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Determinación

de Actividad de Enzima Amilasa de

Trichoderma harzianum en

Fermentaciones Sumergidas y Obtención de Biomasa (esporas) en medios Sólidos. Determination of amylase activity of Trichoderma harzianum in submerged fermentation Obtaining Biomass(spores) on solid media. Luis José Toro Tejada Resumen Se determinó la actividad enzima amilasa de Trichoderma harzianum en cultivos sumergidos en caldo con sales minerales y almidón como única fuente de carbono en muestras de 0, 24, 72, 96 horas de incubación, los mayores niveles se lograron en muestras de 24h de incubación con una concentración de 0,180 mg/L de azúcares reductores lo que conlleva a una actividad amilasa de 4,321 mg AR/mL/h. se compararon los rendimientos en las fermentaciones solidas utilizando como sustrato arroz con distinto espesor de lecho 25, 50 y 75g, en el cual se pudo observar crecimiento de micelio de color verde grisáceo esporulado con mayor rendimiento a 25g de espesor en comparación con las demás muestras, siendo esta de mejor costo beneficio con un promedio de 4,73E+10 Cel/g. Palabras clave: Trichoderma harzianum, cultivos sumergidos, actividad amilasa, fermentaciones solidas. Abstrac Enzyme activity was determined Trychoderma harzianum amylase in submerged

culture in mineral salts brothand starch as sole carbon source in samples of 0, 24, 72, 96 hours of incubation, the highest levels were achieved in 24 samples of incubation with a concentration of 0.180 mg / L of reducing sugars which leads toa 4.321 mg amylase activity of AR / mL / h. compared the yields of solid fermentation using rice as a substrate with different thickness of bed 25, 50 and 75g, in which growth was observed gray-green myceliumsporulated with higher yield to 25g thick compared to other samples , this being the most cost-effective with an average of 4.73 E +10 Cel / g. Key words: Trychoderma harzianum, submerged cultures, amylase activity, solid fermentations.

En la experiencia se busca la producción de enzimas amilasas determinar los rendimientos y recuperación de productos. además también se suelen hallar asociados a la superficie de plantas y cortezas de madera descompuesta. Se encuentra ampliamente distribuido en todo el mundo en diferentes zonas. esporas lisas. Cepa y Preparación del inoculo El microorganismo usado para la producción de amilasa en la fermentación sumergida fue la cepa de Trichoderma harzianum. La importancia de este hongo radica principalmente en su aprovechamiento . El interés científico despertado por los hongos de este género. harzianum se caracteriza por sus conidióforos terminados en fiálidas. dispuesto en muestras de 0. Son un grupo de microorganismos que habitan importante abundante naturalmente de suelos materia en un número con en agrícolas. (Harman y Kubicek. 1998). orgánica a nivel industrial utilizado como agente biocontrolador de hongos fitopatogenos. 1996). 50 y 75g iniciales de arroz). hialinas. 24. 72. para la obtención de productos como enzimas y antibióticos. El sustrato utilizado en la fermentación sumergida fue un caldo con sales minerales y almidón como única fuente de carbono. verdosas. Trichoderma sp. Materiales y Métodos Sustrato y medio de cultivo El Sustrato usado en la fermentación en medio sólido fue arroz blanco dispuesto a distintos espesor de lecho (25. en diferentes hábitat (Harman. Su desarrollo se ve favorecido por la presencia de otros hongos que atacan a los cultivos. El inoculo primario se obtuvo a partir de una suspensión de las esporas del hongo en un caldo con sales minerales y almidón como única fuente de carbono y agitados a 80 rpm a 25°C.Introducción Los hongos del género Trichoderma sp. a través de fermentaciones sumergidas y solidas. 1998). subglobosas u ovoides y colonias de crecimiento rápido (7-9 cm) (GAMS& BISSETT. 96. se debe a las características antagónicas que presentan frente a hongos fitopatógenos. Estos tres mecanismos no son excluyentes sino que actúan sinérgicamente en el control de los patógenos. Entre los mecanismos de control. T. está la competencia por nutrientes o espacio. el micoparasitismo y la antibiosis. descomposición y altas densidades de raíces. horas de inoculación. con un solo núcleo.

Determinación que se realizó por triplicado y al pasar la 24h se descongelaron las muestras para determinar AR iniciales agregando 100µL de DNSA (Ácido dinitrosalicílico) a cada tuvo (AR iniciales y finales). y 96 horas de incubación. 24. 72. Fermentación en medio sólido (FMS) La fermentación en medio sólido se realizo en un solo medio. los cuales fueron congelados a 20°C/24h. con una paleta se homogeneizó el material y se pasó por un colador. . se repitió la operación hasta que la suspensión de lavado de esporas aclaró. Se esterilizó una alícuota de 1ml en el autoclave que sirvió de control del proceso. luego de enfriar se agregó 1ml de agua destilada. (Previamente se realizó un blanco con agua destilada) se realizó una curva de calibración de la glucosa y se comparó la actividad amilasa entre los distintos tiempos. Fermentaciones sumergidas Se dispuso de muestras de cultivo sumergido inoculado con esporas del hongo y agitado a 80rpm a 25°C. en distintos espesor de lecho. Se tomó una alícuota de 1ml y se procedió a realizar una dilución seriada hasta 1/100 y se determinó el número de esporas/ml en una Cámara de Neubauer. Las muestras tomadas fueron de 0. Se calentaron en baño de agua hirviendo por 5 minutos. Se compararon los rendimientos en las fermentaciones con distinto espesor de lecho y se determinó cual es la condición que tiene mejor relación costo beneficio.45µ). se agito y se determinó el volumen. los restantes 100 µL se incubaron a temperatura ambiente por 24h. se depositaron cada uno por separado en un recipiente dispuesto para ello se agregó agua corriente hasta cubrir todo el material fermentado. luego de mezclarlas se tomaran 100µL de muestra para determinar los azúcares reductores (AR) iniciales.En las fermentaciones sólidas de T harzianum se contó con arroz ya esporulado para procesos a distinto distintos espesor de lecho (25. a para determinar densidad óptica 540nm. Se realizó una filtración para separar biomasa del sobrenadante (Filtro de jeringa acetato de celulosa DISMIC 13CP de 0. A 150µL de sobrenadante se les añadieron 50µL de solución de almidón al 0. 50 y 75g iniciales de arroz).5%.

en el cual se pudo observar crecimiento micelio de color verde grisáceo ya esporulado con mayor rendimiento a 25g de espesor en comparación con las demás muestras. 50. Como se observa es una relación concentración de azucares reductores mayor actividad amilasa. leída en espectrofotómetro a una longitud de 540nm y sensibilidad media. a menor espesor de lecho mayor crecimiento.1) para obtener la glucosa residual que respecto a la actividad enzimática neta obtenida en caldo de cultivo. y 75g. los mayores niveles se lograron en muestras de 24h de incubación con una concentración de 0. cual se reemplazó en la ecuación lineal arrojada por la curva patrón (Fig. Muestra los Resultados obtenidos en las fermentaciones sumergías de Trichoderma harzianum efectuadas en caldo con sales minerales y almidón como única fuente de carbono. Se empleó el método ácido dinitrosalicílico (DNS) para determinar los azucares reductores obtenidos de la hidrólisis enzimática (amilasa) de almidón.Resultados y discusión Fermentaciones sumergidas La tabla. para registrar la absorbancia generada y cálculos de desviación estándar. Esto se debe a las condiciones del medio lo que evidencia una relación inversamente proporcional. Muestra los Resultados obtenidos en las fermentaciones sólidas de Trichoderma harzianum efectuadas sobre arroz a distinto espesor de lecho 25. N°4. Fermentaciones sólidas La Tabla. a demás de que a mayor concentración de azucares más intensa es la coloración del ácido 3-amino-5nitrosalicilico de coloración rojo ladrillo.180 mg/L de azúcares reductores lo que conlleva a una actividad amilasa de directamente proporcional a mayor 4.73E+10 Cel/g.5dinitrosalicílico de coloración amarilla a ácido 3-amino-5nitrosalicilico de coloración rojo ladrillo.321 mg AR/mL/h. . puesto que en presencia del grupo reductor de la glucosa se reduce el ácido 3. siendo esta de de mejor costo beneficio con un promedio de 4. N°3.

603 0.325 0.323 0.005 0.263 0.02 0.013 0.04 0.027 0.273 0.536 0.566 Diferencia final-inicial 0 0 0.004020779 Promedio por cada tiempo Desviación estándar .303 Abs final 0.Tabla.396 0.078 0.648 0.068 0.526 0.618 0.352 0.658 0.41 0.614 0.057 0.009 0.395 0.11 0.113 0.326 0.591 0.02 0.03 0.214938518 0.124 0.318 0.031 0.669 0.733 0.529 0.021 0.626 0.2515 0.002 0.204 0.341 0.487 0.79 0. Valores de absorbancia Tiempo 0 0 0 0 0 0 24 24 24 24 24 24 72 72 72 72 72 72 96 96 96 96 96 96 Abs inicial 0.01 0.421 0.001833333 0.702 0.586 0.414 0. N°1.323 0.208 0 0 0.1345 0.486 0.239 0.113332696 0.208 0.421833333 0.41 0.231 0.005 0.165 0.207 0.001 0 0 0.213 0.527 0.001 0.081183126 0.376 0.538 0.

5 Curva patrón de glucosa 0.514 1.08E+09 4.200 0.800 0.600 0.400 0.000 0.3 0.26E+09 4.000 -0. Rendimiento en las fermentaciones con distinto espesor de lecho Concentración Tiempo de azucares reductores (mg/L) 24 72 96 0.500 0.08E+09 Promedio Cel/g 4.100 0.209 0. Actividad Amilasa Tabla.4 Absorbancia 575nm 0.174 0.600 0. N°4.73E+10 7.Tabla.0064 R² = 0.372 0.248 0.N°3. N°2.29E+10 7.307 0.400 0.300 0.321 2.200 0.053 Actividad Amilasa (mg AR/mL/h) 4.273 Espesor de lecho (g) 25 25 25 50 75 75 75 Cel/g 6.2 0.105 0.26E+09 5.0.07E+09 5.46 0.180 0.000 Promedio de absorbancia 0. Datos Curva Patrón concentración mg/L 0.74E+09 .700 0.064 0.442x .com/doc/56421369/DETERMINACIONDE-AZUCARES-REDUCTORES-POR-LA-TECNICA-DE-MILLER Tabla.1 y = 0.9923 0 0.132 0.900 1.scribd.76E+10 6.346 0.049 0.200 Concentración (mg/L) Fig.000 1.800 1. Curva de Calibración de la Glucosa Disponible en: http://es.1 0 0. N°1.13E+10 1.

a mayor concentración de azucares reductores mayor actividad amilasa. . siendo este de 25g iniciales de arroz. estableciendo una relación directamente proporcional. a menor espesor de lecho mayor crecimiento. estableciendo una relación inversamente proporcional. Al igual que en las fermentaciones sólidas nos indica cual es el espesor óptimo para la producción de esporas para el aprovechamiento en relación costo beneficio. En función a la producción de enzimas este tiempo de incubación nos da la idea de en qué momento se debe hacer la extracción de las enzimas para su comercialización.Conclusiones En fermentaciones sumergidas se evidenció que la mayor activada amilasa se registra a las 24h de incubación.

Buena reproducibilidad en medios definidos Baja Aw reduce riesgos de contaminación Mayores riesgos de contaminación Medios diluídos. Mezclado imperfecto o casi imposible. pueden ser: levaduras y bacterias. Elevada concentración de grandes. mayor solución mineral. Requieren adición de agua o una Medios con mayor cantidad de ingredientes. Estimación de biomasa no es directa Amplio desarrollo en sistemas de medición y control Contaminación de producto con componentes del La remoción de grandes volúmenes de agua medio es alta Bajos volúmenes de efluentes aumenta costos en los procesos de separación y líquidos purificación Cinética y fenómenos de transporte poco conocidos Modelos cinéticos y difusionales Los microorganismos utilizados son Por lo general cualquier microorganismo aunque es fundamentalmente hongos. en algunos casos más frecuente levaduras y bacterias. Alimentación de sustrato es común Menor consumo de energia para aerear Transferencia G-L es generalmente limitante Mezclado intenso. Difusión La difusión de nutrientes es generalmente no puede limitar el proceso limitante Remoción de calor es crítica. FERMENTACIONES SÓLIDAS FERMENTACIONES SUMERGIDA Medios simples. . Transferencia de Alto contenido de agua facilita control de calor por evaporación puede ser importante Temperatura Control del proceso dificultoso. Altas concentraciones de medio puede producto Menor volumen de reactor afectar crecimiento. Cuadro comparativo entre fermentaciones sólidas y sumergidas.Cuestionario 1. Sustratos variables costo. Volúmenes de fermentación Medios concentrados.

5dinitrobenzóico se reduce. Como bien es conocido las cadenas de almidon están compuestas por dos grandes sub-cadenas. sal de Rochelle (tartrato sódico-potásico). en ausencia de contaminación es un requisito fundamental. El diseño de tomas de muestras y sellos mecánicos. Composición particular del medio en la fermentación sumergida de esta experiencia. produciendo glucosa. expresados como glucosa. De esta forma. Por ello la importancia del almidón en el medio de cultivo para tener una alta actividad amilasa y poder determinarla. La homogeneización. isoamilasa. en 1 minuto. para la determinación de azúcares reductores. llevar a cabo la instalación e iniciar un proceso fermentativo de este tipo. Principales medidas de cuidado que se deben considerar al instalar e iniciar un proceso en un fermentador sumergido. se fundamenta en el hecho de que una unidad de celulasa (IU) genera un micromol de azúcares reductores. que actúa como oxidante. glucoamilasa. Mecanismo químico por el cual se determina la cantidad de azucares reductores con acido dinitrosalicílico (DNS) Este método analítico. que aporta el medio requerido para que se produzca la reacción redox. el acabado de la superficie del tanque. la transferencia de oxigeno y la agitación mecánica. juega un rol importante en un diseño exitoso. en vista de que las temperaturas de fermentación son moderadas (25 a 40 °C) y el cultivo de células es un proceso exotérmico. Esterilidad. beta-amilasa. - - 3. La alfa-amilasa se caracteriza por atacar los enlaces 1. que impide la disolución de oxígeno en el reactivo y hidróxido sódico.5dinitrobenzóico). así como la conexión de válvulas y aditamentos. puesto que las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan moléculas de almidón dando como productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa. amilosa y amilopectina. bajo las condiciones del método. Esta familia de enzimas hidroliticas esta compuesta por proteínas catalíticas: alfa-amilasa. La utilización de un caldo con sales minerales y almidón como única fuente de carbono en la experiencia. por lo que se conoce como endoamilasa. El reactivo consiste en una disolución formada por los siguientes compuestos: ácido dinitrosalicílico (ácido 2-hidroxi-3.4-alfa-glicosidicos en el centro de la cadena de los polisacáridos. en presencia del grupo reductor .2. 4. La remoción de calor. el ácido 2-hidroxi-3. se debe por la actividad amilasa. maltosa y oligosacáridos.

inoculación. La porosidad en el sustrato está determinada por la geometría y tamaño. Cada módulo cuenta con un brazo de mezclado. para formar un grupo carboxílico. 6. al igual que a una densidad aparente alta favorecerá el crecimiento debido al oxigeno que favorece según sea el caso de crecimiento microbiano. En este método analítico el DNS está en exceso frente a los grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad. de tal forma que mayores concentraciones de azúcares reductores provocan una mayor coloración de la muestra. en el desarrollo de productos de uso alimenticio. formando el acido 3-amino-5-dinitrosalicílico. control de humedad. el cual rota alrededor axialmente. 5. los cuales requieren altas condiciones de asepsia y condiciones de alta precisión (Suryanayan. por lo que una eventual compactación modifica el volumen y porosidad hasta alcanzar un equilibrio. como esterilización. por consiguiente que a menor espesor de lecho mayor crecimiento se obtendrá. El equipo consta de charolas selladas colocadas una sobre la otra formando dos torres unidas por un eje central. de producto y post-esterilización. recuperación. se realiza en un solo equipo. Todas las operaciones del proceso fermentativo. . el cual ya es utilizado para un proceso de cultivo eficientemente en plantas industriales en Biocon. control. aireación y vapor para la esterilización. Birreactores para fermentación en estado sólido Biorreactor Biocon: Biocon diseñó. desarrolló y patentó un nuevo biorreactor llamado PlaFactor TM para llevar a cabo fermentaciones usando matrices sólidas. 2000). y con canales de remoción de calor metabólico. El sistema fue higiénicamente diseñado y automatizado para un proceso de cultivo en charola. Este equipo fue diseñado con el objetivo de reemplazar los cuartos de incubación por un equipo más compacto.de la glucosa. más específicamente al grosor en se ha dispuesto para la fermentación. pero se ha observado un mejor crecimiento en fermentaciones con menor espesor de lecho. Espesor de lecho y densidad aparente en una fermentación sólida. Estas diferencias de coloración pueden determinarse por espectrofotometría visible. Y la densidad aparente es la relación entre el volumen de aire contenido en el sustrato y el volumen total del sustrato. El equipo PlaFactorTM es un sistema que cuenta con estudios del uso cultivos sólidos para la producción de agentes de biocontrol y productos farmacéuticos a nivel industrial. mientras que el grupo aldehído reductor se oxida. enfriamiento. La fermentación se lleva a cabo en un biorreactor controlado por computadora. El espesor de lecho se refiere a la cantidad de sustrato disponible para una fermentación sólida. Básicamente una desidad aparente y espesor de lecho altos van a incidir en la fermentación sólida dependiendo del tipo de sustrato y microorganismo con que se trabaje. a la longitud de onda de máxima absorbancia de 540nm.

rivela. Las variaciones en el lecho han permitido un mejor funcionamiento de este sistema ya que se utilizan pedazos de esponjas. El sistema provee un incremento en la transferencia de oxigeno a la cama de sustrato. Los primeros biorreactores constaban de un cilindro de vidrio. sin embargo causaba problemas de compactación. se presenta daño al inoculo por causa del gran esfuerzo de corte generado. así como también canastas o cajas delgadas de acero inoxidable. El principio del diseño se basa de proveer agitación y aireación por flujo forzado de aire proveyéndolo por la parte del cilindroa través de una bomba. los cuales fueron previamente colocados a lo largo del contenedor. . Dichos soportes son llenados por el medio sólido a fermentar. llenado por una carga completa de lecho o sustrato. sin embargo. además de que se forman gradientes de temperaturas a través de la columna que puede afectar el producto deseado. polímeros sintéticos. 2001. 2000).Biorreactor de lecho fluidizados: Sistema de operación en modo continuo el cual puede ser operado por altos periodos de tiempo a un alto valor de productividad. con o sin chaqueta. troncos naturales. que cuenten con perforaciones que permiten tener una eficiente inmovilización de las células en el soporte con el medio de cultivo (Ogbonna.

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