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Università di Padova

I.N.B.B.

Adelio Rigo

Antiossidanti e Alimentazione

Bolzano , 28 Giugno 2006


Antiossidanti –Alimentazione - Salute

• Sotto la voce Polyphenols-Health sono stati pubblicati più


di 300 lavori scientifici negli ultimi 2 anni.

• Molti antiossidanti si possono considerare dei veri principi


attivi

• Studi difficili e costosi da condurre sull’uomo

• Molti problemi aperti


Bibliografia
Molecular basis of cardiovascular disease (1999)
Fat soluble antioxidants protect against atherosclerosis
Nature, 405, 903 (2000)
Antioxidant activity of fresh apples
• Nature, 408, 239 (2000)
Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing
Nature, 414, 863 (2001)
Endothelin-1 synthesis reduced by red wine
Nature, 424, 1013 (2003)
Plasma antioxidants from chocolate
Carcinogenesis,27, 989 (2004)
Delfinidin as potent angiogenic inhibitor
America Journal of Cardiology, 96, 810 (2005)
Effects of pomegranate juice in patients who have CHD
British journal of nutrition, 93, 895 (2005)
Anthocyanosides improves nocturnal vision and clinical symptoms
La macchina uomo

biochimica

Alimenti + Ossigeno Energia meccanica

elettrica
Anidride carbonica
Acqua
Sottoprodotti

Radicali liberi dell’ossigeno R-O* R-O-O * HO * O-O *


(ROS = Reactive Oxygen Species)

Specie altamente reattive che concorrono all'invecchiamento dell’uomo


Nature, 408, 239 (2000)
LDL e ROS

LDL = Lipoproteine a
bassa densità

• perossidi acidi grassi

• foam cells

• patologie aterosclerotiche
L'organismo ha difese naturali per proteggersi
dai ROS

Enzimi
Vitamine
Sistemi di riparazione

Queste difese possono essere fortemente aiutate da alcuni componenti della


dieta, in particolare dagli antiossidanti (polifenoli), come hanno dimostrato
ricerche epidemiologiche famose, vedi ad esempio il cosiddetto "paradosso
francese".
Lancet i, 1523 (1992)
Paradosso Francese

Consumo di grassi
(calorie)

• I Polifenoli fanno la differenza


I polifenoli comprendono un vasto gruppo di metaboliti secondari
delle piante: i flavonoidi e altri derivati fenolici.

Si conoscono più di 5000 composti fenolici diversi.

I cibi:
Effetti dei Polifenoli
• Azione
– Antiossidante Inibizione
Inibizione della

 della perossidazione
perossidazione
lipidica*

Scavenging di radicali reattivi





Capacità di
Capacità di chelare
chelare ii metalli
metalli
– Prottettiva sul sistema



cardiovascolare
Capacit

 à riducente
Capacità riducente

– Inibizione aggregazione
piastrinica

– Antiinfiammatoria

– Antitumorale
Localizzazione dell’energia nei radicali
Radicali liberi sono molecole contenti un elettrone spaiato
la cui è energia localizzata sugli atomi che lo contengono

Radicale OH°
Radicale polifenolico

•Maggiori sono le dimensioni minore è la reattività


Caratteristiche dei radicali liberi

o I radicali si comportano come piccoli magneti e la loro


presenza può essere misurata mediante risonanza magnetica
elettronica (ESR)

o Esistono radicali liberi


altamente reattivi che vivono pochi nanosecondi
molto stabili con tempi di vita di anni

o I radicali altamente reattivi reagiscono con le biomolecole


danneggiandole

o I radicali altamente reattivi possono essere efficacemente


intercettati dai polifenoli presenti negli alimenti
Radicali liberi e alimenti

o I polifenoli presenti negli alimenti


possono dare origine a radicali poco
reattivi

o Radicali liberi stabili possono essere


presenti negli alimenti
Spremuta d’arancia

Un sorso di salute Radicale vitamina C

1200

800

400

u.a.
0

-400

-800

-1200
3470 3475 3480 3485 3490 3495

Gauss
Presenza di radicali stabili nei vini rossi

A = RADICALE VINO g =2.0037

B = RIFERIMENTO

B A

3430 3440 3450 3460 3470 3480 3490


Gauss
Metodi per valutare l’attività antiossidante
• Molti metodi sono lontani dai processi che
avvengono in vivo
• La quasi totalità dei metodi sono semplici titolazioni

Fe3+-tripiridiltriazina a bassi pH (FRAP)


DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazide)
* Crocina (efficienza) * Usano come
ABTS + MetHb+ H2O2 (TAS o TEAC, Randox ossidanti radicali
lab.) perossidici
Luminolo + perossidasi (Axxora lab.) Solo un metodo
* Ficoeritrina (ORAC) misura
* ROO• (TRAP)
l’efficienza

* acido α-cheto γ-metiolbutirrico (TOSC)


Cu++ + LDL
Valutazione dell’attività antiossidante

Vanno considerate 2 caratteristiche:


CAPACITÀ → quantità delle specie reattive bloccate

EFFICIENZA → abilità nel bloccare le specie reattive

Obiettivo:
misurare capacità ed efficienza di
- antiossidanti
- alimenti
- del plasma umano

nell’inibizione della perossidazione lipidica in modelli che


riproducano sistemi e condizioni presenti nell’uomo
Modello delle LDL

Acido grassi
insaturi Micelle

Tensioattivo

Generatore radicali ( AZO )


Processo di formazione dei perossidi:

• AZO Æ R- OO °

• R-OO ° + L-H Æ R-OO H + L° (L- H = ACIDO GRASSO)

• L° + O-O Æ L- OO °

• L- OO ° + L- H Æ L-OO H + L°

o Formazione perossidi (L-OO H )

o Scomparsa dell’ ossigeno ( O-O ) misurabile, con un


elettrodo
Un Polifenolo ( PFN ) blocca il processo a catena

L-OO ° + L- H Æ L-OO H + L°
(reattivo) (reattivo)

L-OO ° + PFN - H Æ L-OO H + PFN °


(reattivo) (non reattivo)
ROO°
ROO°
Effetto Vino
Effetto della concentrazione

120 azo
100 0,8 g / L
vino 1,6 g / L
80 αo
2,7 g / L
Ossigeno %

60

40 α1

20

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (minuti)
Effetto Polifenoli

120 azo
Peonidina
100
α0 Polifenolo Catechina
80 Malvidina
Ossigeno %

( 6 mg / L )
60

40 α1
20

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (minuti)
Metodo: misura del consumo di ossigeno in un sistema micellare
costituito da un tensioattivo +
acido linoleico + iniziatore radicalico (ABIP), pH 7.4, 37°C

ABIP dO2
200 α=−
dt
150 α0 Lag-time
Ossigeno (μM)

α1

100

Antiossidante
α2
50

0
0 5 10 15 20 25 30

tempo (min)
Variazione di α1/α0 in funzione della concentrazione di malvidina

25
25
1.0
1.0
20
20
0.8
0.8

(min)
time (min)
15
15
α1 / α 0

0.6
0.6

Lag time
10
10
0.4
0.4

Lag
0.2 55
0.2
A
0.0
0.0 00
00 22 44 66 88 10
10 12
12 14
14 00 22 44 66 88 10
10 12
12 14
14
c1/2
[Malvidina 3-glicoside] μM
[Malvidina 3-glicoside] μM [Malvidina 3-glucoside]) μM
[Malvidina 3-glucoside]) μM

Efficienza: 1 / c1/2 Capacità = n = LT Ri / [IH]


Synergy
2000

1500
[O2] (a.u.)

1000

500

0
0 5 10 15
time (min)
Synergy
2000

MH = 1g/L ( C1/2 = 0.1 g/L n = 200)


1500
[O2] (a.u.)

1000

500

0
0 5 10 15
time (min)
Synergy
2000

1500 CH = 1g/L (C1/2 = 1g/L; n = 750)


[O2] (a.u.)

1000

500

0
0 5 10 15
time (min)
Synergy
2000

MH
1500
[O2] (a.u.)

1000
CH

500

0
0 5 10 15
time (min)
Synergy
2000

1500
[O2] (a.u.)

1000

500

0
0 5 10 15
time (min)
Synergy
2000

1500
[O2] (a.u.)

1000

500

0
0 5 10 15
time (min)
Interazioni tra Antocianidine e Catechina

200
200
**
a. Non inibita
b. Catechina 6 μM
150
150
μM

ee c. Malvidina 6 μM
d. Malvidina 6 μM + Catechina 6 μM

100
100
Oxygen

50
50 aa bb cc dd

00
00 10
10 20
20 30
30 40
40 50
50

time
time (min)
(min)
Efficienza e capacità di sostanze pure nel sistema TA-LH

Composto n C1/2 (C1/2 )-1 Composto n C1/2 (C1/2 )-1


(μM) (μM)-1 (μM) (μM)-1

delfinidina-3G 11 0.44 2.3 catechina 6 1.1 0.9


petunidina-3G 11.2 0.07 14 t-resveratrolo 3.0 1.25 0.80
malvidina-3G 6.8 0.31 3.2 ac. clorogenico 6.4 1.29 0.78
cianidina-3G 4.1 0.95 1.1 ac. caffeico 4.8 1.75 0.57
peonidina-3G 3.3 0.67 1.5 ac. gallico 2.5 0.8 1.30
pelargonidina- 11.9 0.26 3.8 ac. vanillico - 9.7 0.10
3G
ac. siringico 4.4 1.32 0.76
trolox 2 3.7 0.3
ac. p-cumarico - 40.3 0.02
quercetina 3.1 nr nr
ac. protocatetico 3.5 3.9 0.26
ac. cicorico 9.9 0.23 4.30
ac. urico 2.9 0.77 1.30
ac. ascorbico 1.5 nr nr
Effetto qualità:
g mela / Kg necessari per dimezzare perossidazione lipidica

3,5

2,5

1,5

0,5

0
Golden Golden Golden Renetta Precoce Royal
Revò Cocea Coba Gala

Buccia Polpa Mela


Sinergismo nelle Mele
350 Catechina sperimentale

300 Catechina calcolata


mg/100g
250

200

150

100

50

0
M

Ro

Fu

Br
Re

St

ol
or

ra
ar

ae
ji
ya
ne

de
nn
ge

bu
lG
tta

n
De
nd

rn
D
al
Sm
l.
uf

el
a
t

.
La quantità di catechina da misure di efficienzaith

risulta del 40% superiore


alla quantità di catechina calcolata dalla composizione su base addittiva
Capacità Antiossidante e polifenoli nei
vini

10

8
Capacità Antiox

0 500 1000 1500 2000 2500

-1
Polifenoli /mg L

Capacità Antiox = - 0,93 + 3,75 e-3 [P] r = 0,861


Capacità antiosssidante dei vini rossi

• Buone correlazioni lineari sono state trovate fra capacità


antiossidante dei vini e

• - contenuto di polifenoli
• - concentrazione delle proantocianidine
• - contenuto di polimeri con n >5
Composizione, efficienza e capacità antiossidante di alcuni radicchi

25
ac. Clorogenico
20 ac. Cicorico
(mmoli/Kg ac. paracumarico
15 ac. vanilllico
ac. siringico
10 ac. caffeico
ac. protocatetico
5 ac. Gallico
antociani
0

50
180
160
40 r2 0.92
r2 0.95
(L/g)

140

n (mmoli/Kg)
30 120
100
-1
(C1/2)

20 80
60
10 40
20
0
0
0 5 10 15 20 25 30
0 5 10 15 20 25 30
Polifenoli totali HPLC (mmoli/Kg) Polifenoli totali HPLC (mmoli/Kg)
M
A
R
M
M EL mmoli/Kg
A LA
R
M TA
M E LL M
A O

0
10
20
30
40
50
60
R A R
M T A
EL A M 1
M L O
A A
R
M TA RA
EL M 2
LA O
R
A
ES TA
M 3
TR O
A
TT RA
O 4
M
SU O
C R
C A
ES O
TR DI M
A
TT IRT
O IL
M LO
IR
TI
LL
Confronto tra prodotto:

SU O
C
C
O
PRTC

ES
TR DI P
A ES
TT
O C
A
PE
SC
SU A
C
fresco

C
ES O
lavorato

TR DI M
A
T T EL
O A
M
EL
A
M
A
R
M L/g
M EL
A LA
R
M TA
M E LL M
A O

0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
R A R
M T A A
M E LL M 1
A A O
R
M TA RA
EL M 2
LA O
R
A
ES TA
M 3
TR O
A
TT RA
O 4
M
SU O
C R
C A
ES O
TR DI M
A
TT IRT
O IL
M LO
IR
TI
LL
Confronto tra prodotto:

SU O
C
C
PRTE

ES O
TR DI P
A
TT ESC
O A
PE
SC
SU A
C
fresco

C
ES O
lavorato

TR DI M
A
T T EL
O A
M
EL
A
Confronto Alimenti
C50 = g alimento per dimezzare perossidazione lipidica nell’uomo
(biodisponibilità completa)

1400

1200

1000

800

600

400

200

0
Pera Mela Pesca Fragola Vino Pinot
Banana
William Stark D. Gialla El'Santa nero
850 170 1350 510 160 190
• I polifenoli formano radicali liberi
relativamente stabili

• Radicali stabili sono presenti negli


alimenti e contribuiscono all’azione
antiossidante
Concentrazione dei radicali nei vini (nM)

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TERO LAMB LAGR CABS MARZ MERL PINN SCHI
Radicali (R°) e Antociani
100

80
R° /nM

60

40

20

0
0 100 200 300 400 500 600 700

A n to c ia n i T o ta li
1993 R ° = 0 ,1 9 x A T + 6 ,6 7 r = 0 ,8 7 0
1998 R ° = 0 ,0 2 7 x A T + 5 ,4 2 r = 0 ,8 3 6
Attività Antiox. , Radicali , Polimeri

x tio

8
80
n

6
A

70
4
à

60
p a cit

2 50

]
[R °
0 40
Ca

30
2400
2200
2000
1800 20
1600
1400
1200 10
1000
P o li 800
600
m er
i
0
2
4
6
8
Ricotta affumicata
¾Parte interna bianca
¾Parte intermedia gialla
¾Parte esterna bruna

Efficienza Capacità
interna intermedia esterna interna intermedia esterna
3 12

2,5 10

2 8

1,5 6

1 4

0,5 2

0 0

interna intermedia esterna interna intermedia esterna


Ricotta affumicata
¾Parte interna bianca
¾Parte intermedia gialla
¾Parte esterna bruna

1500
Parte esterna scura
1000 Parte intermedia
Parte interna bianca

500
A.U.

-500

-1000

-1500
3440 3450 3460 3470 3480 3490 3500 3510 3520

Gauss
Conclusioni
ƒ Nel metabolismo si formano radicali liberi altamente reattivi che
contribuiscono all’invecchiamento dell’uomo

ƒ Concentrazioni modeste di polifenoli rallentano efficacemente la


perossidazione lipidica

ƒ I polifenoli sono efficaci nel bloccare i radicali liberi altamente


reattivi formando radicali poco reattivi

ƒ Radicali liberi stabili sono presenti in molti alimenti

ƒ Esiste una ottima correlazione fra l’effetto antiossidante, il


contenuto di polifenoli e la concentrazione di radicali liberi
Sistemi messi a punto

• Sviluppati e messi a punto due sistemi per la misura


della capacità, dell’efficienza antiossidante e della
sinergia di molecole o di alimenti.
I sistemi di micelle riproducono :

• Le condizioni del tratto digestivo


(non esistono problemi di biodisponibilità)

• Le condizioni del plasma umano


(si deve considerare la biodisponibilità)
Attività in corso

• Studio dei meccanismi in cui sono coinvolti radicali dei


polifenoli nei biosistemi ed effetti sinergici.

• Effetto di diete ricche di polifenoli sui markers dello


stress ossidativo

• Recupero di polifenoli da scarti di lavorazione di


prodotti ortofrutticoli

• Valutazione dell’attività antiossidante in funzione della


cultivars

• Effetto dei polifenoli sul metaboloma e sul proteoma


Partecipano a queste ricerche
Dipartimento di Chimica Biologica
I.N.B.B. Università di Padova

Dipartimento di Fisica
I.N.B.B. Università di Trento

Istituto Agrario San Michele all’Adige

Dipartimento di Scienze Neurologiche


Università di Padova

Dipartimento di Biotecnologie Agrarie


Università di Padova

IRCS Ospedale S.Camillo (Venezia)


Attività antiossidante del plasma umano
Condizioni: TA 6 mM, LH 4mM, ABIP 1mM

200
a- plasma 0.07%
b- plasma 0.28%
c- plasma 0.5%
150
d- plasma 2%
Ossigeno (μM)

100

50

a b c d
0
0 10 20 30 40 50 60

tempo (min)
Sistemi a confronto: capacità antiossidante del plasma, HMWplasma,
LMWplasma misurata nei sistemi HMWplasma, TA, SDS

900
800
700
μmoli R· bloccati / Lplasma

600
500 HMW
400 LMW
300 PLASMA
200
100
0
HMW TA SDS
Correlazione tra i valori di PRTC e PRTE

1000

900
R2 = 0,73
800

700

600
PRTC

500

400
HMW
300
LMW
200
R2 = 0,69 Plasma

100

0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
PRTE
PRTC/PRTE

1,40E+00
1,20E+00
1,00E+00

8,00E-01 HMW
6,00E-01 LMW
Plasma
T-test
4,00E-01
2,00E-01 PRTC/PRTE
Giovani
0,00E+00
Giovani Anziane Vecchie Anz.+Vec. H L P
Anziane 0.5679 0.0097 0.9324
Vecchie 0.1024 0.0368 0.5668
Anziane +
0.1440 0.0067 0.7240
Vecchie
Antociani
Nei polifenoli sono presenti strutture del tipo

cianidina peonidina malvidina