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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS QUÍMICA- BACHARELADO

RICADO PATRICK DONIZETE SILVA

Exercícios sobre técnicas caracterização/purificação de proteínas

Alfenas/MG 2012

A eletroforese se baseia principalmente na separação de proteínas baseada nas suas cargas líquidas. Usando a técnica de focalização isoelétrica. a massa molar e quantas subunidades a proteína possui.Mostre como é possível determinar a massa molar de uma proteína usando: a) eletroforese desnaturante. a separação das proteínas ocorre em função de seus respectivos pontos isoelétricos numa fita de poliacrilamida com gradação contínua e conhecida de pH. Proteínas menores migram mais depressa que as maiores formando bandas que são visualizadas por coloração específica.3. ela foi separada de diversas outras proteínas que eram contamintes da preparação. O sistema é submetido a uma diferença de potencial e as proteínas migram em direção ao pólo de carga oposta com velocidade proporcional à carga. as proteínas migram sob ação de um campo elétrico em um gel contendo um gradiente de pH e a migração se interrompe ao atingirem seu ponto isoelétrico. Na eletroforese em papel a amostra é aplicada em uma tira de papel. o que proporciona reparação das moléculas segundo seu tamanho. menores serão os poros da malha formada. a) A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilssulfato de sódio (SDS) é um método muito utilizado para a análise de massas moleculares de proteínas oligoméricas. o pH usado para essa técnica foi de 4. um detergente anfipático cuja função é desnaturá-las.3. as proteínas são misturadas com SDS.Quais os princípios da técnica de eletroforese de proteínas. Antes de iniciar a eletroforese. Portanto. Já a eletroforese em gel é a mais utilizada para separação de proteínas. além da sua carga. 3. Os diferentes tipos de eletroforese empregam na sua maioria um suporte sólido (como papel ou gel) que evita a mistura de proteínas por convecção. . A eletroforese em gel permite a separação de proteínas além de fornecer informações adicionais como o número de proteínas. O gel é uma matriz constituída de um polímero de acrilamida com ligações cruzadas de N. ou seja. o ponto isoelétrico da proteína X. 2. cuja porosidade da malha pode ser escolhida. Nesta técnica. Quanto maior a concentração de acrilamida. as variáveis forma e carga nativa das proteínas devem ser eliminadas para que a separação dependa apenas de sua massa molecular. b) cromatografia por permeação em gel. Para isso. pois é nesse momento que a carga líquida da proteína será zero.Bioquímica para Química Bacharelado Exercícios sobre técnicas de caracterização/purificação de proteínas 1. As extremidades do papel são emersas em reservatórios distintos contendo solução tampão. N-metil-bis-acrilamida. já que proteínas possuem cargas líquidas diferentes em um mesmo ph. submetida a voltagem crescente.A proteína X tem ponto isoelétrico igual a 4. Qual foi o pH usado para essa técnica? Justifique bioquimicamente o pH usado e a purificação. saturada com uma solução tampão. Os géis utilizados por esta técnica podem ser preparados com porosidade variável.

as proteínas são aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida e submetidas a uma corrente elétrica. Após esse tratamento.ou seja. enquanto as moléculas pequenas ou íons atravessam a membrana de diálise. elas são aplicadas sobre um gel formado por esferas porosas. tornando-as negativamente carregadas. ajudando a eliminar a estrutura tridimensional dos polipeptídeos. assim. em geral. Também pode ser feito o gel de poliacrilamida sem o uso do dodecilssulfato de sódio (SDS). seguidas por moléculas com carga oposta. mas é um tipo de filtração molecular. A mistura de proteína e moléculas pequenas é colocada dentro de um saco de material semipermeável. Além da adição do SDS. Com isso.Qual é o efeito da eluição de uma solução aquosa com alta força iônica em uma coluna de troca iônica à qual esteja adsorvida uma proteína? Justifique.4 g de SDS para cada grama de proteína. Geralmente escolhem-se . podem ser removidos dessa forma? A diálise é um processo utilizado para separar proteínas de substâncias de baixo peso molecular. convertê-las numa estrutura linear – a forma nativa é geralmente globular – e conferir-lhes densidade de carga uniforme. as moléculas proteicas ficam retidas. b) Na cromatografia por permeação em gel é uma mistura de duas proteínas. as proteínas podem ser opcionalmente fervidas na presença de um agente redutor. Após a separação para a determinação da massa molar usa-se o espectrômetro de massa obtendo o pico íon molecular que é a massa molar do composto analisado. sua conformação tridimensional e seu peso molecular. enquanto que as maiores terão mais dificuldade em atravessar a malha do gel e. como ditiotreitol (DTT) ou 2-mercaptoetanol. se moverão mais lentamente.Qual o princípio da purificação de proteínas por diálise? Que tipo de contaminantes. A diálise não é uma técnica cromatográfica. cada proteína se moverá diferentemente: as proteínas menores migrarão mais rapidamente. 4. como o celofane (acetato de celulose). Na ausência do SDS. Moléculas com carga de mesmo sinal que a resina são eluidas primeiramente. O SDS tem alta carga negativa e uma cauda hidrofóbica que interage com as cadeias polipeptídicas numa proporção aproximada de 1. as proteínas com massas iguais podem migrar diferentemente na malha do gel devido ao diferencial de cargas de suas estruturas tridimensionais. que desfazem as pontes dissulfetos. em uma ordem definida pela magnitude da carga apresentada pela proteína nas condições da cromatografia. fazendo assim que ocorra a separação entre as proteínas durante a corrida por sua carga residual final. a proteína em questão não sofre a desnaturação. fazendo com que elas migrem através da malha de acrilamida em direção ao pólo positivo. Quando o saco de diálise é imerso em tampão. Quando se representa a mobilidade eletroforética frente ao logaritmo dos pesos moleculares conhecidos de diversas cadeias polipeptídicas (proteínas marcadoras). As moléculas da proteína menor podem penetrar nos poros das esferas. 5. as maiores percorrem a coluna com velocidade maior sendo coletadas em primeiro lugar. obtém-se uma reta que pode ser utilizada como padrão para o cálculo do peso molecular das subunidades da proteína de interesse. Dependendo do seu tamanho.

valores de ph e de concentração salina que determinem a ligação da proteína de interesse à resina escolhida. . seguem-se alterações dessas condições que levem a eluição de proteína.