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UNIVERSIDAD TECNICA DE MACHALA FACULTAD DE CEINCIAS QUIMICAS Y DE LA SALUD ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA __________________________________________________________________________________________________________

HEMOGRAMA O BIOMETRA HEMTICA El recuento de hemates y leucocitos es el laboratorio clnico ha ido evolucionando de manera paulatina hasta llegar en la actualidad al diseo y construccin de aparatos cientficos que permiten hacer un gran nmero de determinaciones en tiempo relativamente corto. Durante mucho tiempo y se puede decir que hasta la actualidad se han usado las tcnicas con las pipetas de disolucin, cmaras de recuento y la microscopia ordinaria y de campo claro. Hasta hace tiempo los aparatos automticos todava presentaban algunas limitaciones como por ejemplo no registraban valores muy altos o muy bajos de las clulas sanguneas o en la formula leucocitaria representar un solo porcentaje de las sub-poblaciones de Leucocitos como son, Neutrfilos, Eosinfilos, Basfilos a los cuales se les debe llamar leucocitos grandes. Los aparatos ms recientes han superado las limitaciones y proporcionan una gran cantidad de parmetros biolgicos y clnicos de cuyos alcances deben ser muy bien instruidos los laboratoristas clnicos y los mdicos. Tenemos que reconocer con toda propiedad el recuento globular sanguneo con pipetas de dilucin, cmaras de recuento, este proceso es largo, tedioso y sujeto a causas de error, pero la practica insistente llega a perfeccionar los detalles, para que se reduzcan al mnimo los errores y de esa manera los resultados que se obtengan sean seguros y confiables. I. RECUENTO DE HEMATES Y LEUCOCITOS 1.1 MATERIAL NECESARIO 1.1.1 Pipetas de dilucin Las ms usadas son las del modelo de Thoma y consisten en tubos capilares con un ensanchamiento o bulbo entre ellos. En los capilares inferiores se presentan las marcas, (0.5 y 1) en los capilares superiores la marca 101 (para hemates) y 111 (para leucocitos). En el bulbo o ensanchamiento hay una perla de vidrio de color rojo para hemates y una perla de color blanco para leucocitos y sirve no solo para diferenciar las rpidamente sino que se constituyen en ncleos de agitacin para facilitar la mezcla de la sangre con el liquido de dilucin. Las pipetas se acompaan de mangueritas de caucho con boquilla para facilitar la absorcin tanto de la muestra o lquido de dilucin. 1.1.2 Cmara de cuenta-glbulos Se la llama tambin cmara de recuento celular o hemacitometro siendo la ms usada la de Thoma modificada por

Neubaver y que se presenta como una placa de vidrio grueso e incoloro cruzado trasversalmente por dos surcos que delimitan tres porciones: una central donde se encuentran los reticulados para el recuento y dos sobresalientes sobre las cuales se asienta el cubre cmara.
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Este cubre cmara es una plaquita de vidrio poco ms gruesa que los cubre objetos ordinarios y perfectamente plana en toda su rea. El reticulado para recuento de hemates tiene 1 mm3 de superficie dividido en 25 cuadros medianos y limitados por doble lnea y cada cuadro mediano subdividido a su vez en 16 cuadraditos pequeos. El rea destinada para el recuento de leucocitos son los 4 cuadrados de los ngulos y tiene cada uno 1mm3 dividido en 16 cuadrados medianos y limitados por lneas simples.

1.1.3 Lquidos de dilucin 1.1.3.1 Lquidos de dilucin para hemates Cualquier solucin o lquido que se use con este propsito deber cumplir con la condicin bsica de ser isotnico con respecto al plasma sanguneo de tal manera que se mantenga la integridad de los hemates; uno de estos lquidos es el de Hayem que tiene la siguiente composicin: Cloruro de mercurio 0.05 gr. Sulfato de sodio 5 gr. Cloruro de sodio 1 gr. Agua destilada 200 ml. Su conservacin es definida a temperatura ambiente pero se debe descartar si aparece turbidez o sediment. 1.1.3.2 Lquidos de dilucin para leucocitos El de uso ms generalizado es de Turh que se prepara mezclando 1 a 3 ml de acido actico glaciar, 1 ml de una solucin al 1 % en agua de azul de metileno o violeta de genciana y 100ml de agua. El acido actico vuelve hipotnica a la solucin con lo que se logra destruir un buen numero de hemates, mientras que los colorantes tien ligeramente los ncleos de los leucocitos facilitando su visualizacin y recuento.

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1.2 TCNICAS 1.2.1 Llenado de la pipeta Se aspira con pipeta la muestra de sangre capilar o venosa hasta la marca 0.5 sin rebasarla. Se limpia la punta de la pipeta y se comienza a aspirar el lquido de dilucin respectivo. Al comienzo de la aspiracin las pipetas deben estar ligeramente inclinadas y se desimprime un ligero movimiento de rotacin. Cuando este cerca de llenarse la pipeta debe estar ya vertical y se enrraza cuidadosamente y se enrraza en las marcas superiores sin rebasar. Se saca la manguerita de caucho, se coloca la pipeta entre los dedos medios y pulgar y se des-imprime un movimiento d agitacin perpendicular al eje longitudinal de la pipeta durante 10 a 20 seg y finalmente se las coloca en los agitadores mecnicos durante 45 seg. 1.2.2 Carga de la cmara De manera previa la cmara y el cubre cmara debern estar perfectamente limpios y secos lo que se logra pasndoles un algodn con acetona. Se toma la pipeta cargada, se eliminan 3 o 4 gotas de cada una de ellas y con la subsiguiente se carga la cmara en los espacios que fueron destinados, con anticipacin hay que procurar que la gota depositada en la cmara no sea tan grande como para que se extienda o derrame a los surcos laterales. Una vez cargada la cmara se deja en reposo 5 minutos para que se asienten las clulas. 1.2.3 Recuento al microscopio 1.2.3.1 Recuento de hemates Se lleva la cmara al microscopio y con el lente de 40x o de mayor aumento se ubica el reticulado central de 25 cuadrados medianos. Los hemates se contaran en 5 de estos 25 cuadrados medianos: 4 en las esquinas y uno central, sin tomar en cuenta los hemates que estn sobre la doble lnea izquierda y superior, se suman las 5 cifras parciales y se multiplica por 10.000 obtenindose la cifra de hemates por mm3 de sangre circulante. Ejemplo 86 + 93 + 87 + 95 + 82 = 443 443 * 10.000 = 4430.000 x mm3 1.2.3.2 Recuento de leucocitos Con la platina de microscopio se pasa a la parte de la cmara que se cargo para leucocitos y con los lentes de 10x o 40x se busca y se ubica los 4 ngulos del reticulado cada uno de los cuales est dividido en 16 cuadrados medianos limitados por lneas imples. Se cuentan los leucocitos en estos cuatro cuadrados de las esquinas se suman las 4 cifras parciales y se multiplican por 50 con lo que se obtiene el nmero de leucocitos de sangre circular. Ejemplo. 35 + 29 + 37 + 28 = 129
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129 * 50 = 6.450 mm

Valores normales de leucocitos: De 5.000 a 10.000 leucocitos por microlitros (ul) Valores normales de eritrocitos: Hombres de 4.3 a 7 millones por mm3 o ul Mujeres de 4.1 a 5.4 millones por mm3 o ul Patologas asociadas con alteracin en la concentracin de eritrocitos por baja de eritrocitos anemia Patologas asociadas con alteraciones en la concentracin de leucocitos. Por exceso de leucopenia para los adultos menos de 10.000 para los nios menos de 12.000 involucrada por factores como la edad, el peso e infecciones bacterianas micticas y parasitarias, como por ejemplo por infeccin con bacilo de , bordethella, aspergillus fumigatus, Sporothrix
schenckii, plasmodium vivax, etc., respectivamente.

Por exceso de leucocitos: (leucocitosis) estimulada por infecciones bacterianas como meningitis causada por neisseria meningitidis, neumona originada por estreptococos neumona, gangrena originada clostridium tetani, y factores fisiolgicos que demanden un elevado gasto de energa como ejercicio fsico exagerado en la menstruacin y durante la labor de parto.

ERRORES DE LA TCNICA 1. La contaminacin de los lquidos de dilucin de Turk para los blancos y de Hayem para los rojos, lo cual puede ocasionar un resultado ocasionado de contaje globular en un paciente. 2. La falta de limpieza da la cmara de recuento globular o citometro con una torunda de algodn con alcohol lo cual dificulta la visualizacin clara y precisa de las clulas hemticas ya sea por el polvo o por la grasa de los dedos, al momento de manipular dicho material. 3. El no dejar reposar el citometro como mnimo de unos dos a minutos y como mximo 15 minutos. Ciertos laboratorios el lugar de ampliar pipetas de dilucin hacen uso de las pipeta automticas donde para trabajar en el recuento de leucocitos lo hacen con una dilucin de 1 2n 20 es decir, 1 ul de muestra 19 ul de liquido de Turk y para Hemates en dilucin de 1 en 100, distribuyendo una landa de la muestra en 99 ul de liquido de Hayem, pero el problema estriba cuando al ejecutar esta tcnica los lquidos de dilucin estn mal preparados, por ejemplo si el liquido posee una concentracin exagerada de sus solutos consecutivos, esto conllevara a reportar un numero exagerado de clulas sanguneas y viceversa en un liquido demasiado dbil; pudiendo remediar este inconveniente en el primer caso diluyendo aun ms el liquido de Turk o de Hayem y en el segundo caso disminuyendo la dilucin de dichos lquidos.

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HEMATOCRITO (HT)

Se lo abrevia con la letra Ht tambin conocido como volumen de clulas centrifugadas PCV que se expresa en %, nos indica la cantidad de eritrocitos que se mantienen intactos despus de haber sido sometidos a un proceso de centrifugacin. TCNICA DE MICROHEMATOCRITO. 1. Primero llenamos el tubo capilar con la muestra de sangre del paciente hasta la partes del mismo. 2. Sellamos el extremo del capilar por donde realizamos su llenado con la muestra sangunea. Llevamos a centrifugacin procurando que la parte sellada se ubiqu en la periferia del plato de la microcentrfuga y el extremo libre en la parte central de el mismo. 3. Centrifugamos a 10.000 o 15.000 revoluciones por minuto (rpm). 4. Leemos en la tabla diseada para esta tcnica. PARMETROS NORMALES Recin nacidos Hombre y mujeres 45 a 65 $ (hasta una semana) De una semana hasta dos semanas en hombres y mujeres 35 al 54 % De dos meses hasta los 15 aos 32.3 al 44.5 % De 15 aos en adelante Hombres 40 al 54 % Mujeres 37 al 47 % ERRORES DEL MTODO. 1. Si no sellamos correctamente el capilar una vez llenado con la muestra. 2. En una persona a la cual se le est realizando un seguimiento en un proceso anmico no es recomendable que si dicho paciente sufre un accidente con presencia de hemorragias se determine el hematocrito por que el resultado va hacer demasiado bajo. 3. El tiempo de centrifugacin que si no es el adecuado nos puede dar un hematocrito demasiado elevado.
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4. La utilizacin exagerada de anticoagulantes que producen un efecto contrario para el cual han sido diseados estos reactivos, esto quiere decir que en lugar de que las clulas sanguneas (glbulos rojos) puedan mantenerse dispersas y de forma homognea en el plasma tiendan a sedimentarse y al momento de establecer el valor de hematocrito este ser muy bajo. HEMOGLOBINA
La hemoglobina es una protena que contiene hierro y que le otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glbulos rojos y es la encargada del transporte de oxgeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. La hemoglobina tambin transporta el dixido de carbono, que es el producto de desecho del proceso de produccin de energa, lo lleva a los pulmones desde donde es exhalado al aire. El anlisis de la hemoglobina se realiza normalmente en un estudio completo de hematimetra, con el recuento de glbulos rojos o hemates.

Aspectos bioqumicos Mtodo foto-colorimtrico REACTIVOS 1. Reactivo 1 o de DRABKIN.- Contiene ferricia de potasio, cianuro de potasio, bicarbonato y agua destilada. 2. Reactivo 2 o ESTNDAR.- contiene hemoglobina 14.8 gr/dL Tcnica 1. En 3 tubos de ensayo previamente limpios, secos y rotulados ( al primero con B, al segundo con T o S y al tercero con D y colocamos 5 ml de R1) 2. Al tubo T colocamos 20 ul del R2. 3. Al tubo D colocamos 20ul de la muestra (sangre no coagulada con utilizacin de EDTA o Heparina). 4. Mezclamos por inversin y dejamos a temperatura ambiente hasta obtener un cambio de coloracin. 5. Luego llevamos al espectrofotmetro utilizando en filtro de 540 mm al 100% de trasmitancia (T) o cero de absorbancia (ab) con el blanco. 6. Luego finalmente lee la trasmitancia y por ende la absorvancia de nuestro testigo y del desconocido, 7. Clculos:

Parmetros normales Edad 1 semana de vida 1 semana a 2 meses 2 meses a 1 ao 1 ao a 3 aos 3 aos a 8 aos 8 aos a 15 aos 15 aos en adelante
era

Hombres (mg/dL) 17 21 11 17 11 15 10 15 11 15 11 16 14 18

Mujeres (mg/dL) 17 21 11 17 11 15 10 15 11 15 11 16 12 16

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Fundamento
Comprende la ejecucin de tres reacciones, la primera es la combinacin de la hemoglobina con el ferri cianuro de potasio para formar metahemoglobina. La segunda combinando metahemoglobina con cianuro de potasio para obtener Cian metahemoglobina que es el compuesto a medirse en el espectrofotmetro y que es directamente proporcional a la hemoglobina del paciente.

LEYES EN LAS QUE SE BASAN LAS MEDICIONES COLORIMTRICAS AL SER DETECTADAS EN UN ESPECTROFOTMETRO O FOTOCOLORMETRO.

LE Y DE LAMBERT.- nos indica que la energa radiante absorbida es inversamente proporcional a la energa radiante total que incide sobre una muestra pero directamente proporcional a la concentracin de la sustancia en anlisis tal como nos indica la siguiente frmula: K.L K: Energa radiante total L: Espesor de seno lquido (cm) LEY DE BEER.- Nos indica que la intensidad de energa radiante absorbida es directamente proporcional al nmero de molculas de muestra a determinar su concentracin tal como lo seala la siguiente formula. K.E.C K: Energa radiante total E: Energa radiante absorbida C: Concentracin de la muestra (mol/l)
CONSTANTES CORPUSCULARES Existen tres constantes que contribuyen tambin con el mdico para a nivel sanguneo dar un buen diagnostico, para evitar patologas producto de las anemias que el paciente este desarrollando como por ejemplo la anemia micro citica y macro citica. Estas constantes son 3: Volumen corpuscular medio (VCM VGM).- Esta se representa en unidades de femtolitros (fL) que no es otra cosa que el volumen promedio que representa cada eritrocito, se lo calcula mediante la siguiente frmula.

Donde: Ht: Es el valor del hematocrito expresado en porcentaje RCR: Es el valor absoluto del recuento de los glbulos rojos por cada mm3 de sangre. _____________________________________________________________________________ 7

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Ejemplo: Un paciente presenta Ht: 30 % RCR: 3300.000 ery/mm3 sangre Por lo tanto su VCM ser

Entonces si los parmetros normales de VCM son de 80 a 95 fl un parmetro superior a 95 nos inducir a pensar que el paciente puede estar presentando un cuadro de anemia macroctica y viceversa si los parmetros de VCM se encuentran por debajo de 80 fl. ANEMIA MICROCITICA.- Es el resultado de un producto de eritrocitos de tamao inferior al normal es decir menor de 80 U3 lo cual conlleva a que el organismo como una forma que eliminan lo anormal de nuestro cuerpo sintetiza enzimas que elisan a los micrositos (GR inmaduros pequeos) y con esto que la hemoglobina liberada se deposita debajo de la piel formando pequeas pecas o petequias, una de las manifestaciones de la tolerancia sin contar en esta ultima tambin se caracteriza sin desarrollo de esplenomegalia ( aumentando del tamao del vaso) y en el caso de los nios por bloquear el desarrollo o crecimiento normal en ellos, en conclusin este tipo de anemia es el resultado de deficiencia de hierro en concentraciones normales en la sangre. ANEMIA MACROCITICA.- se caracteriza por desarrollo de eritrocitos anormales de tamao superior a los 9 um que es el tamao limite normal de todo hemates y que en consecuencia de alteraciones en el correcto funcionamiento de la medula sea que estimula en esta situacin una produccin excesiva de hemates y con esto que se inhiba la capacidad de limite de tamao normal en este tipo de clulas sanguneas. ( Ejemplo: Si nuestra muestra tuviese un valor de hemoglobina de 10.3 y el nmero de eritrocitos (GR) 3520.000 nuestro HbCM. ser: )

Los valores normales de esta constante oscilan de 27 31 pg. Conocindose cuando se muestra dentro de lo normal como monocrmico y cuando esta debajo de lo normal como hipocrmico. Esta constante permite confirmar los resultados del VCM.

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Concentracin de HbCM (CHbC o CmHb) Se expresa en unidades de gr/ dL y nos indica la concentracin promedio de Hb dentro de cada hemate, se la calcula de acuerdo ha la formula: ( )

Los parmetros normales de ello atributan entre 32 36 gr/Dl y nos facilita la comprobacin de las dos constantes detalladas anteriormente. Ejemplo: Si la hemoglobina fuese 15.7 y el hematocrito 48 la concentracin de HbCM. ser ( )

PARMETROS NORMALES VCM HbCM. CHbCM. 80 95 fl 27 31 pg. 32 36 g/dl

CONSTANTES CORPUSCULARES VGM.- Volumen de glbulo medio VCM.- Volumen corpuscular medio HbCM.- Hemoglobina corpuscular media CHbCM.- Concentracin de hemoglobina corpuscular media. Macrocit.- es un eritrocito con un tamao mayor a 9 u3 Microcito.- es un eritrocito con un tamao menor a 80 u3 ESTUDIO DE EXTENSIONES COLOREADAS DE SANGRE En la actualidad la tcnica que aun se sigue utilizando en los laboratorios clnicos incluye el uso de 2 porta objetos, el uno que acta como extensor y el otro que es donde se efectuara el extendido, ambos deben ser de borde biselado y de extremos rombos, sin embargo hay quienes aseguran que el empleo de un cubre-cmaras fijado a un baja lenguas fijado con cinta adhesiva para facilitar el papel del extensor en la realizacin de una extensin de sangre, e incluso que dos portaobjetos entre s puedan servir para el mismo efecto, e incluso ayudarnos a realizar un examen de medula sea sin considerar que en ciertas ocasiones puede llevar a una
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mala formacin de las clulas sanguneas al haber una demasiada presin sobre el cubre objetos para obtener la extensin pertinente de sangre entre ellos. No obstante el colorante a utilizarse con cualquiera de estos materiales de vidrio es el Writigh el mismo que suele presentarse en forma de polvo y que para una buena preparacin de l es aconsejable ser triturado con un mortero (100mg) y luego agregarle alcohol metlico (60 ml) mesclar con el pistilo ambos componentes y dejar macerar por 2 das dentro de l mortero y bien tapado, para luego de este laxo de tiempo proceder a filtrar obteniendo el Writigh solubilizado en las condiciones apropiadas para trabajarlo. PUNTOS QUE NOS ENCAMINAN A COMPROBAR LA CALIDAD DE UN EXTENDIDO DE SANGRE: 1. Que el extendido ocupe las partes del portaobjeto base, (donde se va a realizar la extensin). 2. Que la gota de sangre sea extendida en las partes del objeto lo cual indica que se ha tomado la cantidad adecuada de sangre. 3. La ausencia de estras o espacios libres de extensin sobre la placa base. 4. Que la cola del extendido tenga la forma de un dedo pulgar ms no de una bala es decir no en punta. 5. Al momento de visualizar el extendido contra la luz este se observa como un arcoris. TCNICA 1. En la cuarta parte de un porta objeto procedemos a rotularlo como se nos facilite la identificacin de nuestro paciente. 2. Colocamos una gota de sangre a continuacin en el mismo porta objeto base. 3. Colocamos el porta objetos extensor sobre dicha gota de sangre con una inclinacin de 450 hasta lograr que la muestra fluya por todo lo ancho del extensor especficamente a nivel del borde que est en contacto con ella. 4. Realizamos la extensin en un solo sentido y de preferencia hacia delante y no de forma inversa con la finalidad de evitar contaminacin de nuestra rea de de trabajo con la muestra biolgica y en donde dicha extensin debe ser de un solo golpe y no de manera pausada para evitar la fragmentacin de la gota y que las clulas leucocitarias queden mal distribuidas en toda la extensin, sea que en la cabeza se depositen las clulas ms grandes y pesadas y en la cola las ms pequeas y livianas quedando en el medio sin nada. 5. Dejamos secar a temperatura ambiente. 6. Teimos con writigh por unos 5 10 15 20 minutos dependiendo de la calidad del colorante y lavamos con agua destilada la que proporciona un pH neutro, dejamos secar. 7. Limpiamos el reverso de la placa donde no se encuentra teido posteriormente colocamos una gota de acetite de inmersin sobre el teido y observamos sobre el microscopio con el lente objetivo de 10x, utilizando el condensador completamente arriba y el diafragma abierto. Forma correcta de hacer el extendido

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VALORES NORMALES DE FORMULA LEUCOCITARIA VALOR ABSOLUTO GRUPO DE LEUCOCITOS VALOR % Neutrfilos Linfocitos Monocitos Eosinfilos Basfilos 55 - 70 % 2500 - 8000 mil/mm3 20 - 40 % 1000 - 4000 mil/mm3 2-8% 1-4% 0-1% 100 - 700 mil/mm3 50 - 500 mil/mm3 25 - 100 mil/mm3

VALORES NORMALES DE ERITROSEDIMENTACIN Recin Nacidos Lactantes Hasta la Pubertad Hombres Jvenes Hombres Adultos Hombres Mayores Mujeres Jvenes Mujeres Adultas Mujeres Mayores 0 - 2 mm/h 10 mm/h hasta 11 mm/h hasta 10 mm/h hasta 12 mm/h hasta 14 mm/h hasta 10 mm/h hasta 19 mm/h hasta 20 mm/h

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