You are on page 1of 10

Clulas animais ligados por nanotubos pode ser electricamente ligada, atravs de interposta junes canais Nanotubos de tunelamento

(TNTs) so recm-descoberto condutas para uma forma anteriormente no reconhecida de clula-clula comunicao. Estes nanoescala, tubos de F-actina contendo membrana ligar clulas longas distncias e facilitar o intercmbio intercelular de pequenas molculas e organelos. Usando ptico potencial de membranamedies combinadas com estimulao mecnica e gravao wholecell de patchclamp, demonstramos que TNTs mediar a difuso bidirecional de sinais eltricos entre TNT ligado clulas de rim de ratos normais ao longo de distncias de 10 a 70 uM.Resultados similares.Foram obtidas para outros tipos de clulas, sugerindo que o acoplamento elctrico atravs TNTs pode ser uma caracterstica generalizada de clulas animais. Fora de acoplamento elctrico dependia do comprimento e nmero de conexes de TNT. Vrias linhas de evidncia implicada um papel para junes neste acoplamento de longa distncia eltrica: puntiformes imunorreatividade conexina 43 foi frequentemente detectado em um final de TNTs e acoplamento elctrico era sensveis voltagem e inibida pelo cido meclofenmico, um bloqueador de junes. Os tipos de clula falta de junes no mostrar TNT-dependente acoplamento eltrico, o que sugere que a TNT mediadas sinais eltricos so transmitido atravs de junes em uma interface entre a membrana TNT e uma clula do par ligado. Medidas do indicador de clcio fluorescente X-Rhod-1 revelou que a despolarizao TNTmediated eliciada limiardependente, transiente sinais de clcio em clulas HEK293. Estes sinais foram inibidos por Ca voltagem dependentes 2 + bloqueador dos canais de mibefradil, sugerindo que eles foram gerados atravs de influxo de clcio atravs de baixa voltagem dependentes Ca 2 +canais. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem um papel nico para TNTs, em que a sincronizao elctrica entre as clulas distantes leva ativao da sinalizao alvo a jusante.Cell-a-clula comunicao desempenha um papel importante nos processos fisiolgicos de organismos multicelulares. Sinalizao diversas caminhos tm sido documentados para a troca de molecular informaes entre as clulas. Estes incluem (i) a interaco directa de molculas de superfcie celular, (ii) a secreo de molculas de sinalizao ea sua absoro do receptor mediada por clulas alvo, e (iii) o transporte directo de molculas atravs de junes. Alm de a troca de molculas de sinalizao, as clulas tambm comunicar via sinais eltricos, onde acoplamento de clulas atravs de junes gap crucial para o processamento de informaes e sincronizao. Estudos recentes implicam a sinalizao eltrica em desenvolvimento processos, tais como o estabelecimento de esquerda-direita padro em embries de (1), a regenerao da cauda de Xenopus (2), e cicatrizao de feridas (2). Alguns anos atrs, uma nova via de comunicao intercelular, baseado na formao de nanotubos de encapsulamento (TNTs) ou similar estruturas que conectam clulas em longas distncias, foi identificada (3, 4). Estes tubos de membrana, geralmente 50 a 200 nm de dimetro com comprimentos at vrios dimetros celulares, contm F-actina e, como

uma propriedade caracterstica, a falta de contacto com o substrato (5).Subsequentemente, um nmero crescente de tipos de clulas tm sido mostrados para formar e usar TNTs para a troca de diversos componentes celulares, tais como vesculas endocticas, mitocndrias, protenas de membrana de plasma, e molculas citoplasmtico (6, 7). Agentes patognicos, tais como HIV (8, 9) e os pries (10), tambm foram encontrados para espalhar atravs de TNT-like estruturas. O nmero crescente de funes atribudas a TNTs (6, 7, 11), em conjunto com o recente descoberta de que estas estruturas existem in vivo (12), sugere um papel importante na intercelular comunicao de TNTs sob condies fisiolgicas.A questo de saber se, para alm da troca de molculas, TNTs tambm transmitir sinais eltricos entre distante clulas. A demonstrao de que artificiais nanotubos de membrana com um dimetro semelhante ao TNTs so condutores eficientes de elctrica correntes (13) sugere que TNTs pode tambm realizar elctrica clula-clula acoplamento. Para investigar esta teoria, ns combinamos pticos potencial de membrana de medies e eletrofisiolgico mtodos para anlise de sinais eltricos entre TNT ligado clula pares. Os resultados demonstram que pode mediar TNTs elctrica acoplamento entre clulas distantes e fornecem evidncias de que a lacuna junes participar neste acoplamento a longa distncia. Alm disso, mostra-se que os sinais elctricos transferida de uma clula para outro so suficientes para induzir uma elevao transitria de clcio no clula receptora ativando baixa voltagem dependentes de Ca2 +canais. Resultados.Mecnicos estimulao induzida-Spreads despolarizao atravs da TNT Conexes entre as clulas do rim normal de rato. Para identificar TNTs em normais rim de rato (NRK) clulas, utilizou-se microscopia de contraste de interferncia diferencial (DIC), para evitar danos fototxico para estas estruturas frgeis. Conexes somente em linha reta intercelulares (> 10 mM de comprimento), sem contato com o substrato e carente uma estrutura de seco central foram considerados. Este processo eliminado filopodia-base clula a clula-contactos e de clulas em diviso do nosso anlise. Lapso de tempo de imagem demonstrou que todos os TNTs entre as clulas NRK formado por desalojamento de clulas (Fig. S1) (n = 54 formao de eventos). Para excluir circuitos potencialmente complexos durante nossas medies, foram selecionados apenas os pares TNT-conectados celulares desprovido de contacto a outras clulas (Fig. 1A, imagens DIC). Despolarizao de clulas individuais foi induzida por estimulao mecnica e medido como um aumento na fluorescncia de uma membrana pr-carregado corante sensvel potencial, bis-(1,3-dibutylbarbituric cido) trimethine oxonol [DiBAC4(3)]. A fluorescncia de ambas as clulas estimuladas e TNT-ligado clulas aumentou aps estimulao mecnica (Fig. 1A, imagens de intensidade pseudocolored). Clulas sem ligaes fsicas para o par de clulas estimuladas no exibir um aumento na fluorescncia. Este achado excluda a possibilidade de que a despolarizao espalhar por difuso de sinais moleculares entre as clulas.A amplitude da despolarizao na clula receptora foi sempre menor que a da clula estimulada (Fig. 1B), sugerindo que o TNT-dependente sinal de despolarizao movido passivamente a partir de uma clula para a outra. Como um controlo para os nossos medies pticas, clulas NRK adjacentes (isto , clulas cujos plasma membranas exibida

uma grande rea de contato) sempre se mostrou forte acoplamento eltrico Alm disso para a propagao intercelular de Cascade Blue, um corante injectado para dentro da clula estimulada durante a estimulao mecnica. (Fig. S2A). Alm disso, a presena de imunocolorao contra conexina 43 na interface destas clulas adjacentes sugerido queClulas NRK expressa junes funcionais (Fig. S2B). Ns nunca detectou a difuso de Cascade Azul, entre TNT ligado clulas, mesmo aps 20 min de injeco de corante (Fig. S2C), indicando que a difuso passiva de molculas pequenas, tais como Cascade Azul atravs de estruturas de TNT fortemente reduzida. Interessantemente, as clulas ligadas por um TNT a uma clula estimulada mostrou sinais mais fracos do que as clulas despolarizao ligados por dois TNTs mais curtos (Fig. 1A e curvas vermelhas na fig. 1B). Para elucidar a relao entre a fora de acoplamento de corrente e do comprimento do TNT, analisouse pares de clulas ligadas TNTs de comprimento varivel. Medio de 31 de TNT conectado NRK pares celulares revelou que 25 (~ 80%) foram acoplados electricamente. O eficincia de acoplamento, calculado como a razo de despolarizao entre uma nica clula TNT-ligado e da clula estimulada (Fc/Fs), Diminuiu com o aumento do comprimento TNT (Fig. 1C) (rs = -0,60,P = 0,038, anlise de correlao de Spearman). Como notado acima clula,pares ligados por mais do que uma TNT exibida mais forte acoplamento elctrico em comparao com os pares de clulas ligadas por uma TNT de comprimento semelhante (Fig. 1C, os smbolos abertos). Este achado implica que mltiplas TNT-conexes entre as clulas pode funcionar como paralelo condutas para a propagao de sinais eltricos. Assim, a fora de acoplamento elctrico entre as clulas TNT-ligados determinada por tanto o comprimento eo nmero de TNT-conexes entre eles. Todo-Cell Gravao de patch-clamp revela bidirecional Eltrica Acoplamento entre as clulas NRK TNT-conectados. Para caracterizar ainda mais dependente de TNT acoplamento eltrico, foi realizada em simultneo, dois celulares totais tenso grampos de gravaes a partir de pares de TNT conectado clulas NRK. Acoplamento elctrico foi testada por aplicando passos de tenso para uma clula e gravando respostas actuais em ambas as clulas (Fig. 2A). Uma tenso aplicada a um hiperpolarizante clula resultou em uma corrente para dentro em que a clula e um exterior corrente na clula TNT-ligado, enquanto que uma tenso despolarizante aplicado a uma clula resultou em uma corrente para fora, em que a clula e uma corrente interna na clula ligado (Fig. 2 B e C, Left e Centro). Para estimar a condutncia juncional (Gj), Ns aplicada uma srie de despolarizantes e hiperpolarizante impulsos de tenso para a clula estimulada. Por atual juno plotagem (Ij) Versus juno de tenso (Vj), Foi calculado Gj como a inclinao de uma reta linha montado no Ij -Vj relao (Fig. 2 B e C, direita). Tanto direces de medio mostrou condutncia muito semelhante (Fig. 2D), indicando nonrectifying, acoplamento bidirecional eltrica. Assim, a condutncia por um par de clulas foi calculado como o mdia da condutncia valores medidos em cada direco (14). Todos os pares de clulas-TNT conectados testado exibido rpido eltrica o acoplamento com uma condutncia mdia de 566 129 pS (intervalo de 55 1341 pS, n = 12). O acoplamento elctrico foi abolida se o TNT quebrou durante a gravao. Como esperado, dada a presena de

junes em clulas NRK, a gravao de a partir de pares de clulas nas quais a clula de corpos ou filopodios estavam em contato fsico direto sempre resultou em acoplamento elctrico forte, com condutncias mais elevadas (8,9 1,9 nS, gama de 1,8-25 nS, n = 12) em comparao com os pares de clulas TNTconnected. Pares de celular sem contato fsico nunca exibiram acoplamento elctrico (n = 4). A condutncia entre individuais pares TNT-ligados de clulas diminuiu com o aumento de comprimento dos TNTs (2E Fig.) (rs = -0,83, P = 0,0029, anlise de correlao de Spearman).Alm disso, dois pares de clulas que estavam ligados com duas TNTs cada indicadas valores mais elevados em comparao com os pares de condutncia de clulas ligadas por uma nica ligao a TNT de comprimento semelhante (Fig. 2E, smbolos abertos). Os resultados destes experimentos eletrofisiolgicos so consistentes com a nossa ptica potencial de membrana de medies. Cx43 Participa no acoplamento TNT-Dependent Eltrica da NRK Clulas. Os nossos resultados levanta a questo da base estrutural para o Observou TNT-dependente de acoplamento elctrico. Os modelos estruturais tm sido propostos anteriormente com a possibilidade de que TNTs so contnuo com as membranas de ambas as clulas de um par ou com apenas uma das clulas (3, 8). Para testar a TNT mediada continuidade da membrana, analisou-se populaes mistas de clulas NRK transfectadas com marcadores fluorescentes de membrana de plasma. Uma populao, expressando GPI-EGFP, foi cocultured com uma segunda populao expressando GPI-mCherry. Microscopia vivo de clulas de fluorescncia confocal revelou que todas as TNTs foram marcadas por um marcador nico (Fig. 3A) (n = 50). Este achado indica que o plasma GPI-ancorada marcadores de membrana no se difundem livremente entre TNT-ligado Clulas NRK e sugeriram que os TNTs so contnuas com apenas uma destas clulas. A existncia provvel de uma membrana de plasma no outra extremidade de uma ponte de TNT sugere que um mecanismo para a acoplamento elctrico atravs de uma TNT poderia ser a presena de junes em pontos de contacto entre as clulas. Para testar esta teoria, immunolabeled TNT-ligado pares de clulas NRK com um anticorpo contra Cx43. Puntiformes Cx43 sinais foram observados em 78% de todas as Estruturas TNT (n = 54). A imunomarcao Cx43 era geralmente confinado a uma posio da estrutura de TNT (Fig. 3B, superior e Mdio) (n = 35), mas foi observada, por vezes, em ambas as extremidades do TNT (Fig. 3B, Inferior) (n = 7). Este resultado foi muito provavelmente porque da presena de dois ou mais TNTs localizados muito perto em conjunto. A ausncia de Cx43 rotulagem em 22% dos TNTs aqui analisado consistente com a nossa constatao de que 20% das clulas NRK no foramacoplados electricamente. Alm disso, este resultado indica que em TNTs Clulas NRK formar independentemente de junes. Se Cx43 medeia o acoplamento TNT-dependente observada eltrica, acondutncia deve exibir voltagem-dependentes da sensibilidade, como j foi demonstrado para junes Cx43 contendo gap (15). Testmos a tenso de sensibilidade do acoplamento com experincias de relaxamento pela aplicao de 10-s tenso longo hiperpolarizante impulsos (Vj = -20 a -120 mV, 20-mV passos) para uma clula de um par de

clulas TNTconnected a partir de um potencial explorao comum de 0 mV. para tenses transjunctional superior a 60 mV, foi observada uma diminuio da corrente timedependent juncional na clula gravado (Fig. 3C), indicando uma diminuio dependente do tempo correspondente de a condutncia. Entre pulsos de voltagem subsequentes, as clulas foram retornado para 0 mV durante 30 s para permitir a recuperao a partir da tenso relaxamento. Todos os TNT-ligados pares de clulas NRK (n = 5) testados exibido um certo grau de sensibilidade de tenso, embora completa conjuntos de dados eram difceis de obter por causa da fragilidade e curto tempo de vida de TNTs (5) durante essas gravaes mais duradouros. Alm disso, a percentagem de TNT-dependente acoplado electricamente Clulas NRK, avaliadas por um aumento na DiBAC4 (3) de fluorescncia aps a estimulao mecnica, diminuda na presena de 25 uM cido meclofenmico (MFA), um bloqueador de junes comunicantes em clulas NRK (16) (Fig. 3D). Tomados em conjunto, a co-localizao observada de Cx43 com TNTs, a sensibilidade de tenso da condutncia, eo nmero reduzido de clulas electricamente acoplados na presena de AMF sugerem que as protenas junes desempenham um papel central no acoplamento TNTdependent elctrica de clulas NRK. TNT Dependente do acoplamento eltrico entre as clulas ocorre com Junes Gap funcionais. Para resolver se TNT-dependente acoplamento eltrico uma caracterstica geral das clulas animais, primeiro investigado Clulas HEK293. HEK293 clulas formam TNTs principalmente por deslocamento (82%, n = 13 de 17 eventos de formao) e, em menor extenso por interaco filopodial (18%). TNT-conectados HEK293 pares de clulas foram acoplados electricamente como indicado por DiBAC4 (3) de fluorescncia (Fig. 4 A e C) e Cx43 imunocolorao foi evidente em apenas uma extremidade do uma conexo de TNT (Fig. S3A, Top). Consistente com a observao de este ltimo, a TNT entre clulas HEK293 pareceu ser contnua com a membrana de apenas uma das duas clulas (Fig. S3A, Mdio) (n = 50). Em primrias de clulas endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), TNT-dependente de acoplamento elctrico tambm foi observada (Fig. 4 A e C) e Cx43 imunocolorao foi evidente em apenas uma fim da ligao a TNT (Fig. S3B, em cima). Como um controlo positivo para a presena de junes funcionais em ambos os tipos de clulas, elctricos acoplamento e de transferncia de corante foram registados entre clulas adjacentes (Fig. S3 A e B, parte inferior). Em codorna clulas da crista neuronais (NCC) migrar a partir de explantes do tubo neural, identificados por um marcador especfico HNK-1 (17) (fig. S4A), TNTs formada atravs de desalojamento (n = 7 de 7 formao de eventos). Estimulao mecnica de TNT ligado clula pares destas culturas revelou que apenas alguns deles foram acoplados electricamente (Fig. 4 A e C). Do mesmo modo, uma percentagem baixa de clulas acopladas electricamente foi encontrado para pares de clulas adjacentes NCC (Fig.4C). Anlise por imunofluorescncia mostrou que TNT-ligado Clulas NCC eram apenas em alguns casos positivos para Cx43 (Fig. S4B, Top e Mdio), enquanto TNTs entre NCC e no NCC clulas foram sempre positivo para Cx43 (Fig. S4B, Inferior). Este achado sugere que apenas uma subpopulao de clulas NCC expressa junes levando a acoplamento elctrico.

Os resultados acima sugerem que a TNT-dependente de acoplamento elctrico caracterstico de clulas que expressam ambas as TNTs e funcionais junes. Para testar isso, investigamos uma lacuna juno deficiente linha de clulas, as clulas PC12 (18), que formam TNTs por interaco filopodial (19). A ausncia de junes comunicao entre as clulas adjacentes foi confirmada tanto com patch-clamp e azul Cascade tingir experimentos de transferncia. Para 23 pares de TNT conectado PC12 clulas, observou-se nenhum aumento na DiBAC4 (3) de fluorescncia do TNT-ligado celular aps estimulao mecnica (Fig. 4 A e C). Em dupla voltagem-clamp gravaes de TNT ligado clula PC12 pares, no foi encontrada evidncia de acoplamento elctrico (Fig. 4B) (n = 6). Estes dados confirmam um modelo em que canais de conexinas so importantes mediadores da TNT-dependente acoplamento eltrico. Sinais TNT Transmissveis despolarizao Ative Baixa Tenso-Gated Ca 2 + Canais em HEK293 clulas. Para investigar se o observado TNT acoplamento mediado elctrica poderia conduzir a mudanas fisiolgicas mensurveis, ns simultaneamente medida potenciais de membrana com DiBAC4 (3) e Ca intracelular 2 +nveis ([Ca2 +]Eu) Com o indicador de clcio fluorescente X-Rhod-1 em TNT-ligado HEK293 pares de clulas. Estimulao mecnica de uma clula HEK293 sempre revelou uma despolarizao e um aumento na [Ca2 +]Eu no estimulada clula. No entanto, as elevaes de clcio foram s vezes observado em clulas que no tinham nenhuma conexo fsica com a estimulada clula (Fig. S5, Upper). Para eliminar estes sinais no especficos, aplicou-se 100 uM suramina, um bloqueador do receptor purinrgico (20), que completamente suprimida essas elevaes de clcio (Fig. S5, Baixa). Em a presena de suramina, rpidos nveis elevados de clcio foram observados em ~ 50% de TNT-ligado clulas HEK293 quando a clula estimulada foi despolarizada (Fig. 5A, no topo). No restante ~ 50%, porm, a clula TNT-conectado no mostram um aumento na [Ca 2 +] Eu Mesmo embora o Ca [2 +]i foi sempre fortemente elevados na estimulada clula (Fig. 5A, Oriente). Este achado, em conjunto com a nossa descoberta que um 30 mm, mas no um 19 uM longos TNT conduziu a uma mudana na [Ca 2 +]Eu em a clula ligada, excludos uma difuso de comprimento limitado de clcio a partir da clula estimulada atravs do TNT. Em vez disso, observamos que a TNT conectado clulas que apresentaram aumento [Ca 2 +] Eu tambm exibido um aumento no seu potencial de membrana que excedeu um Fmax de 0,2 no primeiro minuto aps o estmulo (Fig. 5B, abrir tringulos pretos). O limiar-dependente correlao entre a extenso da despolarizao eo aumento na [Ca2 +]Eu sugerido que o Ca voltagegated 2 +canais foram sendo ativado. Porque voltagem dependentes Ca 2 + canais em clulas HEK293 activar-se a uma baixa tenso e, como tal, foram comparados com um Ca do tipo T2 +canal (21), ns repetida das experincias acima, na presena de 5 mM mibefradil, um bloqueador seletivo de baixa voltagem dependentes de Ca 2 + canais de esta baixa concentrao (22). Independentemente do nvel de despolarizao no clula estimulada, no houve mudanas na [Ca 2 +]i ocorreu em TNT-ligado clulas na presena de mibefradil (Fig. 5A, inferior, e B,

vermelho tringulos). Em contraste, as clulas NRK expressar uma Ca tipo L2 +canal que activado em potenciais mais elevados de membrana (23). Quando repetiu as experincias anteriores com TNT ligado clula NRK pares, nunca foram observadas mudanas nas [Ca2 +]Eu, Tal como medido com X-Rhod-1 (Fig. S6) (n = 10). Este achado sugere que, sob nossa estimular condies, TNT mediadas despolarizaes pode ser grande suficiente para ativar de baixo limiar de porto de voltagem Ca 2 +canais, mas no so suficientes para ativar o patamar mais elevado do tipo L-Ca 2 +canais em clulas NRK.Discusso.Neste estudo, proporcionar uma forte evidncia de que as clulas dos animais podem ser eletricamente acoplada a longas distncias atravs de TNTs e essa lacuna cruzamentos so necessrios para esta comunicao (Fig. 5C). Acoplamento elctrico TNTmediated foi observada entre todos os tipos de clulas que expressam Cx43, incluindo NRK, HEK293, HUVEC, e NCC clulas. No encontramos nenhuma evidncia de acoplamento eltrico entre TNT-ligado clulas PC12, que no expressam junes. Este resultado sugere que existem pelo menos dois tipos diferentes de TNTs: aqueles que interpem conexinas e, assim, participar em acoplamento elctrico, e aqueles que no possuem conexinas e no exibir acoplamento elctrico. Cx43 imunorreactividade foi mais frequentemente expressos em apenas uma extremidade de uma ligao a TNT duas clulas, implicando uma fronteira membrana naquela extremidade do TNT e uma continuidade da membrana TNT com a outra clula. O mximo condutncia valor observado foi de 1,3 ns para uma conexo de TNTe, dado um nico canal de condutncia 61 pS para Cx43 (24), este sugere que pelo menos um equivalente de ~ 20 canais abertos foram envolvidos no acoplamento respectivo. Assim, a TNT-dependente eficincia de acoplamento elctrico entre as clulas susceptvel de ser no determinado apenas por o comprimento eo nmero de TNTs entre as clulas, mas tambm pela Nmero e aberto probabilidade de os canais conexinas apresentar. Nossos resultados sugerem que aproximadamente 80% dos TNTs entre NRK clulas mediar acoplamento elctrico. Ns demonstramos que anteriormente ~ 50% de TNTs entre clulas NRK esto envolvidos na organela transferncia (5). Esta descoberta sugere que um nmero de TNTs so susceptveis de ser envolvido em ambos os processos e aumenta a questo de o mecanismo pelo qual ocorre a transferncia organela entre TNT-ligado clulas. Mecanismos possveis poderiam exo-envolver e eventos endoctica na interface da membrana, ou fuso uma transitria da membrana TNT com a clula-alvo membrana. Alm disso, com base em nossos dados aqui, TNTs no PC12 as clulas no so permanentemente aberto em ambas as extremidades, mas em vez disso formar uma margem de membrana (ou interface) com uma clula. Este achado aparentemente em contraste com o nosso achado anterior que um poucos TNTs em clulas PC12 mostrou abertura em ambas as extremidades evidenciado por evidncias morfolgicas (3). Estes TNTs abertas poderia refletir estruturas transitrias, que podem facilitar a vida curta organela transferir como documentado por longos perodos de observao (3, 19). No entanto, capturar esses eventos transientes de longa durao por medies elctricas pode ser difcil devido a limitaes tcnicas. TNT-dependente de transferncia de carga entre organela As clulas tem sido observada em uma variedade de diferentes tipos de clulas (3, 5-

7,19), assim, os mecanismos de transferncia so de considervel interesse para futuros estudos.O nosso resultado que a TNT acoplamento mediado elctrica de uma magnitude suficiente para activar os canais de clcio dependentes da voltagem noclula receptora no suporta um modelo simples de difuso de clcio (Fig. 5C). Observamos que a alta [Ca2 +]Eunas clulas estimuladas foi no suficiente para evocar sinais de clcio na clula TNT-se ligado a despolarizao transmitido foi abaixo de um valor de limiar. No entanto, dois estudos recentes em clulas HeLa dendrticas e transfectado evidncias encontradas para a TNT-dependente de sinalizao de clcio intracelular atravs de difuso de clcio atravs TNTs (25, 26). Este achado sugere que diferentes mecanismos de sinalizao de clcio intercelulares so probabilidade de existir e pode refletir a diversidade de estruturas de TNT e funes em tipos celulares especficos (6, 7). Alm disso, nossos achados aqui abrir a possibilidade de que TNTs participar fisiologicamente funes celulares relevantes. Em particular, o comportamento coletivo de solitrios ou livremente em anexo clulas migratrias que seguem o mesmo faixas durante a diversos processos de desenvolvimento poderiam se beneficiar uma rede de sinalizao de longa distncia. Clula a clula-contactos atravs longo "Filopidia fina" tm sido observados in vivo dentro de um fluxo de migrar NCC (27) e da migrao das clulas durante mar gastrulao ourio-do-(28). Nosso resultado que algumas clulas NCC eram de fato eletricamente acoplada por via de TNTs sugere que TNTs poderia desempenhar um papel importantena coordenao do NCC migrao.Para alm da activao de canais dependentes da voltagem de ies, TNT mediada acoplamento eltrico pode afetar a jusante outros percursos e processos em clulas ligadas, incluindo a modulao da actividade de molculas pequenas transportadores (2) ea activao de enzimas, tais como a protena quinase A (29), cinase PI3(2), ou sensveis voltagem de fosfatase (30). Factina-rico membranaextenses de ligao de clulas em locais opostos da ferida ter sidoObservou (31), bem como a activao de PI3 quinase durante cicatrizao de feridas (2) e uma despolarizao da membrana no lder aresta de feridas (32). Este achado pode sugerir que a membrana extenses / TNT-estruturas como propagar sinais de despolarizao longas distncias para sincronizar a remodelao F-actina observado pela ativao de cascatas de sinalizao a jusante durante cura. Assim, nosso estudo fornece evidncias de que a transferncia de sinais eltricos atravs de TNTs e ativao subseqente de fisiologicamente relevantes sinais biofsicas pode fornecer uma nica mecanismo de longa distncia de sinalizao celular. Materiais e Mtodos Potencial de membrana e [Ca2 +]Eu Imaging. Por nico potencial de membranamedies, as clulas foram pr-carregado com 2 mM de DiBAC4 (3) (Sigma-Aldrich) a 37 C durante 45 min. Imagens lapso de tempo de fluorescncia foram adquiridos antes e aps a estimulao mecnica com excitao a 488 nm. Para a medio simultnea de [Ca2 +]i e potencial de membrana, as clulas foram carregadas com 0,3 uMX-Rhod-1 AM (Molecular Probes) durante 30 min, em seguida, com 2 uM DiBAC4 (3) a 37 Cdurante 30 min. Imagens de fluorescncia (excitao a 560/488 nm, respectivamente) foram obtida sob as mesmas condies que individuais membrana potenciais medies, excepto que 100 uM suramina (Sigma-Aldrich) estava presente. Medidas eletrofisiolgicas. Por meio de patch-clamp celular a gravao, foi substitudo com (em mM): 145 NaCl, 10 glucose, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1 MgCl2, 5

Hepes (pH 7,4). Pipetas de gravao (5-7 mohms) foram enchidos com (em mM): 125 CsCl, 8 NaCl, EGTA 1 de CaCl2, 5, 15 TEA-Cl, 4, 10 MgATP Hepes (pH = 7,3).Dual de clula completa gravaes foram realizadas com um EPC9 dupla amplificador de patch-clamp controlado por software PatchMaster (Heka Elektronik GmbH), como descrito anteriormente (14).Mais detalhes dos mtodos podem ser encontrados em Materiais e Mtodos SI.AGRADECIMENTOS. Agradecemos E. Dupin para o conselho em clulas da crista neural preparao e E. Hodneland para comentrios valiosos sobre o manuscrito.Confocal de imagem foi realizado no Molecular Imaging Center (genmica funcional, Norwegian Research Council), da Universidade de Bergen. Este estudo foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa da Noruega Grants 178105 (para EH) e 172.646 NanoMat (para H.-HG), o Nano UIB (H.-HG), e Helse VestSamarbeidsorganet (911,574) (a H.-HG).1. Levin M, Thorlin T, Robinson KR, Nogi T, M Mercola (2002) Assimetrias em H + /K +-ATPase e potenciais de membrana de clulas compreendem um passo muito cedo na esquerda-direita padronizao. Clula 111:77-89. 2. Levin M (2007) em grande escala biofsica: fluxos inicos e de regenerao.Trends Cell Biol 17:261-270. 3. Rustom A, R Saffrich, Markovic I, Walther P, Gerdes HH (2004) rodovias Nanotubular para o transporte organela intercelular. Cincia 303:1007-1010. 4. Onfelt B, Nedvetzki S, K Yanagi, Davis DM (2004) de ponta: os nanotubos de membrana conectar clulas do sistema imunolgico. J Immunol 173:1511-1513. 5. Gurke S, et al. (2008) de nanotubos de tnel (TNT)-estruturas como facilitar uma constitutiva, actomyosin dependente da troca de organelas endocticas entre rins de ratos normais clulas. Exp. Cell Res. 314:3669-3683. 6. Gerdes HH, Carvalho RN (2008) a transferncia intercelular mediada por nanotubos de tunelamento. Curr Opin celular Biol 20:470-475. 7. Davis DM, Sowinski S nanotubos (2008) Membrana: Dinmico de longa distncia conexes entre as clulas animais. Nat Rev Mol. Cell Biol 9:431-436. 8. Sowinski S, et al. (2008) Membrana de nanotubos de conectar fisicamente as clulas T mais longo distncias que apresentam uma nova via para o HIV-1 de transmisso. Nat Cell Biol 10:211-219. 9. Eugenin EA, Gaskill PJ, Berman JW (2009) nanotubos de tunelamento (TNT) so induzidas porHIV-infeco de macrfagos: Um mecanismo potencial para o HIVintercelular traf de trfico. Clula Immunol 254:142-148. 10. Gousset K, et al. (2009) Os prons seqestrar nanotubos de tunelamento para disseminao intercelular.Nat Cell Biol 11:328-336. 11. Chauveau A, Aucher A, Eissmann P, E Vivier, Davis DM (2010) Membrana de nanotubosfacilitar a longa distncia interaces entre as clulas assassinas naturais e clulas-alvo. ProcNatl Acad Sei EUA 107:5545-5550. 12. Chinnery HR, Pearlman E, McMenamin PG (2008) de ponta: os nanotubos de membranain vivo: Uma caracterstica da MHC de classe II + de clulas na crnea do rato. J Immunol 180:5779-5783. 13. Tokarz M, et al. (2005) o transporte arquivo nico eletrofortica e contagem dos indivduos As molculas de DNA em nanotubos surfactante. Proc Natl Acad Sei EUA 102:9127-9132. 14. Veruki ML, Hartveit E (2002) AII (Rod) clulas amcrinas formar uma rede de electricamente interneurnios acoplados na retina de mamferos. Neuron 33:935-946.

15. Gonzlez D, Gmez-Hernndez JM, Barrio LC (2007) Bases moleculares da tenso dependncia dos canais de conexinas: uma avaliao integrada. Prog Biophys Mol Biol 94:66-106. 16. Harks EG, et al. (2001) Fenamates: Uma nova classe de bloqueadores de juno reversveis gap.J Exp Ther. Pharmacol 298:1033-1041 17. Tucker GC, Aoyama H, M Lipinski, Tursz T, Thiery JP (1984) reatividade idntico deOs anticorpos monoclonais HNK-1 e NC-1: Conservao em vertebrados em clulas derivadas a partir do primrdio neural e em alguns leuccitos. Clula diferem 14:223230. 18. van der Heyden MA, et al. (1998) Identificao de connexin43 como um alvo funcional para sinalizao de Wnt. J Cell Sci 111:1741-1749. 19. Bukoreshtliev NV, et ai. (2009) bloco seletiva de nanotubos de tunelamento (TNT) formaoinibe a transferncia organela intercelular entre as clulas PC12. FEBS Lett 583:1481-1488. 20. Fischer W, Franke H, Grger-Arndt H, P Illes (2005) Prova da existncia de P2Y1, 2,4 subtipos de receptores em clulas HEK-293: a reactivao dos receptores P2Y1 aps aplicao agonista repetitivo. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 371:466-472. 21. Berjukow S, et al. (1996) endgenos canais de clcio em rim de embrio humano (HEK293) clulas. Br J Pharmacol 118:748-754. 22. Martin RL, Lee JH, LL Cribbs, Perez-Reyes E, Hanck DA (2000) Mibefradil bloco de clonado canais de clcio tipo T-. J Exp Pharmacol Ther 295:302-308. 23. de Roos AD, Willems PH, PH Peters, van Zoelen EJ, Theuvenet AP (1997) Sincronizado picos de clcio proveniente potenciais de ao espontneos de clcio em monocamadas de fibroblastos NRK. O clcio clula 22:195-207. 24. Valiunas V, Bukauskas FF, R Weingart (1997) Condutncias e permeabilidade seletiva de connexin43 canais junes examinados em clulas cardacas de ratos recm-nascidos. Circ Res. 80:708-719. 25. Watkins SC, Salter RD (2005) a conectividade funcional entre as clulas imunes mediadas nanotubules por tunelamento. Imunidade 23:309-318. 26. K Hase, et al. (2009) M-Sec promove a formao de nanotubos de membrana, interagindo com Ral e do complexo de complexo exocist. Clula Nat Biol 11:14271432. 27. Teddy JM, Kulesa PM (2004) as evidncias in vivo para a clula de curto e de longo alcance comunicao em cranianos clulas da crista neural. Desenvolvimento 131:6141-6151. 28. Miller J, Fraser SE, McClay D (1995) Dinmica de filopodios fina durante ourio do mar gastrulao. Desenvolvimento 121:2501-2511. 29. Zhang C, et ai. (2004) de clcio e endocitose dinamina independente na raiz dorsal neurnios do gnglio. Neuron 42:225-236. 30. Murata Y, Iwasaki H, Sasaki M, Inaba K, Okamura Y (2005) fosfoinositida a actividade da fosfatase acoplado a um sensor de tenso intrnseca. Nature 435:1239-1243. 31. Madeira W, et al. (2002) Cicatrizao de Feridas morfognese recapitula em Drosophila embries. Nat Cell Biol 4:907-912. 32. Chifflet S, Hernndez JA, Grasso S (2005) Um possvel papel para a despolarizao da membrana na cicatrizao de feridas epitelial. Am J Physiol celular Physiol 288: C1420-C1430.