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PRCTICAS

BIOLOGA MOLECULAR

PRCTICA N 1

EXTRACCIN E IDENTIFICACIN DEL ADN


INTRODUCCIN Los cidos nucleicos son macromolculas de carcter polinucleotdico, encontrados en los seres vivos y que cumplen funciones muy. Importantes de almacenamiento de la informacin gentica, participan tambin en la expresin de dicha informacin. En la naturaleza existen dos tipos de cidos nucleicos, el acido desoxirribonucleico (DNA) y el cido ribonucleico (RNA).

El DNA es el responsable de la transmisin de los caracteres hereditarios. El DNA esta formado por dos cadenas polinucleotidicas, enrrolladas en espiral a lo largo de un eje comn. Las dos cadenas de la doble hlice corren en direcciones opuestas. El esqueleto azcar fosfato de cada una de las cadenas se encuentra hacia el exterior de la doble hlice y las bases nitrogenadas estn en el interior. Las dos cadenas estn unidas por puentes de hidrgeno establecidos entre las bases, se constituyen dos puentes de hidrgeno entre los pares A-T y tres puentes de hidrgeno entre los pares G-C.

La adenina siempre se unir a la timina y la guanina siempre se unir con la citosina. Los puentes de hidrgeno pueden romperse por el calor y por agentes qumicos, obtenindose un DNA desnaturalizado. El aislamiento y purificacin del DNA se puede realizar aprovechando la longitud de onda de 260 nm ya que las bases nitrogenadas absorben luz a esta longitud de onda.

En la siguiente figura se muestra la estructura del ADN propuesto segn el modelo de Watson y Crick en 1953

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SURCO MAYOR

H O

OH

A
P
A G T T C
H O

T
H O

SURCO MENOR

3.4 nm
A

G
H O

C
O H

C
P
O H

G
O H

T
OH H

A
O

2.0 nm FIGURA.- Modelo de la estructura del DNA segn Watson y Crick

Dentro de las propiedades fisicoqumicas de los cidos nucleicos, que permiten su identificacin, destacan:

La Absorcin de luz: La presencia de Bases Nitrogenadas permiten una absorcin en el espectro UV con un pico mximo a 260 nm de longitud de onda.

Propiedades Acido-bsicas: En solucin acuosa los grupos fosfato liberaran H+, lo cual determina un pH acido del medio y una carga negativa de los radicales fosfato, los cuales dentro de la clula conforman complejos con iones Mg, histonas, poliaminas, etc. Las bases Nitrogenadas tienen grupos ionizables y en el caso del DNA en la doble hlice algunos de los grupos ionizable participan en la conformacin de enlaces de hidrogeno entre las bases. El DNA es estable gracias a estos enlaces entre los pH 4 a 11. Propiedades de solubilidad: Tanto el DNA como el RNA son solubles en

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soluciones salinas diluidas, por ejemplo cloruro de sodio 0,015M. El DNA cuando se encuentra en forma de complejos unidos a nucleoprotenas tambin es soluble en rangos de NaCI 1 a 2M, mientras que las protenas se desnaturalizan a concentraciones altas de sal, lo cual permitir la separacin en el proceso de extraccin de los cidos nucleicos. Las nucleoprotenas son insolubles a 0,14M de concentracin de NaCI.

El alcohol etlico precipita tanto el DNA como el RNA, en tanto que el isopropanol precipita selectivamente al DNA.

Viscosidad: El DNA tiene estructura fibrilar, la doble hlice es rgida o inmensamente larga en relacin a su dimetro, debido a ello las soluciones del DNA son altamente viscosas. El proceso de desnaturalizacin se suele observar por la perdida de viscosidad. Desnaturalizacin del DNA: El proceso de desnaturalizacin consiste en la separacin de las dos cadenas por rompimiento principalmente de los enlaces hidrogeno que unen las bases complementarias y los otros tipos de uniones que mantienen unidas a los pares de bases, dicha separacin puede ser completa o parcial. Dentro de los agentes que son desnaturalizantes estn pH muy acido o muy alcalino, calor, detergentes, soluciones de baja fuerza inica, tratamiento del DNA con urea y diversas amidas, etc.

Extraccin de cidos nucleicos Dentro de los agentes extractores de las nucleoprotenas se incluyen: el agua, alcoholes diluidos, soluciones de NaCI y buffers de rango de 4 a 11 de pH. En cada caso, la extraccin es seguida de precipitacin por sulfato de amonio saturado, cloruro de calcio diluido, los cidos nucleicos pueden ser obtenidos por digestin de las protenas con animas proteolticos o por remocin de las

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protenas por desnaturalizacin. Sin embargo esta ltima puede alterar los cidos nucleicos. Los iones divalentes como el Mg++, activan a la DNasa, por tal motivo se emplea el citrato para evitar la hidrlisis enzimtico y pH 8 el cual es incompatible con su actividad biolgica

El SDS acta sobre las protenas por tanto desnaturaliza a la DNasa, acta tambin sobre los lpidos disminuyendo su tensin superficial y permitiendo su solubilizacin.

Objetivos

1. 2. 3.

Obtencin del DNA usando como fuente, timo de ternera Identificacin del componente desoxirribosa del DNA: Reaccin de Dische Desnaturalizacin del DNA: Observacin del efecto hipercrmico

Procedimiento

1.- Aislamiento del DNA 1.1.- Los tejidos machacados, son primero lavados con NaCI 0.15M, para remover sustancias citoplasmticas. 1.2.- Luego homogenizar 2 g aprox. de timo de ternera con 25 mi de solucin salina 0.15M mas EDTA 0.1M. pH 8.0, empleando un mortero, licuadora o mixer. 1.3.- Transferir el contenido anterior a una probeta de 100 ml con tapa esmerilada y agregar 2 ml de SDS al 25%, mezclar. 1.4.- Colocar en bao Mara a 60 C durante 10 minutos. 1.5.- Aadir 6,3 ml de una solucin de NaCI 5M para obtener una concentracin final de 1M. 1.6.- Aadir una mixtura de cloroformo-alcohol isoamilico (24:1) v/v en un volumen

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igual al obtenido hasta la etapa anterior. 1.7.- Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos, de preferencia en una centrifuga refrigerada. 1.8.- Separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar desnaturalizar los cidos nucleicos. 1.9.- Precipitar el DNA del sobrenadante con dos volmenes de alcohol etlico al 95%, mezclar con varilla de vidrio, tratando de enrollar el DNA. 1.10.- Colocar la varilla de vidrio con el DNA enrollado y disolver en 10 ml de solucin salina de NaCI 0,015M - citrato 0,0015M.

2.

Identificacin de Desoxirribosa : Reaccin de Dische

2.1.

Tomar 2 tubos de prueba y marcarlos de la siguiente manera :

X (Solucin de DNA obtenido en la prctica) y C (Control)


2.2.

En cada tubo medir lo siguiente :

C Solucin de DNA obtenido en la prctica Agua destilada Reactivo difenilamina en solucin cida
2.3.

X 2,0 ml

2,0 ml 4,0 ml 4,0 ml

Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en bao hirviente durante 10 Enfriar en bao de agua corriente por unos minutos. La presencia de

min.
2.4.

desoxirribosa se revela por la aparicin de un color azul

3.

Desnaturalizacin del DNA Diversos agentes externos, como el calentamiento, la disminucin de la

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constante dielctrica del medio, pHs extremos menores de 4 y superiores de 11, reactivos como la urea y la formamida pueden debilitar dichas fuerzas y rompen los puentes de hidrgeno lo que origina que las dos cadenas se desenrollen y se separen proceso conocido como desnaturalizacin del DNA

FIGURA.- Esquema para explicar el proceso de desnaturalizacin del DNA

CALOR

DNA NATIVO

DESNATURALIZACIN PARCIAL

DESNATURALIZACIN TOTAL

Procedimiento Medir en un tubo 5 ml de la solucin del DNA obtenida en la prctica. Colocar el tubo en bao hirviente durante 15 min., enfriar. Medir la absorbancia de la muestra en el espectrofotmetro a 260 nm.

Si la solucin del DNA desnaturalizada es muy concentrada, diluirla con solucin salina citrato y determinar nuevamente la absorbancia. Comparar la

absorbancia obtenida, con la absorbancia de la solucin del DNA (nativo) obtenida en la prctica. Realizando los pasos sealados anteriormente, en una prctica similar a la presente, se obtuvieron los siguientes resultados:

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Longitud de onda en Absorbancia del DNA nm 320 310 300 290 280 270 260 250 240 230 nativo 0,005 0,019 0,025 0,062 0,135 0,205 0,283 0,235 0,175 0,140

Absorbancia del DNA desnaturalizado 0,020 0,026 0,038 0,125 0,335 0,520 0,650 0,600 0,420 0,350

En el siguiente espacio coloque el grfico obtenido con los resultados anteriores, colocando en el eje de las ordenadas las ABSORBANCIAS y en el de abscisas las LONGITUDES DE ONDA tanto para el DNA nativo como para el desnaturalizado en el mismo grfico.

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Interrogantes 1.- Exponer los aspectos fundamentales de la estructura del DNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2.- Que otros tejidos podran ser utilizados para aislar DNA en la presente prctica. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 3.- A que se denomina efecto Hipercrmico del DNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 4.- Qu relacin tiene el Tm con la estructura del DNA _______________________________________________________________

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_______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 5.- Qu importancia tiene el estudio espectrofotomtrico en el proceso de extraccin del DNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 6.- Cmo podemos aseguramos que tenemos un DNA puro, exento de protena y de RNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 7.- Se puede identificar grupos fosfato en los cidos nucleicos, cmo procederamos _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 8.- Qu caractersticas del alcohol etlico y el alcohol isoproplico, permiten la precipitacin selectiva de DNA y de RNA. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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9.- Qu propiedades fisicoqumicas se tomaron en cuenta para el aislamiento de DNA _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 10.- Qu ventajas tiene el emplear clulas de timo para aislar y estudiar el DNA. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 11.- Qu variaciones realizara si tiene que extraer DNA de: mitocondria, de plantas, de levaduras _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 12.- Qu importancia cree Ud. que tiene el hecho de que en el DNA las bases queden en el interior de la doble hlice? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 13.- Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de la DNAasa II _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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Terminologa: DNA: cido desoxirribonucleico RNA: cido ribonucleico EDTA: Etilen diamino tetra-actico, quelante de iones divalentes. SDS: Dodecl sulfato de sodio (Lauril sulfato de sodio), detergente aninico. DNasa: Nucleasa especifica en la hidrlisis de DNA

PRACTICA N 2

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA


INTRODUCCIN A mediados de la dcada de los 80', investigadores de la Corporacin Cetus de California, EEUU, idearon un nuevo procedimiento de amplificacin

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gnica que tena ventaja sobre la tecnologa del DNA recombinante. Para este procedimiento se acuo la denominacin de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction) o simplemente PCR, en ingles, en vista que consiste en (1) la separacin de las 2 cadenas de DNA, (2) el flaquear con "primers" adecuados el gen que se quiere amplificar y (3) permitir que la DNA polimerasa haga la copia de ambas cadenas. La repeticin sucesiva de estas etapas posibilita que en corto tiempo (pocas horas), se puedan obtener importantes amplificaciones del gen (varios millones). Una de las principales dificultades que tuvo este mtodo cuando fue inicialmente introducido resulto ser el tener que aadir la enzima polimerizante en cada ciclo, ya que al aumentar la temperatura de la preparacin para obtener la separacin de las dos cadenas de DNA inactivaba la enzima. Este inconveniente fue superado con el uso de la DNA polimerasa de un organismo que normalmente vive a temperaturas elevadas (Thermus aquaticus) y por lo tanto no es inactivado a la temperatura usada para separar ambas cadenas de DNA. Junto a introduccin de esta enzima termoestable, denominada Taq-polimerasa y que determine que la enzima solo se aada una vez, se han diseado aparatos (denominados termocicladores) que han automatizado los cambios de temperatura y los tiempos de incubacin requeridos para este procedimiento Las ventajas ms importantes que la PCR tiene sobre la tecnologa del DNA recombinante, son: a.- En menos tiempo se consiguen mayores amplificaciones. En solo 4 horas se pueden obtener aproximadamente un milln de copias, en tanto que con la tecnologa del DNA recombinante se requieren varios das. b. Dispensa la necesidad de usar plsmidos, bacterias, istopos radioactivos, etc. c. No se requiere que el DNA a amplificar se encuentre extensamente purificado y de otro lado se puede partir de mnimas cantidades de DNA, tericamente hasta de una molcula d. Se puede usar muestras de DNA que han estado expuestas por mucho tiempo (siglos medio ambiente, incluso fragmentadas.

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Cuarto ciclo Tercer ciclo Sgundo ciclo AMPLIFICACIN EXPONENCIAL Primer ciclo

35 ciclos
235 copias = 34000 millones copias

21 copias 22 copias 23 copias 24 copias

PARTE EXPERIMENTAL AMPLIFICACIN IN VITRO DEL DNA MEDIANTE LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA USANDO TAQ-POLIMERASA Y DNA POLIMERASA I (fragmento Klenow). Procedimiento: 1. Se ha aislado el DNA de blstula de erizo de mar usando el protocolo descrito en la prctica respectiva. En un tubo de minifuga (Ependorf) se midi lo siguiente: - Agua destilada - Buffer de amplificacin 10X - Mixtura de los 4 dNTPs a la concentracin de 200 uM 30 ul 10 ul (*) 16ul

- Primer 1 (en 5 ul de H2O) - Primer 2 (en 5 ul de H2O) - DNA de blstula ( 2ug)

100 pmoles 100 pmoles

- Agua destilada hasta completar un volumen fina! de 100ul

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(*) El buffer de amplificacin contiene KCl 500 mM, Tris-HCl pH 8.3 100 mM,MgCl2 15mM 2. Calentar la preparacin por 5 minutos a 94C por 5 minutos 3. Estando la mixtura a 94C se aade 0.5 ul de Taq polimerasa (5 unidades/ml) Medir encima de la mixtura de reaccin 100 ul de aceite mineral. 4. Programar las variaciones de temperatura de la siguiente manera: a) Primer ciclo: 5 minutos a 94C, luego 2 minutos a 50C y posteriormente 3 minutos a 72C. b) Siguientes ciclos: 1 minuto a 94C, luego 2 minutos a 50C y posteriormente 3 minutos a 72 C. c) ltimo ciclo: 1 minuto a 94C, luego 2 minutos a 50 C y posteriormente 10 minutos a 72 C 5. Para la amplificacin usando el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I, se procedi de una manera similar, con las siguientes modificaciones. El pH del tampn de amplificacin es de 7.6, la concentracin de los dNTP es de 125 mM. Para la amplificacin se programaron las siguientes variaciones de temperatura: 5 minutos a 94 luego 2 minutos a 37C, posteriormente se agrega el fragmento Klenow (1 unidad por cada ciclo) y luego se incuba por otros 2 minutos a 37 C., siendo necesario e! aadido de la polimerasa en cada ciclo. 6. Luego de completados los ciclos de amplificacin, se precipita el DNA con el aadido de dos volmenes de etanol fro, se centrifuga y se descarta el sobrenadante. El precipitado se suspende en 100 ul de buffer Tris-EDTA pH 8 7. Usando 5ul de cada muestra se practic la electroforesis en geles de agarosa al 1%. Concluido el tiempo de corrida se tie el gel con bromuro de etidio y se tom la fotografa del mismo, bajo luz ultravioleta, obtenindose los resudados que se muestran en la figura siguiente:

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C4 C3 C2

C1
1.35 Origen 0.603 0.194 0.118

En la canaleta 1 del gel se puso un marcador de pesos moleculares consistente en el ADN del fago X174 cortado con Hae III. En la canaleta 2 se puso luego de 35 ciclos de amplificacin usando el fragmento Klenow. En la canaleta 3 se puso el DNA amplificado por la Taq-Polimerasa luego de 25 ciclos. En la canaleta 4 se puso el DNA amplificado por la Taq-Polimerasa luego de 35 ciclos. CUESTIONARIO 1. Qu significa un buffer de amplificacin 10X? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 2. Qu objeto tiene el aadir aceite mineral al tubo de minifuga en donde se hace la de amplificacin en la PCR? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 3. Justifique las diferencias que en cuanto a las variaciones de temperatura se hacen se usa taq-polimerasa y cuando se usa el fragmento de Klenow? _________________________________________________________________

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_________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 4. Qu es el fragmento de Klenow? Qu actividades enzimticas tiene? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 5. Justifique las diferencias que en cuanto al pH del tampn y a la concentracin de nucletidos que se hace cuando se utiliza en la amplificacin con la Taqpolimerasa y el fragmento Klenow. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 6. En cuanto a la fidelidad de la copia, qu diferencia existe entre la Taqpolimerasa y la polimerasa de Konberg? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 7. Qu fuentes de Taq-Polimerasa conoce? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 8. Por qu se tiene que aadir el fragmento Klenow en cada ciclo de amplificacin? _________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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9. En la electroforesis del DNA amplificada usando fragmento Klenow se observan varias bandas, a diferencia del DNA amplificado con la Taq-polimerasa en donde slo se observan una banda. Qu explicacin tiene esto? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 10. Estime el porcentaje de fragmentos amplificadas por PCR que tienen un tamao delimitado por los primeros 3 ciclos de amplificacin. Justifique su respuesta hacer esquema correspondiente a los 3 ciclos de amplificacin.

BIBLIOGRAFA 1. AQUINO, J y ZEGARRA, F. Fundamentos de Biologa Molecular. 2010 2. EHRLICH H. PCR Technology. Oxford University Press 1992. 3. SAMBROOK J. FRITSCH E.F. and MANIATIS T. Molecular Cloning. A Lobaratory Manual CSH. II Ed. 1989

PRACTICA SEMINARIO N 3

MANEJO DE PLSMIDOS
INTRODUCCIN Uno de los vectores ms comnmente usados para la amplificacin de fragmentos de DNA, en el curso de la manipulacin gentica, son los plsmidos.

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Estos vehculos de clonaje son molculas circulares de DNA de doble hebra, que se encuentran en una variedad de especies bacterianas y que se replican independientemente del DNA genmico. Los plsmidos usados corrientemente en ingeniera gentica tienen algunas caractersticas que se aprovechan ventajosamente como un origen de replicacin, capacidad de mantenerse en un alto nmero de copias por clula bacteriana, contener un gran nmero de sitios (palndromos) para ser cortados por diferentes enzimas de restriccin y contener genes que confieren fenotipos que hacen posible la seleccin de las bacterias que han incorporado el plsmido. En el laboratorio, los plsmidos pueden ser introducidos a las bacterias utilizando procedimientos que hacen temporalmente permeables a las bacterias a estos crculos de DNA. En la mayora de casos la replicacin del DNA plasmdico es realizada por el mismo grupo de enzimas encargadas de la replicacin del DNA cromosmico. Con frecuencia se encuentra un nmero de copias del plsmido que oscila entre 10 a 200; pero puede ser incrementado a varios miles si la sntesis de protenas en el hospedero es detenida. Uno de los plsmidos vectores de mayor empleo es el pBR322, que contiene un gen que confiere resistencia a la ampicilina y otro a la tetraciclina y un nmero importante de sitios R1 Eco nicos para diversas enzimas de restriccin, como Ava I, Pst I, Bam H1, Pvu II, Cla I, Sal I, Eco R1 y HindHind III III (Figura 1). El tamao de este plsmido es de 4.3 kb y desde 1979 se conoce completamente su secuencia nucleotdica. Hind II Gen de resistencia a ampicilina Bam H1 Gen de resistencia a tetraciclina Hind II Pst I Sal I

ORI

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Pvu II

Figura 1.- Mapa de restriccin del plsmido pBR322

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OBJETIVO (PROBLEMA) El problema del presente seminario es clonar los genes de actina de erizo de mar (Strogilocentrotus purpuratus). METODOLOGA 1. Purificacin del DNA Se utilizaron embriones (estadio de blstula) de S. Purpuratus y se procedi al aislamiento del DNA en la forma indicada en el Protocolo de la Prctica Seminario Caracterizacin de Fragmentos de DNA- El DNA obtenido fue suspendido en 2 ml de una solucin de Tris-HCI 10mM pH 7.4 y EDTA 0.1 mM. Para verificar la pureza del DNA obtenido, se midi la absorbancia a 260 nm. y 280nm en una dilucin de esta solucin, obtenindose las siguientes lecturas, 0.420 y 0.315, respectivamente. Podemos decir que este DNA est suficientemente purificado?. Justifique su respuesta. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Recuerde que es necesaria una buena purificacin del DNA para que las enzimas de restriccin puedan cortar. Qu se puede hacer ahora para superar este problema?

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_________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 2. Estimativa de la cantidad de DNA obtenida Habiendo verificado que ahora nuestra muestra de DNA est suficientemente purificada, debemos estimar cuanto DNA se obtuvo. Para esto, tengamos en cuenta que una solucin de DNA de doble hebra, que est a una concentracin de 50 ug/ml, tiene una absorbancia de 1. Con ese fin, a 10 ul de la solucin sealada de DNA se aadi 990 ul de agua destilada y al medir su absorbancia a 260 nm dio una lectura de 0.760. Cul es la cantidad total de DNA purificado? (Clculos)

Respuesta____________ 3. Tratamiento del DNA con la enzima de restriccin Para la construccin de la biblioteca genmica debemos cortar el DNA con la enzima de restriccin, para despus construir las molculas de DNA recombinante utilizando el plsmido pBR322. Qu enzima elegimos? Junto al nombre de cada enzima de restriccin de la siguiente lista, indique si la usara o no, justificando en cada caso su respuesta. EcoR1 _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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Hind II _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ PvulI _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Pst I _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Bgl II _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Hind III _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Hae I _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Bam H1 _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Sal I _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ La enzima de eleccin es ______________________________________ Qu enzima elegira para cortar el plsmido? Justifique su respuesta. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 4. Eliminacin de los fragmentos pequeos (menores a 2.8 kb., por ejemplo)

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Se hizo mediante la centrifugacin en gradiente neutra de sacarosa (16-43%) Qu sentido tiene esta etapa? ________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ 5. Unin de los fragmentos de DNA al plsmido La enzima utilizada para este proceso, es ________________________________ 6. Ingreso de las molculas de DNA recombinante a la bacteria y la transformacin de esta. Mandel e Higa en 1970 demostraron que la captacin del bacterifago lambda aumentaba considerablemente si las bacterias se trataban con cloruro de calcio Cohn y col. pudieron demostrar ms tarde que este procedimiento tambin funcionaba con los plsmidos. Con todo, debemos tener en cuenta que slo una proporcin muy pequea de bacterias, son competentes para incorporar el plsmido (aproximadamente una por cada 10000). Una vez que el plsmido ingres a la bacteria, se replica y expresa los marcadores de la resistencia a los antibiticos y es lo que permite a la clula transformada sobrevivir en presencia del antibitico. Cmo reconocemos a las bacterias que no recibieron el plsmido? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Cmo reconocemos a las bacterias que recibieron el plsmido, pero sin el inserto? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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Cmo reconocemos a las bacterias que recibieron el plsmido conteniendo inserto? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Haga las grficas de las placas de cultivo correspondientes:

7. Hibridacin "in situ" de las colonias bacterianas Una vez que se han seleccionado las colonias de bacterias que contienen el plsmido con el inserto, se debe hacer la identificacin de aquellas que contienen el inserto que nos interesa, en este caso los genes de actina. El procedimiento general que se sigue para conseguir este objetivo, consiste bsicamente en la transferencia de las bacterias de la placa de cultivo a un filtro de nitrocelulosa (Millipore HAWP). Las colonias presentes en el papel

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filtro son lisadas y el DNA liberado es fijado al papel filtro mediante calor. Despus se hace la hibridizacin a una prueba (sonda) marcada con P-32. La deteccin de las colonias que hibridizaron se hizo mediante autorradiografa del filtro de nitrocelulosa expuesto a la prueba radioactiva y la comparacin de la posicin de las manchas con la correspondiente a las colonias de la placa madre. De las aproximadamente 8000 colonias estudiadas, seis dieron una significativa reaccin con la prueba que se utiliz. La prueba correspondi a un fragmento de DNA de Drosophila melanogaster de 1.8 kb, conteniendo una secuencia de 1.1 kb que codificaba para actina y otra de 0.7 kb que no codificaba para actina. Este fragmento estaba insertado en un vector, resultando el plsmido quimrico pDmA2. Las colonias seleccionadas de este modo fueron cultivadas para posteriormente pasar al aislamiento del DNA plasmdico. Si se revisan los protocolos comnmente usados para la hibridizacin, constataremos que se hace a temperatura elevada (68 C por ejemplo) y la prueba es previamente calentada a 100C por 5 minutos. Cul es la razn?__________________________________________________ _________________________________________________________________ 8. Aislamiento del DNA plasmdico Se hace utilizando varios procedimientos, que en general incluyen 3 etapas bsicas: - Detencin de la proliferacin. - Lisis de las bacterias hospederas. - Purificacin del DNA plasmdico. Estos procedimientos aprovechan de alguna manera las dos diferencias ms importantes que existen entre el DNA de la bacteria (E. coli) y el DNA plasmdico, es decir, que el DNA de la bacteria es mucho ms grande que el DNA del plsmido comnmente usado como vector y que el DNA que se retira de E.

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coli corresponde a molculas lineales fraccionadas; en cambio el DNA plasmdico es retirado generalmente bajo la forma de un crculo cerrado covalentemente. El procedimiento utilizado consisti bsicamente en lo siguiente: - Las bacterias contenidas en 500 ml de medio de cultivo, fueron colectadas por centrifugacin a 4000 g. por 10 min. a 4 C. El precipitado fue suspendido en 100 ml de tampn Tris-HCI 10 mM pH 8.0, conteniendo NaCl 0.1M y EDTA 1 mM y colectadas nuevamente por centrifugacin, como se seal antes. - El precipitado bacteriano obtenido fue resuspendido en 10 ml. de tampn STET (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, NaCl 0.1M, EDTA 1mM y tritn X-100 al 5%) y transferida esta solucin a un Erlenmeyer de 50 ml. - A esta solucin se aadi 1 ml. de solucin de lisozima (10 mg/ml). Se llev la preparacin al fuego de un mechero Bunsen, agitando constantemente hasta que comenz a hervir. Luego se pas inmediatamente el Erlenmeyer a un bao mara hirviente y se le dej all por 40 seg. - Enseguida se enfri el frasco en bao de hielo, durante 5 min. El contenido viscoso del frasco fue transferido a un tubo de ultracentrfuga y se centrifug por 30 minutos a 30000 rpm y se colect el sobrenadante. Justificar el rol del tritn x-100, de la lisozima y del tratamiento por ebullicin de la preparacin. a) Del tritn x-100___________________________________________________ _________________________________________________________________ b) De la lisozima ____________________________________________________ _________________________________________________________________ c) De la ebullicin ___________________________________________________ _________________________________________________________________

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La purificacin del DNA plasmdico se realiz mediante el mtodo de centrifugacin en gradiente de densidad de cloruro de cesio. Con este fin se aadi a la solucin anterior 1g de CsCl hasta lograr su disolucin. Se aadi luego 0.8 ml de una solucin de bromuro de etidio (10 mg/ml) por cada 10 ml de solucin y se mezcl. La densidad final de la solucin result de 1.556 g/ml. En cuanto a la preparacin de esta gradiente, qu diferencia importante encuentra con respecto a la gradiente de sacarosa vista anteriormente? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Por qu se utiliz bromuro de etidio? Qu precauciones debe tenerse en cuanto a su uso? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Se centrifug la solucin por 5 minutos a 8000 rpm a temperatura ambiente. Al detener la centrfuga se constat en la parte superior la presencia de una capa rosada. Con una pipeta Pasteur de punta fina se retir el lquido que se encontraba debajo de esta capa, se le pas a otro tubo de ultracentrfuga y se le centrifugo a 45000 rpm por 16 horas. Al detener la ultracentrfuga se observ en el tubo tres capas de color rosado y precipitado del mismo color (Ver esquema). A qu corresponde cada capa?

a b c d

a) ______________________________ b) ______________________________

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c) ______________________________ d) ______________________________

La coleccin se hizo siguiendo el esquema mostrado en la figura siguiente:

9. Anlisis de los fragmentos de DNA conteniendo secuencias de genes de actina. Se aisl el DNA plasmdico segn el procedimiento descrito, utilizando dos de las seis colonias que se haban cultivado y que dieron positividad con la prueba. Ambos DNA fueron cortados con Hind III y los fragmentos resultantes analizados mediante electroforesis en agarosa al 1%. Paralelamente se corri en el mismo gel el DNA del fago lambda digerido con Hind III. Cumplido el tiempo de la corrida se tio el gel con bromuro de etidio y se tom la fotografa del mismo bajo luz ultravioleta. El diagrama que se muestra a continuacin es una

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reproduccin a escala de dicha fotografa.

C2

C1

23 Origen

9.5

6.4

4.2

2.2 1.8

INTERROGANTES Cmo se explica que en ambas canaletas se detecte un fragmento del mismo tamao? A qu correspondera? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Cul es el tamao de los fragmentos presentes en el gel? _________________________________________________________________ Se podra decir que corresponden a genes de actina? Por qu? _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Podran corresponder ambos fragmentos al mismo gen? Fundamente su respuesta _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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Cmo se puede afirmar o descartar experimentalmente que correspondan al mismo gen?________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Qu significado tiene el que al cortar ambos fragmentos con seis enzimas diferentes de restriccin, se haya encontrado hasta un 50% de sitios comunes de corte? ________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________

PRACTICA N 4

INMUNOBLOTING
IDENTIFICACIN DE PROTENAS ESPECFICAS POR WESTERN BLOT

INTRODUCCIN La presente practica esta diseada en base a un estudio que se realizo en nuestro medio y que tenia como uno de los objetivos, demostrar que Uncaria

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tomentosa "ua de gato" induce apoptosis a travs de la degradacin de la protena PARP (Poly ADP-ribosa Polimerasa). Cabe sealar por lo tanto, que en este caso no es la intencin estudiar la apoptosis inducida por "ua de gato", sino que estamos tomando como modelo este estudio, a fin de mostrar la aplicacin de la tcnica de "Inmunoblotting" y por lo tanto, para una buena comprensin e interpretacin de los resultados que se obtuvieron, mencionaremos algunos detalles a) respecto.

Uncaria tomentosa, comnmente conocida como "ua de gato" es una liana perteneciente al genero Uncaria, familia de las rubiaseas, que desde hace muchos aos en el Per se le emplea en la medicina popular en el tratamiento de un amplio rango de enfermedades particularmente digestivas e inflamatorias; sin embargo, muchas de sus bondades no estn aun del todo comprendidas.

Los modernos mtodos de la biologa molecular, que cada vez son ms verstiles, ya que adems de tener un alto grado de confiabilidad y especificidad pueden muy bien aplicarse a nuestra realidad, contribuyendo al conocimiento de muchos aspectos del quehacer cientfico. Por otro lado, la evaluacin de las acciones farmacolgicas y moleculares de muchos productos naturales son posibles de ser abordados usando el sistema de macrfagos de rata que se ha convertido en una valiosa herramienta en este tipo de estudios.

La PARP (poli ADP-ribosa polimerasa), es una protena de 116 kd que esta involucrada en la reparacin del ADN, esta protena se ha convertido en un indicador de apoptosis, puesto que es degradada por la caspasa-3, la cual lo convierte en dos fragmentos: uno de 85 kd y otra de 31 kd.

OBJETIVOS.

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1. Conocer el fundamento y los principios en que se basa la metodologa del Western blot. 2. Conocer la utilidad de esta tcnica en el campo de la investigacin.

1.- Tratamiento de macrfagos con Uncaria tomentosa Aproximadamente 2 x 106 macrfagos aislados fueron cultivados en placas Petri, conteniendo 10 ml de medio de cultivo (Buffer fosfato pH 7.2 suplementado con 10% de suero de bovino, penicilina 100 Ul/ml y estreptomicina 100 ug/ml) e incubados a 37C en presencia y ausencia de U. tomentosa al 20 % durante 0, 6,12 y 24 horas.

2.- Lisis de macrfagos para el anlisis de PARP. a) Reactivos: - Tampn de lisis: Tris-HCI CINa Cl2Mg Glicerol NP-40 20mM 137mM 5 mM 10% 1%

- Mezcla de inhibidores de proteasas para 1 ml Pefabloc 100mg

- Tampon de carga "laemmli": Tris-HCI SDS Glicerol 125mM 2% 5%

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Azul de bromefenol 0.003 % 2-Mercaptoetanol 1%

a) Procedimiento: Transcurridos los tiempos de incubacin, se concentran las clulas de la placa por centrifugacin a 3000 rpm durante 3 minutos. A continuacin, el precipitado celular se resuspende y se lava 2 veces con PBS (Buffer fosfato pH 7.4) fri.

El precipitado celular se lisa con 100 ul de tampn de lisis y 5pl de la mezcla de inhibidores de proteasas en un bao de hielo. El homogenizado celular se centrifuga a 13000 rpm durante 20 minutos: Se determina luego la cantidad de protenas totales en el sobrenadante por el mtodo de Bradford. Alcuotas de sobrenadante conteniendo 10 ug de protenas totales se diluyen en tampn de carga 2X y se incuban en bao hirviente durante 7 minutos. Luego se procede a la electroforesis de protenas.

3.- Electroforesis de protenas en gel de Poiacrilamina. a) Reactivos: Acrilamida.bis acrilamida 30 % Tris-HCI 1.5 M pH 8.8 Persulfato de amonio 10 % Temed Tris-HCI 0.5 MpH 6.8 Tampn de corrida pH 8.3 Tris-HC1 SDS 25 mM 0.1 %

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Glicina

250 mM

b) Procedimiento: La electroforesis se realiza utilizando un gel de apilamiento de 4 % de poliacrilamida y un gel de separacin al 12.5 %. Ambos geles se dejan polimerizar durante 45 minutos a emperatura ambiente. El sistema de geles se prepara utilizando el sistema mini-ROTEAN II; para ello, primero se prepara la solucin separadora, dejndola polimerizar en el sistema. Para evitar el efecto inhibitorio del oxigeno atmosfrico sobre la polimerizacin, se aaden con cuidado 500 ul de agua desionizada sobre la solucin una vez polimerizado, se elimina el agua y se aade la polucin de apilamiento en la cual se construyen los pocillos para las muestras.

Una vez cargados los pocillos con las muestras conteniendo 10 ug de protenas totales (Mtodo de Bradford) y con el estndar de pesos moleculares, se introduce el sistema en el tanque de electroforesis, el cual se rellena con tampn de corrida. Por ltimo, el sistema se conecta a una fuente de alimentacin mantenindose a 150 Voltios durante 1 hora.

4.- Transferencia de las protenas a membranas de Polyvinylidene difluoride (PVDF). a) Reactivos: -Tampn de transferencia: Tris HCl Glicina SDS Metano! pH 48 mM 39 mM 0.0375 % 20% 9.2

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b) Procedimiento: La transferencia se efecta utilizando el sistema hmedo de Bio-Rad y membrana de PVDF, siguiendo el protocolo recomendado por esta casa comercial.

Una vez terminada la electroforesis, el gel se introduce en tampn de transferencia para un enjuague y a continuacin se le coloca en forma de emparedado (soporte-esponja-papel filtro-membrana PVDF-gel-papel filtro-

esponja-soporte) en el equipo de transferencia, en bao de hielo. Se conecta luego el sistema a una fuente de alimentacin, efectundose la transferencia y mantenindose la intensidad de la corriente elctrica a 350 mA durante 3 horas.

5.- Incubacin con el anticuerpo (PARP): "Inmunoblotting: a) Reactivos: Tampn de lavado (TBS) Tris-HCI CINa 20 mM 137 mM pH 7.6

Tampn de saturacin de membrana: Leche en polvo 5% en TBST (TBS y Tween 20 al 0.5 %) Anti-PARP (dilucin 1:2000). Las diluciones se hacen en TBST.

b) Procedimiento: En primer lugar la membrana de PVDF con las protenas transferidas, se incuba toda la noche en tampn de saturacin, para bloquear los espacios libres con casena de la leche (tambin se puede usar albmina). Luego se hacen tres lavados con TBS; a continuacin se incuba la membrana durante 12 horas con el primer anticuerpo (en el presente caso con Anti- PARP). Luego se lava la membrana 3 veces con TBS y a continuacin se incuba con un segundo

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anticuerpo Antj-lgG (de conejo) marcado o conjugado con peroxidasa y diluido.1:5000 en TEST. Finalmente se lava la membrana tres veces con TBS.

6.- Revelado o identificacin de la protena a estudiar. a) Reactivos: Tampn ECL Tris-HC1 10mM, pH: 8.5 Luminol 4 mg de Luminol disueltos en 25 ul de NaOH IN y completados hasta 5 ml con tampn ECL. -Yodofenol 1 mg de 4-yodofenol disueltos en 5 ml de tampn ECL.

c) Procedimiento: Tras la mezcla de los reactivos Luminol y yodofenol en volmenes iguales, se aade 5ul de H2O2 concentrado y se incuba la membrana durante 1 minuto. A continuacin, en cuarto oscuro, la membrana se coloca en un casete, en contacto con una pelcula radiogrfica (Hyperfilm MP de Amersham) durante 2 3 minutos. Por ltimo, la pelcula se revela de una forma manual, modificando los tiempos de exposicin segn las circunstancias. RESULTADOS:

++++ 0 6

U. tormentosa 12 24 PM

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Figura N 1.- Degradacin de la PARP en macrfagos de rata tratados con Uncaria tomentosa.

Las clulas fueron incubadas con "ua de gato" al 20 % durante los tiempos indicados. Los "western blot" fueron realizados como se indica en la seccin de Mtodos. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

INTERROGANTES: 1.- Qu funcin cumple el SDS? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

2.- Qu ocurre, si a la membrana de PVDF no se la trata con leche en polvo (casena)? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

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______________________________________________________________

3.- Interprete los resultados mostrados en la figura ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

4.- Por qu aparecen otras bandas en el revelado de inmunoblotting? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

5.- Qu significa la banda de 85 Kd? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

6.- Por qu no aparece la banda de 31 Kd? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

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7.- Qu es un anticuerpo conjugado? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

8.- De qu otra forma se puede revelar para identificar a la protena en estudio? ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________

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