PRÁCTICA # 9 “VIABILIDAD CELULAR”

OBJETIVO Determinar de acuerdo a la toxicología genética los efectos de agentes tóxicos como el mezcal sobre la salud de una persona y cuales son los daños celulares que estos causan. INTRODUCCIÓN La toxicología es la ciencia que estudia el origen, naturaleza y propiedades de los tóxicos, su comportamiento cinético y sus efectos sobre los organismos vivos, las manifestaciones clínicas de la intoxicación la detección y cuantificación del agente tóxico, los procedimientos adecuados de prevención y tratamiento y las implicaciones médico-legal. Genética: Ciencia que estudia los genes, la herencia, y la variación de los organismos Toxicología Genética ∗ Es el estudio de la forma en que agentes químicos o físicos afectan al complejo proceso de la herencia. ∗ Las sustancias químicas genotóxicas son compuestos capaces de modificar el material hereditario de las células vivas ∗ Implementación de métodos para evaluar el riesgo de los agentes genotóxicos presentes en el ambiente y cuya interacción con el material genético puede alterar la integridad del genoma humano. ∗ La aplicación de estas metodologías para la detección y el conocimiento de los mecanismos de actuación de los carcinógenos. La probabilidad de que una determinada sustancia cause un daño genético depende:  Nivel de exposición del organismo a la sustancia  Distribución y retención en el organismo  El metabolismo del organismo  La detoxificación en los tejidos Diana  Reactividad de la sustancia o de sus  metabolitos con macromoléculas críticas de la célula. La probabilidad de que el daño genético produzca enfermedad depende:  La naturaleza del daño  La capacidad que posee la célula de reparar o amplificar el daño genético  La oportunidad de expresar cualquier alteración  La capacidad del cuerpo de reconocer y suprimir la multiplicación de células aberrantes. Mutaciones inducidas

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Químicos: (alquilantes, intercalantes, hidrocarburos Policíclicos, aminas aromáticas)

Sustancias tóxicas con habilidad de difundir su efecto sobre la salud

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Efectos adversos » » Mutación: Cuando se insertan nucleótidos o se pierden nucleótidos durante la síntesis del DNA. Cambio en la secuencia de nucleótidos, que afecta al fenotipo

Carcinogénesis: Es la formación de cáncer, para que una célula normal cambie su fenotipo y se convierta en una célula neoplásica, se requieren varias mutaciones en varios genes y eso ocurre a través de mucho tiempo, a veces de años, de estar expuesto a un agente carcinogénico. Teratogénesis:

Proviene del griego "Teratos", que significa monstruo. ∗ Desarrollo de malformaciones o defectos físicos en el embrión. ∗ Pueden estar causados por agentes físicos (radiaciones), químicos (talidomida), y víricos (rubéola). Mezcal El mezcal es una bebida alcohólica tradicional de México, que se elabora de manera similar al tequila. El proceso comienza con la cosecha del agave después de 8 años de cultivo, en esta etapa las plantas son cortadas de su base y la mayor parte de sus hojas son retiradas, obteniéndose las piñas de agave, las cuales son cocidas en hornos o autoclaves. En esta etapa, los polisacáridos, principalmente los de reserva (fructanos), son hidrolizados térmicamente para obtener un jarabe rico en fructosa que, posteriormente se somete a fermentación alcohólica con levaduras nativas o cepas seleccionadas, finalmente el mosto con un contenido de etanol de 3-6 % v/v aproximadamente se destila para obtener el mezcal blanco o joven En la literatura existe escasa información referente a la composición del mezcal, la mayoría de los reportes están relacionados con tequila y otras bebidas alcohólicas. Benn y Peppard (1996) analizaron mediante cromatografía de gases y expectrofotometría de masas (GC-MS) un extracto orgánico obtenido por extracción líquido-líquido con diclorometano de un tequila comercial, en donde identificaron más de 175 componentes que clasificaron por su naturaleza química en: acetales, ácidos, alcoholes, aldehídos, ésteres, furanos, fenoles, pirazinas, compuestos sulfurados, terpenos, entre otros; siendo los más abundantes los alcoholes, ésteres y ácidos, en una variedad amplia de constituyentes en cada familia. También determinaron los principales agentes odorantes del tequila analizado: isovalerialdehído, alcohol isoamílico, b-damascenona y vainillina. López y Dufour (1001) estudiaron la composición de orgánicos volátiles en tequilas blancos, reposados y añejos así como la identi icación de los principales descriptores de aromas. López y col. (2003) hicieron un seguimiento de los compuestos volátiles generados durante el cocimiento de Agave tequilana, encontrando prácticamente los mismos grupos de compuestos

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mencionados antes, pero con un menor número de constituyentes, también reportan componentes con poder odorífico como b-damascenona, vainillina y linalool; en sus resultados se destaca la presencia elevada de 5-hidroximetil furfural, que es un compuesto originado a partir dela degradación de fructosa. Peña-Alvarez y col. (2004) estudiaron la presencia de ácidos grasos y terpenos en tres variedades de agave: A. angustifolia, A. salmiana y A. tequilana, encontrando 32 terpenos en A. tequilana y solamente 11 de éstos en las otras dos especies utilizadas para la elaboración de mezcal: en cambio en ácidos grasos A. salmiana es más rico. En general, el tequila y A. tequilana han sido objeto de muchos estudios en diversos aspectos: autenticidad, genética, composición y cultivo, debido a su importancia económica y comercial

INTOXICACION POR ALCOHOL METILICO El alcohol metílico (CH3OH), o alcohol de madera se encuentra en el alcohol sólido y es usado como anticongelante para remover pinturas y como solvente de lacas y barnices, se obtiene por destilación de madera o por hidrogenación de monóxido de carbono. La intoxicación aguda se presenta principalmente por adulteración de licores. En muchos países el metanol se comercia libremente. FISIOPATOGENIA La dosis letal de metanol por vía oral varía entre los 60 y 200 ml. La toxicidad obedece al metabolismo del alcohol metílico que se convierte en ácido fórmico y formaldehido, con la propiedad de precipitar las proteínas de las vías nerviosas causando daño irreparable. Es conocido el efecto lesivo específico que tiene esta sustancia sobre las células ganglionares de la retina y el nervio óptico, generando ceguera total, muchas veces de carácter irreversible. El ácido fórmico produce acidosis metabólica severa. Su biotransformación se realiza principalmente en el hígado y su eliminación como ácido fórmico por vía urinaria. En menor porcentaje se elimina por utiliza la vía entero-hepática. La administración de alcohol etílico disminuye la toxicidad del metanol, al bloquear el metabolismo de éste en formaldehido y ácido fórmico, permitiendo a los riñones excretar el metanol inalterado. CUADRO CLINICO

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Las principales manifestaciones son los transtornos visuales y la acidosis. El cuadro se inicia con alteraciones neurológicas de gravedad variable, como agitación, ebriedad, y coma, cefalea global de predominio frontal, náuseas, vómito y visión borrosa. Los síntomas progresan rápidamente, con respiración rápida y superficial como consecuencia de la acidosis. También aparecen cianosis, coma, hipotensión y dilatación pupilar. Aproximadamente 25% de las personas con intoxicación grave fallecen por insuficiencia respiratoria. DIAGNÓSTICO Los criterios para el diagnóstico son: a. Antecedente de ingesta de alcohol b. Visión borrosa c. Respiración rápida y superficial (acidosis) d. Nivel de metanol en sangre. Cifras superiores a 20 mg/100 ml son indicativos de intoxicación severa y requieren tratamiento con etanol. Niveles superiores a 50 mg/100 ml son indicación para la hemodiálisis. e. Gases arteriales; el pH y la concentración sanguínea de bicarbonato delimitan la gravedad del cuadro. f. Presencia de formaldehido o ácido fórmico en la orina TRATAMIENTO 1. Lavado gástrico con carbón activado en las primeras 4 horas después de la ingestión 2. Líquidos parenterales 3. Vendaje ocular precoz 4. Manejo de la acidosis mediante la administración de bicarbonato de acuerdo con los gases arteriales 5. Administración parenteral de etanol (1 mg/kg). Se utiliza la infusión endovenosa de etanol absoluto diluído en dextrosa al 5% en AD, para pasar en 15 minutos, continuando con una dosis de 125 mg/kg/hora para mantener concentraciones sanguíneas de etanol de 100-200 mg/dl, las cuales causan ebriedad; este tratamiento se debe mantener por 72 horas. El etanol se presenta en ampollas de 2 ml y 5 ml al 97%; 1 ml de etanol contiene 790 mg de alcohol. Cuando no se cuente con el etanol para vía parenteral, el tratamiento se hace por vía oral, con: 1. Aguardiente (100 ml tienen 30-35 ml de etanol puro), ron o 2. Wisky 40-45% de etanol en volumen, o 3. Vodka 40-45% de etanol en volumen La hemodiálisis se utiliza cuando los síntomas progresan a pesar del alcohol etílico, o bien si la concentración de metanol en la sangre es igual o superior a 50 mg/100 ml MATERIAL sistema vacutainer torundas torniquete multiplaca de cultivo 6 tubos eppendorf gradilla EQUIPO centrifuga microscopio óptico cámara de Neubauer

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micropipeta 100 µl

REACTIVOS Azul de Teypan Mezcal MATERIAL BIOLOGICO Sangre periférica

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PROCEDIMIENTO Estrategia Metodológica 1. 2. Seleccionar un compuesto con potencial genotóxico Hacer un cultivo de linfocitos humanos de sangre periférica Administrar las dosis del compuesto elegido (mezcal) o Volumen total en cada pozo es de 3 ml o El 1 pozo contiene solo la muestra sin tratamiento o 2 pozo con 100 ml de dosis y cada pozo fue aumenta la dosis de 100 en 100 ml Homogenizar cada pozo del cultivo celular (con micropipeta)  0.04% Hacer una dilución 1:1 de suspensión celular / azul de Teypan (50µl / 50ml) Llenar por capilaridad la cámara de Neubauer con la solución (25 µl de cada lado)

3.

4. 5. 6. 7.

Realizar el conteo en 4 cuadros de los 4 cuadrantes (16 cuadros). Diferenciando células redondas brillantes (vivas) de las teñidas (muertas) 8. Graficar resultados (Dosis / # de células vivas) 9. Obtener el porcentaje de viabilidad celular con y sin tratamiento 10. Obtener el índice mitótico 11. Observar cambios en la morfología celular RESULTADOS

S/T (1)

100 ml (2)

200 ml (3)

300 ml (4)

400 ml (5)

500 ml (6)

Concentraciones del toxico (mezcal)

Preparación de la muestra

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Tubos preparados

Deposito de la muestra en la Cámara de Neubauer

Observaciones al miscroscopio de la Cámara de Neubauer, en la cual se pueden diferenciar cada una de las células Diferenciación de células vivas y muertas (las células totales se multiplican por el factor: # de células * 2 * 10000 = # de células / ml) Muestra 1 Cuadrante Células vivas Azul Teypan Células muertas Azul Teypan + Muestra 3 Cuadrante Células vivas Azul Teypan Células muertas Azul Teypan + Muestra 5 Cuadrante Células vivas Azul Teypan Células muertas Azul Teypan + 1 39 0 2 41 0 3 31 0 4 50 0 Total (células / ml) 3 220 000 0

1 5 1

2 10 1

3 8 0

4 6 10

Total (células / ml) 580 000 240 000

Muestra 2 Cuadrante Células vivas Azul Teypan Células muertas Azul Teypan + Muestra 4 Cuadrante Células vivas Azul Teypan Células muertas Azul Teypan +

1 39 0

2 12 0

3 24 0

4 33 2

Total (células / ml) 2 160 000 40 000

1 2 0

2 4 0

3 4 4

4 9 0

Total (células / ml) 380 000 80 000

1 4 0

2 2 0

3 8 0

4 1 0

Total (células / ml) 300 000 0

Dosis / # células Muestra Dosis (ml) 1 0

# células vivas 3 220 000

Muestra 6 Cuadrante Células vivas Azul Teypan Células muertas Azul Teypan +

1 9 0

2 5 1

3 5 0

4 1 0

Total (células / ml) 400 000 20 000

6

2 3 4 5 6

100 200 300 400 500

2 160 000 580 000 380 000 300 000 400 000

Dosis / # células vivas
4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 100 200 Dosis 300 400 500

DISCUSIÓN DE RESULTADOS En la realización de esta practica se comprueba el daño celular por algún toxico común o comercial en nuestro caso se manejo el Mezcal este es un producto de la fermentación del corazón del agave o maguey, como se le llama a esta planta en México. El mezcal es un destilado de la planta agave, perteneciente a la familia amaryllis, de la cual sólo se utilizan unas cuantas variedades de las 136 que existen en México. El consumidor debe tener mucha precaución, porque el mezcal con proceso de destilación inadecuado puede originar grandes riesgos en la salud del consumidor y llevarlo hasta la muerte, por su alto grado de Metanol. Y este es el toxico principal que daña a las células, ya que como sabemos el parámetro más importante es el metanol, porque los niveles altos de metanol son demasiado tóxicos. El alcohol en sí es tóxico, pero el mezcal como es una bebida espirituosa debe tener 300 miligramos por decilitro de alcohol anidro sí es dañino para la salud; el hígado no lo puede asimilar y se intoxica, y cuando hay una concentración alta de metanol no lo puede eliminar quien lo ingiere y los daños pueden ir desde una ceguera hasta la muerte en altas dosis. Ya que a mayor concentración de este toxico hay una mayor destrucción de células debido a la saturación del sistema ADH-NADH. La muerte celular llevada a cabo por este toxico es por la deshidratación en la membrana celular que este produce en ellas llegando así a su destrucción (muerte). Esto se comprobó al observar la grafica realizada comparando la dosis con el número de células vivas observadas en la cámara de Neubauer. Para la realización de esta práctica no se pudo realizar la extracción del DNA y realizar ensayo cometa, amplificar el gen P53 por PCR ni la realización del cariotipo ya que no se contó con el tiempo suficiente para llevarla a cabo. CONCLUSIONES Se llega a la conclusión de que a mayor dosis (concentración) del toxico mayor es el daño celular que se produce, es por esto que todos los tóxicos son dañinos sin embargo nosotros podemos disminuir este daño consumiendo dosis bajas en este caso de Mezcal. Y se debe tomar en cuenta que una vez llevada a cabo una intoxicación de este tipo se debe de esperar a que el alcohol se elimine completamente del organismo por degradación en el hígado. Si es un caso muy grave se debe de realizar diálisis. En esta practica los diferentes equipos utilizaron diferentes tóxicos pero en todos se aplica la misma conclusión de que entre mas alta sea la dosis mas muerte celular se observa.

# Células

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En nuestro caso no hubo mucha muerte celular como en otros casos (por ejemplo: marihuana), en los que la muerte celular fue muy elevada. REFERENCIAS 1.

2. 3. 4. 5. 6. 7.

http://www.alfa-ditores.com/web/index.php?option=com_content&task=view&id=1290&Itemid=66 (Aguilar-Cisneros, B.O., López, M.G., Richling, E., Heckel, F., y Schreier, P. (2002). Tequila authenticity assessment by headspace SPME-HRGC-IRMS analysis of 13C/12C and 18 O /16 O ratios of ethanol. Journal of Agric. and Food Chemistry 50, 7520-7523. Cedeño, M.C. (1995). Tequila production. Critical Reviews in Biotechnology 15, 1-11. Gil-Vega, K., Díaz., C., Nava-Cedillo, A. y Simpson, j. (2006). AFLP analysis of Agave tequilana varieties. Plant Science 170, 4, 904-909. Gobeille, A., Yavitt, J., Stalcup, P. y Valenzuela, A. (2006). Effects of soil management practices on soil fertility measurements on Agave tequilana plantations in Western Central Mexico. Soil and Tillage Research 87, 1, 80-88. http://www.drogas.bioetica.org/drohol.htm http://books.google.com.mx/books?id=k1YTQn23InYC&pg=PA62&lpg=PA62&dq=da %C3%B1o+celular+por+metanol&source=web&ots=nl7fH4VcU&sig=uJeNOkD1EdT1jzt9dG3DgJrXGNE&hl= es&sa=X&oi=book_result&resnum=1&ct=result

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