A.

Prinsip Dasar HPLC Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. B. Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu: 1. Fasa Gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak

fasa gerak dapat berinteraksi dengan solutesolut. Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. tidak mudah terbakar. Kecepatan alir berkisar antara 0. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (~250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut. Oleh karena itu. Dalam kromatografi gas. zat cair tidak kental. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. sesuai dengan detektor. 2. Bahan tahan korosi Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa reciprocating. zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis. 6. zat cair harus mudah diperoleh. waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram. fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector. 4. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Jenis fasa gerak Fasa gerak untuk kromatografi partisi.1-10 mL/menit 4. Akibatnya. 2. . Sebaliknya dalam HPLC. fasa gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom menuju detector. 5. Oleh karena itu. Persyaratan fasa gerak HPLC Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut: 1.untuk kromatografi gas. fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. displacement dan pneumatic. dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan : 1. 3. Keluaran bebas pulsa 3. Pompa reciprocating Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. murah. keluaran pompa ini bebas pulsa. zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/in2) 2. adsorpsi. Selain itu. dan tidak beracun. waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor.

Detector berdasarkan absorpsi UV merupakan detector HPLC yang paling banyak di pake. 3. Detector Berbagai detector untuk HPLC telah tersedia. 2.5 hingga 5 μL. detectoe yang bersifat umum terhadap solute setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Sebaliknya. 4. 3. cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin. tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel Kadang kala.Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. (2)stabilitas dan keterulangan tinggi. Selain itu. Kran Cuplikan Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. (b) kran diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. . Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. 5. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Masalahnya. kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu. Terakhir. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500μL. Injeksi ‘stop-flow’ Injeksi stop-floe adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara. yaitu: detector umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanaya solute. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi ‘load’.(3) respon linear terhadap solute. perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom. Detector HPLC dikelompokan ke dalam tiga jenis. detector sepesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solute yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. cuplikan masih berada dalam loop. Injeksi Syringe Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. (4) waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir . beberapa puluh mikroliter. Kolom utama berisi fas diam. Detector elektrokimia paling banyak dipakai terutama dalam HPLC penukar ion. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. walaupun demikian detector harus memenuhi persyaratan berikut: (1) cukup sensitive. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC : 1.(5)realibilitas tinggi dan mudah digunakan. (6) tidak merusak cuplikan. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi.

Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. 3. yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). peka. Suatu solven dengan polaritas rendah. 9. yang dipasang tepat pada sampel loop. menjamin pemisahan yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel. daya pisahnya baik. cepat dan mudah melaksanakannya. sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang terikat pada silica gel). misalnya terpenoid tinggi. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya. alkaloid. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil. Kelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas. misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni. ideal untuk molekul besar dan ion. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah 1. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. dapat dilaksanakan pada suhu kamar. Dengan pertolongan mikrosiring. 6. yakni beberapa milliliter per menit. mudah memperoleh cuplikan. Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. lipid dan gula. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak. Cara Kerja HPLC Mula-mula solven diambil melalui pompa. detektor HPLC dapat divariasi dan unik. Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC.C. sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. segala senyawa jenis fenol. D. 4. Sebagai alternative lain. Hal ini terutama sering dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam makanan. . Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponenkomponennya. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar. 7. 2. Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100. diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. 8. dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis. E.000 untuk kolom 100 cm). Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah. 5.

• HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative. dengan fase diam berupa kolom dan larutan tertentu sebagai fase geraknya • Instrumentasi HPLC yaitu: 1. Fasa Gerak 2. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel 4. KESIMPULAN • Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan kepolarannya. . lipid dan gula. IV. alkaloid. Pompa 3. misalnya terpenoid tinggi. segala senyawa jenis fenol. Detector • Dibandingkan dengan kromatografi gas. kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan.dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Kolom 5.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful