FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Microbiología y Parasitología UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS “Universidad del Perú, decana de América”

Año de la calidad educativa

purificación de una enzima utilizando el programa protein.ms-dos

salazar dávila, Carlo César Departamento de Bioquímica, facultad de Ciencias Biológicas Profesoras: Dra. Beatriz Lizárraga y Dra. Patricia Woll 09100036@unmsm.edu.pe

RESUMEN En esta sesión se utilizará un programa de ordenador, PROTEIN, que simula el proceso de purificación de 20 enzimas diferentes. Cada enzima se identifica con un número del 1 al 20. Elegiremos para este caso la enzima representada por el número 3. A continuación nos indican una serie de características generales de la enzima: estabilidad térmica, estabilidad frente al pH, etc. Esta información nos será útil para diseñar las primeras etapas del proceso de purificación. Es posible elegir entre las siguientes técnicas de separación: tratamiento con calor, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatoenfoque, etc. Nuestro objetivo es purificar a homogeneidad (sin ninguna otra enzima contaminante) la enzima Nº 3 contenida en el material de partida. Para ello, a partir de una muestra determinada se irán realizando secuencialmente las pruebas indicadas en la descripción del programa, variando las condiciones de cada ensayo para optimizar la purificación de la proteína problema.

Palabras clave: Enzima, purificación, PROTEIN

To continue with the process we have been explained loads of general characteristics of our enzyme: Thermal stability. como lo es en nuestro caso. For that. se puede citar a aquellos que fraccionan las moléculas basándose en sus tamaños. Ammonium sulphate precipitation. Ion exchange chromatography. Las fuentes comunes son los tejidos de los animales domésticos tales como el pollo. . ya sea una proteína. We will choose in this case the enzyme which is been identified as number 3. Stability against pH. acido nucleído. facilidad de obtención del tejido escogido. This information will be useful for the first stages of purification process. como: la temperatura a la cual se desnaturalizan sustancias que no soportan tal variación que exceda el límite de termoestabilidad. chromatofocusing. Key words: Enzyme. etc. purification. Son fuentes alternativas los microorganismos de fácil cultivo como la E. rata. puede simnp0lificarse con una cuidadosa selección de la fuente. cerdo. buey. All these enzymes must be identified with number from 1 to 20. called PROTEIN. PROTEIN INTRODUCCIÓN U no de los principales procesos para el estudio de un complejo proteico es su purificación de una solución denominada extracto. posibilidades de estabilización. since a given sample it will be making the indicated tests in the description of the programme sequentially. Gel filtration chromatography.ABSTRACT It will be used for this session a computer programme. Coli o la levadura Baker (Saccharomyces cerevisiae). etc. etc. Entre los diversos criterios de separación podemos mencionar algunos. etc. como la cromatografía de filtración en gel y la ultracentrifugación. se hace siguiendo los criterios de separación basados en alguna propiedad física o química que diferencia al compuesto en cuestión de otros que en principio estarían ligados a él. carbohidrato. which simulate 20 different enzymes’ purification process. La purificación de una sustancia de interés. El aislamiento de una proteína. It is possible to choose between these separations techniques: Heat treatment. Our main objective is to purify homogeneously (without any other polluted enzyme) our enzyme N° 3 which is contained in the initial material. changing all the conditions for each experiment to optimize the purification of the protein that we have been looking for.

Otros métodos como los que separan las moléculas atendiendo a las diferencias en la carga eléctrica neta del compuesto. elegiré una enzima para la purificación. Para dichos fines deberemos seguir una metodología que sugiere e implica: familiarizarse con el manejo del software. llevar el registro escrito de todas las acciones y resultados. En la segunda etapa se aplicará la información recopilada para iniciar la purificación. entre los que cabe destacar la cromatografía de afinidad. y. como la cromatografía de intercambio iónico y la electroforesis. Los que se basan en la retención específica de sólo uno o varios tipos de moléculas. La cromatografía de filtración en gel. es una técnica de purificación muy extendida y apreciada debido a su sencillez y eficacia en la resolución de mezclas complejas de macromoléculas. Universidad Nacional Mayor de San Marcos MÉTODOS Y MATERIALES E l software PROTEIN es un simulador de trabajo de purificación de proteínas. para la determinación de pesos moleculares). utilizando los procedimientos que se encuentran disponibles en el software. más corrientemente llamada de exclusión molecular. Esta técnica puede utilizarse con buenos resultados con fines analíticos (por ejemplo. PRIMERA ETAPA En esta primera etapa conseguiremos la mayor cantidad de datos a partir de los métodos presentes en el software. elaborar los cuadros y gráficos necesarios. a partir de un extracto de 20 enzimas diferentes. Para esto. I. Métodos basados en la adsorción diferencial a determinadas matrices. Procedimientos de separación basados en diferencias de solubilidad. Recopilación y sistematización de datos: NOMBRE DE LA ENZIMA | Enzima Nº 5 | . La metodología consiste en aplicar tratamientos que precipiten o inactiven las otras 19 enzimas del extracto inicial procurando mantener la mayor cantidad de la enzima seleccionada activa. para luego analizarlos y tomar decisiones.

que luego será tabulada y estudiada. A continuación los resultados obtenidos para cada temperatura: Tabla Nº1: Resultados del tratamiento con calor Temperatura ºC Inicio | 511 (mg) 30 40 45 50 55 60 65 70 75 80 | 511 | 511 | Proteínas | Unidades de enzima | | 6000 (unid. 1.8 | 0. temperaturas entre 30ºC y 80ºC con un tiempo estándar de 60 minutos.8 | 6000 | | 101.0 | Los trabajos de purificación de proteínas y enzimas están basados en sus características físicoquímicas.5 | 67 | 3.CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS | Esta enzima es estable durante varias horas a temperaturas de hasta 50 º C y con valores de pH entre 3. en este caso. Una vez conseguidos los resultados de una temperatura.3 | 299 | 15.2 | 15 |3 |1 | | | | | . por esta razón es necesario recopilar la información previa. propiedades iónicas y el tamaño molecular (peso molecular). Termoestabilidad de la enzima Nº 5 Para darle un tratamiento con calor a nuestra enzima Nº 5 seleccionamos la opción heat treatment. colocaremos las temperaturas a la que la vamos a someter. Enseguida.5 | 0. se debe aplicar la opción STAR AGAIN que nos permitirá comenzar de nuevo el tratamiento pero con otra temperatura que escojamos.8 | 6000 | | 247.9 | 1339 | | 69. llegando a conclusiones acerca de la Termoestabilidad.0 y 11. saturación óptima de sulfato de amonio para precipitar la enzima.) | | 6000 | | 6000 | | 295.

si se oprime la tecla ESC el programa permite realizar esta etapa desde el inicio. Para esto. A continuación se muestran los resultados obtenidos para distintas concentraciones: Tabla Nº2: Resultados del tratamiento de precipitación con sulfato de amonio Sulfato de amonio [SO4(NH4)3] precipitada | Inicio | 0. por ejemplo 45 a 60% y otras a elegir.9% | | 60. Con este método conseguiremos los datos de solubilidad en presencia de sulfato de amonio y graficaremos la cantidad de proteína precipitada (%) y el porcentaje de actividad enzimática precipitada en por lo menos cuatro concentraciones de sulfato de amonio.9% | 100.9% | 100.7% | | 69.5% | 13.0% | | | % Actividad precipitada | % Proteína Según los datos obtenidos para las determinadas concentraciones. obtendremos los datos a otras concentraciones. colocaremos las diferentes concentraciones de dicha sal.7% | | 100.Según los datos obtenidos para las determinadas temperaturas.0% | 0. construiremos una gráfica .9% | 35. Enseguida. Saturación optima de sulfato de amonio para precipitar la enzima Nº 5 En el tratamiento con sulfato de amonio SO4(NH4)3 escogeremos la opción Ammonium sulphate precipitation. construiremos una gráfica 2.1% | | 98.9% | | 93.1% | | 83.9% | 100.9% | 100. Una vez hechas estas primeras anotaciones.9% | | 51.9% | 100.26% | 93.9% | 100.0% | 0 – 10 % 0 – 20 % 0 – 30 % 0 – 40 % 0 – 50 % 0 – 60 % 0 – 70 % 0 – 80 % 0 – 90 % 0 – 100 % | 16.8% | 23.1% | 3.4% | | 100.

además. Aquí una breve información sobre los rangos de fraccionamientos de los soportes: Matriz | Rango De Fraccionamiento ( kDa ) Sephadex G50 | 1. seguir un protocolo de purificación que genere menos costos y mayor enriquecimiento enzimático. De acuerdo a las tablas de datos y gráficos esbozados podemos reemplazar las distintas temperaturas y concentraciones a una sola por método. En esta opción encontraremos diferentes tipos de soportes. según el programa. análisis de datos II. SEGUNDA ETAPA En esta etapa analizarán los datos obtenidos anteriormente y de manera consecutiva se comenzará con la purificación de mi enzima Nº 5. Método Nº1 . Tratamiento con cromatografía de filtración en gel Para usar el método de cromatografía de filtración en gel escogemos la opción gel filtration. Resultados de la primera etapa. de diferentes marcas y diferentes tamaños.5 – 30 Sephadex G100 Sephacryl S . De los cuales debemos escoger uno que se adecue a un tamaño molecular aproximado con el de nuestra enzima para lograr su diferenciación de las demás.3.200 Ultrogel ACA 54 Ultrogel ACA 44 Ultrogel ACA 34 Biogel P 60 Biogel P 150 Biogel P 300 | | | | | 4 – 150 | 5 – 250 | 5 – 70 | | 10 – 130 | 20 – 350 | | | 3 – 60 | | 15 – 150 | 60 – 400 | | De acuerdo a los datos arrojados por los métodos de termoestabilidad y de solubilidad con sulfato de amonio pudimos evaluar el posible tamaño molecular de nuestra enzima y de esa manera saber qué soporte de gel sería más recomendable usar.

notamos que a concentraciones salinas de 0-10%. la temperatura ideal para nuestra purificación por tratamiento con calor sería 50ºC. usando una baja concentración de sal SO4(NH4)3 que mantiene la solubilidad (no hay precipitación) de nuestra enzima en la solución. pero en 0-40% de concentración la enzima logra un máximo de insolubilidad que mantiene conforme se le aumenta la concentración y con dicho aumento se insolubiliza también a las demás proteínas. de este método se elimina de la solución muchas proteínas indeseables solubles y nos quedamos con la porción que precipitó en el cual se halla nuestra enzima y otras que aún quedan por diferenciar. y la segunda. pude determinar y comprobar que a 50ºC (que es su límite de termoestabilidad) nuestras 6000 unidades de enzima pueden mantenerse activas pero en dicho límite logra desnaturalizar 247. Ahora. Figura Nº2: Resultados de la precipitación con SO4(NH4)3 Según estos resultados elegimos la opción using presipitated material que significa que usaremos el material precipitado con la sal. 0-20%y 0-30% nuestras enzima va precipitando y con ella grandes cantidades de las otras proteínas van siendo cada vez más insolubles. Continuamos la purificación presionando la barra espaciadora como indica (en inglés) el programa y seleccionando la opción continue hasta llegar a la utilización del siguiente método. la concentración ideal que debemos emplear sería de 0-40% de sulfato de amonio con la finalidad de precipitar toda nuestra enzima y de deshacernos de 64. incrementando la concentración de sal SO4(NH4)3 justo por encima del punto de precipitación de nuestra enzima a ser purificada.Tratamiento con calor En el tratamiento con calor. sin embargo. según nuestra gráfica y los datos recopilados en la tabla de precipitación. Por ello. la primera es. la cantidad de proteína que desnaturalizaríamos sería menor. Método Nº2 Precipitación con sulfato de amonio En los procedimientos de separación de proteínas basadas en sus diferencias de solubilidad hay dos formas de purificar y concentrar grandes cantidades de proteína deseada. Figura Nº1: Resultados del tratamiento con calor. Si hubiésemos escogido una temperatura menor a 50ºC.8 gr de las demás proteínas. comprometeríamos grandes cantidades de nuestra enzima y generaríamos un elevado costo por las perdidas. pero. nuestra enzima seguiría siendo estable. y si hubiésemos utilizado una temperatura mayor a 50ºC desnaturalizaríamos más proteínas. Este. nos arrojará la siguiente tabla de resultados: .1% de proteína indeseable que se quedaría en la parte soluble. según sugiere la tabla de datos y la gráfica. Entonces.

Nótese en ella las dos bandas de diferenciación. es decir. Como vamos a trabajar con el material precipitado. tenemos solo 89.0 gr de los 511. y por ultimo tenemos un costo generado por los métodos empleados hasta el momento. Podemos suponer entonces que nuestra enzima tiene como peso molecular uno de esos tres valores. que durante los procesos hemos generados más enzimas como la nuestra. que el total de proteínas al inicio (511 gr) es al total de proteínas que nos queda (89 gr) como 5. Elegimos dicha opción y aparecerán todos los grupos de proteínas que están presentes hasta el momento y que estas separados en material soluble “S” que representan a las proteínas que mantienen su solubilidad hasta esa concentración (0-40% de sal) y en material insoluble “I” que indica a las proteínas y entre ellas a nuestra enzima que precipitaron. y de él obtenemos la siguiente gráfica . exceptuando al BIOGEL P300. Comenzaremos aplicándole el de Sephacryl S – 200 HR. una soluble y la otra insoluble.0 gr de proteínas iniciales. para ello y de acuerdo a la información que tenemos sobre los rangos de fraccionamiento de los soportes y de la electroforesis que analizamos después del tratamiento con calor decidimos emplear las matrices de Sephacryl S – 200 y de Ultrogel ACA 34 en ese orden respectivamente. es decir. 6053 de las 6000 unidades de nuestra enzima.8. Método Nº3 Cromatografía de filtración en Gel Para terminar con la diferenciación de nuestra enzima Nº 3 empleamos la filtración por Gel. un enriquecimiento de 5.8 es a 1.0 gr por purificar. que nos permitirán una mayor diferenciación de los grupos de proteínas aún existentes en los 89. Elegimos dichos soportes pues son los que tienen rangos de fraccionamiento más amplios y diferenciadores. SDS-PAGE Figura Nº4: Página de electroforesis en primera dimensión que resultó luego del tratamiento con sulfato de amonio.Figura Nº3: Resultados totales luego de los dos métodos empleados Según los resultados hasta ahora. En seguida y antes de pasar al siguiente método elegimos la opción SDS-PAGE (electroforesis en primera dimensión) que se nos muestra como alternativa. 24K y 49K. En ella podemos apreciar tres grandes bandas bien marcadas que ocupan en la escala de masa molecular relativa las posiciones aproximadas de 22K. solo nos interesa inspeccionar la región de la SDS que indica a la porción insoluble.

se puede apreciar. es decir. La línea roja se muestra cuando elegimos la opción assay for enzyme activity que significa ensayo de la actividad enzimática. fracciones que vamos a separar del resto usando la opción pool fractions. que habíamos dejado en 89. Finalmente procedemos a aplicarle la segunda filtración en gel. Para pasar a esta opción le damos ENTER a la opción go to next step que nos llevará a las opciones donde se hallan los métodos.9 gr. La gran mancha azul remarcada y ubicada en aproximadamente 50K corresponde a nuestra enzima. Figura Nº6: Resultados al tomar el pool fractions. aquellas líneas tenues y punteadas corresponden a otras proteínas que no son de nuestro interés en la purificación. para esto damos un vistazo a las SDS-PAGE (electroforesis) primero una monodimensional. o que es lo mismo decir. el punto isoeléctrico (pI). el pH al cual la proteína (enzima) tiene una carga neta igual a cero. Esta técnica nos permite ver. Nuestras unidades se mantienes por enzima de la cantidad inicial. pero esta vez. indican la presencia de grupos de proteínas que aumentan y disminuyen su concentración en los tubos (fracciones) de manera ordenada y consecutiva a como fueron filtrados. y esto es lo que nos muestra: SDS-PAGE Figura Nº7: Página de electroforesis monodimensional. De la SDS podemos notar q nuestra enzima tiene un pI ligeramente mayor a 7. Una vez separadas nuestras fracciones. además del tamaño molecular aproximado. A continuación pasamos al siguiente paso. Y este es el grafico que el ordenador nos proporciona: . es favorable. observamos que hemos logrado reducir el número de proteínas. nótese además los beneficios de dicho paso. en ella podemos apreciar que nuestra enzima se halla entre las fracciones 26 y 34. en especial cada pico. y eso. emplearemos el Ultrogel ACA 34. nótese en él la ubicación de nuestra enzima.0 gr y ahora tan solo 20. Ahora veamos otra SDS-PAGE. pero esta corresponde a una bidimensional y sus resultados son los siguientes: SDS-PAGE Figura Nº8: Electroforesis bidimensional. el pH al cual dicha proteína es totalmente neutra. el pI de nuestra enzima. elegimos la filtración por gel y enseguida la matriz de Ultrogel ACA 34. además.Figura Nº5: Gráfica que nos proporciona el ordenador al escoger el Sephacryl S-200HR Las curvas lineadas por un color verde.

Figura Nº9: Gráfica que genera el ordenador luego del tratamiento con Ultrogel ACA 34 Para estar seguros de las fracciones que tomaremos en nuestro pool analizaremos estos resultados con una SDS-PAGE en primera dimensión de 15 fracciones. CONCLUSIONES Hemos logrado purificar una enzima usando un método computacional. por ejemplo. todo lo que implica emplear métodos prosiguiendo de manera lógica y aplicando las propiedades y particularidades de los métodos a las distintas características de una enzima. un rendimiento enzimático del 100. y finalmente. que se evidenció al soportar 50ºC con la cual logramos deshacernos de una enorme cantidad de proteínas inservibles. tenemos también 6032 unidades de nuestra enzima. con el cual nos hemos dado cuenta de ciertos parámetros y puntos clave a la hora de iniciar un proceso de diferenciación enzimática. logramos conocer cuál era su máximo grado de . hemos ocasionado un gasto de tan solo 0.1 gr que debe corresponder al peso de nuestra enzima. no hemos desperdiciado nada durante los procesos. a la vez. y seguros de nuestras fracciones a elegir. generamos un enriquecimiento de 25. y estas son los resultados: SDS-PAGE Figura Nº10: SDS monodimensional para 15 fracciones.46 man-hours/100U que es bastante aceptable si consideramos la eficiencia de nuestra purificación y que no resultaron perdidas en nuestra enzima. Para nuestra enzima pudimos comprender y comprobar distintas características tales como su estabilidad térmica. Hemos valorado. significa que hasta el momento nuestra enzima esta al 100% pura.5. Con esta SDS-PAGE podemos apreciar que nuestra enzima ha quedado totalmente aislada y purificada de las demás. nótese que ya se puede apreciar la pureza de nuestra enzima Finalmente. obteniéndose un alto rendimiento a un bajo costo. tomamos un pool desde la fracción 36 hasta la 54 con la intensión de no desperdiciar unidades de nuestra enzima. Estos son los resultados: Figura Nº11: Resultados luego de escoger nuestro pool Hasta el momento tenemos un total de proteínas de 20.5% que se evidencia en la cantidad de enzimas que tenemos.

9 | 5.edu/default.0 | 6053 | 100.9 | 6044 | 100. a 40% de dicha sal esta precipitó por completo.0 | 2.8 | 0.02 | | 0. además.1 | 6032 | 100.46 | BIBLIOGRAFIA VILLAVICENCIO. Sulphate | | | 247.05 | | Gel filtration | 20.1 | 89.0 | 1. A&S S.: Bioquímica. Lima. Con dicho método logramos.8 | 6000 | 100.solubilidad al someterla a una concentración ligeramente elevada de SO4(NH4)3 que.arizona.biology.0 | 6000 | 100.A. Purification of Enzyme Nº 5 | | Enzime Yield(%) | Step | Procedure | Protein(mg) | Enzyme(units) Enrichment | Cost(m-h/100u) | | Initial | 511.5 | 0.M. The Biology Project (proyecto biológico proveniente de la universidad de Arizona): http://www.6 | 0.5 | 25.17 | | Gel filtration | 20. N.html (Contiene cobertura excelente de la bioquímica de las enzimas membranas y otros) . saber de qué fracción a qué fracción elegir a la hora de extraer los pool. 1994.7 | 24.0 1 2 3 4 | Heat treatment | Amn. Las electroforesis fueron las técnicas que nos permitieron dar a conocer aspectos relativos al ph y al tamaño molecular de nuestra enzima en cuestión.

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