Molecular  Tes,ng  and   Infec,on  Preven,on  

Daniel  J.  Diekema,  MD,  D(ABMM)   University  of  Iowa  Carver  College  of  Medicine   Disclosures:     Research  funding  from  bioMerieux,  Cerexa,   Merck,  Pfizer,  Purthread  

Objec,ves  
•  Know  which  available  molecular  diagnos,c   tests  hold  promise  for  improving  the  diagnosis   and  preven,on  of  HAIs   •  Understand  the  limita,ons  of  molecular   diagnos,cs,  and  how  those  limita,ons  may   impact  diagnosis  and  surveillance  ac,vi,es   •  Be  able  to  discuss  with  your  lab  director  the   pros  and  cons  of  introducing  certain  molecular   assays.  

Caveats:  In  the  interest  of  ,me…  
•  Will  emphasize  applica,on  to  healthcare  epi  
–  most  commonly  encountered  issues     –  MDROs,  C.  difficile,  molecular  typing  

•  Will  not  discuss  specific  products  in  detail  
–  Subject  to  rapid  change,  oSen  more  than  one   using  a  specific  approach  

•  Emphasize  technology  available  to  most  labs  

Major  uses  of  molecular  tes,ng  for   infec,on  preven,on  
•  Detec,on  of  pathogens  and  resistance  (MDRO)  
–  Allow  earlier  interven,on   –  Focused  therapy,  isola,on,  decoloniza,on  

•  Typing  to  assess  gene,c  relatedness  
–  Inves,gate  pathogenesis,  transmission,  outbreaks   –  PFGE,  ribotyping,  rep-­‐PCR,  mul,locus  sequence   typing,  spa  typing  (S.  aureus)  

Molecular  detec,on  of  pathogens  
•  Direct  from  sample  or  from  culture  growth   •  Advantages  in  comparison  with  culture:  
–  Faster  analy,c  turnaround  ,me  (TAT)   –  Increased  sensi,vity  (some,mes)   –  Best  alterna,ve  for  difficult-­‐to-­‐grow  pathogens  

PCR,  or  nucleic  acid  amplifica,on  tes,ng  (NAAT)  methods  

Molecular  detec,on  of  MRSA  from  nares   This  should  be  easy,  right?  

Wrong!    Why?  
•  Mixed  samples  include  coagulase-­‐nega,ve   staphylococci  that  carry  mecA  gene    
–  False  posi,ve  results  (MSSA  +  MR-­‐CoNS)   –  Must  find  a  target  linking  MR  (mecA)  with  SA   –  SCCmec/orfX  junc,on  

Huletsky  et  al.    J  Clin  Microbiol  2004;42:1875.  

But  problems  remain  
•  Single  target  may  remain  aSer  loss  of  mecA   (“mecA  dropouts”)  
–  Found  in  5-­‐10%  of  all  +  samples  in  some  centers  
•  Arbefeville  SS,  et  al.  J  Clin  Microbiol  2011;49:2996-­‐9.  

•  Some  MR-­‐CoNS  may  test  posi,ve  
•  Malhotra-­‐Kumar  et  al.  J  Clin  Microbiol  2010;48:4598.  

•  Posi,ve  predic,ve  value  for  these  assays  can   therefore  be  lower  than  culture  
•  Herdman,  et  al.  J  Clin  Microbiol  2009;47:4102.   New  tes;ng  approaches  include  mecA  primers,  to  address  bullet  1,   but  remain  vulnerable  to  mixed  popula;ons  or  false  +  MR-­‐CoNS    

False  posi,ves  aren’t  the  only  issue  
•  mecALGA251  
–  Undetected  by   current  PCR   –  Widespread  in  UK   among  LA-­‐MRSA   –  Mul,ple  spa  and   MLST  types  

•  I’m  sure  this  won’t   ever  happen   again…  
Garcia-­‐Alvarez,  et  al.  Lancet  Infect  Dis  2011;11:595-­‐603.   Shore  AC,  et  al.  An,microb  Agents  Chemother  June  2011  

The  moral  of  this  story:   Don’t  toss  those  agar  plates!  
•  Less  vulnerable  than  PCR  to  gene,c  variability  
–  Emerging  clones,  “empty  casseoe”  variants  

•  Improved  PPV,  helps  detect  assay  problems   •  Organism  is  available  for  AST,  typing,  etc.   •  Greater  flexibility  of  use  (site,  sample)   •  Adding  a  molecular  test  to  culture,  rather  than   replacing  culture  

The  importance  of  MSSA  detec,on  
•  Focus  periop  decoloniza,on  of  SA  carriers   •  Tailor  an,microbial  prophylaxis  for  MRSA  carriers  

Bode  et  al.    N  Engl  J  Med  2010;362:9-­‐17  

A  new  test  method  of  interest,  nares  test  not  yet  available:  

• Uses  bacteriophages  to  amplify  signal                  (must  be  species-­‐specific)   • Simple  immunoassay  detects  phage  Ag   • Tes,ng  +/-­‐  an  an,bio,c  can  serve  as  a   method  of  suscep,bility  tes,ng   • Only  current  FDA-­‐approved  assay  is  for   blood  cultures  +  for  Gram  posi,ve  cocci  
www.microphage.com  

From  blood  cultures  or  nares  samples  
Method   PCR  (various)*   Bacteriophage**   TAT   1-­‐4   5-­‐6   Sens   90-­‐98   92   Spec   91-­‐99   98   Equipment   Per  test   30-­‐150K   n/a   n/a   25-­‐50   ?   5  

Rapid  detec,on  of  MRSA/MSSA  

Chromogenic  agar   18-­‐48   60-­‐90   90-­‐100  

*Commonly  used  commercial  assays:  home  brew  PCR  is  far  less  expensive   **blood  culture  only,  nares  test  in  development   ***TAT  is  analy=c  TAT  only!     Bhowmick,  et  al.    50th  ICAAC,  Boston,  MA,  2010,  Abstract  D-­‐155.   Carroll  KC.    Mol  Diagn  Ther  2008;12:15   Malhotra-­‐Kumar  et  al.  J  Clin  Microbiol  2010;48:4598.   Reyes  RC,  et  al.  Diagn  Microbiol  Infect  Dis  2008;60:225   Pape  J,  et  al.    J  Clin  Microbiol  2006;44:2575.  

Scenario  
Your  lab  director  comes  to  your  monthly  infec,on  control   mee,ng  to  ask  for  your  support  to  bring  in  a  new  real-­‐,me   PCR  test  for  MRSA  direct  from  nasal  swabs.    Your  hospital   currently  screens  all  admissions  to  selected  units,  has  a  4%   admission  prevalence,  and  has  seen  a  60%  decline  in  MRSA   HAI  rate  over  the  past  5  years.    The  current  screening  method   is  chromogenic  agar,  with  ~24  hr  TAT.  

The  lab  director  asks:  will  adop,ng  the  new  test  be   cost-­‐effec,ve?    Will  it  result  in  improved  preven,on   of  MRSA  transmission  and  infec,on?  

Best  way  to  answer  the  ques,on:  
•  •  •  •  Prospec,ve  trial  with  concurrent  controls!   Culture  vs.  NAAT  (PCR  with  reduced  TAT)     Outcomes  to  include  MRSA  transmission   (acquisi,on)  and  infec,on  events   At  least  3  such  trials  have  been  published,  all   use  unit-­‐based  crossover  designs:  
1.  Jeyaratnam  et  al.    BMJ  2008;336:927-­‐930.   2.  Aldeyab  et  al.    J  Hosp  Infect  2009;71:22-­‐8.   3.  Hardy  et  al.    Clin  Microbiol  Infect  2010;16:333.  

Summary  of  controlled  trials  
•  Two  show  no  difference  in  MRSA  outcomes1,2  
–  But  overall  TAT  only  reduced  to  19-­‐22  hours  

•  Hardy,  et  al,  showed  benefit  for  PCR3:  
–  Pts  on  cx  units  1.5X  more  likely  to  acquire  MRSA   –  Almost  2-­‐fold  more  unscreened  in  culture  arm   –  Only  17%  of  colonized  were  properly  isolated   –  71%  of  PCR  +  decolonized  (vs.  41%  in  cx  +  arm)  
•  Really  a  trial  of  decoloniza,on  (not  of  “ADI”)  
1.  Jeyaratnam  et  al.    BMJ  2008;336:927-­‐930.   2.  Aldeyab  et  al.    J  Hosp  Infect  2009;71:22-­‐8.   3.  Hardy,  et  al.    Clin  Microbiol  Rev  2010;16:333-­‐39.  

What  is  your  true  turnaround  ,me?  
Pre-­‐analy,c   •  Collec,on   •  Transport   Analy,c   •  Processing   •  Tes,ng   Post-­‐analy,c   •  Repor,ng   •  Interven,on  

How  long  is  each  step?       What  por,on  of  TAT  is  aoributable  to  the  test?       Are  PCR  tests  batched?   Is  the  “efferent  arm”  of  your  program  func,oning?   It  isn’t  as  simple  as  2  hours  versus  24-­‐72  hours….  

MRSA/MDRO  preven,on:   So  much  more  than  a  lab  test  
•  •  •  •  •  •  •  •  Environmental  disinfec,on  prac,ces   Hand  hygiene  adherence  (40%  or  90%?)   Contact  precau,ons  adherence   Hospital  design:  %  single  rooms   Adherence  to  CLABSI/VAP/SSI  bundles   Decoloniza,on  prac,ces  (CHG,  mupirocin)   Pa,ent  popula,on  (risk  factors)   Admission  MRSA  prevalence  

Consider  two  units  
A.  40%  adherence  to  HH  and  CP,  poor   implementa,on  of  DAI  preven,on  bundles   B.  90%  adherence  to  HH  and  CP,  nearly  100%   adherence  to  DAI  bundle  measures   •  Reduce  TAT  to  zero  in  unit  A,  you  s,ll  have  no   impact  on  MRSA  disease.       •  In  unit  B,  MRSA  disease  falls  85-­‐90%  before   screening  can  be  implemented.  

Has  your  laboratory  adopted  a  rapid  molecular  test  for  detec,on   of  MRSA  and/or  MSSA  direct  from  clinical  samples?  

ClinMicroNet  Survey,  2011  

24 (75%): cost 3 (9%): performance 4 (13%): both

32 (46%)

38 (54%)

35 (92%) for nares 13 (34%) for BSI

Diekema D, Peterson L. ClinMicroNet survey.

Has  your  laboratory  adopted  a  rapid  test  and   then  gone  back  to  a  culture-­‐based  test?   •  Thirteen  (19%)  of  the  labs  reported  having   gone  back  to  an  agar-­‐based  method  from  a   rapid  detec,on  test  
–  Eight  went  completely  back  (all  tes,ng)   –  Five  s,ll  did  some  rapid  molecular  tes,ng  
•  Physician  preference   •  Agar-­‐based  for  one  unit  with  endemic  empty  casseoe   •  Went  back  for  nares  but  not  BSI  

–  Reasons:  Cost  (7),  performance  (3),  cost  +  perf  (3)  
•  Empty  casseoes,  failure  to  demonstrate  savings/impact  
Diekema D, Peterson L. ClinMicroNet survey.

Quote  excerpts  from  survey  responses  
•  May  go  back  to  culture  from  PCR  b/c  promised  cost  savings  haven't  been   demonstrated   •  Did  a  comparison  and  PCR  not  beoer,  at  higher  cost   •  Adopted  PCR  but  had  no  impact  on  MRSA  rates  in  ICU   •  Concerns  about  sensi,vity  and  applica,on  to  non-­‐nares  sites   •  Cost,  plus  not  validated  for  non-­‐nares  samples   •  No  diff  in  performance  in  our  hands,  TAT  not  different  enough   •  Actual  TAT  in  our  lab  not  much  different  for  chrom  vs  PCR   •  Would  cost  over  500K  per  year,  no  proof  that  faster  TAT  causes  fewer   MRSA  infxs   •  We  save  about  450K  per  year  by  using  chromogenic  agar   •  No  study  showing  reduc,on  in  MRSA  transmission  for  molecular  vs  24  hr   chromogenic  culture  detec,on  

Lessons  learned  from  molecular   tes,ng  for  S.  aureus  
•  Gene,c  variability  and  evolu,on  will  be  an   ongoing  challenge  for  NAAT  tests   •  Culture  back-­‐up  remains  important   •  Analy,c  TAT  may  differ  from  actual  TAT  
–  Know  how  your  lab  will  incorporate  the  test  

•  Cost  saving  es,mates  must  be  individualized:   NAAT  may  not  be  the  right  choice  for  all  

Vancomycin-­‐resistant  enterococci  
•  Another  MDRO  with  well-­‐characterized   resistance  genes  (vanA/B/C/D/E/G/L/M)   •  vanA  and  vanB  detec,on  most  important  
–  Mobile  gene,c  elements,  E.  faecium  and  E.  faecalis  

•  Problem  for  rapid  detec,on:  reservoir  

Rapid  VRE  detec,on  
•  Molecular  aorac,ve  given  TAT  of  culture   •  Some  obstacles  to  keep  in  mind:  
–  lower  limit  of  detec,on  (varies,  ~10-­‐100  cfu/ml)  
•  effect  of  an,microbials  on  detec,on!  

–  vanB  is  present  in  selected  gut  anaerobes  

•  What  does  a  nega,ve  VRE  screen  mean?  
–  Before  versus  aSer  an,microbial  exposure  

•  What  does  a  posi,ve  VRE  screen  mean?  
Ballard  et  al.    An,microb  Agents  Chemother  2005;49:77-­‐81.   Gazin  et  al.    Eur  J  Clin  Microbiol  Infect  Dis  2012;31:273-­‐76.   Donskey  et  al.  N  Engl  J  Med  2000;343:1925-­‐32.  

Performance  of  vanA/vanB  screen  vs.  broth   enriched  culture  

Posi,ve  predic,ve  value  in  mul,center  evalua,on  ~50%   For  vanB,  PPV  in  one  study  was  <10%  for  2  diff  assays   Don’t  toss  those  agar  plates!  
Xpert  vanA/vanB  package  insert  (www.cepheid.com)   Gazin  et  al.    Eur  J  Clin  Microbiol  Infect  Dis  2012;31:273-­‐76.  

Lessons  learned  from  molecular   tes,ng  for  VRE  
•  Tes,ng  samples  from  complex  organism   popula,ons  (direct  from  samples  of  non-­‐ sterile  environment)  is  challenging   •  Other  species  share  resistance  determinants  
–  mecA:  found  in  S.  aureus  +  coag  nega,ve  staph   –  vanB:  found  in  VRE  +  selected  anaerobes  

Molecular  detec,on  of  MDR-­‐GNR   Even  more  complicated!  

Peleg and Hooper. N Engl J Med 2010;362:1804-13.

Rapid  emergence  and  spread  of  carbapenemases  (NDM,  KPC,  VIM,  IMP)    

Obstacles  to  widely  available   molecular  detec,on  of  MDR-­‐GNR  
•  Mul,plicity  of  targets,  emerging  new  targets  
–  Difficult  to  “keep  up”  with  FDA-­‐approved  methods  

•  Gene  presence  ≠  gene  expression    
–  e.g.  chromosomal  cephalosporinase  in  E.  coli  

•  Some  important  phenotypes  are  complex  
–  Carbapenem  R  from  stably  de-­‐repressed  ampC     cephalosporinase  +  porin  muta,on…  

•  The  realm  of  referral,  reference,  research  labs  

Current  approaches  
•  PCR  targe,ng  most  common  problems  
–  e.g.  “home  brew”  KPC  detec,on  assays  common   –  on  isolated  colonies,  limited  targets  

•  For  screening,  microarray  most  promising  
         Specific  nucleic  acid  probes                                        Only  hybridized  probes  amplified  

Naas,  et  al.    J  Clin  Microbiol  2011;Feb  16  (online  ahead  of  print)  

MDR-­‐GNR  NAAT  tes,ng:  Summary  
•  Complexity/variety  of  resistance  determinants   is  a  challenge  for  test  development   •  For  now,  “screening”  for  carriage  best  done   with  selec,ve  culture  (e.g.  chromogenic  agar)  
–  Labor  intensive,  and  ideal  screening  sites,  assay   performance  s,ll  uncertain  

•  Performance  of  any  new  assay  in  mixed  and   complex  samples  (e.g.  stool,  blood  culture   broth,  respiratory  secre,ons)  will  be  key  

Molecular  detec,on  of  C.  difficile  
•  The  right  target  for  molecular  tes,ng:  
–  Difficult/laborious  to  culture   –  Standard  tests  (EIA)  perform  poorly  (60-­‐70%  sens)   –  Toxin  gene  presence  correlates  with  pathogenicity  

Toxin  EIAs:  Poor  sensi,vity  and  PPV  

Goldenberg  SD,  et  al.  J  Hosp  Infect  2011;79:4-­‐7.  

Several  NAAT  tests  now  available  
•  •  •  •  Most  target  tcd  B  gene  (gene,  not  toxin!)   Important  to  test  only  those  with  disease   Sensi,vity  and  specificity  in  mid-­‐90s   Repeat  tes;ng  is  not  necessary  

Table  adapted  from:  Carroll  KC.  Anaerobe  2011;17:170-­‐174.  

Two  step:  Glutamine  dehydrogenase  →  PCR/NAAT  

A  less  expensive  approach?  

Problem:    GHD  EIA  isn’t  sensi,ve  enough  (?  Mid-­‐80%)  
Chapin  K,  et  al.  J  Mol  Diagn  2011;13:395-­‐400.   Selvaraju,  et  al.  Diagn  Microbiol  Infect  Dis  2011;71:224-­‐29.   Carroll  KC.    Anaerobe  2011;17:170-­‐174.  

Best  tes,ng  prac,ces  are  essen,al!  
Diagnos,cs  101  
•  PPV  depends  upon  disease  prevalence   •  Prevalence  drops  if  test  is  performed  on  those   with  low  pre-­‐test  probability  of  disease  
–  e.g.  at  a  4-­‐5%  posi,vity  rate,  PPV  ~50%   –  Usually  reflects  poor  tes,ng  prac,ces  

•  NO  tes,ng  of  non-­‐diarrheal  stool  (C-­‐T-­‐C)   •  NO  repeat  tes,ng  within  7  days   •  NO  test  of  cure  

What  is  your  prevalence?  
Deshpande,  et  al.  Clin  Infect  Dis  2011;53:e81-­‐e90.  

Pooled  sensi,vity  =  90%   Pooled  specificity  =  96%  

How  about  those  C.  difficile  rates!  
The  impact  of  ↑  sensi,vity  

N  samples   N  (%)  posi,ve   CDI  rates*  

EIA   2579   167  (6.5)   4.9  

PCR   2534   382  (15.1)   10.3  

*cases/10,000  pa,ent  days  
Fong  KS,  et  al.  Infect  Cont  Hosp  Epidemiol  2011;32:932.  

C.  difficile  tes,ng:  summary  
•  PCR/NAAT  seems  the  best  single  op,on   •  Prepare  for  CDAD  rate  increase  of  up  >  50%   •  Strict  enforcement  of  test  rejec,on  policies  
–  NPV  >99%  allows  this,  preserves  good  PPV  

•  Consider  review  of  clinical  tes,ng  approach  
–  >  3  diarrhea  stools  per  day,  an,bio,c  use  history  

•  Periodically  assess  posi,vity  rate  
–  If  <15%,  assess  rejec,on  polices/tes,ng  prac,ce  

Use  of  Molecular  Typing  
•  Study  pathogenesis  of  infec,on  
–  Colonizing  and  infec,ng  strains   –  Contamina,on  versus  pathogen  

•  Assess  extent  and  mode  of  pathogen   transmission  
–  Effec,veness  of  infec,on  control  efforts   –  Outbreak  inves,ga,on  

•  Detect  epidemiologically  important   pathogen  (e.g.  NAP1/BI  C.  difficile)   Requires  maintaining  an  organism  bank  

Methods  are  all  based  upon  detec,ng   differences  in  nucleo,de  sequence  
•  Banding  paoerns:  size  of  fragments  produced  by   amplifica,on  and/or  enzyma,c  diges,on  of   genomic  DNA  
–  PFGE,  RFLP,  ribotyping,  AFLP,  rep-­‐PCR,  RAPD,  MLVA,  etc.  

•  DNA  sequencing:  polymorphism  of  DNA  sequences  
–  Mul,locus  sequence  typing  (MLST),  spa  (S.  aureus)   –  Whole  genome  sequencing  

•  DNA  hybridiza,on:  using  nucleo,de  probes  
–  Spoligotyping  (macroarray—M.tb),  microarrays  
Li,  Raoult  and  Fornier.  FEMS  Microbiol  Rev  2009;33:892-­‐916.

Criteria  for  Evalua,ng  Typing  Systems  
•  Typeability:    Ability  to  obtain  an   unambiguous  result  for  each  isolate   analyzed   •  Reproducibility:    Ability  to  give  the  same   result  each  ,me  an  isolate  is  tested   •  Discriminatory  power:    Ability  to   differen,ate  among  unrelated  strains   •  Cost  ($$,  labor,  ease  of  use,  etc.)   •  Turnaround  ,me  

Choosing  a  Typing  Method  
•  PFGE:  excellent  discrimina,on,  flexibility  
–  Labor  intensive,  longer  TAT  (2-­‐3  days)  

•  Several  PCR  methods  provide  good   discrimina,on  w/  faster  TAT  (rep-­‐PCR,  MLVA)   •  Method  used  determined  by:  
–  Purpose  (local  outbreak/cluster,  vs.  “library”)   –  Organism  (some  specific  for  bug  (e.g.  spa  typing))  

•  Combina,on  of  methods  may  provide   greatest  discrimina,on  (e.g.  MRSA)  

Comparing  common  typing  methods  
Method Reproducibility Discrimina,on       PFGE   MLVA   Ribotype   MLST   WGS  
Intra  (Y)/Inter  (V)  

Cost   $$   $$   $   $$$   $$   $$$  

TAT   2  d   4  h   4  h   1  d   2-­‐3  d   ??  

Excellent   Good   Very  Good   Fair-­‐Good   Fair   Excellent  

rep-­‐PCR Yes  (auto  only)     Yes   Yes   Yes   Yes  

When  will  rapid  throughput  sequencing  come  to  the  clinical  lab?   How  will  we  handle  all  the  data?     Resistance  detec,on,  typing,  virulence,  etc.,  etc.,  etc.  

Typing  data  informs  good  epidemiology     (it  doesn’t  replace  it)  
•  “Indis,nguishable”  ≠  immediate  common  source   Same:   PFGE   spa   MLST   SCCmec   rep-­‐PCR  

Zazakova,  et  al.  N  Engl  J  Med  2005;352:468.  

Typing  data  informs  good  epidemiology     (it  doesn’t  replace  it)  
•  “Different”  (type  or  species)  does  not  “rule   out”  transmission  
–  e.g.  spread  of  plasmid-­‐mediated  ESBLs  

Regional  KPC  spread   Most  were  KPN   Interspecies  to  E.  coli     on  at  least  2  occasions  
Won,  et  al.    Clin  Infect  Dis  2011;53:532.  

Molecular  typing:  Summary  
•  Many  acceptable  methods  available   •  Discuss  per,nent  issues  with  your  lab  director  
–  TAT:  need  for  in  house  versus  send  out  tes,ng   –  Local  use  for  cluster/outbreaks  only?   –  Need  for  library  method  (e.g.  MLST,  spa)  

•  Most  well  served  by  PFGE,  rep-­‐PCR,  MLVA   •  Most  important  point  is  to  interpret  results  in   context  (bug,  gene,cs  of  R,  epidemiology)  

Proteomics  
•  Matrix  assisted  laser   desorp,on/ioniza,on  –,me   of  flight  (MALDI-­‐TOF)   •  Produces  detailed  protein   fingerprint   •  Accurate  species  ID  
–  Rapid,  inexpensive   –  Requires  isolated  colony  

•  Other  poten,al  applica,ons?  
–  Strain  typing   –  Resistance  detec,on   –  Analysis  of  mixed  samples  

Summary  
•  Molecular  tes,ng  increasingly  offers  faster,   more  sensi,ve  detec,on  of  HAI  pathogens   •  No  test  is  perfect:  understand  limita,ons  and   implica,ons  (diagnosis,  surveillance,  cost)   •  Close  collabora,on  with  lab  director  
–  Regular  rounds  in  the  micro  lab   –  Lab  par,cipa,on  on  infec,on  control  commioee   –  Know  implica,ons  of  IC  ini,a,ves  on  the  lab  

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful