Factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas

• Concentración de sustrato o sustratos (cofactores) • Concentración de enzima • Inhibidores • Activadores • pH • Temperatura
Rosario A. Muñoz-Clares

Regulación de la actividad enzimática por unión a la enzima de ligandos que no son sustrato
• INHIBIDOR : Molécula o ion que al unirse a la enzima produce una disminución en la velocidad de la reacción catalizada. • ACTIVADOR: Molécula o ion que al unirse a la enzima produce un aumento en la velocidad de la reacción catalizada.

Rosario A. Muñoz-Clares

SATURACIÓN POR INHIBIDORES Y ACTIVADORES REVERSIBLES

30

25

Velocidad (µmol/ml/min)

Velocidad (µmol/ml/min)

20

[S] = cte [E] = cte

25

20

15

15

[S] = cte [E] = cte

10

10

5

5

0 0 5 10 15 20

0 0 5 10 15 20

[Inhibidor] (mM)

[Activador] (mM)

Rosario A. Muñoz-Clares

Caracterización de la inhibición enzimática

• Determinar el tipo de inhibición • Determinar la constante de inhibición

Rosario A. Muñoz-Clares

TIPOS DE INHIBIDORES
• ISOSTÉRICO
El inhibidor se une al mismo sitio que el sustrato (sitio activo).

• ALOSTÉRICO
El inhibidor se une a un sitio diferente al que se une el sustrato (sitio alostérico).

Rosario A. Muñoz-Clares

Muñoz-Clares .TIPOS DE INHIBIDORES – TOTAL Si todas las moléculas de enzima tienen unido al inhibidor la velocidad de la reacción catalizada es cero. Rosario A. – PARCIAL Aun cuando todas las moléculas de enzima tengan unido al inhibidor la velocidad de la reacción catalizada no es cero.

Muñoz-Clares .Inhibición total Ks E + S +I ES kcat Kiu E + P ESI E + I + P Rosario A.

Inhibición parcial Ks E + S +I ES kcat Kiu E + P ESI β<1 βkcat E + I + P Rosario A. Muñoz-Clares .

TIPOS DE INHIBIDORES • IRREVERSIBLE k E + I E-I k = cte de velocidad de inactivación de segundo orden • REVERSIBLE E + I k3 k-3 E-I Ki = cte de disociación = k-3/k3 Rosario A. Muñoz-Clares .

pero la union es tan fuerte que se pueden considerar como irreversibles. • Firmemente unidos – [I]t ≈ [E]t El equilibrio E + I EI se alcanza rápidamente. Rosario A. Muñoz-Clares .TIPOS DE INHIBIDORES • Clásicos – [I]t >> [E]t El equilibrio E + I EI se alcanza rápidamente y es fácilmente reversible.

Forman complejos con la enzima que no pueden participar en la reacción. Estos inhibidores sólo pueden unirse y despegarse de la especie de la enzima por la que tengan afinidad. disminuyen la proporción de la enzima disponible para unir el sustrato. y (2) porque revierten la reacción (en el caso de reacciones reversibles). – Pueden ser productos. Rosario A.TIPOS DE INHIBIDORES REVERSIBLES PRODUCTOS • Inhiben porque: (1) al unirse a la especie de la enzima por la que tienen afinidad. que ya no están disponibles para que se una el sustrato. SIN SALIDA • Inhiben porque secuestran formas de la enzima. Muñoz-Clares . sustratos o análogos de sustratos o productos.

TIPOS DE INHIBIDORES REVERSIBLES • PRODUCTO E + S E-S E-P E + P • SIN SALIDA E + I E-I Rosario A. Muñoz-Clares .

Muñoz-Clares .TIPOS DE INHIBIDORES – LINEAL (Total) Si los regráficos de los intersectos o pendientes de las gráficas de dobles recíprocos dependen linearmente de la concentración de inhibidor – HIPERBÓLICO (Parcial) Si los regráficos de los intersectos o pendientes de las gráficas de dobles recíprocos dependen hiperbólicamente de la concentración de inhibidor – PARABÓLICO (Total) Si los regráficos de los intersectos o pendientes de las gráficas de dobles recíprocos dependen parabólicamente de la concentración de inhibidor Rosario A.

Muñoz-Clares .INHIBIDORES LINEALES – Aparecen términos en el denominador de la ecuación de velocidad proporcionales a la concentración de inhibidor – Los regráficos de los parámetros cinéticos aparentes vs la concentración de inhibidor son lineales – Producen una inhibición total Rosario A.

Muñoz-Clares .TIPOS DE INHIBIDORES REVERSIBLES • COMPETITIVO – El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con la unión del sustrato • INCOMPETITIVO – El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato interfiriendo con la formación de producto • MIXTO – El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzimasustrato. por tanto interfiriendo la unión del sustrato y la formación del producto • NO COMPETITIVO – Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une con igual afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato Rosario A.

Nomenclatura de las constantes de inhibición • Competitiva: Constante de disociación del complejo EI E + I ↔ EI Kd = [E][I]/[EI] Kic ó Kis • Incompetitiva: Constante de disociación del complejo ESI ES + I ↔ ESI Kd = [ES][I]/[ESI] Kiu ó Kii ó αKi Rosario A. Muñoz-Clares .

Inhibición competitiva lineal E + S +I Kic Ks ES kcat E + P EI + S ESI E + I+ P Rosario A. Muñoz-Clares .

INHIBICIÓN COMPETITIVA LINEAL v = kcat[ES] [Etotal] = [E] + [ES] + [EI] Ks = [E][S]/[ES] [ES]/[Etotal] = Kic = [E][I]/[EI] [E][S]/Ks = [S]/{Ks( 1 + [I]/Kic) + [S]} [E] + [E][S]/Ks + [E][I]/Kic v = kcat[Etotal][S] / {Ks( 1 + [I]/Kic) + [S]} v = Vmax[S] / {Ks( 1 + [I]/Kic) + [S]} Rosario A. Muñoz-Clares .

ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN PRESENCIA DE UN INHIBIDOR COMPETITIVO LINEAL • Ecuación hiperbólica Vmax [S] v= Km ap + [S] • Ecuación lineal Km 1 1 + = Vmax ap Vmax v Rosario A. Muñoz-Clares .

Inhibición incompetitiva lineal Ks E + S +I ES kcat Kiu E + P ESI E + I+ P Rosario A. Muñoz-Clares .

INHIBICIÓN INCOMPETITIVA LINEAL v = kcat[ES] [Etotal] = [E] + [ES] + [ESI] Ks = [E][S]/[ES] Kiu = [ES][I]/[ESI] = [E][S][I]/[ESI]Ks [E][S]/Ks [ES]/[Etotal]= = [S]/{Ks+ [S]( 1 + [I]/Kiu)} [E] + [E][S]/Ks + [E][S][I]/KiuKs v = kcat[Etotal][S]/{Ks+ [S]( 1 + [I]/Kiu)} v = Vmax[S]/( 1 + [I]/Kiu) / {(Ks/ ( 1 + [I]/Kiu) + [S])} Rosario A. Muñoz-Clares .

ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN PRESENCIA DE UN INHIBIDOR INCOMPETITIVO LINEAL • Ecuación hiperbólica Vmax ap [S] v = Km ap + [S] • Ecuación lineal Km 1 1 + = V Vmax ap v max Rosario A. Muñoz-Clares .

Muñoz-Clares .Inhibición mixta lineal E + S +I Ki Ks ES +I kcat E + P αKi EI + S αKs ESI E + I+ P α>1 Rosario A.

INHIBICIÓN MIXTA LINEAL v = kcat[ES] [Etotal] = [E] + [ES] + [EI] + [ESI] v = kcat[Etotal][S]/{Ks ( 1 + [I]/Kic) + [S]( 1 + [I]/Kiu)} v = Vmax[S]/( 1 + [I]/Kiu)/{Ks[( 1 + [I]/Kic)/( 1 + [I]/Kiu)]+[S] Rosario A. Muñoz-Clares .

ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN PRESENCIA DE UN INHIBIDOR MIXTO LINEAL • Ecuación hiperbólica Vmax ap [S] v= Km ap + [S] • Ecuación lineal Km ap 1 + 1/v = Vmax ap Vmax ap Rosario A. Muñoz-Clares .

Muñoz-Clares .Inhibición no competitiva lineal E + S +I Ki Ks +I ES Ki kcat E + P EI + S Ks ESI E + I+ P Rosario A.

INHIBICIÓN NO COMPETITIVA LINEAL v = kcat[ES] [Etotal] = [E] + [ES] + [EI] + [ESI] Ki = Kic = Kiu v = kcat[Etotal][S]/{Ks ( 1 + [I]/Ki) + [S]( 1 + [I]/Ki)} v = Vmax[S]/( 1 + [I]/Ki)/(Ks + [S]) Rosario A. Muñoz-Clares .

Muñoz-Clares .ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN PRESENCIA DE UN INHIBIDOR NO COMPETITIVO LINEAL • Ecuación hiperbólica Vmax ap[S] v = Km + [S] • Ecuación lineal Km 1 + V 1/v = V max ap max ap Rosario A.

Ecuación de velocidad inicial en presencia de inhibidores lineales Reacción monosustrato v = Vmax[S]/(Ks+ [S]) Inhibición competitiva lineal v = Vmax[S]/{Ks( 1 + [I]/Kic) + [S]} Inhibición incompetitiva lineal v = Vmax[S]/{Ks+ [S]( 1 + [I]/Kiu)} Inhibición mixta lineal v = Vmax[S]/{Ks( 1 + [I]/Kic) + [S] ]( 1 + [I]/Kiu)} Inhibición no competitiva lineal v = Vmax[S]/{Ks( 1 + [I]/Ki) + [S] ]( 1 + [I]/Ki)} Rosario A. Muñoz-Clares .

Muñoz-Clares .Efecto de los inhibidores lineales sobre la ecuación de velocidad inicial Un inhibidor sin salida lineal introduce un factor (1 + [I]/Ki ) al término en el denominador de la ecuación de velocidad que representa la especie de la enzima a la que se une el inhibidor Rosario A.

Efecto de los inhibidores lineales sobre los parámetros cinéticos Inhibición Competitiva Parámetro Vmax Vmax/Km Km Vmax Vmax/Km Km Vmax Vmax/Km Km Vmax Vmax/Km Km Parámetro aparente Vmax (Vmax/Km ) / (1 + [I]/Kic) Km(1 + [I]/Kic) Vmax / (1 + [I]/Kiu) (Vmax/Km ) Km / (1 + [I]/Kiu) Vmax / (1 + [I]/Kiu) (Vmax/Km ) / (1 + [I]/Kic) Km(1 + [I]/Kic) / (1 + [I]/Kiu) Vmax / (1 + [I]/Ki) (Vmax/Km ) / (1 + [I]/Ki) Km Rosario A. Muñoz-Clares Incompetitiva Mixta No competitiva .

Muñoz-Clares .PATRONES DE INHIBICIÓN ______________________________________________________ Tipo Patrón _______________________________________________________ COMPETITIVA INCOMPETITIVA MIXTA Líneas que se cruzan en el eje de ordenadas (1/v) Líneas paralelas Líneas que se cruzan en el segundo cuadrante (a la izquierda del eje de ordenadas (1/v)) Líneas que se cruzan en el eje de abscisas (1/[S]) (a la izquierda del eje de ordenadas (1/v)) NO COMPETITIVA Rosario A.

competitivo o incompetitivo. predomine Rosario A.Efecto de los inhibidores sobre la velocidad de flujo de una ruta metabólica A E1 B E2 C E3 D La inhibición de cualquiera de las enzimas lleva a un aumento en la concentración de su sustrato. • Si el inhibidor es COMPETITIVO se contrarresta la inhibición • Si el inhibidor es INCOMPETITIVO se favorece la inhibición • Si el inhibidor es MIXTO se contrarresta o favorece la inhibición dependiendo de cual de los dos componentes. Muñoz-Clares . Por tanto.

Muñoz-Clares .Determinación de Ki Inhibición lineal • Regraficar los valores del parámetro cinético aparente frente a la concentración de inhibidor (hipérbola) Cap = C/(1 + [I]/Ki) = CKi /(Ki +[I]) • Regraficar el inverso de los valores del parámetro cinético aparente frente a la concentración de inhibidor (línea recta) 1/Cap = (1 + [I]/Ki)/C = 1/C + [I]/KiC Cap = Vmax ap o (Vmax/Km )ap Rosario A.

00 0 0 ki [I] -ki [I] Rosario A. Muñoz-Clares .Determinación de Ki Inhibición lineal Cap = CKi /(Ki +[I]) 1/Vmax ap ó 1/ (Vmax /Km)ap Vmax ap ó (Vmax /Km)ap 1/Cap = 1/C + [I]/KiC 0.

Constante de inhibición aparente (I50) en inhibición lineal I50 es la concentración de inhibidor que reduce la velocidad de la reacción a la mitad de la que existe en ausencia del inhibidor Es una Ki aparente Inhibición competitiva I50 = Kic( 1 + [S]/Ks) Inhibición incompetitiva I50 = Kiu( 1 + Ks/[S]) Inhibición mixta I50 = αKi ( 1 + Ks/[S]) / ( 1 + αKs/[S]) Inhibición no competitiva I50 = Ki Rosario A. Muñoz-Clares .

03 10 v 0.04 vi = v0 I50/(I50 + [I]) 1/ v 15 0. Muñoz-Clares .00 I50 [I] I50 [I] Rosario A.Determinación de I50 en inhibición total [S] = constante [E] = constante 1 1 [I] = + vi v0 I50 v0 0.05 20 0.02 0.01 5 GRÁFICO DE DIXON 0 0 5 10 15 20 -5 0 5 10 15 20 0.

Ki versus I50 • Ki es el valor de concentración de inhibidor al que el parámetro cinético afectado (Vmax o Vmax/Km) se reduce a la mitad del determinado en ausencia de inhibidor. Rosario A. Muñoz-Clares . • I50 es el valor de concentración de inhibidor que reduce la velocidad de la reacción a la mitad de la que existe en ausencia del inhibidor. – No depende de la concentración de sustrato. – Depende de la concentración de sustrato a la que se determina.

02 0 0 1 2 3 4 5 0.Inhibición por sustrato v = Vmax [A]/{KmA + [A](1 + [A]/KsiA)} 60 Actividad (U/mg proteína) 50 0.04 10 0.10 40 0.08 30 1/v (mg prot/ U) 0.00 0 20 40 60 80 100 [S] (mM) 1/[S] (mM-1) Rosario A. Muñoz-Clares .06 20 0.

TIPOS DE INHIBIDORES REVERSIBLES • Lineales • Hiperbólicos • Parabólicos Rosario A. Muñoz-Clares .

Muñoz-Clares . – Los regráficos de los parámetros cinéticos aparentes vs la concentración de inhibidor son hiperbólicos.INHIBIDORES HIPERBÓLICOS – Aparecen términos en el denominador y en el numerador de la ecuación de velocidad proporcionales a la concentración de inhibidor. Rosario A. – Producen una inhibición parcial.

Inhibición competitiva hiperbólica (parcial) E + S +I Ki (Kic) Ks ES +I kcat E + P αKi (Kiu) EI + S αKs ESI kcat E + I+ P α>1 Rosario A. Muñoz-Clares .

Rosario A. Se le suele llamar inhibición incompetitiva hiperbólica. Muñoz-Clares .Inhibición mixta hiperbólica (parcial) Ks kcat E + S +I Ki ES +I E + P α Ki EI + S αKs ESI βkcat E + I+ P Cuando α = β se obtiene un patrón de inhibición de líneas paralelas y el regráfico de intersectos vs la concentración de inhibidor es hiperbólico. pero en realidad tiene un componente de activación y uno de inhibición.

Muñoz-Clares .INHIBIDORES PARABÓLICOS – Más de una molécula de inhibidor se une a una sola especie enzimática. o una sola molécula de inhibidor a varias especies de la enzima cuyos niveles de estado estacionario dependen una de la otra – Aparecen términos en el denominador de la ecuación de velocidad proporcionales al cuadrado de la concentración de inhibidor – Los regráficos de los parámetros cinéticos aparentes versus la concentración de inhibidor son parabólicos – Producen una inhibición total Rosario A.

Inhibición competitiva parabólica E + S +I Kic Ks ES kcat E + P EI + I E + I+ P Kic´ EI2+ S ESI Rosario A. Muñoz-Clares .

I-parabólica) Ks +I kcat E + S +I Ki (Kic) ES E + P EI + S αKs αKi (Kiu) ESI +I E + I+ P αKi´ (Kiu´) ESI2 Rosario A.Inhibición mixta parabólica (S-lineal. Muñoz-Clares .

• Los patrones de inhibición obtenidos pueden servirnos para proponer el mecanismo cinético. – Por ello. – si el sustrato que se une a la Rosario A. ya que a veces la inhibición frente al sustrato variable se anula si el sustrato fijo es saturante. o confirmar la propuesta hecha en base a estudios de velocidad inicial. Muñoz-Clares . • Hay que determinar la inhibición para cada uno de los sustratos manteniendo el otro fijo a una concentración subsaturante.Inhibición en mecanismos con más de un sustrato – El tipo de inhibición producida por un determinado inhibidor dependerá del mecanismo cinético y del sustrato variable frente al que se esté determinando la inhibición.

• Determinar el tipo de inhibición: – Comprobando cuál es el parámetro cinético (Vmax. en ausencia y presencia de varias concentraciones fijas de inhibidor. – Determinando si la velocidad de la reacción se recupera cuando se elimina el inhibidor del medio en que está la enzima. Muñoz-Clares .Caracterización cinética de los inhibidores • Determinar la velocidad inicial de la reacción catalizada – variando la concentración de sustrato y manteniendo constante la concentración de enzima. por medio de regráficos o I50. o mediante ajuste por regresión no lineal a la ecuación correspondiente. – Determinando si a concentración saturante del inhibidor la velocidad de la reacción es o no es cero. – Determinando si la reacción no permanece linear en el periodo de tiempo en que aún no hay agotamiento del sustrato. • Determinar la constante de inhibición (Ki ): – Graficando la inversa del parámetro cinético que cambia frente a la concentración de inhibidor. Vmax/Km o ambos) que disminuye en presencia del inhibidor. Rosario A.

TIPOS DE ACTIVADORES • ESENCIAL: Se requiere para que ocurra la reacción • NO ESENCIAL: No se requiere para que ocurra la reacción Rosario A. Muñoz-Clares .

Muñoz-Clares .ACTIVADORES ESENCIALES • Se requieren para la unión del sustrato E + A Ka EA + S Ks EAS kcat E +A + P • Se requieren para el (los) paso(s) catalíticos E + S Ks ES + A Ka EAS kcat E+A + P Rosario A.

ACTIVADORES NO ESENCIALES • Favorecen la unión del sustrato E + S + A Ka EA + S Ks ES kcat E + P E + A+ P αKs + A αKa kcat EAS • Favorecen el (los) paso(s) catalíticos E + S Ks ES +A Ka kcat E + P E + A+ P Rosario A. Muñoz-Clares EAS βkcat .

Valores de α y β • Inhibidores α >1 β<1 • Activadores α <1 β>1 • Efectores α >1 β>1 α <1 β<1 Rosario A. Muñoz-Clares .

Muñoz-Clares .Determinación de Ka Activación esencial • Regraficar los valores del parámetro cinético aparente frente a la concentración de activador (hipérbola) Cap = C / (1 + Ka/[A]) = C[A] / (Ka + [A]) • Regraficar el inverso de los valores del parámetro cinético aparente frente al inverso de la concentración de activador (línea recta) 1/Cap = (1 + Ka/[A]) / C = 1/C + Ka/C[A] Rosario A.

Muñoz-Clares .Determinación de Ka Activación esencial 1/Cap = 1/C + Ka/C[A] Cap = C[A] / (Ka + [A]) 0 0 1/ C ap C ap ka [Activador] 0 -1/ka 1/[A] Rosario A.

Efecto de los inhibidores lineales y activadores esenciales sobre los parámetros cinéticos • Inhibidores Cap = C/(1 + [I]/Ki) • Activadores Cap = C/(1 + Ka/[A]) Siendo Cap = Vmax ap o (Vmax/Km )ap Rosario A. Muñoz-Clares .

haciendo una cinética de saturación por su sustrato en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor o del activador. viendo cuál de estos parámetros cinéticos es el que cambia por la presencia del inhibidor o del activador. Determinar el tipo de inhibición o de activación.Diseño y análisis de los experimentos de inhibición o activación reversible de una enzima • Determinar los parámetros cinéticos reales de la enzima (Vmax. Para ello: – Comparar los valores de los parámetros cinéticos aparentes con los reales. Rosario A. la Ki o la Ka es el valor absoluto del intersecto de la línea en el eje de abscisas. Determinar los parámetros cinéticos aparentes (apVmax. Para ello: – Usando la ecuación que relaciona el valor aparente del parámetro cinético con el real. la concentración del inhibidor o del activador y su constante de disociación despejar el valor de ésta última. apVmax/Km). – Regraficar aquel(los) parámetro(s) cinéticos que cambien frente a las diferentes concentraciones del inhibidor o del activador. Determinar la constante de inhibición o de activación. Cuando se grafica el inverso del parámetro cinético. Vmax/Km). – Hacer un gráfico de dobles recíprocos incluyendo los datos obtenidos en ausencia y presencia del inhibidor o del activador y ver si las líneas obtenidas en su presencia muestran cambios en las pendientes y/o intersectos en el eje de ordenadas. Muñoz-Clares • • • . haciendo una cinética de saturación por su sustrato en ausencia del inhibidor o del activador.

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