Avances biotecnolgicos en el diagnstico de enfermedades infecciosas

RESUMEN La deteccin de molculas de patgenos (antgenos y material gentico) y molculas de respuesta de los hospederos ante la infeccin (anticuerpos) es el principio bsico de las pruebas diagnsticas moleculares. Estas pruebas han hecho innecesaria la deteccin directa del microorganismo patgeno agresor. Los nuevos avances en biologa molecular y el desarrollo de tecnologa robtica y secuenciacin genmica y proteica han permitido el desarrollo de nuevas pruebas diagnsticas altamente especficas y de gran rendimiento. La genmica y protemica contribuyen a la identificacin de biomarcadores y la biotecnologa aporta mtodos para producir reactivos de alta pureza. La identificacin de genes codificantes de antgenos especficos, su clonacin y produccin recombinante y la produccin de anticuerpos monoclonales, fragmentos de stos y anticuerpos de una sola cadena han hecho posible el desarrollo de nuevas tcnicas inmunolgicas ms seguras y de sensibilidad y especificidad elevadas. Nuevas molculas de reconocimiento, incluidos los aptmeros, podrn pronto superar la necesidad de producir anticuerpos mediante inmunizacin. Para la deteccin de material gentico se han desarrollado nuevas medidas metodolgicas basadas en la hibridacin y amplificacin (PCR, de punto final y en tiempo real) en formatos multiplex y en microarreglos y para su deteccin se han diseado molculas reporteras que permiten su cuantificacin. Aunque estos mtodos requieren instrumentacin compleja, puede ya anticiparse que pronto sern accesibles para su aplicacin en salud pblica.

La eficacia de los mtodos para el diagnstico de las enfermedades infecciosas depende de su sensibilidad y especificidad para la deteccin inequvoca de la presencia de organismos patgenos o la respuesta especfica del hospedero infectado ante su presencia. Las nuevas tecnologas basadas en la biologa molecular ha permitido la identificacin de componentes (biomarcadores) exclusivos de los agentes infecciosos (bacterias, protozoarios, virus), molculas que participan en la interaccin de los patgenos con sus hospederos (de reconocimiento e interaccin con sus clulas y organismos blanco, productos metablicos y toxinas) y molculas que producen los hospederos en respuesta a la agresin. stas pueden utilizarse para la deteccin e identificacin, a nivel de grupo y especie, de los agentes agresores y son la base para el diseo de pruebas diagnsticas moleculares. Para este efecto, los nuevos desarrollos en biotecnologa han posibilitado la ingeniera molecular de reactivos para pruebas que dependen de la interaccin de molculas de reconocimiento, la produccin a gran escala de reactivos altamente purificados, el desarrollo de pruebas ms sensibles con alta especificidad y la automatizacin de protocolos diagnsticos para el procesamiento simultneo de un nmero grande de muestras, lo cual las hace tiles en estudios de salud pblica. Deteccin especfica de molculas mediante pruebas inmunolgicas Las pruebas inmunolgicas estn diseadas para detectar antgenos circulantes de los patgenos o la presencia de anticuerpos producidos en respuesta a agentes infecciosos. Algunas de las molculas que participan en la interaccin hospedero-parsito pueden permanecer en el suero de los sujetos infectados por periodos prolongados y son detectables aun en casos en los que la infeccin es asintomtica y despus de su resolucin. La deteccin de estas molculas, si bien no siempre es til para identificar infecciones activas, lo es para determinar su frecuencia y el grado de dispersin de los agentes infecciosos en la poblacin humana. La deteccin de antgenos circulantes en una persona es prueba fehaciente de una infeccin activa o muy reciente; la presencia de anticuerpos especficos es evidencia de que el agente microbiano se encuentra o estuvo presente en ese individuo, por lo que su reconocimiento puede servir como prueba diagnstica de una infeccin aguda o reciente (IgM), o bien de una infeccin pasada o crnica (IgG). En la prctica, las mayores limitaciones para el diseo y desarrollo de nuevos sistemas de diagnstico por mtodos inmunolgicos son la produccin de antgenos y anticuerpos especficos para las molculas de inters. La produccin de protenas y secuencias nucleotdicas por medio de tcnicas de biologa molecular hace posible la obtencin de reactivos de alta pureza en grandes cantidades. De manera adicional, la estructura de las molculas producida por estas tcnicas puede modificarse para incrementar su reactividad. La preparacin de anticuerpos especficos requiere antgenos en cantidad y pureza suficientes. Si bien los antgenos proteicos pueden obtenerse directamente del organismo que se

desea detectar en la prueba diagnstica, el uso de molculas producidas por metodologa recombinante tiene varias ventajas: dado que se conoce la secuencia del gen y su producto correspondiente, es posible introducir en estas secuencias modificaciones que al cambiar algn grupo qumico especfico facilitan su purificacin, o la hacen ms antignica y por tanto ms eficiente para la produccin de anticuerpos especficos. Adems, la produccin de antgenos por medio de tecnologa recombinante permite aumentar la cantidad y pureza del antgeno producido, adems de acelerar y disminuir los costos de produccin.4 Por otra parte, los antgenos de microorganismos peligrosos pueden producirse en organismos inocuos, con lo que se reduce el riesgo de infeccin durante la produccin. Entre las pruebas inmunolgicas ms utilizadas en mtodos diagnsticos figuran las de hemaglutinacin, inmunodifusin e inmunofluorescencia indirecta (IFI); algunas de stas constituyen las pruebas de referencia ("estndar de oro") para la deteccin de agentes patgenos. En la actualidad se utilizan los mtodos automatizados en cmaras de multipozos tipo ELISA y las pruebas rpidas (rapid diagnostic tests, RDT), en las cuales los antgenos a detectar se fijan a una tira de membrana que se sumerge directamente en los reactivos de deteccin (anticuerpos) y revelado, con obtencin en pocos minutos de un resultado. Estas pruebas permiten procesar en forma expedita un nmero elevado de muestras, con buena sensibilidad y especificidad. El anlisis del desarrollo de pruebas rpidas (RDT) ejemplifica los procedimientos moleculares empleados para el diseo de nuevas tcnicas inmunolgicas, as como las ventajas y limitaciones de este tipo de pruebas para el diagnstico de enfermedades infecciosas, incluidas malaria, SIDA y sfilis. Las RDT son tiras diagnsticas que tienen como principio la inmunocromatografa para identificar antgenos o anticuerpos; un reactivo (antgeno o anticuerpo) es reconocido por otro reactivo (anticuerpo o antgeno) contenido en un lquido que migra a travs del papel. El objetivo de estas pruebas es contar con instrumentos diagnsticos que sean simples, con resultados inmediatos para el diagnstico in situ (junto al paciente) y, de esa manera, poder instituir tratamiento oportuno (por tal razn se conocen como pruebas de punto de atencin), y al mismo tiempo tomar decisiones acerca del control de la dispersin de los agentes patgenos. Las tiras diagnsticas son producto de la aplicacin de la biologa molecular a varios niveles, la identificacin de biomarcadores especficos, su clonacin y produccin por medio de tecnologa recombinante y la produccin de anticuerpos monoclonales para su captura y deteccin. El caso de las RDT para la deteccin de pacientes malricos es un buen ejemplo. El diagnstico de infeccin con el parsito de la malaria (Plasmodium spp.) se basa en la identificacin de un biomarcador como la protena rica en histidinas 2 (PRH2), la enzima deshidrogenasa de lactato (pLDH) o una aldolasa parasitaria. Las tiras diagnsticas contienen en su extremo distal anticuerpos monoclonales que reconocen pLDH o aldolasa, comunes entre las especies del parsito, pero todas

contienen anticuerpos especficos contra P. falciparum, de tal modo que pueden servir para establecer diagnsticos diferenciales o de infecciones mixtas. Para el diagnstico se coloca en el extremo proximal de la tira la muestra sangunea, junto con un amortiguador de lisis celular que contiene adems un anticuerpo marcado con un colorante. La migracin del lquido pone en contacto a los tres reactivos y la fijacin en una banda del anticuerpo marcado (figura 1). La presencia de pLDH o aldolasa en la muestra sangunea indica infeccin activa, pero la PRH2 persiste en circulacin hasta por 14 das despus del tratamiento, por lo que en ese caso puede tratarse de una infeccin resuelta o persistente. La sensibilidad de la prueba es de 95%, en comparacin con un anlisis por microscopia, con un lmite inferior de 100 parsitos/l. Sin embargo, existen variaciones regionales de HPR2, lo que hace que en algunas reas la prueba genrica no reconozca parasitemias por debajo de 500 parsitos/l.

Varias pruebas de la efectividad y el costo-beneficio de las RTD se han realizado en varias partes del mundo. Por ejemplo, debido al aumento de la resistencia de los parsitos del paludismo a los medicamentos anti-malricos, se han introducido nuevos esquemas de tratamiento con combinaciones farmacolgicas que requieren una evaluacin oportuna de su efectividad; para ello las RTD proporcionan ventajas en relacin con el manejo rpido y masivo de muestras para la deteccin parasitaria.

La disponibilidad de aparatos robticos ha posibilitado la manipulacin automatizada de cantidades muy pequeas de reactivos y la fijacin de molculas reactivas (cidos nucleicos, protenas o azcares) en hileras, muy prximas entre s, sobre una matriz slida plana (una membrana o un vidrio), lo que se denomina microarreglos (figura 2). Para el desarrollo de pruebas diagnsticas existen dos tipos de microarreglos de protenas: los que contienen fijados en la matriz slida anticuerpos para la deteccin de diversos antgenos (biomarcadores de patgenos) y los que contienen antgenos especficos de los patgenos para la deteccin de anticuerpos en muestras sanguneas. Un ejemplo de estos ltimos se desarroll para la deteccin simultnea de anticuerpos en sueros humanos contra Toxoplasma gondii, el virus de la rubeola, citomegalovirus y el virus del herpes simple tipos 1 y 2. El desempeo diagnstico de estos microarreglos se compar con el de una prueba ELISA comercial, lo cual puso de manifiesto las ventajas de este tipo de pruebas de alto desempeo respecto de las tcnicas inmunolgicas tradicionales: ambas pruebas pueden utilizarse para el diagnstico de infecciones recientes (deteccin de IgM), pero en los microarreglos, adems de la investigacin simultnea de varios patgenos, la reproducibilidad de los resultados es mayor, se utilizan cantidades de reactivos menores y, por ltimo, la incorporacin de curvas de calibracin en la matriz permite que sta se procese bajo las mismas condiciones que las muestras, de tal modo que se eliminan las variaciones debidas al tiempo de manipulacin, temperatura, contenido de grasa, protenas, y otros factores, en los sueros problema.

Ingeniera molecular de anticuerpos Los anticuerpos se unen con alta especificidad y sensibilidad a protenas, azcares, lpidos y molculas diversas; en consecuencia, usados como reactivos, pueden identificar de forma eficaz una gran variedad de biomarcadores de

agentes patgenos. No obstante, stos presentan algunas dificultades de produccin e inconvenientes para las aplicaciones biotecnolgicas. Por consiguiente, la produccin tradicional de anticuerpos contra el antgeno deseado, por medio de inmunizaciones de animales, no siempre es exitosa; asimismo, es posible que la especificidad y la sensibilidad de los anticuerpos producidos puede ser limitada por las caractersticas genticas de la especie animal utilizada. 15,16 Si bien la tecnologa recombinante ha revolucionado la produccin, diseo y adecuacin para funciones especficas de protenas, la estructura de los anticuerpos formada por dos cadenas pesadas y dos ligeras dificulta su produccin por medio de esta tecnologa. Adems, estas molculas requieren modificaciones postraduccionales, como glucosilacin, doblamiento y formacin de puentes disulfuro, lo que impide su produccin en forma recombinante en organismos procariontes. La metodologa para la preparacin de anticuerpos monoclonales revolucion la produccin de anticuerpos, ya que hace posible obtener anticuerpos dirigidos contra un solo epitopo, se pueden almacenar las clulas para volver a elaborarlos cuando sea necesario y se pueden producir cantidades suficientes de reactivos.No obstante, esta medida es todava costosa y encarece su inclusin en pruebas diagnsticas. Varias intervenciones moleculares se han empleado para resolver las limitaciones de produccin y el diseo de anticuerpos con mayor afinidad por sus antgenos y estructuras ms sencillas y estables. Las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) que conforman los anticuerpos pueden producirse de manera aislada y conservar su capacidad de unirse de manera especfica a sus antgenos, pero con afinidad y solubilidad reducidas. Las molculas que contienen aparejadas las regiones complementarias (CDR) de las cadenas VH y VL son suficientes para mantener su unin especfica a los antgenos. Los mtodos de biologa molecular se emplean para generar protenas semisintticas derivadas de los anticuerpos, estructuralmente ms sencillas, que incluyen las regiones variables funcionales, con capacidad de unin a un antgeno y estables en diversas condiciones ambientales; entre stas figuran las siguientes: fragmentos ab (Fab);25 fragmentos variables (Fv); y regiones variables conformadas con una sola cadena (scFv). Estas molculas se producen como fragmentos Fab de anticuerpos monovalentes, como cadenas nicas (SCFv) que contienen las regiones VH y VL unidas por un polipptido puente y que mantienen su funcionalidad, como por ejemplo su capacidad de inhibir el desarrollo de patgenos. Las molculas formadas por un solo dominio variable (VHs) se pueden disear por computadora para hacerlas complementarias a la estructura de su molcula blanco. Tambin se producen fragmentos correspondientes a las regiones variables de los anticuerpos conformados con dos cadenas peptdicas ensambladas en una sola cadena peptdica (dsFv). Algunas de estas variantes de anticuerpos se producen a gran escala en organismos modelo como Escherichia coli o sistemas de virus, procariotes y eucariotes. La produccin de fragmentos de protenas en bacterifagos filamentosos de tipo f (fagos f1, fd y M13) tambin se ha empleado para la elaboracin de scFvs, para cuyo fin se clona el fragmento de inters para producirla fusionada con una protena de cpside expuesta en la superficie del virin (phage display) (figura 3). Los fagos son muy convenientes para expresar

dominios de anticuerpos, ya que son estables en forma cristalizada o liofilizada y ello facilita su almacenaje y transporte y se pueden producir en gran cantidad y a bajo costo. Ejemplos de la aplicacin de esta tecnologa son la produccin de fagos capaces de identificar antgenos de bacterias del gneroBacillusspp., incluido B. anthracis, los cuales tienen alto potencial para diagnstico ya que son especficos y sensibles y se pueden manipular en diversas plataformas de ensayos diagnsticos y se experimenta con fagos tiles para la neutralizacin de ataques terroristas, ya que se ha demostrado que la inmunizacin pasiva tiene efectos significativos en el tratamiento.

Una alternativa para la produccin de nuevos reactivos de reconocimiento es la ingeniera de molculas (protenas y otras molculas) diferentes de las Igs, con capacidad de unirse de manera especfica a un antgeno. Una ventaja adicional de estos moldes es que pueden generarse molculas que no tengan reacciones inmunitarias cruzadas y que para el revelado de sus pruebas no dependan, a su vez, de segundos anticuerpos que puedan presentar reconocimiento cruzado. Entre estas molculas se encuentran las protenas ricas en leucina, lipocalinas y tendamistat. Por otra parte, por medio de la sntesis qumica de oligonucletidos, se generan molculas de ARN y ADN (genes sintticos), con propiedades de reconocimiento altamente especfico de molculas que en algunos casos es superior al de los anticuerpos. Los aptmeros son muy estables ante condiciones ambientales, pueden producirse contra molculas poco inmunognicas y su afinidad y especificidad de unin a los antgenos pueden mejorarse clonando los aptmeros como genes sintticos y la introduccin dirigida de variaciones en su secuencia "evolucin dirigida". Por otra parte, durante la sntesis de los aptmeros se pueden introducir tomos que funcionan como etiquetas para su deteccin como los quantum dots (Q-dots) y al aplicarse se puede inducir su unin covalente al sitio blanco, lo que permite que el complejo aptmero-molcula blanco pueda lavarse en condiciones extremas, antes de su lectura, para mejorar la especificidad y estabilidad de las pruebas diagnsticas. Los aptmeros son eficientes en pruebas y formatos bien establecidos y pueden competir con los anticuerpos en diagnstico e investigacin. Biologa molecular de cidos nucleicos y mtodos diagnsticos Si bien los organismos comparten de manera variable en su genoma genes comunes (ortlogos), estos genes y otros no compartidos presentan secuencias especficas de gnero, especie y cepa que hacen posible su identificacin inequvoca. Una vez identificadas las secuencias exclusivas de patgeno, stas pueden utilizarse para el desarrollo de reactivos para pruebas diagnsticas. En la prctica se desarrollan de forma constante nuevos equipos para la manipulacin, secuenciacin y deteccin de cidos nucleicos, lo que permite que est en desarrollo una gran cantidad de proyectos de secuenciacin de genomas de microorganismos; de igual modo, muchas de las bases de datos generadas, completas o en proceso, y las herramientas informticas para su anlisis estn disponibles libremente en internet (Portal NCBI National Institute for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes/).Tambin estn disponibles bases de datos con informacin sistematizada sobre microorganismos con potencialidad patognica, segn sean la agresividad, potencialidad de dispersin, datos epidemiolgicos y tcnicos para el diagnstico de enfermedades infecciosas; estas bases de datos se pueden consultar en lnea (http://www.cdc.gov/page.do) (cuadros I a III).

Deteccin de cidos nucleicos. La deteccin del material gentico de un microorganismo en muestras biolgicas indica la presencia del patgeno en los sujetos de estudio en el momento de obtener la muestra. Esta deteccin permite la identificacin de infecciones de manera directa sin la necesidad del cultivo del agente patgeno causal y la deteccin de ARN mensajeros indica que el organismo en cuestin est metablicamente activo. Las pruebas diagnsticas basadas en cidos nucleicos se basan en la deteccin directa de su presencia por medio de sondas especficas (hibridacin), pero tambin es posible incrementar su sensibilidad por medio de la amplificacin de secuencias especficas diagnsticas (reaccin en cadena de la polimerasa) del material gentico presente en las muestras. La hibridacin se basa en la capacidad de dos cadenas sencillas de cido nucleico, ADN o ARN, complementarias en su secuencia de bases, de formar enlaces especficos y crear una doble hlice en cualquier combinacin: ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. Durante la hibridacin una molcula de secuencia conocida (la sonda diagnstica) "busca" e identifica a su complementaria en una mezcla de molculas de cido nucleico, aunque sta sea muy compleja. La hibridacin se puede efectuar en diversos formatos, en solucin o con la cadena blanco unida a un soporte slido o incluso in situ, esto es, en un corte de tejido o un microorganismo completo fijado. La sonda diagnstica puede producirse por sntesis qumica o tcnicas recombinantes y durante su produccin se le incorporan etiquetas para su deteccin (enzimas para deteccin colorimtrica, fluorescencia). El nmero de molculas blanco presentes en la muestra determina el nmero de molculas de la sonda que se fijan al formato, lo cual determina la intensidad de la seal. La especificidad de la seal obtenida depende del grado de complementariedad entre las dos cadenas de ADN (la sonda y el gen investigado)

y su sensibilidad (que se limita al nmero de copias del gen investigado en el material biolgico). En formato individual, la hibridacin es til para detectar o confirmar los resultados de otras pruebas. Nuevos desarrollos que usan el principio de hibridacin son los microarreglos. En este formato, las sondas de ADN se imprimen o sintetizan (con formacin de celdas) por medios automticos directamente sobre soportes slidos de vidrio o polipropileno y estas secuencias, fijadas en el soporte slido, se incuban con muestras que contienen el material gentico en estudio, previamente marcado, de tal modo que al hibridarse se presenta una seal en la celda reconocida. En el momento presente, los altos costos de los mtodos basados en microarreglos impiden su empleo en estudios poblacionales; no obstante, esta tcnica se ha utilizado para estudios epidemiolgicos que incluyen nmeros pequeos de muestras, como la genotipificacin de cepas de virus de la inmunodeficiencia humana resistentes a tratamiento, y para determinar el origen de infecciones sintomticas y asintomticas con poliovirus en una poblacin previamente vacunada. PCR. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento muy sensible que utiliza una polimerasa de ADN; este procedimiento permite amplificar y detectar de manera especfica, a partir de una sola molcula blanco, secuencias particulares de ADN. La reaccin depende de oligonucletidos cortos (cebadores o sondas) que tienen la secuencia adecuada (complementaria) para hibridar en los extremos de cadenas sencillas del ADN blanco, las cuales se obtienen mediante la desnaturalizacin del ADN original. Una vez unida, la sonda sirve como ancla para que la polimerasa inicie la produccin de la cadena complementaria a la secuencia blanco, de tal manera que se forman molculas de ADN de doble cadena. La desnaturalizacin de este ADN, la hibridacin con la sonda y la sntesis de la cadena complementaria con ciclos repetidos permiten la obtencin de grandes cantidades de ADN especfico del microorganismo investigado, lo cual facilita su deteccin. El reconocimiento del material producido se obtiene mediante electroforesis en geles de agarosa y la identificacin de bandas del tamao molecular esperado por medio de tincin con bromuro de etidio. La sensibilidad y especificidad de la PCR han permitido el desarrollo de mtodos diagnsticos para una gran variedad de agentes infecciosos: bacterias, protozoarios, virus y helmintos. La prueba de PCR descrita se conoce como de "punto final", ya que la reaccin se detiene hasta que todos los reactivos necesarios para la amplificacin se han utilizado. A partir del mtodo bsico de PCR se han desarrollado variantes para detectar ADN o ARN, con objeto de hacerlo cuantitativo (vase ms adelante) y aplicar sistemas diagnsticos automatizados que realizan el procesamiento de las muestras desde la purificacin del material gentico hasta su anlisis. Existen numerosas pruebas diagnsticas que usan la PCR con el formato de "punto final"; en stas, la reaccin se realiza en un nmero predeterminado de

ciclos y los productos se analizan por electroforesis. Por ejemplo, las especies de Corynebacterium: C. diphteriae, C. ulcerans y C. pseudotuberculosis, son patgenas slo cuando producen la toxina diftrica, para lo cual necesitan copias completas del gen tox. Mediante pruebas de PCR se puede reconocer la presencia del gen aun en muestras de pacientes que han recibido antibiticos, en quienes ya no es posible cultivar la bacteria. Sin embargo, en algunas cepas que poseen el gen tox, debido a mutaciones en la regin de control del gen, ste no es activo, por lo que los pacientes positivos por PCR an se los considera como casos presuntivos. La PCR de punto final tambin se usa para el diagnstico y clasificacin de los parsitos del gnero Leishmania spp., los cuales poseen una mitocondria modificada llamada cinetoplasto en la que existen dos tipos de molculas de ADN, los maxicrculos y los minicrculos. En la secuencia de los minicrculos, se presentan regiones conservadas y variables, entre las cuales se encuentran algunas especficas de especie/aislado (oxidasa de citocromo y regiones espaciadoras intergnicas), a partir de las cuales se pueden disear pares de oligonucletidos iniciadores que al amplificar permiten distinguir entre gneros, especies y poblaciones de parsitos. Este mtodo se puede aplicar a diferentes tipos de muestras, como sangre o aspirados de ndulos linfticos, y en la actualidad se ha probado para la evaluacin de la efectividad de nuevos frmacos, la identificacin de portadores asintomticos y de animales que sirven como reservorios en la naturaleza. En la PCR multiplex se incorporan a la reaccin de amplificacin ms de un par de sondas especficas para diferentes secuencias blanco. Los fragmentos generados pueden reconocerse por su tamao o por medio de marcadores incluidos en las sondas. Entre las aplicaciones de este sistema figuran el anlisis de muestras en las que hay varias molculas blanco del mismo organismo, la confirmacin de que ste se halla presente, o bien la investigacin de forma simultnea de varios patgenos, para lo cual se incluyen sondas especficas para cada microorganismo. La dificultad principal de la PCR multiplex es el diseo adecuado de los oligos con el fin de evitar interacciones inespecficas entre ellos y reconocimientos cruzados y lograr que los amplicones resultantes se puedan diferenciar unos de otros. Para el diseo de estos cebadores se han desarrollado programas computacionales que incluyen como elementos de seleccin secuencias especficas de los patgenos en estudio y composicin de stos para que los procesos de amplificacin requieran las mismas condiciones (temperatura de "fusin"). De esta manera se genera un "sistema de tubo nico", en el cual se coloca la muestra en un tubo que se cierra con los reactivos de purificacin y amplificacin y ya no se abre sino hasta obtener el resultado, lo cual reduce el riesgo de manipular muestras peligrosas. Para la identificacin de los productos amplificados se han propuesto varias alternativas, adems del uso de la electroforesis en agarosa. En un sistema para la deteccin de productos de PCR en una reaccin multiplex, los oligos iniciadores se acoplaron a microesferas, de tal modo que los productos quedaron acoplados a

stas y eran distinguibles en un citmetro de flujo, lo que permita la automatizacin de la lectura y la distincin de hasta de 80 blancos diferentes en una reaccin. De la misma forma, los oligos pueden acoplarse a molculas de tamao diverso disponibles en el comercio (Qiagen Masscode Technology, Qiagen, Hilden, Alemania), con capacidad de distinguir hasta 64 diferentes tamaos y por tanto el mismo nmero de secuencias especficas.Otra manera de identificar productos diferentes en una PCR multiplex consiste en utilizar oligos marcados con faros moleculares (beacons, vase ms adelante), los cuales emiten seales fluorescentes a distintas longitudes de onda. Las pruebas basadas en la PCR multiplex son tiles para reconocer infecciones por patgenos que comparten cuadros sintomticos comunes; con este propsito se dise una prueba para investigar la causa de las fiebres virales hemorrgicas, que incluye sondas para identificar 10 diferentes virus. Para mejorar la sensibilidad en los ensayos multiplex se aplica tambin el principio de las reacciones "anidadas", en las cuales la reaccin se realiza primero con un juego de iniciadores "externos", que en los primeros ciclos genera un fragmento "grande". En una segunda etapa, el producto de la primera ronda de amplificacin se convierte en el molde con un segundo juego de iniciadores que se hallan dentro del producto primario ("anidados"), lo cual asegura la especificidad del amplificado de la primera ronda. PCR en tiempo real. Los "puntos finales" de las reacciones de PCR varan entre las muestras debido a la cantidad de ADN blanco presente en stas. Adems, el punto final es difcil de precisar ya que la amplificacin, despus de una fase exponencial, alcanza una meseta en la que los reactivos comienzan a agotarse. Estas condiciones son determinantes de las limitaciones de este mtodo, entre ellas bajas precisin y sensibilidad, adems de que no puede ser cuantitativa. En los mtodos de PCR "en tiempo real", las molculas del fragmento blanco que se amplifican se detectan al mismo tiempo que se generan (durante la fase exponencial de la amplificacin), con base en varias estrategias que dependen de molculas fluorescentes (fluorforos) cuya emisin es proporcional al nmero de molculas producidas, lo que permite hacer la prueba de forma cuantitativa. Un fluorforo es una molcula que absorbe radiacin de una longitud de onda determinada (luz UV o lser) y luego emite la energa absorbida en forma de luz de una longitud de onda determinada, pero diferente a la empleada para su excitacin; esto hace posible su identificacin. La utilizacin de fluorforos tambin permite realizar reacciones de amplificacin multiplex y detectar cada molcula blanco con un fluorocromo diferente. El mtodo ms sencillo de deteccin de los productos de PCR en tiempo real es la aplicacin de un fluorforo marcador, como el SYBRgreen, el cual emite fluorescencia cuando se intercala en el surco mayor de la doble hlice del ADN. Otra forma de reconocer productos de PCR en tiempo real consiste en usar los beacons ("faros moleculares"). En este sistema se generan sondas que poseen un fluorforo "principal" en el extremo 5 y otro fluorforo de menor intensidad en el extremo 3 con diferente espectro de emisin(beacons). Cuando

estas sondas se encuentran como molculas nicas se pliegan sobre s mismas y la proximidad de los fluorforos genera el efecto "FRET" (fluorescence resonance energy transfer), en el cual el fluorforo secundario apaga la emisin del primario. Al ocurrir la reaccin de PCR, el beacon forma parte de las molculas amplificadas, con lo que el fluorforo principal se separa del secundario y recupera su fluorescencia, de tal manera que la poblacin de hbridos se puede medir porque su nmero es directamente proporcional a la magnitud de la fluorescencia. Losbeacons pueden prepararse con diferentes fluorforos, como SYBRgreen, fluorescena (FAM), Texas red, Rhodamina 6G, Cy3, Cy5, entre otros, y DABCYL como apagador, lo que posibilita realizar combinaciones para la deteccin multiplex. En un ejemplo de aplicacin se investig en muestras sanguneas humanas la presencia de los genes gag de HIV-1, env HIV-2, tax del virus T-linfotrpico tipo 1 y pol del tipo 2, mediante los juegos de beaconscorrespondientes, marcados con diferentes fluorforos; esto permiti determinar la carga viral en las muestras; el mtodo es rpido, sensible, especfico y seguro para el operador. En la PCR llamada TaqMan adems del efecto FRET se utilizan las actividades de la polimerasa Taq, que acta como polimerasa en direccin 5>3 y como exonucleasa en direccin 3>5 (figura 4). A diferencia de la reaccin de la PCR estndar, en el TaqMan se lleva a cabo una hibridacin con una sonda complementaria de una regin interna de la secuencia blanco, antes de la amplificacin. La sonda interna tiene una temperatura de "fusin" 10C superior a la de los iniciadores en los extremos y posee en su extremo 5 un fluorforo verde (6-carboxifluorescena, FAM), cuyo espectro de emisin est "apagado" (quenched) por la proximidad espacial de un segundo colorante fluorescente. En una reaccin de PCR, el primer paso de cada ciclo es un aumento de la temperatura para la desnaturalizacin de las cadenas de ADN, seguido de un descenso de la temperatura para la renaturalizacin, durante la cual se unen los iniciadores a los lados de la secuencia blanco. En la reaccin TaqMan, durante la renaturalizacin la sonda TaqMan, en virtud de su afinidad mayor, se une a su sitio blanco antes de que lo hagan los iniciadores de amplificacin. Para la fase de sntesis los iniciadores se unen, empieza la conformacin de molculas de ADN y durante el avance de la polimerasa Taq, sta "choca" con la sonda y por su actividad de exonucleasa la degrada (se "come la sonda", de tal modo que el fluorforo de la sonda se libera y la seal se activa, lo que posibilita su medicin. Se han publicado varios ensayos diagnsticos con base en este mtodo, como el descrito para reconocer Chalmydia trachomatis y tuberculosis. En este tipo de prueba tambin se pueden hacer combinaciones de juegos de iniciadores y sondas con fluorforos que emitan a distintas longitudes de onda para identificar varios blancos en reacciones multiplex.80-82 El sistema Scorpions es similar al anterior en tanto que incluye el juego de fluorforos, principal y apagador, y el uso de un iniciador para la reaccin de PCR, pero con la incorporacin covalente de una secuencia adicional formada por un "bloqueador" en la regin 5; empero, a diferencia del anterior, no hay degradacin de molculas. En este formato se han

diseado mtodos diagnsticos, pylori85 y Micoplasma.86

como

los

descritos

para Helicobacter

En el mercado ya estn disponibles varios estudios diagnsticos basados en la reaccin de PCR en tiempo real [sistema Roche Amplicor; stos se someten de forma continua a evaluaciones y comparaciones con nuevos productos, an no comerciales. Por ejemplo, la prueba PCR para Mycobacterium tuberculosis usa como blanco de amplificacin una regin del ARN ribosomal 16S de la micobacteria, con una sensibilidad de 47 a 58.2% y especificidad de 94 a 97%, segn sea el tejido del que se obtiene la muestra. La sensibilidad vara con el tratamiento usado para purificar el material gentico y, aunque esta prueba fue

superior a los mtodos tradicionales, todava se identific a un grupo de pacientes en el que no pudo establecerse un diagnstico definitivo. Espectrometra de masas y diagnstico En la actualidad, los mtodos de espectrometra de masas (MS) disponibles permiten identificar molculas orgnicas e inorgnicas de forma rpida, confiable y con alto rendimiento. La identificacin de protenas por MS es paralela a la acumulacin de secuencias de cidos nucleicos (genmica) y su control por bioinformtica para conocer las protenas codificadas por ellas y con estas protenas virtuales hacer experimentos in silico, consistentes en la prediccin de los iones que se generan durante la fragmentacin en los diferentes sistemas de anlisis. En una sola ronda de fragmentacin/separacin de iones se obtienen "huellas digitales" (grfica de valores de masa/carga de los iones, m/z), que permiten identificar a la molcula exacta por comparacin con las huellas digitales generadas tericamente a partir de las bases de datos genmicas. Con estos estudios es posible identificar biomarcadores de patgenos especficos. La MS tambin puede usarse para identificar secuencias de ADN, lo que permite emplearla para el anlisis automatizado y rpido de productos de PCR.Esta aplicacin es til en ensayos de PCR multiplex, como en el sistema denominado Masstag-PCR, en el cual los oligos para realizar la PCR se marcan con grupos qumicos de masa conocida (MassTag) y la cantidad de los productos generados durante la amplificacin se mide mediante un sistema de espectrometra de masas en fase lquida por la cantidad de las "etiquetas" incorporadas. Esta tcnica se ha aprobado para el diagnstico diferencial e identificar hasta 22 agentes patgenos de muestras clnicas causantes de enfermedades respiratorias y virales hemorrgicas, con sensibilidad y especificidad elevadas. Comentarios finales La investigacin bsica mediante genmica y protemica de microorganismos patgenos proporciona nuevos marcadores biolgicos potencialmente tiles para desarrollar mtodos de diagnstico. Para cada enfermedad infecciosa es importante el conocimiento de varios biomarcadores entre las molculas de los patgenos y entre las molculas de respuesta de los pacientes, ya que stas pueden variar a lo largo del proceso infeccioso, segn sean las caractersticas genticas de los pacientes, los agentes patgenos y las condiciones ambientales. El uso de pruebas automatizadas y la inclusin de mltiples marcadores permiten en su formato actual investigar de forma simultnea, rpida y a bajo costo el origen de infecciones que comparten cuadros sintomticos. Por otra parte, es recomendable aplicar un plan estratificado en la investigacin de microorganismos patgenos de acuerdo con las condiciones epidemiolgicas en cada caso. En consecuencia, cuando la clnica y los informes epidemiolgicos sugieren la participacin de uno o pocos patgenos es recomendable el uso de PCR de punto final; si no existe suficiente informacin para circunscribirse a pocos patgenos sospechosos, el PCR multiplex puede ser til para investigar un nmero elevado

de microorganismos. Los microarreglos pueden ser de utilidad si el PCR multiplex no provee informacin. La disposicin de genomas completos de los patgenos ms comunes ha permitido la identificacin y produccin masiva de genes y antgenos; las tcnicas de biologa molecular se emplean para la produccin de anticuerpos y sus fragmentos con elevadas especificidad y sensibilidad. Las tcnicas para la produccin qumica de molculas complementarias promete la posibilidad de prescindir ya en el futuro de la produccin de anticuerpos y evitar la necesidad de inmunizaciones de animales. Los sensores basados en molculas biolgicas ofrecen oportunidades sin precedentes para el tamizaje gentico y la deteccin. La tecnologa de los microarreglos es til para el anlisis masivo de muestras, aunque implica el uso de una instrumentacin muy costosa y algoritmos numricos complejos para interpretar los datos, de modo tal que dichos mtodos se han limitado a los laboratorios de investigacin. Sin embargo, los costos disminuyen rpidamente y cabe anticipar que, en un futuro prximo, estarn al alcance de la comunidad mdica