leucina 100 g/ml. Pesar 10 mg (0.01 g) de leucina disolver en un poco de agua destilada y aforar a 200 ml. Almacenar en frasco mbar en refrigeracin.

Reactivo de ninhidrina 2 % en metilcelosolve Disolver 5 g de ninhidrina en 187.5 ml de metilcelosolve (etilenglicol monometil eter) agitando suavemente, aforar a 250 ml con amortiguador de acetato de sodio 4M pH 5.5. Almacenar en frasco mbar en refrigeracin. Para preparar el amortiguador de acetato 4M pH 5.5 se disuelven 272 g de acetato de sodio en 300 ml de agua destilada calentando. Enfriar a 25C y agregar 50 ml de cido actico. Ajustar el pH a 5.5 con HCl o KOH. Aforar a 500 ml con agua destilada. Almacenar en refrigeracin.
Nota: El reactivo no dura ms de 5 horas a temperatura ambiente, por lo que debe mantenerse en refrigeracin siempre, en estas condiciones se mantiene til por un mes. De preferencia debe prepararse fresco justo antes de usarse.

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