VILNIAUS GEDIMINO TECHNIKOS UNIVERSITETAS

Chemijos ir bioinžinerijos katedra












BIOINŽINERIJA

LABORATORINIAI DARBAI IR PRATYBOS































VILNIUS 2005
Bioinžinerija. Laboratoriniai darbai ir pratybos. Autorių kolektyvas: Ž. Bumelienė,
V. Chmieliauskienė, R. Garuckas, G. Gedminienė, J. Giedrienė, R. Gražėnienė, A. Jakubauskas,
J. Jankauskas, A. Juška, J. Kulys, B. Kurtinaitienė, V. S. Laurinavičius, R. Marcišauskas,
M. Meizeraitytė, V. Michailovienė, J. Sereikaitė, G. Valinčius, A. Žilinskas, A. Žvirblienė,
G. Žvirblis. Vilnius: Technika, 2005.


Pateikta laboratorinių darbų ir pratybų metodinė medžiaga.

Leidinį rekomendavo Vilniaus Gedimino technikos universiteto Fundamentinių mokslų fakulteto
studijų komitetas





Recenzentai: prof. habil. dr. A. kazragis ir prof. dr. J. Kerienė












VGTU leidyklos „Technika“ 752 mokomosios metodinės literatūros knyga











ISBN 9986-05-829-5
© Ž. Bumelienė, V. Chmieliauskienė, R. Garuckas,
G. Gedminienė, J. Giedrienė, R. Gražėnienė, A. Jakubauskas,
J. Jankauskas, A. Juška, J. Kulys, B. Kurtinaitienė,
V. S. Laurinavičius, R. Marcišauskas, M. Meizeraitytė,
V. Michailovienė, J. Sereikaitė, G. Valinčius, A. Žilinskas,
A. Žvirblienė, G. Žvirblis, 2005

© VGTU leidykla „Terchnika“, 2005.

TURINYS

Įvadas
Bendroji chemija
Laboratoriniai darbai
Juozas Jankauskas, Rūta Gražėnienė

1. Laboratorinių darbų technika.
2. Tirpalų ruošimas.
3. Buferiniai tirpalai.
4. Kompleksiniai junginiai.
5. Cheminė kinetika, katalizė ir pusiausvyra.
6. Medžiagų tirpumas.
7. Neelektrolito molio masės nustatymas krioskopiniu metodu.
8. Koloidiniai tirpalai.
9. Elektrolitinė disociacija.
10. Druskų hidrolizė.
11. Galvaniniai elementai ir elektrolizė.
12. Vandens kietis ir jo minkštinimas.
12A. Karbonatinio, pastoviojo ir bendrojo vandens kiečio nustatymas.
12B. Vandens minkštinimas.
12C. Švaraus vandens gavimas ir jo kokybės kontrolė.
13. Neorganinių ir organinių medžiagų gryninimas.

Analizinė chemija
Laboratoriniai darbai
Žana Bumelienė, Rūta Gražėnienė, Juozas Jankauskas,

1. I ir II analizinių grupių katijonų mišinio analizė.
2. III ir IV analizinių grupių katijonų mišinio analizė.
3. V ir VI analizinių grupių katijonų mišinio analizė.
4. Sausos medžiagos analizė
5. Tiesioginė konduktometrija ir konduktometrinis titravimas.
6. Tiesioginė potenciometrija ir potenciometrinis titravimas.
7. Molekulinė absorbcinė spektrinė analizė (spektrofotometrija).
8. Skysčių tūrio matavimo priemonių (pipečių, biurečių, matavimo kolbučiu ir kt.) metrologinių
charakteristikų nustatymas.

Organinė chemija
Laboratoriniai darbai
Albinas Žilinskas

1. Distiliavimas.
2. Kristalizacija.
3. Ekstrahavimas.
4. Chromatografija (adsorbcinė).
5. p-Toluensulfonrūgštis.
6. Benzenkarboksirūgštis.
7. Acetonas.
8. 1-brombutanas.
9. Etiletanoatas.
10. Ciklopentanonas.

Biologija
Pratybos
Genovaitė Gedminienė

1. Šviesinis mikroskopas, jo sandara. Įvairaus dydžio ląstelių stebėjimas.
2. Šiuolaikinė mikroskopija. Elektroninis mikroskopas.
3. Paveldimumas ir kintamumas.
4. Baltymų sintezė.

Fizikinė chemija
Laboratoriniai darbai
Gintaras Valinčius

1. Kietų medžiagų tirpimo entalpijos nustatymas.
2. Koligatyviosios tirpalų savybės. Ebulioskopinis garavimo entalpijos nustatymas.
3. Reakcijos pusiausvyros konstantos nustatymas.
4. Jonų pernašos ypatumų tyrimas.
5. Molekulių dipolinio momento nustatymas.
6. Difuzijos koeficiento nustatymas sukamuoju diskiniu elektrodu.
7. Elektrono pernašos greičio konstantos nustatymas ciklinės voltamperometrijos metodu.
8. Koligatyviosios tirpalų savybės. Krioskopija.

Biochemijos pagrindai
Laboratoriniai darbai
Romualdas Marcišauskas, Vilma Michailovienė, Jolanta Giedrienė, Artūras Jakubauskas, Aurelija
Žvirblienė

1. Kiekybiniai baltymų nustatymo metodai.
2. Alkoholdehidrogenazės pradinio fermentinės reakcijos greičio ir aktyvumo nustatymas.
3. Nukleorūgščių nustatymo kiekybiniai metodai.
4. DNR išskyrimas iš Escherichia coli ląstelių biomasės.
5. RNR išskyrimas iš Escherichia coli ląstelių biomasės.
6. Restriktazės Eco RI aktyvumo nustatymas.
7. Baltymų molekulinės masės nustatymas gelfiltracijos metodu.
8. Baltymų elektroforezė 12 % poliakrilamidiniame gelyje.
9. Restikcijos endonukleazių aktyvumo nustatymas. Restrikcijos endonukleazių preparatų kokybės
įvertinimas.
10. Specifinių antikūnų titro nustatymas imunofermentiniu metodu.
11. Alfa-interferono kiekybinis nustatymas imunofermentiniu metodu.

Bioorganinė chemija
Laboratoriniai darbai
Albinas Žilinskas

1. Aminorūgštys ir baltymai.
2. Angliavandeniai.
3. Nukleino rūgštys.
4. Lipidai.
5. Alkaloidai, terpenai, steroidai.

Biocheminiai metodai
Laboratoriniai darbai ir pratybos
Valdas Stanislovas Laurinavičius ir Bogumila Kurtinaitienė

1. Statistinis duomenų apdorojimas.
2. Eksperimentinių duomenų aproksimavimas.
3. Fermentinių kinetinių konstantų nustatymas.
4. Analitinių sistemų metrologinis įvertinimas.
5. Fermentų inhibicijos tyrimas.

Modeliai biologijoje
Pratybos
Alfonsas Juška

1. Funkcijų skaičiavimas ir grafinis vaizdavimas. Tiesinės ir (pusiau) logaritminės koordinatės.
2. Dispersinė analizė. Modelio patikra.
3. Ribotojo augimo modelis.
4. Grįžtamojo proceso modeliavimas.
5. Bifermentės sistemos modeliavimas.
6. Jonų pernašos per ląstelės membraną modeliavimas.
7. Paprastosios kinetikos modeliavimas. Skatinimas. Slopinimas.
8. Atsako slopinimas ligando pertekliumi.
9. Dviejų vienodų sąveikos vietų kinetikos modelis.
10. Dviejų nevienodų sąveikos vietų kinetikos modelis.
11. Kooperatinio veikimo kinetikos modeliavimas.
12. Imunofermentinės analizės modeliavimas.


Genų inžinerijos pagrindai
Laboratoriniai darbai
Gintautas Žvirblis, Meilutė Meizeraitytė, Valerija Chmieliauskaitė

1. E. coli RRI kamieno transformacija, naudojant plazmidinę DNR.
2. Plazmidinės DNR hidrolizė restrikcijos endonukleazėmis.
3. Plazmidinės DNR išskyrimas ir jos koncentracijos nustatymas.
4. Plazmidinės DNR ligavimas.
5. Ekspresinės plazmidės palaikymas E. coli kamiene ir jos stabilumo kontrolė.
6. Polimerazinė grandininė reakcija (PGR).

Chromatografijos pagrindai
Laboratoriniai darbai
Vilma Michailovienė

1. Baltymų jonų mainų chromatografija.
2. Biomolekulių pasiskirstymas vandeninėse fazinėse sistemose.
3. Afininė (biospecifinė) chromatografija.
4. Baltymų afininė chromatografija naudojant imobilizuotuosius metalo jonus (IMAC).
5. Chromatografinės kolonėlės efektyvumo nustatymas.
6. Baltymų hidrofobinės sąveikos chromatografija (HSCH).

Biofarmacija 1
Laboratoriniai darbai
Genovaitė Gedminienė

1. Rekombinantinio baltymo biosintezė E.coli ląstelėse. Pasėjamosios kultūros paruošimas.
2. Rekombinantinio baltymo biosintezė E.coli ląstelėse. Biomasės gavimas.
3. Rekombinantinio producento ląstelių suardymo laipsnio priklausomybė nuo ardymo trukmės.
4. Rekombinantinio producento ląstelių suardymo laipsnio įvertinimas pagal baltymų koncentraciją.
5. Rekombinantinio augimo hormono gryninimas jonų mainų chromatografijos metodu.
6. Rekombinantinio baltymo ekspresijos įvertinimas elektroforezės PAAG-SDS metodu.

Enzimologija (Pasirinkimas 1)
Laboratoriniai darbai
Jolanta Sereikaitė

1. β-galaktozidazės iš Kluyveromyces fragilis specifinio aktyvumo nustatymas.
2. β-galaktozidazės kinetinės kreivės gavimas.
3. β-galaktozidazės imobilizacija. Baltymo ir aktyvumo nustatymas liekamajame imobilizacijos
tirpale.
4. Tirpiosios ir imobilizuotosios β-galaktozidazės iš Kluyveromyces fragilis pH optimumo
nustatymas.
5. Tirpiosios ir imobilizuotosios β-galaktozidazės iš Kluyveromyces fragilis katalitinio aktyvumo
priklausomybė nuo temperatūros.

Biotechnologinių maisto produktų technologijos pagrindai
Pratybos
Rimantas Garuckas

1. Žaliavos, jų technologinis paruošimas, naudojami įrenginiai, jų veikimo principas.
2. Alaus misos paruošimo technologija.
3. Alaus fermentavimo ir išlaikymo technologija.
4. Alaus mielių gamybos technologija.
5. Alaus filtravimo ir išpilstymo technologija.
6. Alaus gamyba cilindriniuose kūginiuose tankuose.
7. Alaus gamybos technologinė kontrolė.

Biofarmacija 2
Laboratoriniai darbai
Genovaite Gedminienė

1. Rekombinantinio kiaulės augimo hormono agreguotų formų atskyrimas naudojant Q-sefarozę.
2. Monomerinės ir oligomerinės rekombinantinio baltymo formų įvertinimas.
3. Disulfidinių jungčių nustatymas elektoforetiniais metodais rekombinantiniuose baltymuose.
4. Rekombinantinių baltymų peptidinio žemėlapio sudarymas.
5. Baltymo molekulinės masės nustatymas masių spektrometru.

Eksperimentinių tyrimų pagrindai
Pratybos
Aurelija Žvirblienė

1. Biologinių duomenų bazės internete. NCBI duomenų bazės. Entrez paieškos sistema.
2. Literatūros duomenų paieška PubMed duomenų bazėje. Metodų aprašymų paieška internete.
3. DNR sekų paieška genų banke. DNR sekų palyginimas bei koduojamų baltymų sekos nustatymas,
naudojant BLAST kompiuterinę programą.
4. Baltymų sekos ir struktūros paieška duomenų bazėse. Baltymų sekų palyginimas. Baltymų
struktūros modeliavimas, naudojant RasMol kompiuterinę programą.
5. Geros laboratorinės praktikos taisyklės.
6. Darbas steriliame bokse. Audinių kultūros.
7. Eksperimentinių duomenų statistinis apdorojimas.
8. Eksperimento rezultatų grafinis pateikimas. Duomenų apibendrinimas. Demonstruojamosios
medžiagos paruošimas.
9. Eksperimentinio darbo rezultatų pristatymas.

Imunologija
Laboratoriniai darbai
Aurelija Žvirblienė

1. Gama-interferono nustatymas žmogaus limfocitų kultūrose imunofermentiniu metodu.
2. Žmogaus alfa-interferono nustatymas imunoblotingo metodu.
3. Šviesinė ir fluorescencinė mikroskopija.

Genų inžinerijos metodai
Laboratoriniai darbai
Valerija Chmieliauskaitė, Meilutė Meizeraitytė, Gintautas Žvirblis

1. DNR fragmento (geno) klonavimas.
2. Plazmidinės DNR sekvenavimas.
3. Klonuoto geno ekspresija.

Inžinerinė enzimologija
Laboratoriniai ir pratybų darbai
Juozas Kulys

1. Nestacionarios fermentinės kinetikos analizė.
2. Stacionariosios bisubstratinės fermentinės reakcijos kinetikos tyrimas.
3. Fermentinių reakcijų tyrimai nestacionarios kinetikos metodu.
4. Baltymų konformacinio stabilumo nustatymas naudojant denatūrantus.
5. Baltymų denatūracijos termodinaminių parametrų nustatymas diferenciniu skanuojamuoju
mikrokalorimetru.
6. Fermentų kinetika detergentų tirpaluose.
7. Imobilizuotų fermentų kinetikos ir difuzijos modeliavimas.

Įvadas

Bioinžinerijos programa yra viena iš studentų rengimo programų, vykdomų Vilniaus Gedimino
technikos universiteto Fundamentinių mokslų fakultete. Pagrindinės (bakalauro) bioinžinerijos
studijos tęsiasi 8 semestrus, o magistrantūros studijos – 4 semestrus. Šie laboratoriniai ir pratybų
darbai parengtini remiantis dalykais, dėstomais Chemijos ir bioinžinerijos katedroje bakalauro ir
magistrantūros studijų metu bioinžinerijos programos studentams. Į rinkinį neįtrauktos
bendrauniversitetinių dalykų pratybos ir laboratoriniai darbai. Medžiaga rinkinyje išdėstyta pagal
semestrus, taip, kaip skaitomi kursai.
Rinkinio autoriai, pateikusieji pratybų ar laboratorinių darbų aprašymus: Ž. Bumelienė,
V. Chmieliauskaitė, R. Garuckas, G. Gedminienė, J. Giedrienė, R. Gražėnienė, A. Jakubauskas,
J. Jankauskas, A. Juška, J. Kulys, B. Kurtinaitienė, V. S. Laurinavičius, R. Marcišauskas,
M. Meizeraitytė, V. Michailovienė, J. Sereikaitė, G. Valinčius, A. Žilinskas, A. Žvirblienė,
G. Žvirblis.
Rinkinio tikslas − pateikti studentams laboratorinių darbų ir pratybų metodinę medžiagą, išvengti
darbų ir temų studijų metu pasikartojimo. Šiuolaikinės komunikacijos priemonės sudaro sąlygas kartu
su darbų aprašymu pateikti pagrindinę literatūrą, modelinius skaičiavimus ar net multiplikaciją.
Medžiagos skelbimas internete lengvina medžiagos prieinamumą.
Išvardyti laboratoriniai darbai ir pratybos atliekamos naudojant Vilniaus Gedimino technikos
universiteto, Biotechnologijos instituto ir Biochemijos instituto eksperimentinę bazę bei kompiuterius.
Laboratorinių ir pratybų darbų adresas interneto svetainėje: www.vtu.lt

Chemijos ir bionžinerijos katedros vedėjas
Juozas Kulys

2
B Be en nd dr ro oj ji i c ch he em mi ij ja a
Laboratoriniai darbai
Juozas Jankauskas, Rūta Gražėnienė

1. Laboratorinių darbų technika

Šiame darbe susipažįstama su pagrindinėmis operacijomis,
atliekamomis chemijos laboratorijoje: skysčių tūrių matavimu,
nusodinimu, filtravimu, titravimu.

1. Svėrimas

Chemijos laboratorijoje naudojamos įvairaus tikslumo svarstyklės:
techninės – mažiau tikslios, analitinės bei elektroninės – tikslesnės.
Sveriant reikia laikytis šių pagrindinių taisyklių:
1. Negalima perstatyti svarstyklių iš vienos vietos į kitą. Perstačius būtina patikrinti, ar jos stovi lygiai.
2. Uždėti ir nuimti svarelius arba sveriamą daiktą galima tik išjungus svarstykles, švelniai.
3. Sveriama medžiaga dedama ant kairės lėkštelės, o svareliai – ant dešinės.
4. Svareliai dedami ant lėkštelės tik pincetu mažėjančia tvarka.
5. Birios medžiagos sveriamos iš anksto pasvertuose induose arba ant švaraus popieriaus.
6. Baigus sverti, svarstyklės ir svareliai sutvarkomi: nuvalomos svarstyklių lėkštelės, svareliai pincetu
nuimami ir sudedami į dėžutę.
7. Nededamas ant lėkštelės svoris, didesnis už nurodytą ant svarstyklių.

2. Skysčių tūrio matavimas

Skysčių tūriai matuojami įvairiais matavimo indais: apytikriai matuojama matavimo cilindrais bei
menzūromis, tiksliai – įvairios talpos matavimo kolbomis, pipetėmis, biuretėmis.
Matavimo induose, ypač siauruose, skysčio paviršius yra įgaubtas, jo aukštis nustatomas pagal
žemiausią menisko lygį viename lygyje su akimi.
Naudojami tik švarūs matavimo indai. Tirpalą pamatavus, indai gerai išplaunami ir padedami į jų vietą.
Matavimo indų negalima šildyti, pilti į juos karštų tirpalų ir atlikti juose cheminių reakcijų. Skysčiams
matuoti galima naudoti tik tuos indus, kurie nurodyti darbo aprašyme.
Matavimo cilindrai ir menzūros naudojami apytikriam
skysčio tūriui matuoti.
Matavimo kolbos skirtos tiksliam tirpalo tūriui matuoti,
tirpalams iki tam tikro tūrio praskiesti bei jiems gaminti.
Matavimo kolbos yra įvairaus tūrio; jis žymimas ant kolbos
šono arba kaklelio. Ilgas, siauras kolbos kaklelis yra su brūkšneliu;
iki jo kolba pripilama skysčio (menisko apačia − ant brūkšnio).
Gaminant arba skiedžiant tirpalus, paskutiniai lašai iki pat brūkšnio
lašinami pipete, o tada tirpalas gerai sumaišomas.
Pipetės naudojamos tiksliam skysčių tūriui matuoti; jis gali
būti įvairus – nuo 0,1 iki 100 mL ir žymimas viršuje arba ant
praplatintos pipetės dalies. Ant pipetės kaklelio yra brūkšnelis, iki
kurio pipetė pripildoma tirpalo taip: ji giliai įmerkiama į tirpalą ir
tirpalas lūpomis arba gumine kriauše įsiurbiamas virš brūkšnelio.
Tada pipetė užspaudžiama smiliumi (ne nykščiu!), ištraukiama iš
tirpalo ir priglaudžiama prie indo sienelės. Atsargiai atleidžiant
pirštą, skysčio lygis pipetėje nuleidžiamas iki brūkšnio (menisko
apačia ant brūkšnio, 1 pav.). Užspausta pirštu pipetė perkeliama į
reikiamą indą, pirštas atleidžiamas, pipetės galas priglaudžiamas
1 pav. Tūrio matavimas pipete
3
prie indo sienelės ir skysčiui leidžiama ištekėti. Negalima išpūsti iš pipetės skysčio likučių. Naudota pipetė
išplaunama ir padedama į vietą. Naudojamos ir graduotos pipetės, kuriomis galima pamatuoti įvairų ant jų
pažymėtą tūrį.

Automatinės pipetės skirtos tiksliam skysčių tūrio matavimui. Jos būna įvairios – pastovaus ir keičiamo
tūrio, nuo 1 µL iki 10 mL. Keičiamo tūrio pipetėse tūris
reguliuojamas sukant operacinį mygtuką pagal laikrodžio
rodyklę, norint sumažinti tūrį, arba prieš laikrodžio
rodyklę, norint padidinti tūrį, kol indikatoriaus langelyje
atsiras reikalingi skaičiai. Griežtai draudžiama nustatyti
matuojamą tūrį už matavimo ribų, nes galima sugadinti
pipetę, ji gali prarasti tikslumą (matavimų ribos yra
nurodytos ant pipetės rankenos). Pipetę privaloma laikyti
tik vertikaliai, kad skystis nepatektų į mechanizmą.
Atrama (kablys) turi gulėti ant smiliaus, mygtukas
spaudžiamas nykščiu. Dirbama su pipete taip: užmaunamas
antgalis, operacinis mygtukas spaudžiamas iki pirmo
atsirėmimo (2 pav. 1 padėtis), antgalis panardinamas į skystį, mygtukas švelniai ir lėtai atleidžiamas (2 pav.
2 padėtis), palaukiama, kol skysčio prisipildo antgalis, antgalis ištraukiamas iš skysčio, atsargiai
nubraukiamas skysčio perteklius į indo sieneles, skystis išleidžiamas lengvai spaudžiant mygtuką iki pirmo
atsirėmimo, praėjus 1 sekundei mygtukas spaudžiamas iki galo norint pašalinti iš antgalio visą skystį (2 pav.
3 pozicija). Baigus darbą antgalis nuimamas nuo pipetės stūmokliu ir kruopščiai išplaunamas. Pipetė
pastatoma į specialų stovą.
Biuretės skirtos tiksliam skysčių tūrio matavimui. Tai yra ilgas plonas stiklinis vamzdelis, sugraduotas į
dešimtąsias mililitro dalis, kurio gale yra kranelis arba žarnelė su stikliniu burbuliuku arba spaustuku ir
stiklinis antgalis. Biuretė pripildoma skysčio per piltuvėlį taip, kad stikliniame antgalyje neliktų oro burbulų.
Prieš pradedant dirbti piltuvėlis būtinai išimamas, nes nuo jo sienelių nuvarvėjusio skysčio lašai sumažina
matavimo tikslumą.

3. Titravimas

Titravimas – tai žinomos koncentracijos tirpalo (titranto, darbinio tirpalo) pilimas iš biuretės į
analizuojamą tirpalą, kol pasiekiamas ekvivalentinis taškas. Taip yra nustatoma analizuojamo tirpalo
koncentracija.
Prieš titruojant biuretė pripildoma žinomos koncentracijos (N
1
) tirpalo iki nulinės padalos taip, kad jos
apatiniame gale nebūtų oro burbuliukų; piltuvėlis išimamas. Į kūginę kolbutę įpilamas tiksliai pipete
pamatuotas nežinomos koncentracijos (N) tirpalo tūris (V), įlašinami keli indikatoriaus lašai, išskyrus tuos
atvejus, kai vienas iš paimtų tirpalų pats yra indikatorius. Viena ranka kolbutė laikoma už kaklelio ir sukama
taip, kad joje esantis skystis nuolat maišytųsi (biuretės galas yra kolbutės kaklelyje, bet neturi liesti sienelių),
kita ranka atsargiai atleidžiamas spaustukas. Iš pradžių tirpalas iš biuretės pilamas plona čiurkšle nuolat
maišant tirpalą, paskui darbinis tirpalas pilamas vis lėčiau ir, baigiant titruoti, – lašais. Titravimo rezultatai
bus teisingi, jeigu titravimo pabaigoje nuo vieno lašo darbinio tirpalo staiga
pasikeis titruojamojo tirpalo spalva. Kad tirpalo spalvos pasikeitimas būtų
geriau matomas, titruojant naudojamas baltas fonas (balta koklinė plokštelė
arba popieriaus lapas). Pagal biuretėje likusio tirpalo lygį randamas
titravimui sunaudoto titranto tūris (V
1
, 3 pav.).
Kiekvienas tirpalas titruojamas ne mažiau kaip du, tris kartus; titravimo
rezultatai vienas nuo kito turi skirtis ne daugiau kaip 0,1 mL. Kiekvieną
kartą, baigus titruoti, atskaitoma biuretės skalėje, kiek sunaudota darbinio
tirpalo; rezultatai užrašomi. Pirmas titravimas yra orientacinis. Titruojant
pirmą kartą, darbinio tirpalo iš biuretės rekomenduojama pilti kiekvieną
kartą po 1 mL, kad būtų galima nustatyti intervalą, kurio ribose yra
ekvivalentinis taškas. Pvz., jeigu pridėjus į titruojamą tirpalą 15 mL titranto,
indikatoriaus spalva nesikeičia, o pridėjus 16 mL tirpalo, spalva staiga pasikeičia, tai reiškia, kad
ekvivalentinis taškas yra intervale nuo 15 iki 16 mL. Titruojant naują porciją analizuojamo tirpalo, 15 mL

2 pav. Tūrio matavimas automatine pipete
3 pav. Tūrio matavimas

4
darbinio tirpalo supilami gana greitai, kolbos turinį gerai maišant, o toliau titrantas lašinamas jau lašais, kol
pasikeičia indikatoriaus spalva. Kad būtų patogu stebėti spalvos pasikeitimą, prieš pradedant titruoti
rekomenduojama iš karto į kelias kolbutes įsipilti analizuojamojo tirpalo ir indikatoriaus vienodus kiekius ir
titravimo metu lyginti titruojamojo ir netitruoto tirpalų spalvas. Norint įsitikinti, ar teisingai atliktas
titravimas, į nutitruotą skystį įlašinamas analizuojamojo tirpalo lašas. Tirpalo spalva turi staiga pasikeisti.
Analizuojamo tirpalo koncentracija skaičiuojama naudojant darbinio tirpalo tūrio vidurkį pagal formulę:

NV = N
1
V
1
,
čia:
N – analizuojamojo tirpalo nežinoma molinė ekvivalentų koncentracija (normalingumas),
V – titravimui paimtos analizuojamojo tirpalo porcijos tūris, mL,
N
1
– darbinio tirpalo žinomas normalingumas,
V
1
– titravimui sunaudoto darbinio tirpalo vidurkis, mL.

4. Filtravimas

Filtravimas yra kietųjų dalelių atskyrimas filtru iš skystosios arba dujinės terpės.
Filtravimui reikia turėti piltuvėlį, filtravimo popieriaus ir stiklinę lazdelę. Ruošiant filtrą, filtravimo
popierius sulenkiamas du kartus, praskleidžiamas taip, kad vienoje pusėje liktų trys popieriaus lapeliai, t. y.
padaromas maišelis. Filtras įstatomas į piltuvėlį. Filtro kraštai turi būti maždaug 5 mm žemiau piltuvėlio
krašto. Jeigu filtras yra didesnis, jį reikia apkirpti. Filtras sudrėkinamas distiliuotu vandeniu ir
prispaudžiamas prie piltuvėlio sienelių. Filtruojamas skystis kartu su nuosėdomis per stiklinę lazdelę pilamas
ant filtro. Skysčio pilama tiek, kad jo lygis būtų 2–3 mm žemiau filtro kraštų. Ant stiklinėje likusių nuosėdų
užpilama truputis distiliuoto vandens. Skystis su nuosėdomis vėl pilamas ant filtro. Ši operacija kartojama
tol, kol visos nuosėdos iš stiklinės supilamos ant filtro. Skystis, praėjęs pro filtrą, vadinamas filtratu.
Jeigu nuosėdas reikia praplauti, tai plovimo skystis (distiliuotas vanduo arba nurodytas tirpalas) pilamas
porcijomis ant filtro. Kiekviena kita skysčio porcija pilama tik tada, kai ankstesnioji būna visiškai
persifiltravusi.

Darbo tikslas

Susipažinti su dažniausiai chemijos laboratorijoje naudojamomis operacijomis ir išmokti jas.

Darbo priemonės ir reagentai

Stiklinė, pipetė, kūginės kolbutės, matavimo kolbutė, biuretė, piltuvas, filtro popierius, stiklinė lazdelė.
Tirpalai: NaOH 1 N; druskos (CuSO
4
, CoCl
2
, NiCl
2
) 1 N; HCl 0,1 N; metiloranžas.

Darbo eiga

Pipete pamatuojama 10 mL 1 N metalo druskos (CuSO
4
, CoCl
2
arba NiCl
2
), supilama į stiklinę ir
įpilama 20 mL pipete pamatuoto 1 N NaOH tirpalo (imamas NaOH perteklius). Tirpalas sumaišomas ir
filtruojamas į 100 mL matavimo kolbutę. Nuosėdos ant filtro perplaunamos distiliuotu vandeniu, ir filtratas
surenkamas į tą pačią matavimo kolbutę. Baigus plauti nuosėdas, jos išmetamos, o filtratas praskiedžiamas
distiliuotu vandeniu iki brūkšnio ir gerai sumaišomas. Išplauta pipete, skirta NaOH matuoti, pamatuojama
10 mL gauto tirpalo, supilama į kūginę kolbutę, įlašinama 1–2 lašai indikatoriaus metiloranžo ir titruojama
0,1 HCl tirpalu. Titravimas kartojamas 3 kartus. Titravimo duomenys surašomi į lentelę:

Titravimas
Titruoti paimto tiriamo
tirpalo tūris, mL
Titravimui sunaudotos
HCl tūris, mL
Vidutinis titravimui
suvartotos rūgšties tūris, mL
1 10
2 10
3 10

5
Skaičiavimai

1. Nesureagavusio šarmo tirpalo koncentracija skaičiuojama pagal formulę:
NV = N
1
V
1
, (1)
čia:
N – šarmo molinė ekvivalentų koncentracija (normalingumas),
V – titravimui paimto šarmo tūris, mL,
N
1
– rūgšties normalingumas,
V
1
– titravimui suvartotos rūgšties tūris, mL.
2. Nesureagavusio šarmo kiekis gramais 100 mL praskiesto filtrato:

m
2
=
1000
V N E ⋅ ⋅
, (2)
čia:
V – tirpalo tūris, iki kurio buvo praskiestas filtratas, t. y. V = 100 mL,
E – šarmo ekvivalento masė,
N – šarmo normalingumas (normalinė koncentracija).
3. Naudojantis (2) formule, apskaičiuojamas metalo druskos ir šarmo reakcijai paimto natrio hidroksido
kiekis gramais m
1
(V = 20 mL, N = 1).
4. Druskos ir natrio šarmo reakcijai sunaudoto šarmo kiekis gramais:

m
3
= m
1
− m
2
. (3)

5. Parašoma druskos reakcija su šarmu ir, žinant sureagavusio natrio šarmo kiekį, m
3
, apskaičiuojamas
susidariusio metalo hidroksido, t. y. nuosėdų, kiekis gramais.

Atsiskaitymas

- pateikiama užpildyta lentelė;
- pateikiami skaičiavimai.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Janickis, V.; Kreivėnienė, N. Neorganinės chemijos teoriniai pagrindai, praktikos darbai ir uždaviniai.
Kaunas: Technologija, 2004. 339 p.
6
2. Tirpalų ruošimas

Laboratorijose dažniausiai naudojami procentiniai, moliniai ir normaliniai
įvairių medžiagų tirpalai. Moliniai ir normaliniai tirpalai ruošiami tik matavimo
kolbose. Procentiniai tirpalai gali būti ruošiami bet kokiuose induose: stiklinėse,
kūginėse kolbose ir panašiai. Praktinio darbo sėkmė laboratorijoje nemažai
priklauso nuo to, kaip tiksliai paruošiami darbui reikalingi tirpalai.

Darbo tikslas

Išmokyti studentus gerai skaičiuoti ir teisingai paruošti reikiamos
koncentracijos tirpalus, taip pat išmokyti juos patikrinti jau paruoštų tirpalų
koncentracijas. Tobulinti svarstyklių, skysčių tūrio matavimo priemonių (automatinių pipečių, biurečių)
naudojimo įgūdžius. Supažindinti su skysčių tankio nustatymo būdais bei priemonėmis.

Darbo priemonės bei medžiagos

Elektroninės svarstyklės, skiriamoji geba 0,01 g. Automatinės 5 ir 10 mL tūrio pipetės. 25 mL tūrio
biuretės. 200–250 mL tūrio stiklinės. Cilindras. 100–150 mL tūrio kūginės (Erlenmejerio) kolbutės.
Termometras. Areometras. Elektrinė plytelė.
Koncentruota H
2
SO
4
, KOH, sausa medžiaga. H
2
SO
4
ir KOH 0,500 N tirpalai. Metiloranžas, 0,1 %
tirpalas.

Darbo eiga

Studentai apskaičiuoja ir pagamina 100–150 gramų H
2
SO
4
arba KOH 1–8 % tirpalą (tikslią ruošiamo
tirpalo koncentraciją ir masę nurodo dėstytojas). Ruošiant H
2
SO
4
tirpalą, rūgštį reikia pilti į vandenį, bet
ne atvirkščiai. Ruošiant tirpalus tirpinys ir tirpiklis sveriami svarstyklėmis. Kadangi tiksliai pasverti
apskaičiuotą tirpiklio ir tirpinio kiekį yra sunku, todėl labai svarbu užsirašyti realiai pasvertas tirpinio ir
tirpiklio mases. Žinant šias mases, patikslinama paruošto tirpalo procentinė koncentracija.
Kitas darbo etapas yra paruošto tirpalo procentinės koncentracijos patikrinimas. Patikrinimą galima
atlikti dviem būdais:
a) surandamas paruošto tirpalo tankis (ρ) ir koncentracija nustatoma naudojantis tankių ir koncentracijos
lentele;
b) nutitruojamas tiksliai paimtas paruošto tirpalo tūris (pvz., 10 mL su 0,5 N sieros rūgšties arba 0,5 N kalio
šarmo tirpalu. Procentinė koncentracija apskaičiuojama remiantis titravimo rezultatais ir a būdu nustatytu
tirpalo tankiu.
a) būdas:
Čia pateikiama kalio šarmo tirpalo tankio nustatymo eiga (sieros rūgšties tirpalo tankis nustatomas
analogiškai).
Ant elektroninių svarstyklių pastatoma tuščia sausa 100–150 mL kūginė kolbutė arba stiklinėlė,
palaukiama, kol svarstyklių rodmenys taps stabilūs ir spaudžiamas TARE mygtukas. Svarstyklių ekrane
matysite 0,00 g. Automatine pipete pamatuojama 10 mL paruošto tirpalo ir supilama į ant svarstyklių
stovinčią kūginę kolbutę (Dėmesio! Tirpalas turi būti 20 ± 1 ° °° °C temperatūros, jo temperatūra
patikrinama termometru.) Užrašoma 10 mL tirpalo masė. Vėl spaudžiamas TARE mygtukas. Svarstyklių
ekrane matysite 0,00 g. Tūrio matavimas ir svėrimas kartojamas tris kartus. Rezultatai surašomi į lentelę.

Svėrimas
Tirpalo tūris
V, mL
Tirpalo masė m, g
Vidutinis tirpalo tankis
ρ, g/mL
ρ = m
vid.
/V
Tirpalo konc. pagal
1 lentelę, %
1 10,0 m
1

2 10,0 m
2

3 10,0 m
3


7
Norint apskaičiuoti paruošto tirpalo tankį, pirmiausia surandama trijų svėrimų vidutinė masė – m
vid
., kuri
dalijama iš svėrimui paimto tirpalo tūrio V(10 mL).


3
3 2 1
m m m
m
. vid
+ +
= ,


V
m
. vid
= ρ .

Apskaičiavus tirpalo tankį, iš 1 lentelės surandama tirpalo procentinė koncentracija.
Jeigu apskaičiuotos vidutinio tirpalo tankio reikšmės ir ją atitinkančios procentinės koncentracijos lentelėje
nėra, reikia perskaičiuoti.
Pavyzdžiui, surastas vidutinis tirpalo tankis ρ = 1,033 g/mL. 1 lentelėje tokios tankio reikšmės ir ją
atitinkančios koncentracijos nėra. Lentelėje yra tankis 1,030 g/mL (3,48 %) ir kitas tankis 1,040 g/mL
(4,58 %). Šiuo atveju reikia apskaičiuoti procentinę koncentraciją mažesnio bei didesnio tankio atžvilgiu ir
imti vidutinę koncentraciją:

1,030 g/mL − 3,48 %
1,033 g/mL − X
1
%
49 3
030 1
48 3 033 1
1
,
,
, ,
X =

= %
1,040 g/mL − 4,58 %
1,033 g/mL − X
2
%
55 4
040 1
58 4 033 1
2
,
,
, ,
X =

= %

02 4
2
55 4 49 3
2
2 1
,
, , X X
X
. vid
=
+
=
+
= %

b) būdas:
Šiuo būdu randama paruošto tirpalo procentinė koncentracija, remiantis titravimo rezultatais.
Tam tikslui automatine pipete pamatuojama 10 mL (V mL) paruošto KOH tirpalo, supilama į kūginę
kolbutę, įlašinami 3–4 lašai 0,1 % indikatoriaus metiloranžo tirpalo ir titruojama 0,5 N HCl arba H
2
SO
4

tirpalu, kol geltona tirpalo spalva nuo 1 titranto lašo pereina į oranžinę (apelsino spalvą). Užrašomas titruoti
sunaudotas rūgšties tūris (V
1
mL). Titravimas pakartojamas paėmus naują KOH 10 mL porciją. Jeigu dviejų
titravimų rezultatai skiriasi ne daugiau kaip 0,1 mL, trečią kartą titruoti nereikia. Randamas dviejų titravimų
vidurkis (V
1
vid.). Titravimo rezultatai surašomi į lentelę.

Eil. Nr.
Titravimui paimto KOH tirpalo
tūris (V), mL
Titravimui suvartotas 0,5 N
rūgšties tūris (V
1
), mL
Vidutinis 0,5 N rūgšties
tūris (V
1

vid
.), mL
1 10,0
2 10,0

Skaičiavimai

1. Pirmiausia apskaičiuojama KOH tirpalo normalinė koncentracija N
1
(ekv/L) pagal formulę:

V · N = V
1vid
. · N
1
,

V – titravimui paimtas KOH tirpalo tūris, mL;
N – KOH tirpalo normalinė koncentracija, ekv/L (ieškoma);
V
1vid
– vidutinis titravimui sunaudotas 0,5 N rūgšties tūris, mL;
N
1
– rūgšties (titranto) normalinė koncentracija, ekv/L.
8

2. Žinant KOH tirpalo normalinę koncentraciją, galima apskaičiuoti jo masę (m, g) 10-tyje mL(0,01 l)
tirpalo:

m (g) = E · N · 0,01.

3. Apskaičiuojama procentinė KOH tirpalo koncentracija (C
%
) panaudojus svorio būdu surastą šio tirpalo
tankį:

10 · ρ gramų tirpalo − m gramų KOH
100 gramų tirpalo − x gramų KOH (C
%
)

4. Apskaičiuojama absoliuti ir santykinė paruošto ir pagal tankį iš lentelės surasto procentinio tirpalo
paklaida, laikant, kad teisinga yra titravimo būdu nustatyta koncentracija.
Ruošiant sieros rūgšties tirpalus ir tikrinant paruoštų tirpalų koncentracijas daroma tas pats, tik
titruojama 0,5 N KOH arba NaOH tirpalu. Be to, gavus dėstytojo užduotį naudojant tinkamo aukščio
matavimo cilindrą ir areometrą (densimetrą), surandamas koncentruotos H
2
SO
4
tankis. Šis tankis toliau
naudojamas atliekant reikalingus skaičiavimus.

Atsiskaitymas

- aprašomas atliktas darbas, užpildomos visos lentelės;
- apskaičiuojamos paklaidos.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Petrucci, R. H.; Harwood, W. S. Bendroji chemija. Vilnius: Tvermė, 2000. 298 p.
3. Korosteliovas, P. Tirpalų ruošimas analizinės chemijos darbams. Vilnius: Mintis, 1969. 383 p.

1 lentelė. Kalio šarmo vandeninių tirpalų tankis ir koncentracija esant 20 °C temperatūrai (KOH, M = 40,01 g/mol)

Tankis,
g/cm
3
KOH,
%
Tankis,
g/cm
3
KOH,
%
Tankis,
g/cm
3
KOH,
%
Tankis,
g/cm
3
KOH,
%
Tankis,
g/cm
3
KOH,
%
1,000 0,197 1,110 12,08 1,220 23,38 1,330 33,97 1,440 43,92
1,010 1,295 1,120 13,14 1,230 24,37 1,340 34,90 1,450 44,79
1,020 2,38 1,130 14,19 1,240 25,36 1,350 35,82 1,460 45,66
1,030 3,48 1,140 15,22 1,250 26,34 1,360 36,735 1,470 46,53
1,040 4,58 1,150 16,26 1,260 27,32 1,370 37,65 1,480 47,39
1,050 5,56 1,160 17,29 1,270 28,29 1,380 38,56 1,490 48,25
1,060 6,74 1,170 18,32 1,280 29,25 1,390 39,46 1,500 49,10
1,070 7,82 1,180 19,35 1,290 30,21 1,400 40,37 1,510 49,95
1,080 8,89 1,190 20,37 1,300 31,15 1,410 41,26 1,520 50,80
1,090 9,96 1,200 21,38 1,310 32,09 1,420 42,155 1,530 51,64
1,100 11,03 1,210 22,38 1,320 33,03 1,430 43,04









9
2 lentelė. Vandeninių sieros rūgšties tirpalų tankis ir koncentracija (20 °C)

Tankis,
g/cm
3

H
2
SO
4
,
%
Tankis,
g/cm
3

H
2
SO
4
,
%
Tankis,
g/cm
3

H
2
SO
4
,
%
Tankis,
g/cm
3

H
2
SO
4
,
%
Tankis,
g/cm
3

H
2
SO
4
,
%
1,000 0,2609 1,180 25,21 1,360 46,33 1,540 63,81 1,720 79,37
1,005 0,9855 1,185 25,84 1,365 46,86 1,545 64,26 1,725 79,81
1,010 1,731 1,190 26,47 1,370 47,39 1,550 64,71 1,730 80,25
1,015 2,485 1,195 27,10 1,375 47,92 1,555 65,15 1,735 80,70
1,020 3,242 1,200 27,72 1,380 48,45 1,560 65,59 1,740 81,16
1,025 4,000 1,205 28,33 1,385 48,97 1,565 66,03 1,745 81,62
1,030 4,746 1,210 28,95 1,390 49,48 1,570 66,47 1,750 82,09
1,035 5,493 1,215 29,57 1,395 49,99 1,575 66,91 1,755 82,57
1,040 6,237 1,220 30,18 1,400 50,50 1,580 67,35 1,760 83,06
1,045 6,956 1,225 30,79 1,405 51,01 1,585 67,79 1,765 83,57
1,050 7,704 1,230 31,40 1,410 51,52 1,590 68,23 1,770 84,08
1,055 8,415 1,235 32,01 1,415 52,02 1,595 68,66 1,775 84,61
1,060 9,129 1,240 32,61 1,420 52,51 1,600 69,09 1,780 85,16
1,065 9,843 1,245 33,22 1,425 53,01 1,605 69,53 1,785 85,74
1,070 10,56 1,250 33,82 1,430 53,50 1,610 69,96 1,790 86,35
1,075 11,26 1,255 34,42 1,435 54,00 1,615 70,39 1,795 86,99
1,080 11,96 1,260 35,01 1,440 54,49 1,620 70,82 1,800 87,69
1,085 12,66 1,265 35,60 1,445 54,97 1,625 71,25 1,805 88,43
1,090 13,36 1,270 36,19 1,450 55,45 1,630 71,67 1,810 89,23
1,095 14,04 1,275 36,78 1,455 55,93 1,635 72,09 1,815 90,12
1,100 14,73 1,280 37,36 1,460 56,41 1,640 72,52 1,820 91,11
1,105 15,41 1,285 37,95 1,465 56,89 1,645 72,95 1,821 91,33
1,110 16,08 1,290 38,53 1,470 57,36 1,650 73,37 1,822 91,56
1,115 16,76 1,295 39,10 1,475 57,84 1,655 73,80 1,825 92,2
1,120 17,43 1,300 39,68 1,480 58,31 1,660 74,22 1,827 92,8
1,125 18,09 1,305 40,25 1,485 58,78 1,665 74,64 1,830 93,6
1,130 18,76 1,310 40,82 1,490 59,24 1,670 75,07 1,831 93,94
1,135 19,42 1,315 41,39 1,495 59,70 1,675 75,49 1,832 94,32
1,140 20,08 1,320 41,95 1,500 60,17 1,680 75,92 1,833 94,72
1,145 20,73 1,325 42,51 1,505 60,62 1,685 76,34 1,834 95,12
1,150 21,38 1,330 43,07 1,510 61,08 1,690 76,77 1,835 95,72
1,155 22,03 1,335 43,62 1,515 61,54 1,695 77,20 1,8355 96,0
1,160 22,67 1,340 44,17 1,520 62,00 1,700 77,63 1,8364 97,0
1,165 23,31 1,345 44,72 1,525 62,45 1,705 78,06 1,8361 98,0
1,170 23,95 1,350 45,26 1,530 62,91 1,710 78,49 1,8342 99,0
1,175 24,58 1,355 45,80 1,535 63,36 1,715 78,93 1,8305 100,0

10
3. Buferiniai tirpalai

Darbo tikslas

Išmokyti studentus apskaičiuoti ir paruošti norimos pH reikšmės
buferinį tirpalą ir nustatyti jo buferinę talpą.

Trumpa teorinė dalis

Buferiniai tirpalai – tai tirpalai, kuriuose yra tam tikra vandenilio jonų
koncentracija (pH), kuri tik nedaug keičiasi skiedžiant tirpalus arba pridedant į juos nedidelį kiekį stiprios
rūgšties arba bazės.
Klasikiniai buferiniai tirpalai gaminami iš silpnos rūgšties ir jos druskos arba silpnos bazės ir jos
druskos, pvz., CH
3
COOH + CH
3
COONa arba NH
4
OH + NH
4
Cl.
Iš silpnos rūgšties ir jos druskos pagamintuose buferiniuose tirpaluose vandenilio jonų koncentracija gali
būti apskaičiuota taip:


+
H
C =
druskos
šties g rū
šties g rū
C
C
K . (1)


Iš silpnos bazės ir jos druskos pagamintuose buferiniuose tirpaluose vandenilio jonų koncentracija gali
būti apskaičiuota taip:


+
H
C =
s bazė
druskos
s bazė
O H
C
C
K
K

2
, (2)
čia:

K
rūgšties
ir K
bazės
– silpnos rūgšties ir silpnos bazės disociacijos konstantos (acto rūgšties ir amonio
hidroksido disociacijos konstantos yra vienodos ir lygios 1,85 ⋅ 10
−5
),

O H
K
2
– vandens joninė sandauga (1 ⋅ 10
−14
),
C – rūgšties, bazės ar druskos molinė (mol/L) koncentracija.
Žinant vandenilio jonų koncentraciją, pH apskaičiuojamas taip:

pH = –lg C
H+.
(3)

Jeigu reikia pagaminti žemos pH reikšmės buferinį tirpalą, reikia imti rūgštį, kurios K yra didelė.
Vidutinių pH reikšmių buferiniams tirpalams gaminti naudojamos rūgštys, kurių K yra maža. Buferiniams
tirpalams, kurių pH reikšmės yra didelės, gaminti naudojami bazių ir jų druskų mišiniai.
Buferinius tirpalus galima taip pat pagaminti iš daugiavandenilinių rūgščių druskų mišinių, pvz.,
NaH
2
PO
4
+ Na
2
HPO
4
.
Skiedžiant buferinius tirpalus, jų pH keičiasi labai nedaug, pvz., CH
3
COOH + CH
3
COONa buferinio
tirpalo pH, keičiantis rūgšties ir druskos koncentracijoms (abiejų komponentų koncentracijos vienodos),
keičiasi taip:

Normalinė koncentracija 0,1 0,01 0,001
pH 4,63 4,67 4,73

Taip pat skiedžiant HCl, pH keičiasi nuo 1 iki 3, o CH
3
COOH – nuo 2,86 iki 3,86.
Svarbi bet kurio tirpalo charakteristika yra jo buferinė talpa (BT). Buferinė talpa (BT) – tai stiprios
rūgšties ar stiprios bazės gramekvivalentų skaičius, kurį galima pridėti į 1 litrą buferino tirpalo, kol jo pH
pasikeičia per 1 pH vienetą (grekv/L arba mgekv/mL, grekv/L = mgekv/mL). Buferinė talpa praktiškai
nustatoma titruojant tam tikrą buferinio tirpalo tūrį su žinomos koncentracijos stiprios rūgšties (HCl, H
2
SO
4
)
arba stiprios bazės (KOH, NaOH) tirpalu tol, kol pH pasikeičia per 1 pH vienetą. Titravimo metu pH
pasikeitimas stebimas naudojant pH-metrą (potenciometrinis titravimas).
11

Darbo priemonės ir reagentai

pH-metras, magnetinė maišyklė, svarstyklės, pipetės, biuretė, 50 mL stiklinėlė, 250 mL matavimo kolba,
0,1 N HCl ir 0,1 N NaOH tirpalai, ledinė CH
3
COOH ir CH
3
COONa arba NH
4
OH ir NH
4
Cl.

Darbo eiga

a) Buferinio tirpalo ruošimas
Dėstytojui nurodžius buferinio tirpalo tipą (amoniakinis, acetatinis) ir pH reikšmę, pirmiausia atliekami
skaičiavimai (silpnos rūgšties, silpnos bazės ir jų druskų koncentracijos turėtų svyruoti 0,05 – 0,1 M
intervale).
Skaičiavimo pavyzdys. Reikia paruošti 250 mL acetatinio buferinio tirpalo, kuriame acto rūgšties
koncentracija yra 0,07 M ir kurio pH reikšmė yra 4,5.
1. Surandama vandenilio jonų koncentracija tokiame tirpale:

C
H
+
= 10
−pH
= 10
−4,5
= 3,16 ⋅ 10
−5
mol/L.

2. Žinant vandenilio jonų koncentraciją tirpale iš (1) surandama reikalinga natrio acetato molinė
koncentracija:
041 0
10 16 3
07 0
10 85 1
5
5
,
,
,
,
C
C
K C
H
ūgšties r
ties ūgš r druskos
=

⋅ ⋅ = =


+
mol/L.

3. Apskaičiuojamos CH
3
COOH ir CH
3
COONa masės, reikalingos 250 mL tirpalo paruošimui pagal
formulę:

m = M ⋅ C
M
⋅ V (litrais).

Dėstytojui patikrinus skaičiavimus, paruošiama 250 mL buferinio tirpalo. Į 250 mL matavimo kolbą
įpilama 10–20 mL distiliuoto vandens, ji statoma ant svarstyklių, palaukiama kol stabilizuojasi svarstyklių
rodmenys ir atliekama taravimo funkcija. Naudojant pipetę, pasveriama paskaičiuota acto rūgšties masė.
Matavimo kolba nuimama nuo svarstyklių ir atskirai pasveriamas reikalingas CH
3
COONa kiekis, kuris
suberiamas į tą pačią matavimo kolbą. Kolba iki pusės tūrio pripilama distiliuoto vandens ir maišoma tol, kol
druska ištirpsta. Tirpalas praskiedžiamas vandeniu iki brūkšnio ir gerai sumaišomas.
Naudojantis pH-metru, išmatuojama paruošto buferinio tirpalo praktinė pH reikšmė (žr. pH-metro
naudojimo instrukciją), kuri palyginama su teorine.

b) Buferinio tirpalo buferinės talpos nustatymas
Pipete pamatuojama 20 mL paruošto buferinio tirpalo ir supilama į 50 mL stiklinėlę. Stiklinėlė
pastatoma ant magnetinės maišyklės, į tirpalą įmerkiami elektrodai (kombinuotas elektrodas) ir maišant
tirpalą jis titruojamas 0,1 N rūgšties tirpalu tol, kol jo pH reikšmė pasikeičia per 1 pH vienetą. Po kiekvienos
titranto porcijos pridėjimo laukiama, kol stabilizuojasi pH rodmenys. Užrašomas titranto tūris (V
1
).
Buferinė talpa (BT) apskaičiuojama taip:

BT(grekv/L) =
V
N V
1
,
čia:
V
1
– titravimui sunaudotas stiprios rūgšties tūris, mL,
N – stiprios rūgšties molinė ekvivalentų koncentracija (normalingumas),
V – titravimui paimtas buferinio tirpalo tūris, mL.
Tokiu pat būdu atliekamas 20 mL buferinio tirpalo titravimas su 0,1 N šarmo tirpalu ir naudojantis ta
pačia formule vėl apskaičiuojama buferinė talpa.

12
Atsiskaitymas

- buferinio tirpalo receptūros skaičiavimai;
- buferinės talpos reikšmės pagal rūgštį ir pagal šarmą.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganinės chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius, Mokslas, 1991. 374 p.

13
4. Kompleksiniai junginiai

Kompleksiniais junginiais vadinami tokie junginiai, į kuriuos įeina
daugiau ar mažiau patvarūs sudėtingi (kompleksiniai) jonai ar molekulės,
galintys egzistuoti tiek tirpalo, tiek kristalų pavidalu.
Kompleksiniai junginiai gaunami jungiantis neutralioms molekulėms,
pvz.:

NH
3
+ HCl →[NH
4
]Cl,
CuCl
2
+ 4 NH
3
→ [Cu(NH
3
)
4
]Cl
2
.

Kompleksiniai junginiai gali turėti:
1) kompleksinį katijoną, pvz.: [Co(NH
3
)
6
]Cl
3
,
2) kompleksinį anijoną, pvz.: Na
3
[Co(NO
2
)
6
],
3) kompleksinį katijoną ir anijoną, pvz.: [Ni(NH
3
)
6
]
2
[Fe(CN)
6
],
4) kompleksą – neelektrolitą, pvz.: [Co(NH
3
)
3
(NO
2
)
3
], [Pt(NH
3
)
2
Cl
4
].
Kompleksinių junginių sandarą aiškina koordinacinė teorija. Pagal ją kompleksinis junginys sudarytas
iš vidinės ir išorinės koordinacinių sferų.
Komplekso vidinė koordinacinė sfera susideda iš kompleksadario ir ligandų. Formulėse vidinė
komplekso sfera žymima laužtiniais skliausteliais.
Kompleksinių junginių kompleksadaris užima centrinę vietą. Kompleksadariu būna:
1) metalų jonai, pvz.: Ag
+
, Cu
2+
, Co
3+
, Ni
2+
, Fe
2+
, Pt
4+
ir kt.,
2) metalų, priklausančių d elementams, neutralūs atomai, pvz.: Cr, Mn, Fe, Re, Mo,
3) nemetalų jonai, pvz.: B
3+
, N
3+
, Si
4+
, P
5+
,S
6+
.
Ligandai (adendai) išsidėsto aplink kompleksadarį. Ligandais būna:
1) neigiamieji jonai, pvz.: OH

, Cl

, F

, NO
2

, CN

, CO
2
2−
ir kt.,
2) polinės molekulės, pvz.: H
2
O, NH
3
, NO, CO, PH
3
ir kt.,
3) linkusios poliarizuotis molekulės, pvz.: (CH
2
)
2
(NH
2
)
2
– etilendiaminas ir kt.
Koordinacinis skaičius – tai skaičius, rodantis, kiek ligandų susijungę su kompleksadariu. Žinomi
įvairūs koordinaciniai skaičiai: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12. Dažniausiai pasikartoja šie:

6 – Co
2+
, Co
3+
, Fe
2+
, Fe
3+
, Pt
4+
, Ni
2+
, Cr
3+
jonams,
4 – Cu
2+
, Pt
2+
, Zn
2+
, Hg
2+
, Au
3+
, Cd
2+
jonams.

Koordinacinis skaičius visada didesnis už kompleksadario valentingumą.
Komplekso išorinę koordinacinę sferą sudaro jonai, esantys toliau nuo kompleksadario. Formulėse –
tai jonai, esantys už laužtinių skliaustų. Pvz., junginio K
4
[Fe(CN)
6
]:
1) komplekso vidinė koordinacinė sfera – [Fe(CN)
6
]
4−
,
2) kompleksadarys – Fe
2+
,
3) ligandai (adendai) – CN

,
4) koordinacinis skaičius – 6,
5) komplekso išorinė koordinacinė sfera – 4K
+
.
Žinant koordinacinės teorijos pagrindinius teiginius, galima sudaryti kompleksinių junginių formules.

1 pavyzdys. Sudaryti kompleksinį junginį iš CrCl
3
, KCl, 2NH
3
. Chromo koordinacinis skaičius lygus 6.

K[CrCl
4
(NH
3
)
2
].

2 pavyzdys. Parašyti kompleksinio junginio [Ni(NH
3
)
6
]SO
4
susidarymo reakciją.

NiSO
4
+ 6NH
3
→ [Ni(NH
3
)
6
]SO
4
.

14
Kompleksinių junginių grupei priskiriamos dvigubos druskos, pvz., KAl(SO
4
)
2
, ir kristalohidratai, pvz.,
CuSO
4
⋅ 5H
2
O. Dvigubos druskos yra labai nepatvarūs kompleksiniai junginiai. Pagrindinis skirtumas tarp
dvigubų ir kompleksinių druskų yra tas, kad dvigubos druskos vandenyje disocijuoja į visus jas sudarančius
jonus. Pvz.:

KAl(SO
4
)
2
⇔ K
+
+ Al
3+
+ 2SO
4
2−
.

Kompleksiniai junginiai vandenyje disocijuoja į kompleksinį joną ir jonus, esančius išorinėje
koordinacinėje sferoje. Pvz.:

K
3
[Fe(CN)
6
] ⇔ 3K
+
+ [Fe(CN)
6
]
3−
, (1)
[Ag(NH
3
)
2
]Cl ⇔ [Ag(NH
3
)
2
]
+
+ Cl

. (2)

Tirpalą skiedžiant vandeniu, kompleksinių junginių disociacijos laipsnis didėja.

Kompleksinio jono ir kompleksadario krūvio skaičiavimas

Kompleksinio jono krūvis lygus kompleksadario ir ligandų krūvių algebrinei sumai. Pvz.:

[Cu(NH
3
)
4
]
2+
, [BF
4
]
1−
, [PtCl
4
(NH
3
)
2
]
0
,
+2+0=+2. +3+(−4)=−1. +4+(−4)+0=0.

Apie kompleksinio jono krūvį galima spręsti iš išorinėje koordinacinėje sferoje esančių jonų krūvių (žr.
1 ir 2 reakcijų lygtis).
Kompleksadario krūvis skaičiuojamas pagal bendrą taisyklę: junginį sudarančių elementų krūvių
algebrinė suma turi būti lygi nuliui. Pvz.:

K[Co(NH
3
)
2
(NO
2
)
4
],
+1+x+0+(−4)=0,
x = 4 −1 =3.

Kompleksinio junginio pavadinimas

Kompleksadario prijugtų adendų skaičiui ir išorinėje koordinacinėje sferoje esančių jonų skaičiui rasti
vartojami graikiški skaičių pavadinimai (mono, di, tri, tetra, penta ir kt.). Kompleksadario krūvis žymimas
romėnišku skaičiumi skliausteliuose (kompleksiniame katijone – po kompleksadario, kompleksiniame
anijone – prieš kompleksadarį).
Jei junginyje yra kompleksinis katijonas – sakomi prijungtų ligandų, kompleksadario (lietuviškai) ir
išorinėje koordinacinėje sferoje esančių jonų pavadinimai. Pvz.:

[Ag(NH
3
)
2
]NO
3
– diamoniako sidabro (I) nitratas,
[Cu(NH
3
)
4
]Cl
2
– tetraamoniako vario (II) dichloridas.

Jei junginyje yra kompleksinis anijonas, sakomi išorinės sferos jonų, prijungtų ligandų ir
kompleksadario pavadinimai. Kompleksadario pavadinimas sudaromas, prie kompleksadario lotyniško
pavadinimo pridedant galūnę „-atas“. Pvz.:

K
3
[Fe(CN)
6
] – trikalio heksaciano (III) feratas,
K
2
[PtCl
4
] – dikalio tetrachloro (II) platinatas.

Darbo tikslas

Išanalizuoti darbe gautus ir vartojamus kompleksinius junginius, parašyti jų pavadinimus.

15
Darbo priemonės ir reagentai

Mėgintuvėliai, matavimo cilindras (10 mL), elektros plytelė, stiklinė (vandens vonia).
Tirpalai: BaCl
2
, Bi(NO
3
)
3
, C
2
H
5
OH, CoCl
2
, FeCl
3,
Fe(NH
4
)(SO
4
)
2
, FeSO
4
, KI, K
3
[Fe(CN)
6
],
K
4
[Fe(CN)
6
], KSCN, NH
3
konc., NaOH, NiSO
4
.
Sausi reagentai: CuSO
4
, NH
4
SCN, raudono lakmuso popierėliai.

Darbo eiga

Atliekamos reakcijos pagal vieną iš dėstytojo nurodytų variantų. Parašomos visų atliktų reakcijų lygtys ir
išanalizuojami darbe naudoti ir pagaminti kompleksiniai junginiai. Duomenys surašomi į lentelę:

Eil.
Nr.
Kompleksinio junginio
formulė, jo disociacijos
lygtis
Komplek-
sadaris
Ligandai
(adendai)
Koordinacinis
skaičius
Kompleksadario
valentingumas
Kompleksinio jono
valentingumas

A variantas

1. Junginys su kompleksiniu katijonu
Nedidelis kiekis vario sulfato ištirpinamas 2 mL distiliuoto vandens. Į gautą tirpalą įpilama 2 mL
koncentruoto amoniako ir 1,5 mL etilo alkoholio. Išsiskiria rugiagėlių spalvos tetraamoniako vario sulfatas:

CuSO
4
+ 4NH
3
→ [Cu(NH
3
)
4
]SO
4
.

2. Junginys su kompleksiniu anijonu
Į mėgintuvėlį įpilama 1 mL bismuto nitrato ir lašinamas kalio jodidas tol, kol iškritusios tamsios bismuto
jodido nuosėdos ištirpsta KI pertekliuje. Parašoma BiI
3
susidarymo reakcija ir BiI
3
reakcija su KI, žinant, kad
Bi koordinacinis skaičius yra 4.

3. Kompleksinės ir dvigubos druskos
Į vieną mėgintuvėlį įpilama 2 mL Fe(NH
4
)(SO
4
)
2
tirpalo, o į kitą – 2 mL K
3
[Fe(CN)
6
] tirpalo. Į abu
mėgintuvėlius įpilama maždaug po 0,5 mL kalio rodanido KSCN tirpalo. Stebima, kuriame iš mėgintuvėlių
susidaro raudonos spalvos geležies rodanidas Fe(SCN)
3
. Paaiškinama, kodėl jis vienu atveju susidaro, o kitu
– ne.

4. Kompleksiniai junginiai, vykstant mainų reakcijoms
Į mėgintuvėlį įpilama 2 mL FeCl
3
ir 2 mL K
4
[Fe(CN)
6
] tirpalų. Susidaro mėlynos spalvos Berlyno mėlis
– Fe
4
[Fe(CN)
6
]
3
.

B variantas

1. Junginys su kompleksiniu katijonu
Į mėgintuvėlį įpilama 1 mL nikelio sulfato ir paskui – koncentruoto amoniako, kol tirpalas nusidažo
šviesiai mėlyna spalva. Susidaro heksaamoniako nikelio sulfatas – [Ni(NH
3
)
6
]SO
4
.
2. Junginys su kompleksiniu anijonu
Į mėgintuvėlį įpilama 1 mL kobalto chlorido tirpalo ir pridedama truputis NH
4
SCN druskos – tirpalas
nusidažo mėlynai:

CoCl
2
+ 4NH
4
SCN → (NH
4
)
2
[Co(SCN)
4
] + 2NH
4
Cl.

3. Kompleksinės ir dvigubos druskos
Imami 4 mėgintuvėliai. Į pirmą, antrą ir trečią mėgintuvėlį įpilama maždaug po 2 mL Fe(NH
4
)(SO
4
)
2
. Į
ketvirtą mėgintuvėlį įpilama 2 mL K
3
[Fe(CN)
6
] tirpalo. Į pirmą mėgintuvėlį įpilama maždaug 0,5 mL bario
chlorido tirpalo. Susidaro baltos spalvos BaSO
4
nuosėdos.
16
Į antrą mėginuvėlį įpilama 10 % koncentracijos natrio šarmo tirpalo ir vandens vonioje pašildoma iki
virimo. Virš mėgintuvėlio palaikomas vandeniu suvilgytas raudono lakmuso popierėlis, kuris pamėlynuoja
nuo išsiskyrusio amoniako.
Į trečią ir ketvirtą mėgintuvėlius įpilama 0,5 mL kalio rodanido KSCN tirpalo. Trečiame mėgintuvėlyje
susidaro raudonos spalvos geležies rodanidas Fe(SCN)
3
. Vadinasi, aptinkami visi tirpale esantys jonai:

Fe(NH
4
)(SO
4
)
2
⇔ Fe
3+
+ NH
+
4
+ 2SO
4
2−
.

Ketvirtame mėgintuvėlyje spalva nepakinta. Paaiškinama, kodėl.
4. Kompleksiniai junginiai vykstant mainų reakcijoms
Į mėgintuvėlį įpilama 2 mL FeSO
4
ir 2 mL K
3
[Fe(CN)
6
] tirpalų. Susidaro tamsiai mėlynos nuosėdos
(Turnbulio mėlynasis) – Fe
3
[Fe(CN)
6
]
2
.

Atsiskaitymas

- parašomos atliktų reakcijų lygtys;
- užpildoma pateikto pavyzdžio lentelė.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganinės chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

17
5. Cheminė kinetika, katalizė ir
pusiausvyra

Cheminė kinetika

Cheminę reakciją apibūdina tam tikras greitis. Jis
matuojamas reaguojančių medžiagų koncentracijų
pasikeitimu per laiko vienetą. Cheminės reakcijos gali būti
homogeninės ir heterogeninės. Reakcijos, kai reaguoja
vienodos fazės medžiagos, vadinamos homogeninėmis.
Pavyzdžiui, ištirpusių medžiagų reakcijos, dujų reakcijos.
Reakcijos, kai reaguoja skirtingų fazių medžiagos, vadinamos heterogeninėmis. Pavyzdžiui, ištirpusių
medžiagų reakcijos su kieta medžiaga, dujų reakcijos su kieta medžiaga.
Cheminių reakcijų greitis priklauso nuo įvairių veiksnių, tačiau pagrindiniai iš jų yra reaguojančiųjų
medžiagų koncentracija, temperatūra ir katalizatoriai.
Cheminės reakcijos greitis yra tiesiog proporcingas reaguojančiųjų medžiagų koncentracijų sandaugai.
Tai veikiančiųjų masių dėsnis, kurio matematinę išraišką galima pritaikyti cheminėms reakcijoms.
Reakcijos n A + m B → p C greitį galima išreikšti lygtimi:

v = k[A]
n
[B]
m
,
čia:
v – reakcijos greitis,
k – proporcingumo koeficientas, vadinamas reakcijos greičio konstanta,
[A] ir [B] – reaguojančių medžiagų koncentracijos,
n ir m – stechiometriniai cheminės lygties koeficientai.
Pvz.:

2SO
2
+ O
2
→ 2SO
3
,
v = k[SO
2
]
2
[O
2
].

Veikiančiųjų masių dėsnis taikomas ir heterogeninėms reakcijoms, tačiau šiuo atveju reakcijos greitis
priklauso nuo ištirpusių ir dujinių medžiagų koncentracijų ir nepriklauso nuo kietų medžiagų koncentracijų.
Pvz., sieros degimo reakcijos greitis priklauso tik nuo deguonies koncentracijos:

S + O
2
→ SO
2
v = k[O
2
].

Remiantis šiais dėsningumais, galima atlikti daug skaičiavimų.
Pavyzdys. Kaip pasikeis reakcijos 2SO
2
+ O
2
→ 2SO
3
greitis, jeigu dujų tūrį sumažinsime 3 kartus?
Sprendimas. Reakcijos greičio išraiška šiai reakcijai bus tokia:

v = k[SO
2
]
2
[O
2
].

Sumažinus dujų tūrį 3 kartus, reaguojančių medžiagų koncentracijos 3 kartus padidės, todėl reakcijos
greičio išraiška bus:

v = k[3SO
2
]
2
[3O
2
],
v = k27[SO
2
]
2
[O
2
].

Reakcijos greitis padidės 27 kartus.
Reakcijos greičio priklausomumas nuo temperatūros išreiškiamas van’t Hofo (van’t Hoff) taisykle:
padidinus temperatūrą 10 °C, reakcijos greitis padidės 2–4 kartus. Skaičius, rodantis, kiek kartų padidėja
reakcijos greitis, pakėlus temperatūrą 10 °C, vadinamas temperatūriniu reakcijos greičio koeficientu.
Reakcijos greičio (arba konstantos) priklausomumas nuo temperatūros išreiškiamas lygtimi:
0
50
100
150
20 30 40 50
t
o
C
v
,

s
-
1
18


10
t
t
t t
t
t t
k
k
v
v

∆ + ∆ +
γ = = ,
čia:
v
t
ir k
t
– reakcijos greitis ir konstanta, esant t °C temperatūrai,
v
t + ∆t
ir k
t + ∆t
– reakcijos greitis ir konstanta, esant (t + ∆t) °C temperatūrai,
γ – temperatūrinis reakcijos greičio koeficientas.
Pavyzdys. Temperatūrinis reakcijos greičio koeficientas yra 2,5. Kiek kartų padidės reakcijos greitis,
padidėjus temperatūrai nuo 20 iki 65 °C?
Sprendimas. Surandame ∆t:

∆t = 65 – 20 = 45 °C.

Pažymime reakcijos greitį, esant 20 °C ir 65 °C temperatūroms, atitinkamai v ir v
1
. Reikšmes įrašome į
lygtį:


5 4
10
45
1
5 2 5 2
,
, ,
v
v
= = ,

62 76 61
1
≈ = ,
v
v
.

Reakcijos greitis padidės 62 kartus.

Cheminė pusiausvyra

Reakcijos, kurios vienu metu vyksta dviem priešingomis kryptimis, vadinamos grįžtamosiomis.
Kai tiesioginės ir atvirkštinės reakcijų greičiai yra lygūs ir visų reaguojančių medžiagų koncentracijos
pastovios, reakcija yra cheminėje pusiausvyroje. Cheminė pusiausvyra apibūdinama pusiausvyros konstanta
(K), kurios matematinę išraišką galima pritaikyti cheminėms reakcijoms.
Reakcijos n A + m B → p C pusiausvyros konstanta išreiškiama lygtimi:


[ ]
[ ] [ ]
m n
p
B A
C
K = .

Pavyzdžiui, reakcijos

2SO
2
+ O
2
→ 2SO
3
,

[ ]
[ ] [ ]
2
2
2
2
3
O SO
SO
K = .

Cheminės pusiausvyros būklė priklauso nuo reaguojančių medžiagų koncentracijų, temperatūros ir
slėgio (jeigu reaguoja dujos arba garai). Jeigu pakeičiamas bent vienas iš šių dydžių, pusiausvyra pasislenka.
Kryptį, kuria pasislenka pusiausvyra, nurodo Le Šateljė (Le Chatellier) principas.
Pakeitus vieną iš sąlygų, kurioms esant sistema yra cheminėje pusiausvyroje, pusiausvyra
pasislenka ta kryptimi, kuri priešinasi padarytam pakeitimui. Pvz.:

2SO
2
+ O
2
→ 2SO
3
,
∆H = –193 kJ.

Šioje sistemoje gali vykti tokie pusiausvyros poslinkiai:
19
1. Padidinus SO
2
arba O
2
koncentracijas ir sumažinus SO
3
koncentraciją, pusiausvyra pasislenka į dešinę,
nes, vykstant tiesioginei reakcijai, sumažės SO
2
ir O
2
koncentracijos ir padidės SO
3
koncentracija.
Didinant SO
3
koncentraciją arba mažinant SO
2
bei O
2
koncentracijas, pusiausvyra pasislenka į kairę.
2. Sumažinus temperatūrą, pusiausvyra pasislenka į dešinę, nes SO
3
susidaro išsiskiriant šilumai. Padidinus
temperatūrą, pusiausvyra pasislenka į kairę, t. y. į tos reakcijos pusę, kuriai vykstant suvartojama šiluma.
3. Padidinus slėgį, pusiausvyra pasislenka į dešinę, nes šioje pusėje yra mažesnis dujų molekulių skaičius.
Sumažinus slėgį, pusiausvyra pasislinks į kairę, t. y. į tą pusę, kurioje molekulių skaičius yra didesnis.

Katalizė

Reakcijos greičiui daug reikšmės turi katalizatoriai. Tai tokios medžiagos, kurios pakeičia reakcijos
greitį. Katalizatoriai po reakcijos lieka nepakitę. Katalizė yra skirstoma į homogeninę ir heterogeninę.
Homogeninė katalizė yra tokia, kai katalizatorius ir reaguojančios medžiagos yra vienos fazės.
Homogeninės katalizės mechanizmas aiškinamas tarpinių junginių susidarymo teorija.
Heterogeninė katalizė yra tokia, kai katalizatorius ir reaguojančios medžiagos sudaro skirtingas
fazes. Heterogeninės katalizės mechanizmas aiškinamas adsorbcija. Dėl adsorbcijos padidėja ne tik
reaguojančių medžiagų koncentracija katalizatoriaus paviršiuje, bet ir jų aktyvumas, padidinantis reakcijos
greitį.

Darbo tikslas

Ištirti reakcijos greičio priklausomybę nuo reaguojančių medžiagų koncentracijų ir temperatūros,
susipažinti su katalize bei cheminės reakcijos pusiausvyros poslinkiais.

Darbo priemonės

Elektrinė plytelė, termometras, laikmatis, pipetės, mėgintuvėliai, stiklinėlės, 2 % Na
2
S
2
O
3
bei 2 %
H
2
SO
4
tirpalai, prisotinti FeCl
3
ir KSCN tirpalai, 30 % H
2
SO
4
tirpalas, 1, 0,1 ir 0,01 N KNO
3
tirpalai, sausas
KCl, metalinis cinkas.

Darbo eiga

Darbas atliekamas pagal vieną iš dėstytojo nurodytų variantų.

A vari antas. Reakci jos grei či o pri kl ausomybė nuo koncentraci jos i r temperatūros

Reaguojant natrio tiosulfatui Na
2
S
2
O
3
su sieros rūgštimi, susidaro nepatvari tiosulfatinė rūgštis, kuriai
skylant išsiskiria koloidinė siera.

Na
2
S
2
O
3
+ H
2
SO
4
= Na
2
SO
4
+ H
2
S
2
O
3
,
H
2
S
2
O
3
= H
2
O + SO
2
+ S.

Siera iš reakcijos mišinio ima skirtis, praėjus kiek laiko po tirpalų sumaišymo, todėl reakcijos trukme
galima laikyti laiką, praėjusį nuo tirpalų sumaišymo iki momento, kai mišinys tampa nebeskaidrus. Reakcija
atliekama, esant įvairioms medžiagų koncentracijoms, taip pat skirtingoms temperatūroms.

1. Reakcijos greičio priklausomybė nuo koncentracijos

Į 5 mėgintuvėlius įpilama 2 % Na
2
S
2
O
3
tirpalo ir distiliuoto vandens. Jų tūriai nurodyti 1 lentelėje.
Paskui į pirmą mėgintuvėlį įpilama 5 mL 2 % H
2
SO
4
tirpalo, reakcijos mišinys sumaišomas. Fiksuojamas
laikas –reakcijos trukmė τ (s) – nuo sumaišymo momento iki tirpalo susidrumstimo (arba neskaidrumo).
Analogiškai atliekami bandymai ir kituose keturiuose mėgintuvėliuose.
Šiame darbe labai svarbu užfiksuoti laiką, per kurį mėgintuvėliuose pasiekiamas vienodas mišinio
drumstumas. Tam tikslui patogu sekti mišinių drumstumą juodame fone, lyginant tiriamąjį mėgintuvėlį su
20
kontroliniu, pripiltu vandens (pažymima drumstimosi pradžia) arba laikant mėgintuvėlį prie suliniuoto
popieriaus lapo ir fiksuojant laiką, kai pro mėgintuvėlį nebesimato linijų.
Darbo rezultatai surašomi į 1 lentelę. Santykinė Na
2
S
2
O
3
koncentracija tirpaluose c randama iš
trupmenos a/(a + b), o sąlyginis reakcijos greitis v – iš reiškinio 1000/τ, sek
−1
.


1 lentelė

Bandinio
Nr.
Tirpalų tūriai, (mL)
H
2
O tūris,
(mL) b
Santykinė
Na
2
S
2
O
3
konc., c
Reakcijos
trukmė, τ (s)
Sąlyginis reakcijos
greitis, v s
−1

2 % Na
2
S
2
O
3
,
(mL) a
2 % H
2
SO
4
,
(mL)
1 2 5 8
2 4 5 6
3 6 5 4
4 8 5 2
5 10 5 0

Iš gautų duomenų sudaromas reakcijos greičio priklausomybės nuo natrio tiosulfato koncentracijos
grafikas. Abscisių ašyje atidedama santykinė tiosulfato koncentracija c, ordinačių – sąlyginis reakcijos greitis
v.

2. Reakcijos greičio priklausomybė nuo temperatūros

Į 4 mėgintuvėlius įpilama po 5 mL 2 % Na
2
S
2
O
3
, o kitus keturis – po 5 mL 2 % H
2
SO
4
tirpalų.
Į 4 chemines 100 mL talpos stiklinėles įpilama po 70–80 mL vandentiekio vandens ir į jas įstatoma po
vieną mėgintuvėlį su Na
2
S
2
O
3
bei H
2
SO
4
tirpalais.
Pirmoji stiklinėlė su vandeniu ir įstatytais mėgintuvėliais (kartkartėm atsargiai pakratant mėgintuvėlius)
šildoma, kol vandens temperatūra stiklinėje ir abiejuose mėgintuvėliuose pasiekia 20 °C. Abiejų
mėgintuvėlių turinys supilamas į vieną mėgintuvėlį. Reakcijos mišinys suplakamas. Pažymima reakcijos
trukmė τ (s) nuo reakcijos pradžios iki tirpalo neskaidrumo (stebima dryžuotame fone). Šiame darbe, kaip ir
pirmame punkte, svarbu užfiksuoti laiką, per kurį mėgintuvėliuose pasiekiamas vienodas mišinio
drumstumas.
Kita stiklinėlė ir joje esantys mėgintuvėliai su tirpalais pašildomi iki 30 °C, tirpalai supilami į vieną
mėgintuvėlį, suplakami ir užrašomas laikas nuo tirpalų sumaišymo iki susidrumstimo momento.
Tas pats atliekama su kitomis stiklinėlėmis ir jose esančių mėgintuvėlių turiniu, esant 40 °C ir 50 °C
temperatūroms.
Rezultatai įrašomi į 2 lentelę.
Sąlyginis reakcijos greitis v imamas lygus santykiui 1000/τ, s
−1
.

2 lentelė

Bandymo
Nr.
Bandymo temperatūra, t (°C) Reakcijos trukmė, τ (s) Sąlyginis reakcijos greitis, v (s
−1
)
1 20
2 30
3 40
4 50

Iš gautų duomenų sudaromas reakcijos greičio priklausomybės nuo temperatūros grafikas. Abscisių
ašyje atidedamos temperatūros °C, ordinačių ašyje – sąlyginis reakcijos greitis v.
Apskaičiuojamas temperatūrinis reakcijos greičio koeficientas γ pagal formulę:

21

1
2
2
1
v
v
=
τ
τ
= γ ,
čia:
τ
1
ir v
1
– laikas, per kurį tirpalas susidrumstė, ir reakcijos greitis, esant t °C temperatūrai,
τ
2
ir v
2
– laikas, per kurį tirpalas susidrumstė, ir reakcijos greitis, esant (t+10) °C temperatūrai.
Turint tris temperatūrinio koeficiento reikšmes, randamas jų vidurkis.

B vari antas. Katal i zė i r chemi nė pusi ausvyra

1. Katalizatoriaus koncentracijos įtaka reakcijos greičiui

Homogeninės katalizės greitis priklauso nuo katalizatoriaus koncentracijos.
Į stiklinėlę įpilama 20 mL 30 % sieros rūgšties ir įlašinami 3–4 lašai 0,1 N kalio permanganato. Tirpalas
sumaišomas ir supilstomas į 3 mėgintuvėlius, po 5 mL į kiekvieną. Į pirmą mėgintuvėlį įlašinami 2 lašai 1 N
kalio nitrato, į antrą – 2 lašai 0,1 N kalio nitrato, į trečią 2 lašai 0,01 N kalio nitrato. Paskui į visus
mėgintuvėlius įmetama po gabaliuką cinko. Mėgintuvėliai retkarčiais sukratomi. Cinkui reaguojant su sieros
rūgštimi, išsiskiria vandenilis, kuris redukuoja kalio permanganatą, todėl violetinė KMnO
4
spalva išnyksta.

Zn + H
2
SO
4
→ ZnSO
4
+ 2H,
2KMnO
4
+ 10H + 3H
2
SO
4
→ 2MnSO
4
+ K
2
SO
4
+ 8H
2
O.

Reakciją pagreitina katalizatorius – kalio nitratas:

5KNO
3
+ 10H → 5KNO
2
+ 5H
2
O,
2KMnO
4
+ 5KNO
2
+ 3H
2
SO
4
→ 2MnSO
4
+ K
2
SO
4
+ 5KNO
3
+ 3H
2
O.

Į lentelę surašomas laikas (s), per kurį išnyksta violetinė tirpalo spalva:

Mėgintuvėlio Nr. KNO
3
konc. Reakcijos trukmė τ (s) Reakcijos greitis v = 1000/τ

Gauti duomenys pavaizduojami grafiškai: abscisių ašyje atidedama katalizatoriaus koncentracija,
ordinačių ašyje – reakcijos greitis v.

2. Cheminės pusiausvyros poslinkiai

Geležies trichloridui reaguojant su kalio rodanidu, susidaro raudonas geležies rodanidas:

FeCl
3
+ 3KSCN ↔ Fe(SCN)
3
+ 3KCl.

Tirpalo spalvos intensyvumas priklauso nuo Fe(SCN)
3
koncentracijos. Pusiausvyros poslinkis
pastebimas iš tirpalo spalvos intensyvumo pasikeitimo.
Į stiklinę įpilama 20 mL distiliuoto vandens ir įlašinama 3 lašai prisotintų FeCl
3
ir KSCN tirpalų. Gautas
raudonas tirpalas padalijamas į 4 lygias dalis ir supilamas į mėgintuvėlius. Pirmas mėgintuvėlis paliekamas
palyginimui, į antrą įlašinami 2 lašai prisotinto FeCl
3
tirpalo, į trečią – 2 lašai prisotinto KSCN tirpalo, o į
ketvirtą įberiamas mažas šaukštelis kristalinio KCl. Tirpalų spalvos intensyvumas pasikeičia.
Bandymų rezultatai surašomi į lentelę:

Bandymo
Nr.
Pridedama medžiaga
Tirpalo spalvos intensyvumo
pokytis (tamsėja ar šviesėja)
Pusiausvyros poslinkio kryptis
(į kairę ar į dešinę)

Parašoma atliktos reakcijos pusiausvyros konstantos išraiška.



22
Atsiskaitymas

- pateikiamos nustatyto pavyzdžio užpildytos lentelės;
- pateikiami nurodyti darbo aprašyme grafikai;
- pateikiama apskaičiuota temperatūrinio reakcijos greičio koeficiento reikšmė (5 a variante);
- parašoma atliktos reakcijos pusiausvyros konstantos išraiška (5 b variante).

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganinės chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

23
6. Medžiagų tirpumas

Medžiagų tirpumu yra vadinama jos savybė tirpti vienokiame
ar kitokiame tirpiklyje. Tirpumo matas yra medžiagos sotaus tirpalo
koncentracija. Dažniausiai tirpumas išreiškiamas medžiagos svorio
kiekiu, kuris ištirpsta 100 g tirpiklio esant 20 °C temperatūrai. Daugelio
kietų medžiagų tirpumas didėja kylant temperatūrai, o dujų tirpumas –
mažėja.
Tirpimo procesas visada yra lydimas šiluminio efekto. Šilumos
kiekis, suvartojamas ar išsiskiriantis, tirpstant 1 moliui medžiagos,
vadinamas tirpimo šiluma.

Darbo tikslas

Natrio arba amonio oksalatų tirpumo nustatymas, jų sočiųjų tirpalų įvairių koncentracijų skaičiavimas.

Tyrimo objektas

Natrio arba amonio oksalatai.

Darbo priemonės ir reagentai

Kūginės kolbutės, stiklinaitė (25–50 mL), stiklinė lazdelė, piltuvėlis, filtro popierius, biuretė, pipetė,
matavimo cilindras, matavimo kolbutė (100 mL), elektrinė plytelė.
Na
2
C
2
O
4
, (NH
4
)
2
C
2
O
4
, tirpalai: KMnO
4
0,1 N, H
2
SO
4
1:4.

Darbo eiga

Pasveriama 2 g Na
2
C
2
O
4
arba (NH
4
)
2
C
2
O
4
, supilama į cheminę stiklinaitę ir įpilama
20 mL distiliuoto vandens (matuojama cilindru). Oksalatas stiklinaitėje maišomas
stikline lazdele 10 min. Paskui gautas sotusis tirpalas nufiltruojamas pro sausą filtrą,
pipete pamatuojama 10 mL filtrato ir supilama į 100 mL matavimo kolbutę. Tirpalas iki
brūkšnio praskiedžiamas distiliuotu vandeniu ir gerai sumaišomas. Iš matavimo
kolbutės švaria pipete pamatuojama 10 mL tirpalo, supilama į kūginę kolbutę ir įpilama
10 mL praskiestos 1 : 4 sieros rūgšties (matuojama cilindru arba dozatoriumi). Tirpalas
pašildomas iki virimo temperatūros ir karštas titruojamas 0,1 N kalio permanganato
tirpalu, kol atsiranda silpnai rausva spalva (žr. pav.). Titruojama 2–3 kartus.
Titruojant amonio oksalatą kalio permanganato tirpalu, vyksta reakcija:

5(NH
4
)
2
C
2
O
4
+ 2KMnO
4
+ 8H
2
SO
4
→ 2MnSO
4
+ K
2
SO
4
+ 5(NH
4
)
2
SO
4
+ 10CO
2
+ 8H
2
O.

Titruojant natrio oksalatą kalio permanganatu, vyksta analogiška reakcija.
Titravimo duomenys surašomi į lentelę:

Titravimas
Titravimui paimtas tiriamo
tirpalo tūris (mL)
Titravimui suvartoto kalio
permanganato tūris (mL)
Vidutinis titravimui suvartotas
kalio permanganato tūris (mL)
1
2
3

Skaičiavimai

Iš sunaudoto kalio permanganato tirpalo tūrio apskaičiuojama:
1) praskiesto oksalato tirpalo molinė ekvivalentų koncentracija (normalingumas) pagal formulę:
T
i
r
p
u
m
a
s

(
g
/
1
0
0

g

H
2
O
)

24

NV = N
1
V
1
,
čia:
N – oksalato tirpalo normalingumas,
V – titravimui paimtas oksalato tirpalo tūris, mL,
N
1
– kalio permanganato tirpalo normalingumas,
V
1
– titravimui sunaudoto kalio permanganato tirpalo tūris, mL.

2) ištirpusio oksalato kiekis (g) 10-tyje mL sotaus tirpalo pagal formulę:

m=
1000
100 ⋅ ⋅ N E
,
čia:
E – oksalato ekvivalentinė masė,
N – oksalato tirpalo normalingumas.

3) oksalato tirpumas gramais 100-te gramų vandens
*
,
4) sotaus oksalato tirpalo procentinė koncentracija
*
,
5) sotaus oksalato tirpalo molinė koncentracija
*
.

*
sotaus tirpalo tankis yra 1,02 g/mL

Atsiskaitymas

- užpildyta pateikto pavyzdžio lentelė;
- oksalato tirpumo reikšmė;
- sotaus oksalato tirpalo procentinė koncentracija;
- sotaus oksalato tirpalo molinė koncentracija.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Stulpinas, B. ir kt. Bendrosios chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Mokslas, 1985. 147 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

25
7. Neelektrolito molio masės nustatymas
krioskopiniu metodu

Tirpalų virimo temperatūra yra aukštesnė, negu gryno tirpiklio, o jų stingimo
temperatūra – žemesnė. Tirpalo ir tirpiklio virimo temperatūrų skirtumas
vadinamas tirpalo virimo temperatūros pakilimu, o tirpiklio ir tirpalo stingimo
temperatūrų skirtumas vadinamas tirpalo stingimo temperatūros nuokryčiu
(depresija). Šias tirpalų savybes nusako antrasis Raulio dėsnis: stingimo
temperatūros depresija ir virimo temperatūros pakilimas yra proporcingi
molialinei tirpalo koncentracijai:

∆t = Kc, (1)
čia:
∆t – virimo temperatūros pakilimas arba stingimo temperatūros depresija (nuokrytis),
c – tirpalo molialinė koncentracija,
K – krioskopinė arba ebulioskopinė konstanta.
Krioskopinė konstanta yra vienmolialinio tirpalo stingimo temperatūros depresija. Ebulioskopinė
konstanta yra vienmolialinio tirpalo virimo temperatūros pakilimas.
Kadangi

c =
M
m
, (2)
čia:
m – ištirpusios medžiagos kiekis (g) 1000 g tirpiklio,
M – medžiagos molio masė,
tai antrąjį Raulio dėsnį galima užrašyti taip:

t ∆ =
M
m
K . (3)

Pagal šį Raulio dėsnį galima apskaičiuoti ištirpusių medžiagų molio masę.

Darbo tikslas

Nustatyti dėstytojo nurodytos medžiagos molio masę.

Darbo priemonės

Krioskopas, pipetė (10 mL), grūstuvas su piesta, ledas, sausas NaCl, tiriamoji medžiaga.

Darbo eiga

Darbas atliekamas su krioskopu, kurį sudaro stiklinė su joje įtvirtintu mėgintuvėliu.
Mėgintuvėlis užkemšamas kamščiu, į kurį įstatytas termometras.
Stiklinė pripildoma šaldomojo mišinio, kurį sudaro ½ stiklinės susmulkinto ledo ir
trys šaukšteliai natrio chlorido.
Randama gryno tirpiklio stingimo temperatūra. Tam į mėgintuvėlį įpilama 10 mL
distiliuoto vandens (matuojama pipete). Vanduo atsargiai pamaišomas termometru ir
stebima jo temperatūra. Iš pradžių vanduo peršąla – temperatūra nukrinta žemiau nulio.
Netrukus atsiranda ledo kristaliukai, vandens temperatūra šiek tiek pakyla ir nusistovi.
Tai ir yra gryno tirpiklio stingimo temperatūra t
1
. Mėgintuvėlis išimamas ir šildomas
rankoje, kol ledas ištirpsta. Ištirpinus ledą, į mėgintuvėlį įpilama analitinėmis
svarstyklėmis tiksliai pasverta tiriamoji medžiaga. Medžiagai ištirpus, anksčiau aprašytu
būdu randama tirpalo stingimo temperatūra t
2
.
26
Bandymų duomenys surašomi į lentelę:

Gryno tirpiklio
stingimo temperatūra,
t
1
(°C)
Tirpalo stingimo
temperatūra, t
2

(°C)
Tirpalo stingimo
temperatūros
depresija, ∆t (°)
Gryno tirpiklio
masė (g)
Tiriamos medžiagos
masė (g)

Skaičiavimai

Skaičiuojama pagal antrojo Raulio dėsnio formulę (3). Vandens krioskopinė konstanta K = 1,86 °C/mol.
Gryno tirpiklio svoris imamas lygus jo tūriui, nes laikoma, kad distiliuoto vandens tankis lygus 1 g/mL.
Tirpalo stingimo temperatūros depresija:

∆t = t
1
− t
2
, (4)
čia:
t
1
– gryno tirpiklio stingimo temperatūra,
t
2
– tirpalo stingimo temperatūra.

Atsiskaitymas

- pateikiama užpildyta lentelė;
- pateikiama apskaičiuota nežinomos medžiagos molio masė.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganinės chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

27
8. Koloidiniai tirpalai

Koloidiniais tirpalais, arba zoliais, vadinamos dispersinės
sistemos, kurių dispersinės fazės dalelių skersmuo yra 1–100 nm.
Koloidiniai tirpalai yra heterogeninės sistemos, todėl, norint gauti
koloidinį tirpalą, dispersinė fazė turi netirpti tirpiklyje.
Koloidiniai tirpalai gaunami dviem metodais:
1) dispersiniu – smulkinant medžiagą iki koloidinių dalelių dydžio,
2) kondensaciniu – cheminių reakcijų metu sukimbant molekulėms į
agregatus.
Nors koloidinių tirpalų dalelės yra didelės, tačiau jos neiškrenta
nuosėdomis ir gali ilgai išlaikyti agregatinį pastovumą. Koloidų
agregatinis pastovumas aiškinamas tuo, kad dalelės paviršiuje susidaro
elektrinis krūvis. Koloidinės dalelės adsorbuoja iš tirpalo jonus ir įgyja elektros krūvį, kuris neleidžia joms
sukibti ir nusėsti.
Susidarant koloidiniams tirpalams, dispersinės fazės molekulės sukimba į agregatus ir sudaro koloidinės
dalelės branduolį. Branduolys adsorbuoja tirpale esančius jonus, kurie neleidžia dalelei toliau augti.
Koloidinės dalelės branduolys iš tirpalo adsorbuoja tuos jonus, kurie yra jam giminingi ir kurių tirpale yra
perteklius. Nuo šių jonų ir priklauso koloidinės dalelės krūvio ženklas. Pvz., AgJ koloidinės dalelės
branduolys gali adsorbuoti Ag
+
arba J

jonus ir priklausomai nuo adsorbuotų jonų įsielektrinti teigiamai arba
neigiamai. Metalų hidroksidų koloidinės dalelės turi teigiamąjį krūvį, nes adsorbuoja iš tirpalo teigiamuosius
jonus. Fe(OH)
3
koloidinės dalelės branduolys adsorbuoja Fe
3+
jonus. Metalo sulfidų koloidinės dalelės turi
neigiamąjį krūvį, nes adsorbuoja iš tirpalo neigiamuosius jonus. Sb
2
S
3
bei As
2
S
3
dalelių branduoliai
adsorbuoja S
2−
arba HS

jonus, priklausomai nuo to, kokie jonai yra tirpale. Adsorbuoti branduolio paviršiuje
jonai pritraukia iš tirpalo dalį priešingo krūvio jonų ir sudaro koloidinės dalelės adsorbcinį sluoksnį. Taigi
adsorbciniame sluoksnyje yra teigiamųjų ir neigiamųjų jonų. Koloidinės dalelės branduolys su adsorbciniu
sluoksniu sudaro granulę. Kita priešingo krūvio jonų dalis yra toliau nuo koloidinės dalelės ir sudaro difuzinį
sluoksnį. Granulė ir difuzinio sluoksnio jonai sudaro micelę.
Pvz., As
2
S
3
zolis susidaro pagal šią reakciją:

As
2
O
3
+ 3H
2
S → As
2
S
3
+ 3H
2
O,
As
2
O
3
+ 3H
+
+ 3S
2−
→ As
2
S
3
+ 3H
2
O.

1) As
2
S
3
molekulės sukimba ir sudaro koloidinės dalelės branduolį m(As
2
S
3
),
2) branduolys adsorbuoja S
2−
jonus, įsielektrina neigiamai ir pritraukia iš tirpalo dalį H
+
jonų. S
2−
ir H
+

jonai sudaro adsorbcinį sluoksnį. Branduolys su adsorbciniu sluoksniu – granulė:

{m(As
2
S
3
)nS
2−
⋅ xH
+
}
(2n−x)−
,

3) kiti tirpalo H
+
jonai išsidėsto toliau ir sudaro difuzinį sluoksnį. Granulė su difuziniu sluoksniu – micelė:

{m(As
2
S
3
)nS
2−
⋅ xH
+
}
(2n−x)−
(2n−x)H
+
.

Adsorbcinio ir difuzinio sluoksnių jonai sudaro dvigubą elektros sluoksnį dalelės paviršiuje. Koloidinei
dalelei judant atsiranda potencialų skirtumas tarp dalelės ir tirpale esančių jonų, kuris vadinamas
elektrokinetiniu potencialu, arba ζ (dzeta) potencialu. Kuo didesnė ζ potencialo reikšmė, tuo pastovesnė
koloidinė sistema.
Jeigu koloidinių dalelių krūviai labai sumažėja arba visai išnyksta, koloidinės dalelės sustambėja, iš
tirpalo išsiskiria nuosėdos. Šis procesas vadinamas koaguliacija. Koaguliaciją gali sukelti priešingų krūvių
koloidų sumaišymas, temperatūros pakilimas, zolio koncentravimas ir elektrolitų priedai.
Elektrolito priedas pakeičia difuzinio sluoksnio struktūrą. Elektrolito jonai difuzinio sluoksnio jonus
išstumia į adsorbcinį sluoksnį, todėl dalelės krūvis mažėja ir, atsižvelgiant į elektrolito koncentraciją, gali
visai išnykti. Tada koloidinės dalelės sukimba į agregatus ir koaguliuoja.
28
Minimali elektrolito koncentracija, kuri sumažina zolio agregatinį pastovumą per tam tikrą laiką,
vadinama koaguliacijos slenksčiu C
sl
. Atvirkščias jam dydis apibūdina elektrolito koaguliacinę galią 1/C
sl
.
Koaguliacinė galia priklauso nuo jono valentingumo ir spindulio. Kuo didesnis jono valentingumas ir
spindulys, tuo didesnė elektrolito koaguliacinė galia.

Darbo tikslas

Pagaminti koloidinius tirpalus, nustatyti jų patvarumą. Apskaičiuoti elektrolitų koaguliacinę galią.

Darbo priemonės

Elektrinė plytelė, mėgintuvėliai, cheminės stiklinėlės, matavimo cilindras, pipetės. 4 % FeCl
3
arba 3 %
AlCl
3
, 1 % CuSO
4
, 0,01 % K
4
[Fe(CN)
6
], 0,01 M K
2
SO
4
, 0,001 M K
3
[Fe(CN)
6
], 0,01 M BaCl
2
, 0,001 M
AlCl
3
tirpalai.

Darbo eiga

Darbas atliekamas pagal vieną iš dėstytojo nurodytų variantų.

A vari antas

Stiklinėlėje užvirinama 50 mL distiliuoto vandens, įpilama 5 mL 4 % FeCl
3
arba 3 % AlCl
3
tirpalo ir
palaukiama, kol tirpalas dar kartą užvirs. Chloridų hidrolizė vyksta iki galo, ir susidaro geležies arba
aliuminio hidroksido zolis.
Parašomos hidroksido susidarymo molekulinė ir joninė lygtys ir zolio micelės formulė, žinant, kad
koloidinės dalelės krūvis teigiamasis.
Į 8 švarius mėgintuvėlius įpilama po 5 mL ataušinto hidroksido zolio. Į kiekvieną mėgintuvėlį pridedama
distiliuoto vandens ir elektrolito tirpalo tiek, kiek nurodyta lentelėje:

Mėgin-
tuvėlio
Nr.
Fe(OH)
3
arba
Al(OH)
3
, (mL)
Distiliuoto
H
2
O, (mL)
0,01 M
K
2
SO
4
, (mL)
0,001 M
K
3
[Fe(CN)
6
],
(mL)
Kai koaguliuoja po
15 min., žymima +
1 5 4,5 0,5 –
2 5 4 1 –
3 5 3 2 –
4 5 1 4 –
5 5 4,5 – 0,5
6 5 4 – 1
7 5 3 – 2
8 5 1 – 4

Tirpalai mėgintuvėliuose sumaišomi, ir po 15 min. lentelėje pažymima, kuriuose mėgintuvėliuose įvyko
koaguliacija (tirpalas susidrumstė arba iškrito nuosėdos).

B vari antas

Į 40 mL 0,01 % K
4
[Fe(CN)
6
] tirpalo įpilama 1 mL 1 % CuSO
4
. Susidaro raudonas Cu
2
[Fe(CN)
6
] zolis.
Parašomos šio zolio susidarymo molekulinė ir joninė lygtys ir micelės formulė, žinant, kad dalelės krūvis
neigiamas ir ją stabilizuoja K
4
[Fe(CN)
6
].
Į 8 mėgintuvėlius įpilama po 5 mL gauto zolio, tada pridedama distiliuoto vandens ir elektrolito tirpalo
tiek, kiek nurodyta lentelėje:

Mėgin-
tuvėlio
Cu
2
[Fe(CN)
6
]
(mL)
Distiliuoto
H
2
O (mL)
0,01 M
BaCl
2

0,001 M
AlCl
3

Kai koaguliuoja po 15
min., žymima +
29
Nr. (mL) (mL)
1 5 4,5 0,5 –
2 5 4 1 –
3 5 3 2 –
4 5 1 4 –
5 5 4,5 – 0,5
6 5 4 – 1
7 5 3 – 2
8 5 1 – 4

Tirpalai mėgintuvėliuose sumaišomi, ir po 15 min. lentelėje pažymima, kuriuose mėgintuvėliuose įvyko
koaguliacija (tirpalas susidrumstė arba iškrito nuosėdos).

Skaičiavimai

Koaguliacijos slenkstis ir koaguliaciniė galia skaičiuojami kiekvienam iš panaudotų darbe elektrolitų.
Koaguliacijos slenkstis C
sl
apskaičiuojamas pagal mažiausią elektrolito koncentraciją, kuri sukėlė
koaguliaciją:

C
sl
= 100cv,
čia:
c – molinė elektrolito koncentracija,
v – mažiausias elektrolito kiekis (mL), kuris sukelia koaguliaciją.
Paskui apskaičiuojama elektrolito koaguliacinė galia:

p = 1/C
sl
.

Duomenys surašomi į lentelę:

Elektrolitas Koaguliaciją sukeliantis jonas Koaguliacijos slenkstis Koaguliacinė galia

Atsiskaitymas

- pateikiamos zolio susidarymo reakcijos;
- pateikiama zolio micelės formulė;
- pateikiama užpildyta duoto pavyzdžio lentelė.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Stulpinas, B. ir kt. Bendrosios chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Mokslas, 1985. 147 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

30
9. Elektrolitinė disociacija

Darbo tikslas

Apskaičiuoti acto rūgšties arba amonio hidroksido disociacijos konstantą K ir
disociacijos laipsnį α.

Darbo priemonės ir reagentai

pH-metras, biuretė, pipetė, stiklinėlė, kūginės kolbutės.
Tirpalai: CH
3
COOH, NaOH, fenolftaleinas, arba NH
4
OH, HCl, metiloranžas.

Darbo eiga

Darbas atliekamas pagal vieną iš dėstytojo nurodytų variantų.

A. Acto rūgšties disociacijos konstantos ir disociacijos laipsnio nustatymas

Pamatuojamas dėstytojo nurodyto tirpalo pH (matavimų seka yra aprašyta atskirame lape, kurį studentas
gauna laboratorijoje).
Bendra acto rūgšties molinė koncentracija (C) lygi jos normalinei koncentracijai (N), kadangi šios
medžiagos molio masė lygi jos ekvivalento molio masei.
Norint rasti normalinę tirpalo koncentraciją, pipete tiksliai pamatuojama 5 arba 10 mL tiriamojo tirpalo,
įpilama į kūginę kolbutę, įlašinama 3−4 lašai fenolftaleino indikatoriaus ir titruojama duotos koncentracijos
NaOH tirpalu. Titravimas atliekamas 2−3 kartus.

Skaičiavimai

Žinant tirpalo pH reikšmę, iš formulės

pH = −lg[H
+
], (1)

randama vandenilio jonų koncentracija [H
+
] (mol/L) pagal formulę:

[H
+
] = 10
−pH
. (2)

Disocijuojant vienai acto rūgšties molekulei, susidaro vienas vandenilio jonas ir vienas acetato jonas:

CH
3
COOH ⇔ H
+
+ CH
3
COO

,

todėl acetato jonų koncentracija yra lygi vandenilio jonų koncentracijai:

[CH
3
COO

] = [H
+
]. (3)

Pusiausvyroje esančios acto rūgšties koncentracija [CH
3
COOH] prilyginama bendrai molinei acto
rūgšties koncentracijai, kuri yra lygi tirpalo molinei ekvivalentų koncentracijai (normalingumui):

[CH
3
COOH] = C = N. (4)

Normalinė acto rūgšties koncentracija apskaičiuojama iš titravimo duomenų pagal lygtį:

N ⋅ V = N
1
⋅ V
1
, (5)
čia:
N – acto rūgšties normalinė koncentracija,
31
V – acto rūgšties tūris, paimtas titruoti (mL),
N
1
– NaOH normalinė koncentracija,
V
1
– titruoti sunaudoto NaOH tūris (mL).
Apskaičiavus visas koncentracijas, galima skaičiuoti acto rūgšties disociacijos konstantą K:

K =
[ ] [ ]
[ ] COOH CH
COO CH H
3
3
− +

, (6)
čia:
[H
+
] – vandenilio jonų koncentracija, mol/L,
[CH
3
COO

] – acetato jonų koncentracija, mol/L,
[CH
3
COOH] – nedisocijuotos acto rūgšties koncentracija, mol/L.
Acto rūgšties disociacijos laipsnis skaičiuojamas:

α =
C
K
, (7)
čia:
K – acto rūgšties disociacijos konstanta,
C – acto rūgšties bendra molinė koncentracija, mol/L.

B. Amonio hidroksido disociacijos konstantos ir disociacijos laipsnio nustatymas

Matuojamas dėstytojo nurodyto tirpalo pH.
Bendra amonio hidroksido molinė koncentracija (C) lygi jo normalinei koncentracijai (N), nes šios
medžiagos molio masė lygi jos ekvivalento molio masei.
Tam, kad būtų galima rasti normalinę tirpalo koncentraciją, pipete tiksliai pamatuojama 5 arba 10 mL
tiriamojo tirpalo, įpilama į kūginę kolbutę, įlašinama 1−2 lašai indikatoriaus metiloranžo ir titruojama duotos
koncentracijos HCl tirpalu. Titruojama 2−3 kartus.

Skaičiavimai

Žinant tirpalo pH reikšmę, apskaičiuojama hidroksilo jonų koncentracija [OH

], mol/L. Žinant, kad:

pH + pOH = 14, t. y. pOH = 14 − pH, (8)

iš formulės

pOH = −lg[OH

] (9)

randama hidroksilo jonų koncentracija [OH

] (mol/L):

[OH

] = 10
−pOH
. (10)

Disocijuojant vienai amonio hidroksido molekulei, susidaro vienas amonio jonas ir vienas hidroksilo
jonas:

NH
4
OH ⇔ NH
4
+
+ OH

,

todėl amonio jonų koncentracija yra lygi hidroksilo jonų koncentracijai:

[NH
4
+
] = [OH

]. (11)

Pusiausvyroje esančio amonio hidroksido koncentracija [NH
4
OH] prilyginama bendrai molinei amonio
hidroksido koncentracijai, kuri yra lygi tirpalo molinei ekvivalentų koncentracijai (normalingumui):
32

[NH
4
OH] = C = N, (12)

Normalinė amonio hidroksido koncentracija apskaičiuojama iš titravimo duomenų pagal lygtį (5).
Apskaičiavus visas koncentracijas, galima skaičiuoti duoto amonio hidroksido disociacijos konstantą K:

K =
[ ] [ ]
[ ] OH NH
OH NH
4
4
− +

, (13)
čia:
[NH
+
] − amonio jonų koncentracija, mol/L,
[HO

] − hidroksilo jonų koncentracija, mol/L,
[NH
4
OH] − nedisocijuoto amonio hidroksido koncentracija, mol/L.
Amonio hidroksido disociacijos laipsnis skaičiuojamas pagal (7) lygtį.

Atsiskaitymas

- tiriamos medžiagos disociacijos laipsnio reikšmė;
- tiriamos medžiagos disociacijos konstantos reikšmė.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganinės chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

33
10. Druskų hidrolizė

Hidrolize vadinama druskos ir vandens jonų reakcija, kuriai
vykstant susidaro bent vienas silpnasis elektrolitas (silpnoji rūgštis,
bazė arba rūgštiniai bei baziniai jonai). Todėl dažniausiai pakinta
vandens vandenilio ir hidroksilo jonų koncentracija, ir druskos tirpalas
parūgštėja arba pašarmėja. Kiekvieną druską galima laikyti medžiaga,
gauta rūgščiai reaguojant su baze: druskos katijonas apibūdina bazę,
anijonas – rūgštį. Hidrolizuojasi tik tokios druskos, kurias sudaro
silpnosios rūgštys arba silpnosios bazės. Stipriųjų rūgščių ir stipriųjų
bazių druskos (pvz.: NaCl, KNO
3
) nesihidrolizuoja, nes druskos jonų sąveika su vandeniu nevyksta
(nesusidaro silpnai disocijuojantys junginiai), todėl vandens H
+
ir OH

jonų koncentracija nepakinta, ir
tirpalas yra neutralus.
Rūgščių ir bazių stiprumą nusako jų disociacijos laipsnis α. Stipriųjų elektrolitų disociacijos laipsnis yra
didesnis negu 30 % (α > 30 %), silpnų – mažesnis negu 3 % (α < 3 %). Elektrolitų disociacijos laipsnių
reikšmes galima rasti Chemijos laboratorinių darbų knygutėje [1] 126 p.
Kai rašomos hidrolizės reakcijos, pirma parašoma molekulinė lygtis, paskui – joninė ir sutrumpinta
joninė lygtys. Druskos, sudarytos iš silpnų daugiavandenilių rūgščių (Na
2
CO
3
, K
3
PO
4
) arba silpnųjų
daugiahidroksilių bazių (Fe(NO
3
)
3
, CuCl
2
) hidrolizuojasi stadijomis (pakopomis). Tais atvejais ir susidaro
rūgštūs ar baziniai jonai. Toliau panagrinėkime būdingiausių tipų hidrolizę.
Druskos, sudarytos iš stipriosios bazės ir silpnosios rūgšties, hidrolizuojasi ir sudaro silpnai
disocijuojančią rūgštį:

KCN + H
2
O ⇔ HCN + KOH;
K
+
+ CN

+ H
2
O ⇔ HCN + K
+
+ OH

;
CN

+ H
2
O ⇔ HCN + OH

.

Susidaro silpna ciano rūgštis ir OH

jonų perteklius (KOH yra stipri bazė ir todėl vandeniniame tirpale
gerai disocijuoja į jonus). Tirpalo reakcija yra šarminė: pH > 7.
Druskos, sudarytos iš stiprios bazės ir daugiavandenilės rūgšties, hidrolizuojasi pakopomis:

1 stadija Na
2
CO
3
+ H
2
O ⇔ NaHCO
3
+ NaOH;
2 Na
+
+ CO
3
2−
+ H
2
O ⇔ Na
+
+ HCO
3

+ Na
+
+ OH

;
CO
3
2−
+ H
2
O ⇔ HCO
3

+ OH

.

2 stadija NaHCO
3
+ H
2
O ⇔ H
2
CO
3
+ NaOH;
Na
+
+ HCO
3

+ H
2
O ⇔ H
2
CO
3
+ Na
+
+ OH

;
HCO
3

+ H
2
O ⇔ H
2
CO
3
+ OH

.

Hidrolizuojantis stipriosios bazės ir silpnosios rūgšties druskoms, susijungia vandens vandenilio jonai, ir
tirpale ima vyrauti hidroksilo jonai, kurie suteikia jam šarminių savybių (pH > 7). Be to, susidaro silpnoji
rūgštis arba rūgštusis jonas.
Druskos, sudarytos iš stipriosios rūgšties ir silpnosios bazės, hidrolizuojasi ir sudaro silpnai
disocijuojančią bazę:

NH
4
Cl + H
2
O ⇔ NH
4
OH + HCl,
NH
4
+
+ Cl

+ H
2
O ⇔ NH
4
OH + H
+
+ Cl

,
NH
4
+
+ H
2
O ⇔ NH
4
OH + H
+
.

Druskos, sudarytos iš stipriosios rūgšties ir daugiavalenčio metalo bazės, hidrolizuojasi pakopomis:

1 stadija: CuCl
2
+ H
2
O ⇔ Cu(OH)Cl + HCl,
Cu
2+
+ 2 Cl

+ H
2
O ⇔ Cu(OH)
+
+ Cl

+ H
+
+ Cl

,
34
Cu
2+
+ H
2
O ⇔ Cu(OH)
+
+ H
+
.

2 stadija: Cu(OH)Cl + H
2
O ⇔ Cu(OH)
2
+ HCl,
Cu(OH)
+
+ Cl

+ H
2
O ⇔ Cu(OH)
2
+ H
+
+ Cl

,
Cu(OH)
+
+ H
2
O ⇔ Cu(OH)
2
+ H
+
.

Hidrolizuojantis silpnosios bazės ir stipriosios rūgšties druskoms, susijungia vandens hidroksilo jonai ir
tirpale ima vyrauti vandenilio jonai, kurie suteikia jam rūgščių savybių (pH < 7). Be to, susidaro silpnoji
bazė arba bazinis jonas.
Druskos, sudarytos iš silpnosios bazės ir silpnosios rūgšties, hidrolizuojasi ir sudaro silpnąją rūgštį ir
silpnąją bazę:

CH
3
COONH
4
+ H
2
O ⇔ CH
3
COOH + NH
4
OH,
CH
3
COO

+ NH
4
+
+ H
2
O ⇔ CH
3
COOH + NH
4
OH.
Arba
1 stadija (NH
4
)
2
S + H
2
O ⇔ NH
4
OH + NH
4
HS,
2 NH
4
+
+ S
2−
+ H
2
O ⇔ NH
4
OH + NH
4
+
+ HS

,
NH
4
+
+ S
2−
+ H
2
O ⇔ NH
4
OH + HS

.

2 stadija: NH
4
HS + H
2
O ⇔ NH
4
OH + H
2
S,
NH
4
+
+ HS

+ H
2
O ⇔ NH
4
OH + H
2
S.

Hidrolizuojantis silpnosios bazės ir silpnosios rūgšties druskoms, susijungia vandens hidroksilo ir
vandenilio jonai. Tirpalo pH priklauso nuo susidariusių medžiagų disociacijos laipsnio. Acto rūgšties ir
amonio hidroksido disociacijos laipsniai labai panašūs, todėl šiuo atveju tirpalas praktiškai neutralus. Jei
hidrolizėje susidariusios rūgšties disociacijos laipsnis didesnis už bazės disociacijos laipsnį – tirpalas bus
silpnai rūgštus (pH < 7), jei bazės disociacijos laipsnis didesnis už rūgšties – tirpalas bus silpnai šarminis
(pH > 7). Jei vykstant hidrolizei susidaro labai silpna rūgštis ir labai silpna bazė, be to, jeigu jos yra lakios
arba mažai tirpios, tai hidrolizė gali vykti iki galo, kol suskils visa druska:

Al
2
S
3
+ 6 H
2
O ⇔ 2 Al(OH)
3
+ 3 H
2
S.

Darbo tikslas

Nagrinėti druskų vandeninių tirpalų pH pokyčius. Išmokti rašyti įvairių druskų pakopinės hidrolizės
reakcijų lygtis.

Darbo priemonės ir reagentai

Cheminės stiklinėlės (25–50 mL) arba mėgintuvėliai, universalaus indikatoriaus popierėliai arba pH-
metras.
Įvairios sausos druskos, distiliuotas vanduo.

Darbo eiga

Iš darbo vietoje esančių druskų stiklinėlėse arba mėgintuvėliuose pagaminami tirpalai: imama keliolika
kristaliukų druskos ir užpilama keliais mililitrais distiliuoto vandens, pamaišoma. Druskoms ištirpus pH-
metru arba universalaus indikatoriaus popierėliu nustatomas visų tirpalų pH. Gauti rezultatai surašomi į
lentelę:

Mėgintuvėlio arba
stiklinėlės Nr.
Druskos
formulė
Iš ko sudaryta druska
(bazė ir rūgštis)
Druskos tirpalo
pH reikšmė
Tirpalo reakcija (rūgšti,
šarminė ar neutrali)

35
Parašomos druskų hidrolizės reakcijų molekulinės bei joninės lygtys. Druskų, sudarytų iš
daugiavandenilių rūgščių bei daugiahidroksilių bazių, hidrolizės reakcijas privalu rašyti pakopomis.

Atsiskaitymas

- užpildyta lentelė;
- atliktų reakcijų lygtys.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganinės chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

36
11. Galvaniniai elementai ir elektrolizė

Galvaniniai elementai

Reakcijoje, kai oksidacijos ir redukcijos procesai atskiriami ir
elektronai verčiami nuo reduktoriaus į oksidatorių eiti laidu (išorine
grandine), gaunama elektros srovė. Cheminė oksidacijos-redukcijos
reakcijos energija paverčiama elektros energija. Įrengimai, kuriuose
vyksta toks energijos pasikeitimas, vadinami cheminiais elektros srovės
šaltiniais. Paprasčiausi cheminiai elektros srovės šaltiniai yra
galvaniniai elementai.
Galvaninis elementas susideda iš dviejų elektrodų. Elektrodą sudaro metalas, įmerktas į savo druskos
tirpalą (elektrolitą), pavyzdžiui, švino plokštelė – švino nitrato tirpale ir cinko plokštelė – cinko nitrato
tirpale (žr. paveiksliuką). Sujungus tirpalus vamzdeliu, užpildytu elektrolito tirpalu, o metalo plokšteles –
laidu, gaunamas galvaninis elementas.
Įmerkus metalą į elektrolito tirpalą vandenyje, tarp metalo ir
tirpalo susidaro potencialų skirtumas, vadinamas elektrodo
potencialu. Tiesiogiai išmatuoti potencialų skirtumą tarp metalo ir
tirpalo negalima, dėl to nustatomas potencialų skirtumas,
susidarantis tarp dviejų elektrodų. Elektrodu, su kuriuo lyginami
metalų potencialai, yra naudojamas standartinis vandenilio
elektrodas, kurio potencialas imamas lygus nuliui.
Standartiniu metalo potencialu φ
0
vadinamas elektrodo
potencialas, atsirandantis pamerkus metalą į jo druskos tirpalą,
kuriame metalo jonų koncentracija yra vienas molis litre tirpalo
(1 M), esant 25 °C temperatūrai. Surašius metalus į eilę pagal
didėjančias standartinių elektrodo potencialų (φ
0
) reikšmes,
gaunama metalų įtampų eilė (pateikta [1] šaltinio 125 p.)
Bet kurios koncentracijos druskos tirpale metalo potencialas φ apskaičiuojamas pagal Nernsto lygtį:

c lg
n
,059 0
0
+ ϕ = ϕ , (1)
čia:
φ
0
– standartinis metalo potencialas,
n – metalo valentingumas,
c – metalo jonų koncentracija druskos tirpale (mol/L).
Metalo jonų koncentracija apskaičiuojama taip:

c = c
M
⋅ α ⋅ n
j
,
čia:
c
M
– druskos tirpalo molinė koncentracija,
α – druskos disociacijos laipsnis šiame tirpale (praskiestuose druskų tirpaluose jis imamas lygus
vienetui),
n
j
– metalo jonų skaičius, gaunamas disocijuojant vienai druskos molekulei.
Galvaniniame elemente anodu yra neigiamesnį potencialą turintis elektrodas (aktyvesnis metalas).
Anodas tirpsta (oksiduojasi, t. y. atiduoda elektronus), ir šis procesas vadinamas anodiniu. Teigiamesnį
potencialą turintis elektrodas, ant kurio teigiami metalo jonai netenka krūvio (redukuojasi, t. y. prisijungia
elektronus), vadinamas katodu. Katodo paviršiuje vykstantis redukcijos procesas yra vadinamas katodiniu.
Tarp anodo ir katodo susidaro potencialų skirtumas. Tuo atveju, kai srovės stiprumas galvaniniame
elemente lygus nuliui, šis potencialų skirtumas vadinamas galvaninio elemento elektrovaros jėga EVJ ir
skaičiuojamas pagal lygtį:

EVJ = ϕ
katodo
− ϕ
anodo
. (2)

37
Supaprastinta anksčiau pavaizduoto galvaninio elemento schema užrašoma taip:

– Zn | Zn(NO
3
)
2
|| Pb(NO
3
)
2
| Pb +.

Šiame galvaniniame elemente anodas yra cinkas, nes φ
0
Zn
= – 0,76 V, katodas – švinas, nes
φ
0
Pb
= – 0,13 V. Vykstančios elektrocheminės reakcijos yra šios:

anodinė Zn
0
– 2ē → Zn
2+
(oksidacija, ē atidavimas),
katodinė Pb
2+
+ 2ē → Pb
0
(redukcija, ē pritraukimas).

Galvaninio elemento elektrovaros jėga (EVJ) apskaičiuojama atimant iš didesnio (teigiamesnio)
elektrodinio potencialo mažesnį (neigiamesnį). Galvaninio elemento, sudaryto iš standartinių švino ir cinko
elektrodų, elektrovaros jėga yra:

EVJ = –0,13 – (–0,76) = 0,63 V.

Elektrolizė

Elektrolize vadinamas cheminis procesas, vykstantis leidžiant per elektrolito tirpalą arba lydalą
nuolatinę elektros srovę. Elektros srovę per tirpalus perneša jonai. Vandeniniame druskos tirpale, be druskos
jonų, yra vandenilio (H
+
) ir hidroksilo (OH

) jonų. Elektrolizės metu prie katodo (neigiamo elektrodo) vyksta
redukcija (elektronų prisijungimas), prie anodo (teigiamo elektrodo) – oksidacija (elektronų atidavimas).
Katodiniai procesai. Elektrolizėje prie katodo atkeliauja tirpale esantieji teigiamieji jonai. Pirmiausia
išsikrauna to metalo jonai, kurio elektrodinis potencialas yra teigiamiausias.
Metalų druskų vandeninių tirpalų elektrolizėje galimi trys katodinio proceso atvejai.
1. Labai aktyvių metalų, kurių standartinis elektrodo potencialas yra neigiamesnis už −1,2 V (Li
+
, K
+
,
Na
+
, Ba
2+
, Ca
2+
, Mg
2+
, Al
3+
, Ti
2+
), jonai iš vandeninių jų druskų tirpalų elektrolizėje neišsikrauna. Tuo
atveju išsikrauna vandenilio jonai (jei elektrolitas yra rūgštus):

2H
+
+ 2ē → 2H → H
2
(3)

arba vandens molekulės (jei elektrolitas yra neutralus arba šarminis):

2H
2
O + 2ē → H
2
+ 2OH

. (4)

Elektrolizuojant labai aktyvių metalų druskų vandeninius tirpalus, ant katodo skiriasi vandenilis.
2. Elektrolizuojant tirpalus, kuriuose yra metalo jonų, esančių aktyvumo eilėje tarp titano ir vandenilio
(pradedant manganu), prie katodo redukuojasi metalo jonai:

Me
n+
+ nē → Me. (5)

Kartu su metalo jonais išsikrauna vandenilis. Vyksta (3) arba (4) reakcijos.
3. Metalų, turinčių teigiamą standartinį elektrodo potencialą, jonai vandeninių tirpalų elektrolizės metu
redukuojasi katodo paviršiuje, ant katodo skiriasi tik metalas. Vyksta tik (5) reakcija.
Anodiniai procesai. Anodas elektrolizėje gali būti tirpusis, kai jis metalinis, ir netirpusis, kai jis grafito,
anglies ar kai kurių metalų (pvz.: Pt, Au).
1. Kai anodas tirpusis, jis oksiduojasi, jo jonai pereina į tirpalą:

Me – nē → Me
n+
.

2. Kai anodas netirpusis, prie jo atkeliauja neigiamieji jonai, kurie ir oksiduojasi (išsikrauna). Pagal
aktyvumą oksidacijai neigiamieji jonai gali būti išdėstomi tokia eile:

J

, Br

, Cl

, S
2−
… OH

, H
2
O,
− 2
4
SO ,

3
NO ,

4
ClO …
38

Kai tirpale yra įvairių neigiamųjų jonų, pirmiausia išsikrauna nedeguoninių rūgščių anijonai, t. y.
pirmiau išsikraus J

, po to Br

ir t. t.
Deguoninių rūgščių anijonai iš vandeninių tirpalų ant anodo neišsikrauna, nes lengviau vyksta OH


jonų (šarminiame elektrolite) arba vandens molekulių (rūgščiame arba neutraliame elektrolite) oksidacija:

4OH

− 4ē → O
2
+ 2H
2
O,
2H
2
O − 4ē → O
2
+ 4H
+
.

Šiuo atveju prie anodo skiriasi deguonis.

Darbo tikslas

Susipažinti su galvaninių elementų veikimo principais, sukonstruoti galvaninį elementą, išmatuoti jo
praktinę EVJ ir naudoti jį kaip nuolatinės srovės šaltinį elektrolitų vandeninių tirpalų elektrolizei.


Darbo eiga

a) Galvaninio elemento elektrovaros jėgos nustatymas
Sudaromas dėstytojo paskirtas galvaninis elementas iš dviejų skirtingų metalų, įmerktų į jų druskų
tirpalus (pvz.: cinko elektrodas įmerkiamas į cinko druskos tirpalą, o varis įmerkiamas į vario druskos
tirpalą). Abu tirpalai sujungiami lenktu vamzdeliu, užpildytu kalio chlorido tirpalu.
Nustatoma milivoltmetro skalės vertė ir, prijungus prie jo elektrodus, išmatuojama galvaninio elemento
elektrovaros jėga, t. y. potencialų skirtumas tarp elektrodų voltais (matavimų seka yra aprašyta atskirame
lape, kurį studentas gauna laboratorijoje).
b) Natrio sulfato tirpalo elektrolizė
Sudaryto galvaninio elemento elektrodų vielų laisvieji galai įleidžiami į U formos indelį su Na
2
SO
4

tirpalu. Į abi indelio puses įlašinama po 4–5 lašus fenolftaleino. Einant srovei per tirpalą, vyksta elektrolizė ir
fenolftaleino spalva prie vieno elektrodo pakinta.

Skaičiavimai

Apskaičiuojama sudaryto galvaninio elemento teorinė elektrovaros jėga. Abiejų metalų elektrodiniai
potencialai φ
1
ir φ
2
randami pagal Nernsto formulę (1):

c lg
n
,059 0
0
+ ϕ = ϕ ,

čia:
φ
0
– standartinis metalo potencialas (žr. 125 p. [1]),
n – metalo valentingumas,
c – druskos tirpalo, į kurį įmerktas metalas, molinė koncentracija. Tais atvejais, kai disocijuojant
elektrolitui iš vienos molekulės susidaro vienas metalo jonas, tirpalo molinė koncentracija kartu parodo ir
metalo jonų koncentraciją moliais litre.
Sudaryto galvaninio elemento teorinė elektrovaros jėga skaičiuojama pagal (2).
Gauti rezultatai surašomi į lentelę:

Galvaninio elemento schema
Elektrodiniai potencialai (V) Elektrovaros jėga (V)
φ
1
φ
2
Apskaičiuota Išmatuota

Atsiskaitymas

- parašomos galvaninio elemento anodinė ir katodinė reakcijos;
39
- parašomos Na
2
SO
4
tirpalo elektrolizės anodinė ir katodinė reakcijos, paaiškinami stebėti reiškiniai;
- užpildoma pateikto pavyzdžio lentelė.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Janickis, V. ir kt. Bendrosios ir neorganinės chemijos pagrindai. Kaunas: Technologija, 2003. 339 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.

40
12. Vandens kietis ir jo minkštinimas

Darbo tikslas

Išmokti nustatyti vandens kietį, taip pat jį suminkštinti.

Darbo priemonės ir reagentai

Biuretės, pipetės, matavimo cilindras, matavimo kolbutė,
Erlenmejerio kolbutės, grįžtamasis vandens šaldytuvas su kamščiu,
elektrinė plytelė, katijonitu užpildyta stiklinė kolonėlė.
Tirpalai: Trilono B, HCl, amoniakinis buferinis tirpalas (pH 10), metiloranžas, eriochromo juodasis T.

12a. Karbonati ni o, pastovi ojo i r bendrojo vandens ki eči o nustatymas

Darbo eiga

1. Karbonatinio vandens kiečio nustatymas
Per šį etapą nustatomas bendras vandens šarmingumas A ir pavirinto vandens šarmingumas B, likęs
pašalinus iš vandens druskas, sudarančias karbonatinį vandens kietį. Abiejų šarmingumų skirtumas ir bus
karbonatinis (laikinasis) vandens kietis.
Kad darbas vyktų sparčiau, iš pradžių matavimo kolbute tiksliai pamatuojama 100 mL tiriamo vandens,
įpilama į švarią kūginę kolbutę, užkemšama kamščiu, kuriame įstatytas šaldytuvas ir atsargiai virinama
20 min. Virinant kalcio ir magnio hidrokarbonatai suskyla į karbonatus ir nusėda, vyksta reakcijos:

Ca(HCO
3
)
2

Mg(HCO
3
)
2


Kol vanduo verda, nustatomas bendras vandens šarmingumas A. Tam tikslui į kūginę kolbutę įpilama
matavimo kolbute tiksliai pamatuota nauja 100 mL tiriamo vandens porcija, lašinami 3–4 lašai metiloranžo ir
titruojama 0,1 N HCl tirpalu, kol geltona spalva tampa oranžine. Užsirašomas titravimui sunaudotas tikslus
HCl tūris V
1
. Pirmą kartą titruojant druskos rūgštimi vyksta reakcijos:

Ca(HCO
3
)
2
+ 2HCl →
Mg(HCO
3
)
2
+ 2HCl →
NaHCO
3
+ HCl →

Jeigu dar nesibaigė nurodytas vandens virinimo laikas, galima nustatyti bendrąjį vandens kietį (žr. 2
punktą).
Pavirinus vandenį 20 min., vanduo ataušinamas iki kambario temperatūros po šalto vandens srove (sekti,
kad vandentiekio vanduo nepatektų į kolbą). Susidariusios nuosėdos nufiltruojamos. Kolbutė, kurioje buvo
virinamas vanduo, du kartus praskalaujama distiliuotu vandeniu ir šis vanduo užpilamas ant filtro. Į filtratą
įlašinami 3–4 lašai metiloranžo ir titruojama 0,1 N HCl tirpalu. Užsirašomas titravimui sunaudotas tikslus
HCl tūris V
2
. Šiuo atveju su druskos rūgštimi reaguoja vandenyje likusios šarminės medžiagos, nustatomas
likęs vandens šarmingumas B. Antrą kartą titruojant HCl, vyksta reakcija:

NaHCO
3
+ HCl →

2. Bendrojo vandens kiečio nustatymas
Į kūginę kolbutę įpilama 100 mL tiriamo vandens, pridedama 5 mL amoniakinio buferinio tirpalo
(matuoti cilindru), truputis sauso indikatoriaus eriochromo juodojo T ir, intensyviai maišant, neskubant,
titruojama trilono B tirpalu, kol rausva spalva virsta mėlyna. Pažymimas tikslus sunaudoto trilono B tūris V
3
.
3. Pastoviojo vandens kiečio nustatymas
Kadangi bendrasis vandens kietis yra laikinojo ir pastovaus vandens kiečių suma, pastovusis vandens
kietis apskaičiuojamas taip: iš bendro vandens kiečio atimamas karbonatinis kietis.
41

Skaičiavimai

1. Vandens bendrasis šarmingumas A:


V
N V
A
1000
1 1
⋅ ⋅
= ,
čia:
V – tyrimui paimtas vandens tūris (V = 100 mL),
N
1
– titravimui naudotos HCl normalingumas,
V
1
– pirmą kartą titruojant sunaudotas HCl tūris.

Vandenyje liko šarminės medžiagos B:


V
N V
B
1000
2 1
⋅ ⋅
= ,

čia:
V
2
– pavirinto vandens titravimui sunaudotas HCl tūris.

Karbonatinis kietis KK:

KK = A – B (mekv/L).

2. Bendrasis vandens kietis BK:


V
N V
BK
1000
2 3
⋅ ⋅
= (mekv/L),


čia:
V
3
– titravimui sunaudotas trilono B tūris,
N
3
– trilono B normalingumas.

3. Pastovusis vandens kietis PK:

PK = BK – KK (mekv/L).

12b. Vandens mi nkšti ni mas

Darbo eiga

Nustatomas tiriamojo vandens bendrasis kietis kompleksonometriniu metodu su Trilonu B (žr. ankščiau
aprašyto darbo punktą 2).
Kitas to paties vandens bandinys suminkštinamas: imama apie 200 mL vandens ir jis praleidžiamas per
katijonitu užpildytą stiklinę kolonėlę. Vėl nustatomas per kolonėlę praėjusio vandens kietis tuo pačiu
metodu. Apskaičiuojama, keliais miliekvivalentais sumažėjo vandens kietis.

Atsiskaitymas

- parašomos vandens titravimo ir minkštinimo reakcijos;
- pateikiamos laikinojo, pastovaus ir bendrojo vandens kiečių apskaičiuotos reikšmės, padaroma išvada
apie vandens kietį;
- atliekant 12 b darbą, pateikiamos bendrojo vandens kiečio reikšmės prieš ir po minkštinimo.

42
12c. Švaraus vandens gavi mas i r jo kokybės kontrol ė

Darbo tikslas

Susipažinti su švaraus vandens gavimo būdais, pagaminti nedidelį kiekį tokio vandens ir nustatyti jo
švarumo laipsnį.

Darbo priemonės ir reagentai

Stiklinis vandens distiliavimo įrenginys, katijonito ir anijonito mišiniu užpildyta stiklinė kolonėlė,
laidumo matuoklis, pH-metras, stiklinėlė. Reagentai ir tirpalai: 0,01 N Trilono B tirpalas, amoniakinis
buferinis tirpalas (pH 10), eriochromo juodojo T indikatorius.

Darbo eiga

Pridistiliuojama apie 200 mL vandens. Kol vyks distiliacija, išmatuojamas vandentiekio vandens
savitasis elektros laidis (SEL) (matavimų seka yra aprašyta atskirame lape, kurį studentas gauna
laboratorijoje), pH (t. p.) ir kompleksonometriniu metodu nustatomas jo bendrasis kietis (žr. 12 a darbo 2
punktą). Tos pačios analitės nustatomos distiliuotame vandenyje ir palyginami gauti rezultatai.
Vandentiekio vanduo praleidžiamas per jonitų mišinio kolonėlę ir vėl nustatomos tos pačios analitės.
Gauti rezultatai surašomi į lentelę.

Vanduo SEL, µS/cm pH Bendrasis kietis, mekv/L
Vandentiekio
Distiliuotas
Dejonizuotas

Lyginami gauti rezultatai. Kuris vanduo yra švaresnis?

Atsiskaitymas

- užpildoma pateikto pavyzdžio lentelė, padaromos išvados.

Literatūra

1. Girčienė, B. ir kt. Chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Technika, 1995. 127 p.
2. Stulpinas, B. ir kt. Bendrosios chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: Mokslas, 1985. 147 p.
3. Buinevičienė, G. ir kt. Bendroji chemija. Vilnius: Mokslas, 1991. 374 p.
4. Jankauskas, J.. Vandens chemija (paskaitų konspektas). Vilnius: Technika, 1990. 93 p.

43
13. Neorganinių ir organinių medžiagų
gryninimas

Darbo tikslas

Susipažinti su paprasčiausiais cheminių medžiagų gryninimo
metodais ir technika.

Darbo priemonės ir reagentai

Stiklinis distiliavimo įrenginys, elektrinė plytelė, areometras
(spiritometras), apvaliadugnė kolba, 400–500 mL stiklinės,
graduotas cilindras.
Reagentai: denatūruotas spiritas, jodo ir smėlio mišinys

a) Distiliavimas
Areometru išmatuojamas denatūruoto spirito tankis, o spiritometru – jo stiprumas (tūrio procentais).
Prirenkama apie 100 mL distiliato ir vėl nustatomi jo tankis ir stiprumas. Distiliuojant užfiksuojama
temperatūra, kuriai esant vyksta distiliacija, ir ji lyginama su teorine etanolio virimo temperatūra.
b) Sublimavimas (darbas atliekamas traukos spintoje)
Į 400 –500 mL sausą stiklinę įberiama apie 1 g jodo ir smėlio mišinio (pasveriama ant laboratorinių
svarstyklių 0,01 g tikslumu), ir stiklinė pastatoma ant elektrinės plytelės. Į apvaliadugnę kolbą įpilama iš
krano šalto vandens ir ji pastatoma ant stiklinės su jodo ir smėlio mišiniu. Įjungiama plytelė ir stebima, kaip
vyksta jodo sublimavimasis. Sublimavimas baigiamas, kai stiklinėje nelieka būdingos spalvos jodo garų.
Stiklinė su apvaliadugne kolba nukeliama nuo plytelės ir pastatoma ant asbesto. Ant apvaliadugnės kolbos
dugno susidarę jodo kristalai surenkami ir pasveriami. Taip pat pasveriamas ir stiklinėje likęs smėlis.
Apskaičiuojama, kiek procentų jodo ir kiek procentų smėlio buvo mišinyje.

Atsiskaitymas

- atlikto laboratorinio darbo aprašymas;
- pateikiama smėlio ir jodo mišinio procentinė sudėtis;
- etilo alkoholio praktinė virimo temperatūra.

Literatūra

1. Daukšas, K.; Ramanauskas, E. Neorganinė sintezė. Vilnius: Mintis, 1970. 203 p.
2. Семишин, В. Лабораторные работы по общей химии. Москва: Высшая школа, 1971. 272 с.
44
A An na al li iz zi in nė ė c ch he em mi ij ja a
Laboratoriniai darbai
Žana Bumelienė, Rūta Gražėnienė, Juozas Jankauskas

Analizinių operacijų atlikimo technika ir priemonės

Kokybinė analizė – tai įvairių metodų taikymas cheminei medžiagai identifikuoti. Neorganinė kokybinė
analizė nagrinėja katijonų (teigiamųjų) ir anijonų (neigiamųjų) jonų radimą. Išmokus atlikti pavieniams
jonams būdingas reakcijas, galima analizuoti katijonų ir anijonų mišinius.
Analizinės reakcijos atliekamos pridedant į tiriamąjį tirpalą reagentų, sudarančių su ieškomuoju jonu
būdingus produktus. Šios reakcijos vadinamos būdingosiomis jono reakcijomis. Jas galima atlikti
mėgintuvėliuose, lašų arba mikrokristaloskopiniu metodais.
Mikrokristaloskopinės reakcijos. Ant objektinio stiklelio tiriamojo tirpalo lašas sumaišomas su
reagento lašu ir susidarę kristalai stebimi pro mikroskopą. Būdingiausi kristalai gaunami, kai jie formuojasi
lėtai. Lašai ant objektinio stiklelio dedami vienas šalia kito ir, perbraukiant stikline lazdele, sujungiami.
Lašų reakcijos atliekamos ant filtravimo popieriaus lapelių lašinant tiriamojo tirpalo ir reagento
lašelius.
Kokybinei analizei dažniausiai taikomos tokios operacijos: šildymas ir garinimas, nuosėdų nusodinimas,
jų atskyrimas nuo tirpalo, centrifugavimas, nuosėdų perplovimas, nuosėdų tirpinimas.
Šildant ir garinant naudojamos spiritinės lemputės, elektrinės plytelės bei vandens vonios. Dažniausiai
šildoma centrifuginiuose mėgintuvėliuose, panardinant juos į vandens vonią. Atliekant analizę, tirpalą dažnai
reikia koncentruoti (sumažinti jo tūrį) arba jį sausai išgarinti. Tam naudojamos porcelianinės lėkštelės, tigliai
arba laikrodinis stiklas. Jeigu skystį reikia išgarinti sausai, šildymas nutraukiamas dar prieš baigiant skysčiui
visiškai išgaruoti, nes stiklelis gali skilti.
Nusodinimas atliekamas centrifuginiuose mėgintuvėliuose. Į mėgintuvėlį įpilamas reikalingas tiriamojo
tirpalo kiekis. Preliminariai, iš vadovėlio susipažinus su nusodinimo reakcijos atlikimo sąlygomis, sudaroma
atitinkama terpė ir temperatūra. Terpės reakcija patikrinama indikatoriaus popierėliu: analizuojamas tirpalas
pamaišomas stikline lazdele ir šios šlapios lazdelės galu paliečiamas indikatoriaus popierėlis. Mėgintuvėlis
su tirpalu, jeigu reikia, 3–5 min. panardinamas į vandens vonią (pašildomas). Paskui, maišant tirpalą, į jį
lašinamas nusodinantis reagentas, kol nebesusidaro nuosėdos. Nuosėdoms leidžiama nusėsti arba jos
centrifuguojamos. Jeigu, dar pridėjus nusodinančio reagento tirpalo lašą, virš nuosėdų esantis skaidrus
skystis nesidrumsčia, daroma išvada, kad jonai yra visiškai nusodinti.
Centrifugavimas. Nuosėdos atskiriamos nuo tirpalo filtruojant arba centrifuguojant. Į centrifugą vienas
priešais kitą dedamas porinis skaičius vienodų matmenų kūginių mėgintuvėlių. Į juos turi būti pripilti vienodi
tirpalų kiekiai, paliekant ne mažiau kaip 10 mm iki mėgintuvėlio viršaus. Įpylus daugiau skysčio, jis gali
išsitaškyti bei užteršti greta esančius mėgintuvėlius ir centrifugą. Centrifuguojama 1–2 minutes. Išjungus
centrifugą, būtina palaukti, kol rotorius su mėgintuvėliais visiškai sustos, ir tada mėgintuvėlius išimti.
Negalima mėgintuvėlių palikti centrifugoje, nes taip ji gadinama.
Po centrifugavimo nuosėdos susikaupia mėgintuvėlio dugne. Skaidrus skystis virš nuosėdų vadinamas
centrifugatu. Jeigu nuosėdos būna labai gerai nusėdusios, centrifugatą galima nusiurbti pipete arba atsargiai
perpilti į kitą švarų mėgintuvėlį. Skysčio nupilimas nuo nuosėdų vadinamas dekantavimu.
Nuosėdų perplovimas. Ant nuosėdų užpilama perplauti naudojamo skysčio, stikline lazdele gerai
sumaišoma ir centrifuguojama. Centrifugatas išpilamas. Taip nuosėdos perplaunamos 2–3 kartus, naudojant
vis naują plovimo skysčio porciją.

45
1. I ir II analizinių grupių katijonų mišinio analizė

Darbo tikslas

I ir II analizinių grupių katijonų pusiau mikroanalizė rūgščių ir bazių
metodu. Katijonams būdingų cheminių reakcijų užrašymas. Pavienės katijonų
radimo reakcijos. I ir II analizinių grupių katijonų mišinio analizė.

Tyrimo objektas

Pirmoji analizinė katijonų grupė: Na
+
, K
+
, NH
4
+
, Mg
2+
. Grupinio reagento
neturi.
Antroji analizinė katijonų grupė: Ba
2+
, Ca
2+
. Grupinis reagentas yra praskiesta sieros rūgštis.
Analizuojant tik I−II grupes, grupiniu reagentu gali būti ir (NH
4
)
2
CO
3
.
I ir II analizinių grupių katijonų mišinio tirpalas.

Darbo priemonės

Cilindrinis ir kūginis mėgintuvėliai; laikrodinis ir objektinis stikleliai; kapiliarinės pipetės; filtravimo
popieriaus lapeliai; vandens šildymo vonia; stiklinė mentelė; mikroskopas; centrifuga.

Skirstant sudėtingą analizuojamąjį mišinį į atskiras analizines grupes rūgščių ir bazių metodu, kaip
pagrindas imama katijonų sąveika su sieros ir druskos rūgštimis, susidarant netirpiems junginiams, sąveika
su šarmais ir amoniaku, susidarant tipiškiems arba amfoteriškiems hidroksidams, arba remiamasi pavienių
katijonų savybe sudaryti su amoniaku kompleksinius junginius. Pagal tai, kaip katijonai reaguoja su
rūgštimis ir šarmais, jie skirstomi į 6 grupes (1 lentelė).

1 lentelė. Katijonų skirstymas į analizines grupes rūgščių ir bazių metodu

Grupės
charak-
teristika
Vandenyje
tirpūs
chloridai,
sulfatai ir
hidroksidai
Vandenyje
netirpūs
sulfatai
Vandenyje
netirpūs
chloridai
Amfoteriniai
hidroksidai,
tirpūs šarmų
pertekliuje
Hidroksidai,
netirpūs šarmų
pertekliuje
Hidroksidai,
tirpūs amoniako
pertekliuje
Grupė ir
katijono
simbolis
Pirma
Na
+
, K
+
,
NH
4
+
, Mg
2+

Antra
Ba
2+
, Ca
2+
,
Sr
2+

Trečia
Ag
+
, Pb
2+
,
+ 2
2
Hg
Ketvirta
Zn
2+
, Al
3+
, Cr
3+
,
Sn
2+
, Sn
4+
, As
3+
,
As
5+

Penkta
Mn
2+
, Fe
2+
,
Fe
3+
, Bi
3+
,
Sb
3+
, Sb
5+

Šešta
Ni
2+
, Co
2+
, Cu
2+
,
Cd
2+
, Hg
2+

Grupinis
reagentas
Nėra H
2
SO
4
,
(NH
4
)
2
CO
3

HCl NaOH, H
2
O
2
NH
3
, H
2
O
2
NH
3
, H
2
O
2

Susidarę
junginiai
– BaSO
4
,
CaSO
4
,
SrSO
4

AgCl,
Hg
2
Cl
2
,
PbCl
2

[Al(OH)
4
]

,
[Zn(OH)
4
]
2–
,
− 2
4
CrO ,
[Sn(OH)
6
]
2–
,
− 3
4
AsO
Mn(OH)
2
,
Bi(OH)
3
,
Fe(OH)
3
,
Sb(OH)
3
,
H
3
SbO
4

[Co(NH
3
)
6
]
2+
,
[Ni(NH
3
)
6
]
2+
,
[Cu(NH
3
)
4
]
2+
,
[Cd(NH
3
)
4
]
2+
,
[Hg(NH
3
)
4
]
2+


Darbo eiga

Parašomos būdingosios katijonų (2 lentelė, Nr. 3) radimo cheminės reakcijos (2 lentelė, Nr. 4). Paskui
atliekamos pavienės katijonų radimo reakcijos (2 lentelė, Nr. 5). Toliau atliekama I ir II grupių katijonų
nežinomos sudėties mišinio analizė (2 lentelė, Nr. 5, 4).

46
2 lentelė. I ir II analizinių grupių katijonų radimo analiziniai signalai

Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais
reagentais cheminės reakcijos ir
analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

I


nėra


+
4
NH

+
4
NH + NaOH →
NH
3
↑ + H
2
O →

lakmuso popierėlis
pamėlynuoja
Reakcija su natrio šarmu
Į mėgintuvėlį įlašinami 4 lašai
tiriamojo tirpalo, pridedami 5
lašai 2 N NaOH tirpalo.
Mėgintuvėlis atsargiai
pašildomas vandens vonelėje.
Virš mėgintuvėlio laikoma
distiliuotu vandeniu suvilgyta
raudonojo lakmuso juostelė.
Jeigu tirpale yra
+
4
NH

jonų,
lakmuso juostelė pamėlynuoja.
Uostant jaučiamas išsiskiriančio
amoniako kvapas.

I

nėra

K
+


4
+
4
NH + 6CH
2
O →


2K
+
+ Na
2
[PbCu(NO
2
)
6
] →

kubo formos juodi
arba rudi kristalai



Pastaba. Amonio jonai trukdo
nustatyti K
+
jonus
mikrokristaloskopine reakcija. Todėl
naudojamasi formaldehido savybe
sujungti amonio jonus į urotropiną
(CH
2
)
6
N
4
. Į 5 lašus tiriamojo tirpalo
pridedami 4 lašai formalino tirpalo.

Mikrokristaloskopinė reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas lašas tiriamojo
tirpalo ir greta lašas dinatrio-
švino-vario heksanitrito tirpalo.
Abu lašai stikline lazdele
sujungiami ir, jeigu tirpale yra K
+

jonų, po kurio laiko susidaro pro
mikroskopą matomi juodi arba
rudi kubo formos
K
2
[PbCu(NO
2
)
6
] kristalai.

I

nėra

Na
+


Na
+
+
Zn(CH
3
COO)
2
·3UO
2
(CH
3
COO)
2
+
CH
3
COOH + 9H
2
O →

šviesiai geltoni tetraedrų arba
oktaedrų formos kristalai


Mikrokristaloskopinė reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas lašas tiriamojo
tirpalo ir greta lašas cinko uranilo
acetato tirpalo, parūgštinto acto
rūgštimi. Abu lašai stikline
lazdele sujungiami ir, jeigu
tirpale yra Na
+
jonų, po kurio
laiko susidaro pro mikroskopą
matomi šviesiai geltoni tetraedrų
arba oktaedrų formos natrio
cinko uranilo acetato
NaZn(UO
2
)
3
(CH
3
COO)
9
· 9H
2
O
kristalai.
Pastaba. Jei tiriamoje medžiagoje
yra K
+
, gali susidaryti ilgų adatų
pavidalo kristalai. Tokiu atveju
47
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais
reagentais cheminės reakcijos ir
analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5
patartina dalį tiriamojo tirpalo 2–3
kartus praskiesti vandeniu ir tuomet
atlikti reakciją.

I

nėra

Mg
2+


Mg
2+
+ Na
2
HPO
4
+ NH
4
OH →

baltos kristalinės
nuosėdos


kristalai
praskiestame
tirpale (lėta
kristalizacija)
kristalai
koncentruotame
tirpale (greita
kristalizacija
Reakcija su dinatrio
hidrofosfatu
Ant objektinio stiklelio
užlašinami 1–2 lašai tiriamojo
tirpalo, pridedami 2–3 lašai
2 M HCl, 1 lašas 1 M dinatrio
hidrofosfato tirpalo ir, atsargiai
maišant stikline lazdele,
pridedamas 2 M NH
3
iki
jaučiamo amoniako kvapo
(pH ~ 9). Jeigu tirpale yra Mg
2+

jonų, susidaro baltos magnio
amonio fosfato
MgNH
4
PO
4
· 6H
2
O kristalinės
nuosėdos, kurios stebimos
mikroskopu.

II

H
2
SO
4
,
(NH
4
)
2
CO
3


Ba
2+


2Ba
2+
+ K
2
Cr
2
O
7
+ H
2
O +
2CH
3
COONa →

geltonos nuosėdos

Reakcija su kalio dichromatu
Į mėgintuvėlį įlašinami 1–2 lašai
tiriamojo tirpalo, 3–4 lašai natrio
acetato ir 1–2 lašai K
2
Cr
2
O
7
.
Mėgintuvėlis šildomas vandens
vonioje. Jeigu tirpale yra Ba
2+

jonų, susidaro bario chromato
BaCrO
4
geltonos nuosėdos.
Pastaba. BaCrO
4
tirpsta rūgštyse
(netirpsta acto rūgštyje), todėl,
atliekant reakciją, būtina pridėti
CH
3
COONa, kad laisvi H
+
jonai
būtų sujungti į silpnos acto rūgšties
molekules.

II

(NH
4
)
2
CO
3

H
2
SO
4


Ca
2+


Ca
2+
+ (NH
4
)
2
C
2
O
4


baltos nuosėdos






Ca
2+
+ H
2
SO
4
+ H
2
O →

baltos adatėlių arba rombo
bei suaugusių dvynių
formos kristalai
Reakcija su amonio oksalatu
Į mėgintuvėlį įlašinami 1–2 lašai
tiriamojo tirpalo, pridedami 3–4
lašai 6 M NH
3
ir 2 lašai amonio
oksalato tirpalo. Jeigu tirpale yra
Ca
2+
jonų, išsiskiria baltos kalcio
oksalato CaC
2
O
4
nuosėdos.
Nuosėdos tirpsta stipriose
rūgštyse, netirpsta acto rūgštyje.
Pastaba. Trukdo Ba
2+
jonai.

BaC
2
O
4

nuosėdos tirpsta acto rūgštyje.

Mikrokristaloskopinė reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas lašas tiriamojo
tirpalo ir greta lašas 2 N sieros
rūgšties tirpalo. Abu lašai
stikline lazdele sujungiami ir
48
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais
reagentais cheminės reakcijos ir
analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

kristalai
praskiestame
tirpale (lėta
kristalizacija)
kristalai
koncentruotame
tirpale (greita
kristalizacija)
paliekama pastovėti. Jeigu tirpale
yra nedaug Ca
2+
jonų, išsiskiria
ilgos pro mikroskopą matomos
CaSO
4
· 2H
2
O gipso adatėlės, o
jei daugiau, susidaro rombai arba
suaugę dvyniai.

Atsiskaitymas

- parašomos būdingosios katijonų radimo cheminės reakcijos;
- I ir II grupių katijonų nežinomos sudėties mišinio analizės rezultatai užrašomi 3 lentelėje pateikta forma:

3 lentelė. I ir II analizinių grupių katijonų mišinio analizė

Analizinė
grupė,
reagentas
Katijonų radimo būdingais
reagentais cheminės reakcijos ir
analiziniai signalai
Reakcijos atlikimo sąlygos Pastebėjimai
Atpažintas
katijonas
I
Na
2
HPO
4
,

NH
3

Mg
2+
+ Na
2
HPO
4
+ NH
3

MgNH
4
PO
4
↓ + 2Na
+

baltos
kristalinės
nuosėdos
Reakcija vyksta
amoniakinio buferio
terpėje.
Trukdo jonai, sudarantys
mažai tirpius fosfatus.
Netrukdo jonai:
+
4
NH , K
+
,
Na
+

Susidaro baltos
kristalinės
nuosėdos
Mg
2+


Literatūra

1. Daukšas, K. Kokybinė analizė. Vilnius: Mintis, 1965. 319 p.
2. Škadauskas, J. Katijonų ir anijonų radimas tirpaluose. Mokomoji priemonė. Vilnius: VU, 1997,
p. 10–14, 20–24.
3. Фадеева, В. И.; Шеховцова, Т. Н.; Иванова, В. М. и др. Основы аналитической химии.
Практическое руководство: Учеб. пособие для вузов. Москва: Bыс. шк., 2001, c. 16–29.

49
2. III ir IV analizinių grupių katijonų mišinio analizė

Darbo tikslas

III ir IV analizinių grupių katijonų pusiau mikroanalizė rūgščių ir bazių metodu.
Katijonų būdingų cheminių reakcijų rašymas. Pavienės katijonų radimo reakcijos. III
ir IV analizinių grupių katijonų mišinio analizė.

Tyrimo objektas

Trečioji analizinė katijonų grupė: Ag
+
, Pb
2+
,
+ 2
2
Hg . Grupinis reagentas yra praskiesta druskos rūgštis,
su kuria šie katijonai sudaro mažai tirpias vandenyje chloridų nuosėdas: AgCl, PbCl
2
, Hg
2
Cl
2
. Taip III
analizinė katijonų grupė atskiriama nuo IV.
Ketvirtoji analizinė katijonų grupė: Al
3+
, Cr
3+
, Zn
2+
. Tai amfoterinių metalų katijonai, kurių hidroksidai
šarmų pertekliuje sudaro vandenyje tirpias druskas: NaAlO
2
, NaCrO
2
, Na
2
ZnO
2
.
III ir IV analizinių grupių katijonų mišinio tirpalas.

Darbo priemonės

Cilindrinis ir kūginis mėgintuvėliai; laikrodinis ir objektinis stikleliai; kapiliarinės pipetės; filtravimo
popieriaus lapeliai; vandens šildymo vonia; stiklinė mentelė; mikroskopas; centrifuga.

Kokybinė analizė – tai įvairių metodų taikymas cheminei medžiagai identifikuoti. Neorganinė kokybinė
analizė nagrinėja katijonų (teigiamųjų) ir anijonų (neigiamųjų) jonų radimą.
Skirstant sudėtingą analizuojamąjį mišinį į atskiras analizines grupes rūgščių ir bazių metodu, kaip
pagrindas imama katijonų sąveika su sieros ir druskos rūgštimi, susidarant netirpiems junginiams, sąveika su
šarmais ir amoniaku, susidarant tipiškiems arba amfoteriškiems hidroksidams, arba remiamasi atskirų
katijonų savybe sudaryti su amoniaku kompleksinius junginius. Pagal tai, kaip katijonai reaguoja su
rūgštimis ir šarmais, jie skirstomi į 6 grupes (1 lentelė).

1 lentelė. Katijonų skirstymas į analizines grupes rūgščių ir bazių metodu

Grupės
charak-
teristika
Vandenyje
tirpūs chloridai,
sulfatai ir
hidroksidai
Vandenyje
netirpūs
sulfatai
Vandenyje
netirpūs
chloridai
Amfoteriniai
hidroksidai,
tirpūs šarmų
pertekliuje
Hidroksidai,
netirpūs šarmų
pertekliuje
Hidroksidai,
tirpūs amoniako
pertekliuje
Grupė ir
katijono
simbolis
Pirma
Na
+
, K
+
,
+
4
NH ,
Mg
2+

Antra
Ba
2+
, Ca
2+
,
Sr
2+

Trečia
Ag
+
, Pb
2+
,
+ 2
2
Hg
Ketvirta
Zn
2+
, Al
3+
, Cr
3+
,
Sn
2+
, Sn
4+
, As
3+
,
As
5+

Penkta
Mn
2+
, Bi
3+
, Fe
2+

Fe
3+
, Sb
3+
, Sb
5+

Šešta
Ni
2+
, Co
2+
, Cu
2+
,
Cd
2+
, Hg
2+

Grupinis
reagentas
Nėra H
2
SO
4,
(NH
4
)
2
CO
3

HCl NaOH,
H
2
O
2

NH
3
, H
2
O
2
NH
3
, H
2
O
2

Susidarę
junginiai
– BaSO
4
,
CaSO
4
, SrSO
4
AgCl,
Hg
2
Cl
2
,
PbCl
2

[Al(OH)
4
]

,
[Zn(OH)
4
]
2–
,
− 2
4
CrO ,
[Sn(OH)
6
]
2–
,

− 3
4
AsO
Mn(OH)
2
,
Bi(OH)
3
,
Fe(OH)
3
,
Sb(OH)
3
,
H
3
SbO
4

[Co(NH
3
)
6
]
2+
,
[Ni(NH
3
)
6
]
2+
,
[Cu(NH
3
)
4
]
2+
,
[Cd(NH
3
)
4
]
2+
,
[Hg(NH
3
)
4
]
2+


Darbo eiga

Parašomos būdingosios katijonų (2 lentelė, Nr. 3) radimo cheminės reakcijos (2 lentelė, Nr. 4). Tada
atliekamos pavienės katijonų radimo reakcijos (2 lentelė, Nr. 5). Toliau atliekama III ir IV grupių katijonų
nežinomos sudėties mišinio analizė (2 lentelė, Nr. 5, 4).
50
III analizinės grupės atskyrimas nuo IV. Į centrifuginį mėgintuvėlį įpilama 3 mL tiriamojo tirpalo ir
III grupė nusodinama praskiesta 2 N HCl. Vyksta reakcijos:

Ag
+
+ HCl →

+ 2
2
Hg + HCl →
Pb
2+
+ HCl →

Gautos nuosėdos (AgCl, PbCl
2
, Hg
2
Cl
2
) centrifuguojamos ir 1–2 kartus perplaunamos šaltu distiliuotu
vandeniu, į kurį įlašinama pora lašų 2 M HCl.
Gautas centrifugatas, kuriame yra IV grupė, paliekamas tolesnei analizei.

2 lentelė. III ir IV analizinių grupių katijonų radimo analiziniai signalai

Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

III

HCl

Pb
2+











2Pb
2+
+ K
2
Cr
2
O
7
+ H
2
O →

geltonos nuosėdos
Nuosėdų analizė. Pb
2+
radimas
Nuosėdos mėgintuvėlyje
užpilamos distiliuotu vandeniu ir,
retkarčiais maišant, šildomos
vandens vonioje. PbCl
2
tirpsta
karštame vandenyje. Keli lašai
karšto tirpalo, esančio virš
nuosėdų, pipete perkeliami į kitą
mėgintuvėli ir tirpale ieškomas
Pb
2+
jonas.
Reakcija su kalio dichromatu
Į mėgintuvėlį įlašinami 2–3 lašai
tiriamojo tirpalo ir 2–3 lašai
K
2
Cr
2
O
7
. Jeigu tirpale yra Pb
2+

jonų, susidaro mažai tirpios
geltonos švino chromato PbCrO
4

nuosėdos.

III

HCl

+ 2
2
Hg

+
4
NH + H
2
O = NH
3
+ H
3
O
+


Hg
2
Cl
2
+2NH
3


nuosėdos pajuoduoja

Nuosėdų analizė.
+ 2
2
Hg
radimas
Likusios mėgintuvėlyje Hg
2
Cl
2

nuosėdos užpilamos 6 N NH
3
pertekliumi ir šildoma vandens
vonioje. Jeigu tirpale yra
+ 2
2
Hg
jonų, susidaro mišinys: juodos
Hg ir HgNH
2
Cl nuosėdos.

III

HCl

Ag
+

+
4
NH + H
2
O = NH
3
+ H
3
O
+


AgCl + 2NH
3
+ →


[Ag(NH
3
)
2
]Cl + KI + 2H
2
O →

šviesiai
geltonos
nuosėdos

Ag
+
radimas
AgCl nuosėdos tirpsta
koncentruotame amoniake.
Reakcija su kalio jodidu
Gautą junginį ([Ag(NH
3
)
2
]Cl)
paveikiame KI tirpalu. Susidaro
šviesiai geltonos AgI nuosėdos.
Pastaba. Jeigu chloridų nuosėdos
nuo NH
3
+ H
2
O pajuodavo, o
sidabro rasti būdingomis reakcijomis
nepavyko, jo reikia ieškoti juodose
nuosėdose.
51
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

IV

NaOH,
H
2
O
2





Al
3+

Al
3+
+ NaOH + H
2
O
2

Zn
2+
+ NaOH + H
2
O
2

Cr
3+
+ NaOH + H
2
O
2


Al
3+
+ C
14
H
6
O
2
(OH)
2
→ raudonos
spalvos aliuminio lakas

Centrifugato analizė

Reakcija su alizarinu
Reagentas su Al
3+
jonais sudaro
raudonos spalvos junginį,
netirpstantį acto rūgštyje. Ant
filtravimo popieriaus lapelio
užlašinamas tiriamojo tirpalo
lašas ir gauta dėmė 1–3 min.
laikoma virš indo, kuriame yra
koncentruotas amoniako tirpalas,
kad susidarytų aliuminio
hidroksidas. Paskui greta dėmės
lašinamas alizarino spiritinio
tirpalo lašas. Vėl palaikoma
amoniako garuose. Esant Al
3+
jonams, lašų susilietimo vietoje
atsiranda raudona dėmė.
Pastaba. Reakcija nėra specifinė.
Al
3+
surasti šiuo reagentu trukdo
Sn
2+
, Fe
3+
, Zn
2+
. Norint pašalinti jų
įtaką, į keletą tiriamojo tirpalo lašų
pridedama 2 M NaOH iki stipriai
šarminės reakcijos. Jeigu išsiskiria
nuosėdų, jos centrifuguojamos,
centrifugate ieškoma Al
3+
jonų.

IV

NaOH,
H
2
O
2


Zn
2+


Zn
2+
+ (NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
] →

balti kristalai



kristalai
koncentruotame
tirpale (greita
kristalizacija)
kristalai
praskiestame
tirpale (lėta
kristalizacija)
Mikrokristaloskopinė reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas acto rūgštimi
parūgštinto tiriamojo tirpalo
lašas ir amonio tetrarodano
merkurato (NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
]
tirpalo lašas. Abu lašai stikline
lazdele sujungiami ir, jeigu
tirpale yra Zn
2+
jonų, po kurio
laiko susidaro pro mikroskopą
matomi balti cinko tetrarodano
merkurato Zn[Hg(SCN)
4
]
kristalai.
Pastaba. Jei tiriamosios medžiagos
tirpale yra Cu
2+
arba Co
2+
jonų,
nurodytu reagentu ieškant cinko,
gali iškristi sudėtingesnių junginių
nuosėdos:
Cu[Hg(SCN)
4
] · Zn[Hg(SCN)
4
]
rausvai žalsvos spalvos,
Co[Hg(SCN)
4
] · Zn[Hg(SCN)
4
]
violetinės, žydros spalvos.

IV

NaOH,
H
2
O
2


Cr
3+


2NaCrO
2
+ 3H
2
O
2
+ 2NaOH →

geltonos spalvos tirpalas
Reakcija su vandenilio arba
natrio peroksidu
Į mėgintuvėlį įlašinami 2–3 lašai
tiriamojo tirpalo, pridedami 4–5
lašai 2 M NaOH, 6–8 lašai 3 %
52
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5
H
2
O
2
tirpalo ir pašildoma, kol
žalsva tirpalo spalva pereina į
geltoną, būdingą
− 2
4
CrO jonui.

Atsiskaitymas

- parašomos būdingosios katijonų radimo cheminės reakcijos;
- III ir IV grupių katijonų nežinomos sudėties mišinio analizės rezultatai užrašomi 3 lentelėje pateikta
forma:

3 lentelė. III ir IV analizinių grupių katijonų mišinio analizė

Analizinė
grupė,
reagentas
Katijonų radimo būdingais
reagentais cheminės reakcijos
ir analiziniai signalai
Reakcijos atlikimo sąlygos

Pastebėjimai
Atpažintas
katijonas
III
HCl
2Pb
2+
+ H
2
O + K
2
Cr
2
O
7

2PbCrO
4
↓ + 2K
+
+ 2H
+

geltonos
nuosėdos

Reakcijai trukdo Ba
2+
, Sr
2+
,
Bi
3+
, Hg
2+
, Ag
+
jonai, kurie
su chromato jonais sudaro
spalvotas nuosėdas
Susidaro mažai
tirpios geltonos
švino chromato
nuosėdos
Pb
2+


Literatūra

1. Daukšas, K. Kokybinė analizė. Vilnius: Mintis, 1965. 319 p.
2. Škadauskas, J. Katijonų ir anijonų radimas tirpaluose. Mokomoji priemonė. Vilnius: VU, 1997.
p. 14–19, 24–32.
3. Фадеева, В. И. ; Шеховцова, Т. Н.; Иванова, В. М. и др. Основы аналитической химии.
Практическое руководство: Учеб. пособие для вузов. Москва: Bыс. шк., 2001, c. 29–50.

53
3. V ir VI analizinių grupių katijonų mišinio analizė

Darbo tikslas

V ir VI analizinių grupių katijonų pusiau mikroanalizė rūgščių ir bazių
metodu. Parašyti katijonų chemines reakcijas su būdingais reagentais.
Pavienės katijonų radimo reakcijos. V ir VI analizinių grupių katijonų
mišinio analizė.

Tyrimo objektas

Penktoji analizinė katijonų grupė: Fe
3+
, Mn
2+
. Grupinis reagentas – NH
4
OH ir H
2
O
2
, su kuriais
šie katijonai sudaro hidroksidus, netirpstančius nei stiprių, nei silpnų bazių tirpaluose. Tokiu būdu
V katijonų analizinė grupė atskiriama nuo VI.
Šeštoji analizinė katijonų grupė: Cu
2+
, Co
2+
, Ni
2+
. Šios grupės katijonų hidroksidai tirpsta
amoniako pertekliuje, susidarant amoniakiniams kompleksams.
V ir VI analizinių grupių katijonų mišinio tirpalas.

Darbo priemonės

Cilindrinis ir kūginis mėgintuvėliai; laikrodinis ir objektinis stikleliai; kapiliarinės pipetės; filtravimo
popieriaus lapeliai; vandens šildymo vonia; stiklinė mentelė; mikroskopas; centrifuga.

Kokybinė analizė – tai įvairių metodų taikymas cheminei medžiagai identifikuoti. Neorganinė kokybinė
analizė nagrinėja katijonų (teigiamųjų) ir anijonų (neigiamųjų) jonų radimą.
Skirstant sudėtingą tiriamąjį mišinį į atskiras analizines grupes rūgščių ir bazių metodu, kaip pagrindas
imama katijonų sąveika su sieros ir druskos rūgštimi, susidarant netirpiems junginiams, sąveika su šarmais ir
amoniaku, susidarant tipiškiems arba amfoteriškiems hidroksidams, arba remiamasi kai kurių katijonų
savybe sudaryti su amoniaku kompleksinius junginius. Pagal tai, kaip katijonai reaguoja su rūgštimis ir
šarmais, jie skirstomi į 6 grupes (1 lentelė).

1 lentelė. Katijonų skirstymas į analizines grupes rūgščių ir bazių metodu

Grupės
charakte-
ristika
Vandenyje
tirpūs chloridai,
sulfatai ir
hidroksidai
Vandenyje
netirpūs
sulfatai
Vandenyje
netirpūs
chloridai
Amfoteriniai
hidroksidai,
tirpūs šarmų
pertekliuje
Hidroksidai,
netirpūs šarmų
pertekliuje
Hidroksidai,
tirpūs amoniako
pertekliuje
Grupė ir
katijono
simbolis
Pirma
Na
+
, K
+
,
+
4
NH ,
Mg
2+

Antra
Ba
2+
, Ca
2+
,
Sr
2+

Trečia
Ag
+
, Pb
2+
,
+ 2
2
Hg
Ketvirta
Zn
2+
, Al
3+
, Cr
3+
,
Sn
2+
, Sn
4+
, As
3+
,
As
5+

Penkta
Mn
2+
, Fe
2+
,
Fe
3+
, Bi
3+
, Sb
3+
,
Sb
5+

Šešta
Ni
2+
, Co
2+
, Cu
2+
,
Cd
2+
, Hg
2+

Grupinis
reagentas
Nėra
H
2
SO
4,
(NH
4
)
2
CO
3

HCl NaOH + H
2
O
2
NH
3
+ H
2
O
2
NH
3
+ H
2
O
2

Susidarę
junginiai

BaSO
4
,
CaSO
4
,
SrSO
4

AgCl,
Hg
2
Cl
2
,
PbCl
2

[Al(OH)
4
]

,
[Zn(OH)
4
]
2–
,
− 2
4
CrO ,
[Sn(OH)
6
]
2–
,
− 3
4
AsO
Mn(OH)
2
,
Bi(OH)
3
,
Fe(OH)
3
,
Sb(OH)
3
,
H
3
SbO
4

[Co(NH
3
)
6
]
2+
,
[Ni(NH
3
)
6
]
2+
,
[Cu(NH
3
)
4
]
2+
,
[Cd(NH
3
)
4
]
2+
,
[Hg(NH
3
)
4
]
2+


54
Darbo eiga

Parašomos būdingosios katijonų (2 lentelė, Nr. 3) radimo cheminės reakcijos (2 lentelė, Nr. 4). Paskui
atliekamos pavienės katijonų radimo reakcijos (2 lentelė, Nr. 5). Toliau atliekama V ir VI grupių katijonų
nežinomos sudėties mišinio analizė (2 lentelė, Nr. 5, 4).
V analizinės grupės katijonai trukdo VI grupės katijonams nustatyti. Todėl prieš analizuojant mišinį,
grupes reikia atskirti.
V analizinės grupės atskyrimas nuo VI. Į centrifuginį mėgintuvėlį įpilama 3 mL tiriamo tirpalo ir,
maišant stikline lazdele, lašinamas 6 N NH
4
OH tirpalas tol, kol virš nuosėdų atsiranda mėlynas skaidrus
tirpalas. Centrifuguojama. Nuosėdose gali būti Fe(OH)
3
ir Mn(OH)
2
, centrifugate – VI analizinės grupės
katijonų amoniakiniai kompleksiniai junginiai. Fe
3+
ir Mn
2+
galima nustatyti pradiniame tirpale arba
ištirpinus nuosėdas 2 N HCl tirpale.

2 lentelė. V ir VI analizinių grupių katijonų radimo analiziniai signalai

Analizi-

grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

V

NH
3
, H
2
O
2


Fe
3+


Fe
3+
+ 3NH
4
SCN →

raudonos spalvos tirpalas









Fe
3+
+ K
4
[Fe(CN)
6
] →

Berlyno mėlynasis
Reakcija su kalio arba
amonio tiocianatais
Ant filtravimo popieriaus
užlašinamas tiriamojo
tirpalo lašas ir greta dėmės
dedamas amonio (kalio)
tiocianato (rodanido) lašas.
Esant Fe
3+
jonams, lašų
susilietimo vietoje atsiranda
raudona geležies tiocianato
Fe(SCN)
3
dėmė.
Reakcija su kalio
heksacianoferatu (II)
Keli lašai tiriamojo tirpalo
veikiami keliais lašais kalio
heksacianoferato (II)
K
4
[Fe(CN)
6
]. Jeigu tirpale
yra Fe
3+
jonų, susidaro
amorfinės mėlynos
nuosėdos (Berlyno
mėlynasis).

V

NH
3
, H
2
O
2



Mn
2+


2Mn
2+
+ 5NaBiO
3
+ 16HNO
3


violetinė
permanganato
spalva

Reakcija su natrio
bismutatu
Į mėgintuvėlį įlašinami 1–2
lašai tiriamo tirpalo, 2–3
lašai 6 N HNO
3
tirpalo, 5–8
lašai vandens, tada špateliu
įberiama truputis NaBiO
3
miltelių, supurtoma ir
paliekama stovėti. Jeigu
tirpale yra Mn
2+
jonų,
praėjus kelioms minutėms
tirpalas pasidaro raudonai
violetinis.
Pastaba. Reakcijai gali kenkti
Cl

ir Br

jonai, kurie suardo
55
Analizi-

grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5
permanganatą.

VI

NH
3
, H
2
O
2


Co
2+


Co
2+
+ (NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
] →

mėlyni kristalai










Co
2+
+ 7KNO
2
+ 2CH
3
COOH →

geltonos nuosėdos
Mikrokristaloskopinė
reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas silpnai
parūgštinto (2 N HCl)
tiriamo tirpalo lašas, greta
jo – lašas amonio
tetratiocianomerkurato
(NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
] tirpalo.
Abu lašai stikline lazdele
sujungiami ir, jeigu tirpale
yra Co
2+
jonų, po kurio
laiko susidaro pro
mikroskopą matomi mėlyni
kobalto tetratiociano
merkurato Co[Hg(SCN)
4
]
kristalai.
Pastaba. Su Cu
2+
jonais
(NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
] sudaro
geltonai žalias kristalines
nuosėdas
Cu[Hg(SCN)
4
] · H
2
O.
Reakcija su kalio nitritu
acto rūgšties terpėje
Į kelis lašus tiriamojo
tirpalo įlašinamas 1 lašas
koncentruotosios acto
rūgšties ir įberiama apie
0,1 g KNO
2
. Maišoma, kol
KNO
2
ištirpsta. Jeigu
tirpale yra Co
2+
jonų,
iškrenta geltonos trikalio
heksanitritokobaltato (III)
K
3
[Co(NO
2
)
6
] nuosėdos.

VI

NH
3
, H
2
O
2


Ni
2+


Ni
2+
+ 2 CH
3
C CH CH
3
N N OH HO
+ 2 NH
3


avietinės spalvos nuosėdos

Čiugajevo reakcija
Į mėgintuvėlį įlašinami 2–3
lašai tiriamojo tirpalo,
pridedami keli lašai
amoniako tirpalo ir 1–2
lašai spiritinio
dimetilglioksimo tirpalo.
Jeigu reakcija nepavyksta,
papildomai pridedama
amoniako tirpalo. Jeigu
tirpale yra Ni
2+
jonų,
susidaro avietinės spalvos
nikelio dimetilglioksimato
nuosėdos.
Pastaba. Reakcijai trukdo
Fe
2+
, Fe
3+
, Co
2+
, Cu
2+
.
56
Analizi-

grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

VI

NH
3
, H
2
O
2


Cu
2+


2CuSO
4
+ 2NH
3
+ 2H
2
O →
(CuOH)
2
SO
4
↓ + (NH
4
)
2
SO
4
,


(CuOH)
2
SO
4
+ 8NH
3
+ 8H
2
O →

intensyviai
mėlyna spalva












2CuSO
4
+ K
4
[Fe(CN)
6
] →


raudonai rudos
nuosėdos


Reakcija su amoniako
tirpalu
Jei tirpale nebuvo rasti Ni
2+
jonai, tai Cu
2+
jonai
atpažįstami iš intensyviai
mėlynos tirpalo spalvos,
pridėjus 4 lašus 6 N NH
3
.
Amoniako tirpalas su Cu
2+

jonais iš pradžių nusodina
mėlynai žalių vario
oksidruskų, kurios, dedant
daugiau amoniako tirpalo,
ištirpsta. Tirpalas įgyja
intensyviai mėlyną spalvą.
Pastaba. Kadangi esant Ni
2+
,
įpylus NH
4
OH, susidaro
melsvos spalvos [Ni(NH
3
)
6
]
2+

jonų, reakcija atliekama su
K
4
[Fe(CN)
6
].
Reakcija su kalio
heksacianoferatu (II)
Į mėgintuvėlį įlašinami 1–2
lašai tiriamojo tirpalo. Jeigu
jis yra stipriai rūgščios
reakcijos, pridedamas natrio
acetato perteklius, o jei yra
šarminė reakcija –
parūgštinamas acto rūgštimi
iki silpnai rūgščios terpės.
Tada įlašinami keli lašai
K
4
[Fe(CN)
6
] tirpalo. Jeigu
tirpale yra Cu
2+
jonų,
susidaro raudonai rudų
nuosėdų.

Atsiskaitymas

- parašomos būdingosios katijonų radimo cheminės reakcijos;
- V ir VI grupių katijonų nežinomos sudėties mišinio analizės rezultatai užrašomi 3 lentelėje pateiktu būdu:

57
3 lentelė. V ir VI analizinių grupių katijonų mišinio analizė

Analizinė grupė,
reagentas
Katijonų radimo būdingais
reagentais cheminės reakcijos ir
analiziniai signalai
Reakcijos atlikimo sąlygos Pastebėjimai
Atpažintas
katijonas
VI
(NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
]

Co
2+
+ (NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
] →
Co[Hg(SCN)
4
] ↓ + 2
+
4
NH
mėlyni kristalai



Reakcija vyksta
neutralioje arba silpnai
rūgščioje terpėje.
Trukdo Fe
3+
, Cu
2+
, Zn
2+

jonai
Susidaro mėlyni
kristalai,
stebimi pro
mikroskopą
Co
2+


Literatūra

1. Daukšas, K. Kokybinė analizė. Vilnius: Mintis, 1965. 319 p.
2. Škadauskas, J. Katijonų ir anijonų radimas tirpaluose. Mokomoji priemonė. Vilnius: VU, 1997,
p. 32–49.
3. Фадеева, В. И.; Шеховцова, Т. Н.; Иванова, В. М. и др.; под ред. Ю. А. Золотова. Основы
аналитической химии. Практическое руководство: Учеб. пособие для вузовю Москва: BШ, 2001,
c. 50–72.

58
4. Sausos medžiagos analizė

Darbo tikslas

Sausos medžiagos katijonų ir anijonų identifikavimas rūgščių ir bazių metodu.

Tyrimo objektas

Nežinomos sudėties druska. Katijonai: Na
+
, K
+
,
+
4
NH , Mg
2+
, Ba
2+
, Ca
2+
, Ag
+
, Pb
2+
,
+ 2
2
Hg , Zn
2+
, Al
3+
, Cr
3+
,
Fe
3+
, Mn
2+
, Ni
2+
, Co
2+
, Cu
2+
;
Anijonai:
− 2
4
SO ,
− 3
4
PO , J

, Cl

.

Darbo priemonės

Cilindrinis ir kūginis mėgintuvėliai. Laikrodinis ir objektinis stikleliai. Kapiliarinės pipetės. Filtravimo
popieriaus lapeliai. Vandens šildymo vonia. Stiklinė mentelė. Mikroskopas. Centrifuga.

Skirstant sudėtingą analizuojamąjį mišinį į analizines grupes rūgščių ir bazių metodu, kaip pagrindas
imama katijonų sąveika su sieros ir druskos rūgštimi, susidarant netirpiems junginiams, sąveika su šarmais ir
amoniaku, tipiškiems arba amfoteriškiems hidroksidams arba remiamasi kai kurių katijonų savybe sudaryti
su amoniaku kompleksinius junginius. Pagal tai, kaip katijonai reaguoja su rūgštimis ir šarmais, jie skirstomi
į 6 grupes (1 lentelė).

1 lentelė. Katijonų skirstymas į analizines grupes rūgščių ir bazių metodu

Grupės
charakte-
ristika
Vandenyje
tirpūs chloridai,
sulfatai ir
hidroksidai
Vandenyje
netirpūs
sulfatai
Vandenyje
netirpūs
chloridai
Amfoteriniai
hidroksidai,
tirpūs šarmų
pertekliuje
Hidroksidai,
netirpūs šarmų
pertekliuje
Hidroksidai,
tirpūs amoniako
pertekliuje
Grupė ir
katijono
simbolis
Pirma
Na
+
, K
+
,
+
4
NH ,
Mg
2+

Antra
Ba
2+
, Ca
2+
,
Sr
2+

Trečia
Ag
+
, Pb
2+
,
+ 2
2
Hg
Ketvirta
Zn
2+
, Al
3+
,
Cr
3+
,Sn
2+
, Sn
4+
,
As
3+
, As
5+

Penkta
Mn
2+
, Fe
2+
, Fe
3+
,
Bi
3+
, Sb
3+
, Sb
5+

Šešta
Ni
2+
, Co
2+
, Cu
2+
,
Cd
2+
, Hg
2+

Grupinis
reagentas
Nėra H
2
SO
4,
(NH
4
)
2
CO
3

HCl NaOH
H
2
O
2

NH
3
, H
2
O
2
NH
3
, H
2
O
2

Susidarę
junginiai
– BaSO
4
,
CaSO
4
,
SrSO
4

AgCl,
Hg
2
Cl
2
,
PbCl
2

[Al(OH)
4
]

,
[Zn(OH)
4
]
2–
,
− 2
4
CrO ,
[Sn(OH)
6
]
2–
,
− 3
4
AsO
Mn(OH)
2
,
Bi(OH)
3
,
Fe(OH)
3
,
Sb(OH)
3
,
H
3
SbO
4

[Co(NH
3
)
6
]
2+
,
[Ni(NH
3
)
6
]
2+
,
[Cu(NH
3
)
4
]
2+
,
[Cd(NH
3
)
4
]
2+
,
[Hg(NH
3
)
4
]
2+


Nors anijonų analizė atliekama nesisteminės analizės eiga, tačiau vis tiek juos reikia grupuoti į tam tikras
grupes. Tai gerokai lengvina analizę. Pagal tai, kaip anijonai reaguoja su 2 M HCl arba 2 M H
2
SO
4
, BaCl
2
,
CaCl
2
ir AgNO
3
junginiais, jie skirstomi į keturias analizines grupes (2 lentelė).

2 lentelė. Anijonų grupavimas

Grupė Anijonas Grupinis reagentas Reakcijos produktai
I
− 2
3
CO ,
S
2–
,
− 2
3
SO ,
2 M HCl

arba 2 M H
2
SO
4

Dujos:
CO
2
– be spalvos ir kvapo,
H
2
S – nemalonaus kvapo,
SO
2
– aštraus kvapo,
SO
2
– aštraus kvapo (stovint ir šildant
59
Grupė Anijonas Grupinis reagentas Reakcijos produktai
− 2
3 2
O S ,

2
NO
išsiskiria elementarioji siera),
NO + NO
2
raudonai rudos, dusinančios
II
− 2
4
SO ,
− 3
4
PO ,
− 2
3
SiO ,

2
BO , F

,
− 2
4 2
O C
BaCl
2
+ CaCl
2
;
neutrali terpė
Baltos nuosėdos: BaSO
4
, Ca
3
(PO
4
)
2
, BaSiO
3
,

Ba(BO
2
)
2
, CaF
2
, CaC
2
O
4

III Cl

, I

, CNS

, Br


AgNO
3
+ 2 M HNO
3

Baltos nuosėdos: AgCl, AgCNS; gelsvos
nuosėdos: AgI, AgBr
IV

3
NO ,

3
ClO ,

4
ClO ,
CH
3
COO


Grupinio reagento nėra


Darbo eiga

Apie 0,05 g tiriamos druskos ištirpinama mėgintuvėlyje 5 mL distiliuoto vandens. Preliminarūs
bandymai atliekami naudojant 0,5–1,0 mL tiriamojo tirpalo taip, kaip nurodyta 3 lentelėje.

3 lentelė. Preliminarūs tiriamojo tirpalo tyrimai

Bandymo
Nr.
Tiriamojo tirpalo požymiai Tirpale nėra šių katijonų
1. Tiriamosios medžiagos tirpalas bespalvis Cr
3+
, Co
2+
, Ni
2+
, Cu
2+
, Fe
3+

2.
Tirpale nėra juodų arba tamsiai pilkų nuosėdų
+ 2
2
Hg , Sn
2+
drauge su Bi
3+
, Hg
2+
,
3.
Tirpalas neutralios reakcijos
+ 2
2
Hg , Sb
3+
, Sb
5+
, Sn
2+
, Sn
4+
, Hg
2+
, Bi
3+

4.
Pridėjus į tirpalą HCl, neiškrinta nuosėdos Ag
+
,
+ 2
2
Hg , Pb
2+

5. Pridėjus į tirpalą H
2
SO
4
, neiškrinta nuosėdos Ba
2+
, (Ca
2+
), Pb
2+
, Sr
2+

6. Pilant tiriamąjį tirpalą į ką tik paruoštą SnCl
2

tirpalą, nuosėdos neiškrinta
+ 2
2
Hg , Hg
2+
, Bi
3+


Katijono radimas

Prie 5 lašų tiriamo tirpalo pridedami 3 lašai 6N HCl tirpalo. Jeigu iškrenta nuosėdos, katijonas priklauso
III grupei.
Prie 5 lašų tiriamo tirpalo pridedami 3 lašai (NH
4
)
2
SO
4
tirpalo. Iškritusios baltos nuosėdos rodo, kad
katijonas priklauso II grupei.
Į 0,5 mL tiriamo tirpalo pridedami 4 lašai 2 N NaOH tirpalo. Jeigu susidaro nuosėdos, katijonas
priklauso V arba VI grupei. Nucentrifuguotos nuosėdos veikiamos 4 lašais 6 N NH
4
OH tirpalo. Jeigu
nuosėdos neištirpsta, katijonas yra iš V grupės, jei ištirpsta – iš VI grupės.
Jeigu po įvykdytų reakcijų nuosėdos nesusidaro, katijonas gali priklausyti I arba IV analizinei grupei.
Suradus grupę, atliekamos pavienės reakcijos visiems grupės katijonams (4, 5, 6 lentelės).

4 lentelė. I ir II analizinių grupių katijonų radimo analiziniai signalai

Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai
signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

I

nėra

+
4
NH

NH
4
Cl + NaOH → NH
3
↑ + H
2
O +
NaCl



Reakcija su natrio šarmu
Į mėgintuvėlį įlašinami 4 lašai
tiriamojo tirpalo, pridedami 5
lašai 2 N NaOH tirpalo.
Mėgintuvėlis atsargiai
pašildomas vandens vonelėje.
60
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai
signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5
NH
3
↑ + H
2
O → NH
4
OH

lakmuso popierėlis pamėlynuoja
Virš mėgintuvėlio laikoma
distiliuotu vandeniu suvilgyta
raudono lakmuso juostelė. Jeigu
tirpale yra
+
4
NH jonų, lakmuso
juostelė pamėlynuoja. Uostant
jaučiamas išsiskiriančio
amoniako kvapas.

I

nėra

K
+


4
+
4
NH + 6CH
2
O → (CH
2
)
6
N
4
+ 4H
+

+ 6H
2
O

2KCl + Na
2
[PbCu(NO
2
)
6
] →
K
2
[PbCu(NO
2
)
6
]↓ + 2NaCl

kubo formos juodi
arba rudi kristalai

Pastaba. Amonio jonai trukdo
nustatyti K
+
jonus
mikrokristaloskopine reakcija. Tam
tikslui naudojama formaldehido
savybė sujungti amonio jonus į
urotropiną (CH
2
)
6
N
4
. Į 5 lašus
tiriamojo tirpalo pridedami 4 lašai
formalino tirpalo.
Mikrokristaloskopinė reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas lašas tiriamojo
tirpalo ir greta lašas dinatrio-
švino-vario heksanitrito tirpalo.
Abu lašai stikline lazdele
sujungiami ir, jeigu tirpale yra K
+

jonų, po kurio laiko susidaro pro
mikroskopą matomi juodi arba
rudi kubo formos
K
2
[PbCu(NO
2
)
6
] kristalai.

I

nėra

Na
+


NaCl +
Zn(CH
3
COO)
2
·3UO
2
(CH
3
COO)
2
+
CH
3
COOH + 9H
2
O →
NaZn(UO
2
)
3
(CH
3
COO)
9
·9H
2
O↓ +
HCl
šviesiai geltoni tetraedrų arba
oktaedrų formos kristalai



Mikrokristaloskopinė reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas lašas tiriamojo
tirpalo ir greta lašas cinko uranilo
acetato tirpalo, parūgštinto acto
rūgštimi. Abu lašai stikline
lazdele sujungiami ir, jeigu
tirpale yra Na
+
jonų, po kurio
laiko susidaro pro mikroskopą
matomi šviesiai geltoni tetraedrų
arba oktaedrų formos natrio
cinko uranilo acetato
NaZn(UO
2
)
3
(CH
3
COO)
9
·9H
2
O
kristalai.
Pastaba. Jei tiriamoje medžiagoje
yra K
+
, gali susidaryti ilgų adatų
pavidalo kristalai. Tokiu atveju
patartina lašą tiriamojo tirpalo 2–3
kartus praskiesti vandeniu ir tuomet
atlikti reakciją.

I

nėra

Mg
2+


MgCl
2
+ Na
2
HPO
4
+ NH
4
OH →
MgNH
4
PO
4
↓ + 2NaCl + H
2
O

baltos kristalinės nuosėdos
Reakcija su dinatrio
hidrofosfatu
Ant objektinio stiklelio
užlašinami 1–2 lašai tiriamojo
tirpalo, pridedami 2–3 lašai 2 M
61
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai
signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5


kristalai
praskiestame
tirpale (lėta
kristalizacija)
kristalai
koncentruotame
tirpale (greita
kristalizacija)
HCl, 1 lašas 1 M dinatrio
hidrofosfato tirpalo ir, atsargiai
maišant stikline lazdele,
pridedamas 2 M NH
3
iki
jaučiamo amoniako kvapo
(pH ~ 9). Jeigu tirpale yra Mg
2+

jonų, susidaro baltos magnio
amonio fosfato
MgNH
4
PO
4
· 6H
2
O kristalinės
nuosėdos, kurios stebimos
mikroskopu.

II

H
2
SO
4
,
(NH
4
)
2
CO
3


Ba
2+


2BaCl
2
+ K
2
Cr
2
O
7
+ H
2
O +
CH
3
COONa→ 2BaCrO
4
↓ + 2KCl +
2CH
3
COOH + 2NaCl

geltonos
nuosėdos

Reakcija su kalio dichromatu
Į mėgintuvėlį įlašinami 1–2 lašai
analizuojamojo tirpalo, 3–4 lašai
natrio acetato ir 1–2 lašai
K
2
Cr
2
O
7
. Mėgintuvėlis šildomas
vandens vonioje. Jeigu tirpale
yra Ba
2+
jonų, susidaro bario
chromato BaCrO
4
geltonos
nuosėdos.
Pastaba. BaCrO
4
tirpsta rūgštyse
(netirpsta acto rūgštyje), todėl,
atliekant reakciją, būtina pridėti
CH
3
COONa, kad laisvi H
+
jonai
būtų sujungti į silpnos acto rūgšties
molekules.

II


(NH
4
)
2
CO
3
,
H
2
SO
4


Ca
2+


CaCl
2
+ (NH
4
)
2
C
2
O
4
→ CaC
2
O
4
↓ +
2NH
4
Cl
baltos nuosėdos



CaCl
2
+ H
2
SO
4
+ H
2
O →
CaSO
4
· 2H
2
O↓ +2HCl

baltos adatėlių arba
rombo bei suaugusių
dvynių formos kristalai


kristalai
praskiestame
tirpale (lėta
kristalizacija)
kristalai
koncentruotame
tirpale (greita
kristalizacija)
Reakcija su amonio oksalatu
Į mėgintuvėlį įlašinami 1–2 lašai
analizuojamojo tirpalo,
pridedama 3–4 lašai 6 M NH
3
ir
2 lašai amonio oksalato tirpalo.
Jeigu tirpale yra Ca
2+
jonų,
išsiskiria baltos kalcio oksalato
CaC
2
O
4
nuosėdos. Nuosėdos
tirpsta stipriose rūgštyse,
netirpsta acto rūgštyje.
Pastaba. Trukdo Ba
2+
jonai.

BaC
2
O
4

nuosėdos tirpsta acto rūgštyje.

Mikrokristaloskopinė reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas lašas tiriamojo
tirpalo ir greta lašas 2 N sieros
rūgšties tirpalo. Abu lašai
stikline lazdele sujungiami ir
paliekama pastovėti. Jeigu tirpale
yra nedaug Ca
2+
jonų, išsiskiria
ilgos pro mikroskopą matomos
CaSO
4
·2H
2
O gipso adatėlės, o jei
daugiau, susidaro rombai arba
suaugę dvyniai.
62

5 lentelė. III ir IV analizinių grupių katijonų radimo analiziniai signalai

Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5












III












HCl












Pb
2+

Ag
+
+ HCl → AgCl ↓ + H
+

Hg
2
2+
+ HCl →Hg
2
Cl
2
↓ + H
+

Pb
2+
+ HCl →PbCl
2
↓ + H
+










2Pb(NO
3
)
2
+ K
2
Cr
2
O
7
+ H
2
O →
2PbCrO
4
↓ + 2KNO
3
+2HNO
3


geltonos nuosėdos
Nuosėdų analizė
Pb
2+
radimas
Nuosėdos mėgintuvėlyje
užpilamos distiliuotu vandeniu
ir, retkarčiais maišant,
šildomos vandens vonioje.
PbCl
2
tirpsta karštame
vandenyje. Keli lašai virš
nuosėdų esančio skysčio pipete
perkeliami į kitą mėgintuvėlį ir
tirpale ieškoma Pb
2+
jono.
Reakcija su kalio dichromatu
Į mėgintuvėlį įlašinami 2–3
lašai tiriamojo tirpalo,
pridedami 2–3 lašai K
2
CrO
4

(arba K
2
Cr
2
O
7
). Jeigu tirpale
yra Pb
2+
jonų, susidaro mažai
tirpios geltonos švino chromato
PbCrO
4
nuosėdos.

III

HCl

+ 2
2
Hg

+
4
NH + H
2
O = NH
3
+ H
3
O
+

Hg
2
Cl
2
+2NH
3
→ Hg
2
NH
2
Cl + NH
4
Cl

Hg
2
NH
2
Cl → HgNH
2
Cl + Hg↓

nuosėdos pajuoduoja
+ 2
2
Hg

radimas
Likusios mėgintuvėlyje Hg
2
Cl
2
nuosėdos užpilamos 6 N NH
3

pertekliumi ir šildomos
vandens vonioje. Jeigu tirpale
yra
+ 2
2
Hg jonų, susidaro
mišinys: juodos Hg ir
HgNH
2
Cl nuosėdos.

III

HCl

Ag
+

+
4
NH + H
2
O = NH
3
+ H
3
O
+


AgCl + 2NH
3
→ [Ag(NH
3
)
2
]Cl

[Ag(NH
3
)
2
]Cl + KI → AgI↓ + 2NH
3
+
KCl

šviesiai
geltonos
nuosėdos

Ag
+
radimas
AgCl nuosėdos tirpsta
koncentruotame amoniake.
Reakcija su kalio jodidu
Gautą junginį ([Ag(NH
3
)
2
]Cl)
paveikus KI tirpalu, susidaro
mažai tirpios šviesiai geltonos
AgI nuosėdos.
Pastaba. Jeigu chloridų nuosėdos
nuo NH
3
+ H
2
O pajuodavo, o
sidabro rasti būdingomis
reakcijomis nepavyko, jo reikia
ieškoti juodose nuosėdose.

IV

NaOH,
H
2
O
2


Zn
2+


ZnSO
4
+ (NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
] →
Zn[Hg(SCN)
4
]↓ + (NH
4
)
2
SO
4


balti kristalai



Mikrokristaloskopinė
reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas acto rūgštimi
parūgštinto tiriamojo tirpalo
lašas ir amonio tetrarodano
merkurato (NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
]
tirpalo lašas. Abu lašai stikline
63
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

kristalai
koncentruotame
tirpale (greita
kristalizacija)
kristalai
praskiestame tirpale
(lėta kristalizacija)

lazdele sujungiami ir, jeigu
tirpale yra Zn
2+
jonų, po kurio
laiko susidaro pro mikroskopą
matomi balti cinko tetrarodano
merkurato Zn[Hg(SCN)
4
]
kristalai.
Pastaba. Jei tiriamosios
medžiagos tirpale yra Cu
2+
arba
Co
2+
jonų, nurodytu reagentu
ieškant cinko gali iškristi
sudėtingesnių junginių nuosėdos:
Cu[Hg(SCN)
4
] · Zn[Hg(SCN)
4
]
rausvai žalsvos spalvos,
Co[Hg(SCN)
4
] · Zn[Hg(SCN)
4
]
violetinės žydros spalvos.

IV

NaOH,
H
2
O
2


Al
3+

Al
3+
+ C
14
H
6
O
2
(OH)
2
→ raudonos
spalvos aliuminio lakas

Reakcija su alizarinu
Reagentas su Al
3+
jonais sudaro
raudonos spalvos junginį,
netirpstantį acto rūgštyje. Ant
filtravimo popieriaus lapelio
užlašinamas tiriamojo tirpalo
lašas ir gauta dėmė 1–3
minutes laikoma virš indo,
kuriame yra koncentruotasis
amoniako tirpalas, kad
susidarytų aliuminio
hidroksidas. Paskui greta
dėmės lašinamas alizarino
spiritinio tirpalo lašas. Vėl
palaikoma amoniako garuose.
Esant Al
3+
jonų, lašų sąlyčio
vietoje atsiranda raudona
dėmė.
Pastaba. Reakcija nėra specifinė.
Al
3+
aptikti šiuo reagentu trukdo
Sn
2+
, Fe
3+
, Zn
2+
. Norint pašalinti
jų įtaką, į keletą tiriamo tirpalo
lašų pridedama 2 M NaOH iki
stipriai šarminės reakcijos. Jeigu
išsiskiria nuosėdų, jos
centrifuguojamos, centrifugate
ieškoma Al
3+
jonų.

IV


NaOH,
H
2
O
2


Cr
3+


2NaCrO
2
+ 3H
2
O
2
+ 2NaOH →
2Na
2
CrO
4
+ 4H
2
O

geltonos
spalvos
tirpalas


Reakcija su vandenilio arba
natrio peroksidu
Į mėgintuvėlį įlašinami 2–3
lašai analizuojamo tirpalo,
pridedami 4–5 lašai 2 M
NaOH, 6–8 lašai 3 % H
2
O
2

tirpalo ir pašildoma, kol žalsva
tirpalo spalva virsta geltona,
būdinga
− 2
4
CrO jonui.

64
6 lentelė. V ir VI analizinių grupių katijonų radimo analiziniai signalai

Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

V

NH
3
,
H
2
O
2


Fe
3+


FeCl
3
+ 3NH
4
SCN → Fe(SCN)
3
+ 3NH
4
Cl

raudonos
spalvos
tirpalas





FeCl
3
+ K
4
[Fe(CN)
6
] → Fe
4
[Fe(CN)
6
]
3

+ KCl

Berlyno mėlynasis
Reakcija su kalio arba
amonio tiocianatais
Ant filtravimo popieriaus
užlašinamas tiriamojo tirpalo
lašas ir greta dėmės – amonio
(kalio) tiocianato lašas. Esant
Fe
3+
jonų, lašų sąlyčio vietoje
atsiranda raudona geležies
tiocianato Fe(SCN)
3
dėmė.
Reakcija su kalio
heksacianoferatu (II)
Keli lašai tiriamojo tirpalo
veikiami keliais lašais kalio
heksacianoferato (II)
K
4
[Fe(CN)
6
]. Jeigu tirpale yra
Fe
3+
jonų, susidaro mėlynos
amorfinės nuosėdos (Berlyno
mėlynasis).

V

NH
3
,
H
2
O
2



Mn
2+


2Mn(NO
3
)
2
+ 5NaBiO
3
+ 16HNO
3

2HMnO
4
+ 5Bi(NO
3
)
3
+ 5NaNO
3
+ 7H
2
O

violetinė
permanganato
spalva

Reakcija su natrio bismutatu
Į mėgintuvėlį įlašinami 1–2
lašai tiriamojo tirpalo, 2–3
lašai 6 N HNO
3
tirpalo, 5–8
lašai vandens, tada špateliu
įberiama šiek tiek NaBiO
3
miltelių, papurtoma ir
paliekama stovėti. Jeigu tirpale
yra Mn
2+
jonų, po kelių
minučių tirpalas virsta
raudonai violetinis.
Pastaba. Cl

ir Br

jonai gali
trukdyti reakcijai, nes jie suardo
permanganatą. Chloridus ir
bromidus galima nusodinti
sidabro nitratu AgNO
3
ir filtrate
(arba centrifugate) atlikti reakciją.

VI

NH
3
,
H
2
O
2



Co
2+


CoSO
4
+ (NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
] →
Co[Hg(SCN)
4
]↓ + (NH
4
)
2
SO
4

mėlyni kristalai


Mikrokristaloskopinė
reakcija
Ant objektinio stiklelio
užlašinamas lašas silpnai
parūgštinto (2 N HCl) arba
neutralaus tiriamojo tirpalo,
greta jo – lašas amonio
tetratiocianomerkurato
(NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
] tirpalo.
Abu lašai stikline lazdele
sujungiami ir, jeigu tirpale yra
Co
2+
jonų, po kurio laiko
susidaro pro mikroskopą
matomi mėlyni kobalto
tetratiocianomerkurato
65
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5





CoCl
2
+ 7KNO
2
+ 2CH
3
COOH → 2KCl
+ 2CH
3
COOK + NO + H
2
O +
K
3
[Co(NO
2
)
6
] ↓

geltonos nuosėdos
Co[Hg(SCN)
4
] kristalai.
Pastaba. Su Cu
2+
jonais
(NH
4
)
2
[Hg(SCN)
4
] sudaro
geltonai žalias kristalines
nuosėdas Cu[Hg(SCN)
4
] · H
2
O.
Jei tirpale yra Zn
2+
jonų, susidaro
Co[Hg(SCN)
4
] · Zn[Hg(SCN)
4
]
violetinės žydros spalvos kristalų.
Fe
3+
jonai kenkia reakcijai.
Reakcija su kalio nitritu acto
rūgšties terpėje
Į kelis lašus tiriamojo tirpalo
įlašinamas 1 lašas
koncentruotosios acto rūgšties
ir įberiama apie 0,1 g KNO
2
.
Maišoma, kol KNO
2
ištirpsta.
Jeigu tirpale yra Co
2+
jonų,
iškrinta geltonos K
3
[Co(NO
2
)
6
]
nuosėdos.

VI

NH
3
,
H
2
O
2



Cu
2+


2CuSO
4
+ 2NH
3
+ 2H
2
O →
(CuOH)
2
SO
4
↓ + (NH
4
)
2
SO
4,



(CuOH)
2
SO
4
+ 8NH
3
+ 8H
2
O →
[Cu(NH
3
)
4
](OH)
2
+ [Cu(NH
3
)
4
]SO
4
+
8H
2
O

intensyviai mėlyna spalva







2CuSO
4
+ K
4
[Fe(CN)
6
] →
Cu
2
[Fe(CN)
6
] ↓ + +2K
2
SO
4


raudonai rudos
nuosėdos


Reakcija su amoniako
tirpalu
Jei tirpale Ni
2+
jonų neaptikta,
Cu
2+
jonai atpažįstami iš
intensyviai mėlynos tirpalo
spalvos, pridėjus 4 lašus 6 N
NH
3
.
Pastaba. Amoniako tirpalas su
Cu
2+
jonais iš pradžių nusodina
mėlynai žalių vario oksidruskų,
kurios, dedant daugiau amoniako
tirpalo, ištirpsta. Tirpalas įgyja
intensyviai mėlyną spalvą.
Esant Ni
2+
, įpylus NH
4
OH,
susidaro melsvos spalvos
[Ni(NH
3
)
6
]
2+
kompleksas, tokiu
atveju reakcija atliekama su
K
4
[Fe(CN)
6
].
Reakcija su kalio
heksacianoferatu (II)
Į mėgintuvėlį įlašinami 1–2
lašai tiriamojo tirpalo. Jeigu jis
yra stipriai rūgščios reakcijos,
pridedama natrio acetato, o jei
yra šarminė reakcija –
parūgštinamas acto rūgštimi iki
silpnai rūgščios terpės. Tada
įlašinami keli lašai
K
4
[Fe(CN)
6
] tirpalo. Jeigu
tirpale yra Cu
2+
jonų, susidaro
raudonai rudų nuosėdų.
66
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Katijonas
Katijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

IV

NH
3
,
H
2
O
2


Ni
2+

Ni
N
N
N
N
O
O
O
C
C
C
C H
3
C
H
3
C
H
O
H
CH
3
CH
3
Ni
2+
+ 2 CH
3
C CH CH
3
N N OH HO
+ 2 NH
3
+ 2 NH
4
+

avietinės spalvos nuosėdos
Čiugajevo reakcija
Į mėgintuvėlį įlašinami 2–3
lašai tiriamojo tirpalo,
pridedami keli lašai amoniako
tirpalo ir 1–2 lašai spiritinio
dimetilglioksimo tirpalo. Jeigu
reakcija nepavyksta,
papildomai pridedama
amoniako tirpalo. Jeigu tirpale
yra Ni
2+
jonų, susidaro
avietinės spalvos nikelio
dimetilglioksimato nuosėdų.
Pastaba. Reakcijai trukdo Fe
2+
,
Fe
3+
, Co
2+
, Cu
2+
. Reakciją galima
atlikti mikrokristaloskopiškai. Ant
objektinio stiklelio lašinamas
lašas tiriamojo tirpalo ir po 1 lašą
amoniako bei dimetilglioksimo.
Susidaro raudonų kuokšteliais
sukibusių adatų pavidalo kristalai.


Anijono radimas

Tirpale, naudojamame anijonų analizei, neturi būti II–VI grupių katijonų ir Mg
2+
. Metalų katijonai
pašalinami tiriamąją medžiagą virinant sodos tirpale. Į tirpalą patenka visų anijonų natrio druskos, o į
nuosėdas – metalų karbonatai, hidroksidai ir baziniai karbonatai.
Analizuojant ištirpintą druskos tirpalą, imama apie 30 lašų tirpalo, šarminama 3 M sodos tirpalu,
įlašinama dar 30 lašų to paties sodos tirpalo ir virinama bei centrifuguojama. Centrifugatas perkeliamas į kitą
mėgintuvėlį. Prieš analizuojant paruoštą anijonų tirpalą, reikia neutralizuoti sodos perteklių. Neutralizuojama
azoto rūgštimi: pridedamas lašas fenolftaleino, ir rūgštis lašinama, kol išnyks avietinė spalva (pH≈8). Tirpale
ieškoma anijonų.

7 lentelė. Anijono radimo analiziniai signalai

Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Anijonas
Anijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai
signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

II


BaCl
2
neutralioji
terpė

− 2
4
SO

− 2
4
SO + BaCl
2
→ BaSO
4
↓ + 2Cl


baltos
nusėdos


Reakcija su bario chloridu
Į mėgintuvėlį įlašinami 4 lašai
tiriamojo tirpalo, 3 lašai 2 N BaCl
2
tirpalo ir 2 lašai 6 N HCl tirpalo.
Jei tirpale yra
− 2
4
SO jonų, susidaro
baltos rūgštyse netirpstančios
BaSO
4
nuosėdos.
Pastaba. Neutraliame tirpale fosfato
jonai sudaro baltas kuokštų pavidalo
hidrofosfato nuosėdas. Pridėjus
amoniako, išsiskiria normalusis
fosfatas, tirpstantis acto rūgštyje.

67
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Anijonas
Anijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai
signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5

II

CaCl
2

neutralioji
terpė

− 3
4
PO

− 2
4
HPO + MgCl
2
+ NH
3

MgNH
4
PO
4
↓ + 2Cl


baltos
kristalinės
nuosėdos

Reakcija su magneziniu mišiniu
(MgCl
2
, NH
4
Cl ir NH
3
tirpalas)
Į mėgintuvėlį įlašinami 2–3 lašai
tiriamojo tirpalo, 4–5 lašai
magnezinio mišinio tirpalo ir
sumaišoma. Jeigu tirpale yra
− 3
4
PO
jonų, susidaro baltos kristalinės
magnio amonio fosfato nuosėdos.
Pastaba. Šią reakciją galima atlikti
mikrokristaloskopiškai.

III

AgNO
3
,
2 M
HNO
3



Cl



Cl

+ AgNO
3
→ AgCl ↓ +

3
NO
baltos
nuosėdos

I

+ AgNO
3
→ AgI ↓ +

3
NO

šviesiai
geltonos
nuosėdos





AgCl + 2NH
3
→ [Ag(NH
3
)
2
]Cl


[Ag(NH
3
)
2
]Cl + 2HNO
3
→ AgCl↓
+ 2NH
4
NO
3


Reakcija su sidabro nitratu
Į mėgintuvėlį įlašinami 2–3 lašai
tiriamojo tirpalo, parūgštinama
praskiesta azoto rūgštimi ir lašais
pridedama AgNO
3
tirpalo, kol
nustoja skirtis nuosėdos. Jos nuo
tirpalo atskiriamos centrifuguojant,
perplaunamos praskiesta azoto
rūgštimi.
Pastaba. Trukdo bromido jonai.

Nuosėdų analizė
Reakcija su sidabro nitratu.
Chlorido jonų radimas
Dalis nuosėdų ištirpinama
koncentruotame amoniako tirpale.
Susidaro tirpus kompleksinis
junginys [Ag(NH
3
)
2
]Cl. Gautąjį
tirpalą parūgštinus azoto rūgštimi,
iškrinta baltos sidabro chlorido
nuosėdos.
Pastaba. Fosfato jonas su AgNO
3

sudaro geltonas nuosėdas, tirpstančias
mineralinėse rūgštyse ir amoniake.
AgI nuosėdos amoniake netirpsta.

III

AgNO
3
,
2M
HNO
3


I



Bi(NO
3
)
3
+ 3KI → BiI
3
↓ + 3KNO
3

juodos
nuosėdos

BiI
3
+ H
2
O → BiOI ↓ + 2HI
oranžinė spalva









Reakcija su bismuto nitratu.
Jodido jonų radimas
Dalis nuosėdų mėgintuvėlyje
veikiama 4–5 lašais anglies
tetrachlorido CCl
4
, pridedama
lašais praskiesto bismuto nitrato
tirpalo ir gerai suplakama.
Atsiranda oranžinės bismuto
oksijodido – BiOI nuosėdos, ir
visas skystis kurį laiką yra geltonos
spalvos. Esant Cu
2+
ir Fe
3+
, tuojau
atsipalaiduoja jodas I
2
.
Tetrachlorido sluoksnis nuo jodo
nusidažo violetine spalva.
Reakcija su krakmolu
Amonio persulfatas (amonio
68
Analizinė
grupė
Grupinis
reagentas
Anijonas
Anijonų radimo būdingais reagentais
cheminės reakcijos ir analiziniai
signalai
Darbo eiga
1 2 3 4 5
2KI + (NH
4
)
2
S
2
O
8
+ H
2
SO
4
→ I
2
+
2KHSO
4
+ (NH
4
)
2
SO
4


peroksodisulfatas) rūgščioje terpėje
oksiduoja jodido jonus iki laisvojo
jodo. Į mėgintuvėlį įlašinami keli
lašai tiriamojo tirpalo bei
praskiestos H
2
SO
4
ir pridedami keli
kristaliukai kieto amonio persulfato
(NH
4
)
2
S
2
O
8
(arba K
2
S
2
O
8
). Į
paruoštąjį mišinį įlašinama 1–2
lašai krakmolo tirpalo ir kiek
pašildoma. Išsiskyręs jodas nudažo
tirpalą mėlyna spalva. Esant daug
jodidų, spalva atrodo juoda.

Atsiskaitymas

- sausos medžiagos analizės rezultatai užrašomi 8 lentelėje pateikta forma:

8 lentelė. Sausos medžiagos analizės rezultatai

Analizinė
grupė,
reagentas
Jonų radimo būdingais
reagentais cheminės reakcijos
ir analiziniai signalai
Reakcijos atlikimo sąlygos Pastebėjimai
Atpažintas
jonas
I
Na
2
HPO
4
,
NH
3

Mg
2+
+ Na
2
HPO
4
+ NH
3

MgNH
4
PO
4
↓ + 2Na
+
baltos
kristalinės
nuosėdos
Reakcija vyksta amoniakinio
buferio terpėje.
Trukdo jonai, sudarantys mažai
tirpius fosfatus. Netrukdo jonai:
+
4
NH , K
+
, Na
+

Susidaro baltos
kristalinės
nuosėdos
Mg
2+


- radus katijoną ir anijoną, parašoma druskos formulė.

Literatūra

1. Daukšas, K. Kokybinė analizė. Vilnius: Mintis, 1965. 319 p.
2. Škadauskas, J. Katijonų ir anijonų radimas tirpaluose. Mokomoji priemonė. Vilnius: VU, 1997,
p. 45–69.
3. Фадеева, В. И.; Шеховцова, Т. Н.; Иванова, В. М. и др.; под ред. Золотова, Ю. А. Основы
аналитической химии. Практическое руководство: Учеб. пособие для вузов. Москва: Bыс. шк.
2001, c. 121–142.

69
5. Tiesioginė konduktometrija ir konduktometrinis
titravimas

Konduktometrinė analizė pagrįsta tiriamųjų tirpalų elektrinio
laidumo matavimu. Elektrinį krūvį tirpaluose perneša teigiamieji ir
neigiamieji elektrolitų jonai. Vadinasi, konduktometrinė analizė gali
būti taikoma tiktai elektrolitų (rūgščių, bazių ir druskų) tirpalų analizei.

Šiek tiek teorijos

Jau buvo minėta, kad elektrinį krūvį tirpaluose perneša jonai. Jonų
srautas j (jonų skaičius, pereinantis per tirpalo skerspjūvio vienetą per
laiko vienetą) gali būti apskaičiuotas taip:

j =j
konvekcijos
+ j
difuzijos
+ j
migracijos
+ j
šiluminės difuzijos
. (1)

(1) lygtyje pirmasis narys charakterizuoja konvekcijos srautą, antrasis – molekulinę difuziją, trečiasis –
jonų migraciją, ketvirtasis – šiluminę difuziją. Tirpalų elektrinis laidumas paprastai tiriamas esant pastoviai
temperatūrai, todėl į šiluminę jonų difuziją galima nekreipti dėmesio. Kiti trys efektai realiose sistemose
dažniausiai vyksta kartu ir dengia vienas kitą. Ribiniu atveju galima laikyti, kad pasireiškia tik vienas iš jų.
Pavyzdžiui, nemaišomame homogeniniame elektrolite į pirmąjį narį galima nekreipti dėmesio. Norint
išvengti komplikacijų, susijusių su kartu vykstančia difuzija, matavimus būtina atlikti taip, kad jonams
judant nesusidarytų cheminio potencialo µ gradientas. Tam tikslui naudojama kintamoji srovė. Šiuo atveju
jonai virpa apie tam tikrą vidutinę padėtį, ir gradientas µ = 0. Tokiu atveju svarbi tik jonų migracija, ir
elektrolitų tirpalų elektrinį laidumą lemia ištirpusios medžiagos disociacija bei jonų judėjimas, sukeliamas
išorinio įtampos šaltinio. Kaip ir visi laidininkai, elektrolitų tirpalai apibūdinami varža R arba savitąja varža
σ. Tačiau dažniau vartojamas atvirkščias varžai dydis – elektros laidis G (S) arba atvirkščias savitajai varžai
dydis – savitasis elektros laidis σ (S/cm).

G =
l
A
σ , (2)
čia:
A – elektrodų plotas, cm
2
,
l – atstumas tarp panardintų į elektrolitą elektrodų, cm.
Elektrolitų tirpalų savitasis elektros laidis (SEL) priklauso nuo jonų skaičiaus (koncentracijos) ir jų
migracijos greičio:

σ = 10
–3
· α · C · F(u
k
+ u
a
), (3)

čia:
α – elektrolito disociacijos laipsnis,
C – tirpalo koncentracija, mol/L,
F – Faradėjaus skaičius (konstanta),
u
k
ir u
a
– katijono ir anijono absoliutusis judėjimo greitis.
Įvairių elektrolitų savitojo elektros laidžio (SEL) ir molinio elektros laidžio priklausomybė nuo
koncentracijos parodyta 1 pav.
Stipriųjų ir silpnųjų elektrolitų SEL iš pradžių, didinant elektrolito koncentraciją, didėja. Taip yra todėl,
kad didėja jonų skaičius. Tačiau toliau didinant elektrolitų koncentraciją, didėja tirpalo klampumas, todėl
mažėja jonų greitis ir tuo pačiu mažėja SEL. Be to, didėjant koncentracijai silpnųjų elektrolitų tirpaluose,
sumažėja disociacijos laipsnis, o kartu jonų skaičius ir SEL. Keliant temperatūrą, didėja jonų judėjimo
greitis ir kartu SEL. Nustatyta, kad pakėlus temperatūrą vienu laipsniu, SEL padidėja 1,8–2,5 %. Todėl
norint palyginti rezultatus, SEL reikia matuoti esant tai pačiai temperatūrai.

70



1 pav. Savitojo (a) ir molinio (b) elektros laidžio priklausomybė nuo koncentracijos

Molinis elektros laidis – tai tam tikros koncentracijos tirpalo, gauto disocijavus vienam moliui
elektrolito, elektrinio laidžio matas. Molinis elektros laidis (Λ
m
) atitinka elektrolito tūrio V(cm
3
), kuriame
ištirpintas vienas molis medžiagos, patalpinto tarp dviejų lygiagrečių elektrodų, tarp kurių yra 1 cm atstumas,
elektros laidį. Molinis elektros laidis apskaičiuojamas taip:

m
Λ =
C
σ
= . V ⋅ σ (4)

Dažniausiai molinis elektros laidis reiškiamas S · cm
2
/mol, todėl (4) lygtyje koncentracija išreikšta
mol/cm
3
. Jeigu koncentracija C bus išreikšta mol/L, (4) lygtis atrodys taip:

m
Λ =
C
1000
σ . (5)

Senesnėje literatūroje vartojamas ir ekvivalentinis elektros laidis Λ, t. y. laidis tirpalo, kuriame yra
ištirpintas vienas ekvivalentas elektrolito. Taigi reikėtų žinoti, kad molinis elektros laidis yra lygus
ekvivalentiniam elektros laidžiui, padaugintam iš ekvivalentinio daugiklio. Pavyzdžiui, NaCl tirpalo
m
Λ = Λ, H
2
SO
4
arba MgSO
4
tirpalų
m
Λ = 2 Λ, Al
2
(SO
4
)
3
tirpalo
m
Λ = 6 Λir t. t.
Iš (3) ir (4) lygčių gauname:

m
Λ = α · F(u
k
+ u
a
). (6)

Stipriųjų ir silpnųjų elektrolitų molinio elektros laidžio priklausomybė nuo koncentracijos parodyta
1 pav (b). Ši priklausomybė išlieka dėl to, kad keičiantis tirpalo koncentracijai, pasikeičia ir disociacijos
laipsnis. Skiedžiant tirpalą, molinis elektros laidis didėja artėdamas prie pastovaus dydžio, kuris žymimas
0
m
Λ ir vadinamas ribiniu moliniu elektros laidžiu. Šis dydis atitinka hipotetinio, be galo praskiesto tirpalo,
kuris apibūdinamas visiška elektrolito disociacija ir elektrostatinės sąveikos jėgų nebuvimu tarp jonų,
molinį elektros laidį. Pagal (6) lygtį be galo praskiesto tirpalo molinis elektros laidis bus toks:

0
m
Λ = ( )
0 0
a k
u u F + . (7)

S
a
v
i
t
a
s
i
s

e
l
e
k
t
r
o
s

l
a
i
d
i
s

σ
,

S
/
c
m

M
o
l
i
n
i
s

e
l
e
k
t
r
o
s

l
a
i
d
i
s

Λ
m
,

S
·
c
m
2
/
m
o
l

Koncentracija C, mol/L Koncentracija C, mol/L
a b
71
Sandauga
0
i
Fu =
0
i m,
λ vadinama ribiniu moliniu jonų elektros laidžiu, arba moliniu jonų judrumu. Šio
dydžio dimensija – S·cm
2
/mol. Molinis jonų judrumas yra kiekvienam jonui būdingas dydis, priklausantis
tik nuo tirpiklio prigimties bei temperatūros (1 lentelė).

1 lentelė. Kai kurių jonų molinis judrumas 25
0
C temperatūroje

Katijonas
0
k m,
λ , S·cm
2
/mol Anijonas
0
a m,
λ , S·cm
2
/mol
H
+
349,8 OH

198,6
Li
+
38,6 F

55
Na
+
50,11 Cl

76,34
K
+
73,5 Br

78,1
Rb
+
77,8 I

76,8
NH
4
+
73,4

3
NO

71,44
Ag
+
61,9

4
ClO

67
Mg
2+
106

4
IO

55
Ca
2+
119 HCOO

55
Sr
2+
119 CH
3
COO

41
Ba
2+
127

3
HCO

45
Fe
2+
108 C
6
H
5
COO

32
Co
2+
106 SCN

66
Cu
2+
107
− 2
3
CO

139
Zn
2+
106
− 2
4
SO

160
Hg
2+
106
− 2
4 2
O C

148
Pb
2+
139
− 2
4
CrO

170
Fe
3+
204
− 3
4
PO

210
La
3+
209 [Fe(CN)
6
]
3–
303
Ce
3+
209 [Fe(CN)
6
]
4–
444

Iš (6) ir (7) lygčių gauname:

0
m
m
Λ
Λ
=
0 0
a k
a k
u u
u u
+
+
α =
λ
⋅ α f , (8)
čia:
λ
f – elektrinio laidžio koeficientas.
Absoliutieji jonų judėjimo greičiai praskiestuose silpnųjų elektrolitų tirpaluose ir be galo praskiestuose
tirpaluose yra panašūs ( ≈
λ
f 1), todėl:

0
m
m
Λ
Λ
= α . (9)

Stipriems elektrolitams, kurie visiškai disocijuoja, galioja tokia lygybė:
72

0
m
m
Λ
Λ
= . f
λ
(10)

Be galo praskiesto tirpalo molinis elektros laidis lygus katijonų ir anijonų molinių judrumų sumai:

0
m
Λ =
0
k m,
λ +
0
a m,
λ . (11)

Metodo taikymas

Tiesioginis savitojo elektros laidžio (SEL) matavimas leidžia labai greitai ir pakankamai tiksliai nustatyti
bendrą druskų kiekį tirpale. 2 pav. pateikta SEL priklausomybė nuo NaCl procentinės koncentracijos tirpale.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 2 3 4 5 6
NaCl procentinė koncentracija
S
E
L
,

m
S
/
c
m

2 pav. NaCl kalibracinė tiesė

Remiantis šia kalibracine tiese galima greitai nustatyti procentinę NaCl koncentraciją, pavyzdžiui, NaCl
kiekį sūdytoje mėsoje arba žuvyje
1
. Savaime aišku, kad NaCl koncentraciją galima nustatyti tik tuo atveju,
kai tirpale nėra kitų elektrolitų.
Gamtinio vandens (požeminio ir paviršinio) SEL matavimai leidžia labai greitai ir pakankamai tiksliai
nustatyti bendrą vandens mineralizaciją (kartais vadinama sausuoju likučiu).
Tarp tirpalo savitojo elektros laidžio (SEL) ir jo koncentracijos yra toks ryšys:

F =
SEL
C
arba C = F·SEL . (12)
čia:
C – elektrolito koncentracija, g/L arba mg/L,
SEL – savitasis elektros laidis, mS/cm arba µS/cm,
F – perskaičiavimo faktorius (daugiklis).
Jeigu SEL reiškiamas mS/cm, tai koncentracija gaunama g/L. Jeigu SEL reiškiamas µS/cm, tai
koncentracija gaunama mg/L. Faktoriaus F reikšmė šiek tiek keičiasi, keičiantis elektrolito rūšiai ir jo
koncentracijai.
Gamtiniams vandenims, kuriuose vyrauja Ca
2+
, Mg
2+
katijonai bei

3
HCO anijonai (hidrokarbonatiniai
vandenys), F reikšmė labai nežymiai svyruoja apie 0,57.

1
Ši kalibracinė tiesė buvo taikyta NaCl koncentracijai nustatyti sūdytoje žuvyje. Rezultatai labai gerai sutapo su
klasikinio Cl

jonų nustatymo titrimetriniu metodu, naudojant AgCl, duomenimis (procentinė koncentracija skyrėsi vos
keliomis šimtosiomis procento dalimis).
73
Pavyzdžiui, išmatuotas gamtinio vandens SEL = 520 µS/cm. Tada tokio vandens bendroji mineralizacija
bus lygi: C = F·SEL = 0,57 × 520 = 296,4 mg/L.
SEL matuojamas laidumo matuokliais (konduktometrais). Šiuolaikiniai laidumo matuokliai atlieka
rodmenų temperatūrinės kompensacijos funkciją, t. y. visiškai nesvarbu, kokios temperatūros yra
analizuojamasis tirpalas. Prietaiso ekrane pateikiamas rezultatas, tarsi tiriamojo tirpalo temperatūra būtų
20
0
C arba 25
0
C (pasirinktinai). Laidumo matuokliai tikrinami ir kalibruojami, naudojant tiksliai žinomos
koncentracijos KCl tirpalus (2 lentelė).

2 lentelė. KCl tirpalų savitasis elektros laidis (SEL)

KCl konc., mol/L
Savitasis elektros laidis σ, µS/cm, esant tirpalo temperatūrai
18
0
C 20
0
C 25
0
C
0,1 11190 11670 12880
0,01 1225 1278 1413
0,001 127,1 132,6 146,9

Konduktometrinis titravimas

Konduktometriją galima taip pat taikyti atliekant tūrio analizę ekvivalentiniam taškui rasti. Dėl
nevienodo skirtingų jonų judrumo ir dėl jonų koncentracijų pokyčių titruojant titravimo kreivėse,
vaizduojančiose tirpalo savitojo elektros laidžio priklausomybę nuo titranto tūrio, ekvivalentiniame taške
susidaro lūžis. Tirpalo SEL, įpylus kiekvieną titranto porciją, nustatomas kaip visų tirpale esančių jonų
judrumų suma. Titravimo kreivių pobūdis, rodantis galimus įvairių medžiagų titravimo atvejus, pavaizduotas
3 pav.



3 pav. Konduktometrinio titravimo kreivės

1 kreivė. BaCl
2
tirpalas titruojamas Na
2
SO
4
tirpalu:

BaCl
2
+ Na
2
SO
4
= BaSO
4
↓ + 2NaCl.

74
Jeigu į BaCl
2
tirpalą dozuosime Na
2
SO
4
tirpalą, tai Cl

jonai liks tirpale, o Ba
2+
jonai (
0
Ba
2+
λ = 127
S·cm
2
/mol, 1 lentelė) bus keičiami mažiau judriais Na
+
jonais (
0
Na
+
λ = 50,11 S·cm
2
/mol) ir todėl SEL mažėja.
Susidarantis mažai tirpus BaSO
4
neturės jokios įtakos SEL. SEL mažės tol, kol tirpale esantys Ba
2+
jonai
visiškai pereis į nuosėdas. Dar pilant Na
2
SO
4
tirpalą, SEL pradeda didėti, nes tirpale didėja elektrolito
koncentracija.

2 kreivė. AgNO
3
tirpalas titruojamas NaCl tirpalu:

AgNO
3
+ NaCl = AgCl↓ + NaNO
3
.

Šiuo atveju Ag
+
jonai (
0
Ag
+
λ = 61,9 S·cm
2
/mol) keičiami Na
+
jonais (
0
Na
+
λ = 50,11 S·cm
2
/mol) ir SEL
beveik nesikeičia iki ekvivalentinio taško. Dar pilant NaCl, SEL didėja.

3 kreivė. AgNO
3
tirpalas titruojamas HCl tirpalu:

AgNO
3
+ HCl = AgCl↓ + HNO
3
.

Šiuo atveju SEL pastebimai didėja nuo titravimo pradžios, kadangi mažai judrūs Ag
+
jonai (
0
Ag
+
λ =
61,9 S·cm
2
/mol) keičiami daug judresniu H
+
jonu (
0
H
+
λ = 349,8 S·cm
2
/mol). Po ekvivalentinio taško SEL
didėja dar stipriau.

4 kreivė. Tokia kreivė gaunama titruojant acto rūgštį amonio hidroksidu (silpnas elektrolitas titruojamas
kitu silpnu elektrolitu):

CH
3
COOH + NH
4
OH = CH
3
COONH
4
+ H
2
O.

Iki ekvivalentinio taško labai judrus H
+
jonas yra keičiamas gerokai mažiau judriu
+
4
NH jonu ir SEL
turėtų mažėti. Tačiau taip neatsitinka, kadangi gaminasi gerai disocijuojantis elektrolitas – CH
3
COONH
4
ir
SEL didėja. Po ekvivalentinio taško SEL nesikeičia.
Taigi SEL matavimas titravimo metu leidžia rasti ekvivalentinį tašką netgi tais atvejais, kai titruojami
spalvoti tirpalai ir indikatorių naudojimas yra neįmanomas.

Darbo tikslas

1. Susipažinti su savitojo elektros laidžio (SEL) matavimo priemonėmis ir matavimo technika. Išmatuoti
įvairių vandenų (geriamojo vandens, paviršinio vandens, supilstyto į butelius gėlo ir mineralinio vandens,
distiliuoto, dejonizuoto vandens ir pan.) SEL ir apskaičiuoti šių vandenų bendrąją mineralizaciją.
2. Sudaryti NaCl arba Na
2
SO
4
kalibracinę tiesę ir vėliau panaudoti ją šių medžiagų tirpalų kiekybinei
analizei.

Tyrimo objektas

Įvairių elektrolitų vandeniniai tirpalai.

Darbo priemonės

Analitinės svarstyklės. Dejonizuotas vanduo. Matavimo kolbos. Automatinės pipetės. Laidumo
matuoklis (konduktometras), turintis automatinę temperatūrinę rodmenų kompensaciją, plastikinis matavimo
indelis.

75
Medžiagos ir tirpalai

Kieti NaCl ir Na
2
SO
4
, labai švarus vanduo (distiliuotas arba dejonizuotas; jo SEL neturi viršyti
5 µS/cm).

Darbo eiga

Dėstytojo nurodymu pagaminama 250 g 5,0 % vandeninio NaCl arba 250 g 5,0 % vandeninio Na
2
SO
4

tirpalo. Vėliau šį tirpalą atitinkamai skiedžiant, pagaminama tokių procentinių koncentracijų tirpalų serija:
0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 ir 4,0. Išmatavus visų šių tirpalų SEL, duomenys surašomi į tokią lentelę ir
atliekami reikalingi skaičiavimai:

3 lentelė. Duomenų lentelė

Eil.
Nr.
NaCl (Na
2
SO
4
)
C, %
SEL, mS/cm F =
SEL
C


F





Ant milimetrinio popieriaus arba naudojant kompiuterį nubrėžiama kalibracinė tiesė. Abscisių ašyje
atidedama procentinė koncentracija, o ordinačių – SEL.
Turint kalibracinę tiesę nustatoma analizei pateikto NaCl arba Na
2
SO
4
tirpalo procentinė koncentracija.
Apskaičiuojama absoliuti ir santykinė nustatymo paklaida.

Atsiskaitymas

Pateikiama:
- išsamus darbo aprašymas, pradedant trumpa teorine dalimi,
- tirpalų skaičiavimai,
- užpildyta 3 lentelė,
- nubrėžtas kalibracinis grafikas,
- apskaičiuotos tam tikros koncentracijos tirpalo analizės paklaidos.

Literatūra

Mickevičius, D. Cheminės analizės metodai. 2 dalis (Elektrocheminė ir chromatografinė analizė). Vilnius:
Žiburio leidykla, 1999, p. 21–38.

76
6. Tiesioginė potenciometrija ir potenciometrinis
titravimas

Trumpa teorinė dalis

Egzistuoja du potenciometrijos metodai:
a) tiesioginė potenciometrija;
b) potenciometrinis titravimas.
Tiesioginė potenciometrija pagrista tuo, kad tarp medžiagos
koncentracijos (aktyvumo) tirpale ir išmatuoto elektrodinio
potencialo yra tam tikras ryšys. Taikant šį metodą nustatoma
vandenilio jonų koncentracija tirpale ir taip pat tirpalo pH, įvairių
jonų koncentracijos tirpale naudojant jon-selektyvius elektrodus (Na
+
,
F

,

3
NO ir kt., iš viso apie 30 katijonų ir anijonų).
Potenciometrinis titravimas pagrįstas elektrodinio potencialo matavimu titravimo metu. Ekvivalentinis
taškas nustatomas pagal potencialo šuolį, kuris gaunamas ekvivalentiniame taške. Jeigu atliekama
neutralizacijos reakcija (rūgščių ir šarmų metodas), ekvivalentiniame taške gaunamas didesnis ar mažesnis
pH šuolis. Jeigu atliekama oksidacijos-redukcijos reakcija, ekvivalentiniame taške gaunamas didesnis ar
mažesnis oksidacijos-redukcijos potencialo šuolis. Potenciometrinis titravimas gali būti panaudotas ir
vykdant kompleksinių junginių susidarymo arba nusodinimo reakcijas. Bet kuriuo atveju pH-metras ar
milivoltmetras čia yra kaip indikatorius. Potenciometrinis titravimas turi keletą privalumų lyginant su
vizualiu titravimu:
a) potenciometrinis titravimas yra jautresnis už vizualų;
b) eliminuojamas subjektyvus faktorius (kiekvienas žmogus savaip mato spalvas ir jų
pasikeitimą);
c) galima titruoti labai spalvotus ir drumstus tirpalus, kai indikatorių naudojimas yra
neįmanomas;
d) galima nustatyti kelių komponentų koncentracijas viename mėginyje;
e) galima automatizuoti titravimo procesą, kadangi matuojamas elektrinis dydis (potencialas).
Reakcijoms, kurios taikomos potenciometriniam titravimui, keliami tie patys reikalavimai, kaip ir
atliekant paprastą titrimetrinę analizę:
a) reakcijos turi vykti pakankamai greitai;
b) reakcija turi vykti stechiometriškai, t. y. jų metu turi
pasigaminti žinomos sudėties cheminiai junginiai
(neturi vykti pašalinių reakcijų);
c) reakcijos turi vykti iki galo.
Jeigu reakcija vyksta nepakankamai greitai, galima taikyti
atvirkštinio titravimo metodą. Jo esmė yra tokia: į titruojamąjį
tirpalą pridedamas titranto perteklius, kuris paskui nutitruojamas su
kitu tinkamu titrantu. Kitas būdas padidinti reakcijos greitį –
titravimas aukštesnėje temperatūroje (pašildyti titruojamą tirpalą).
Pateiksime keletą potenciometrinio titravimo pavyzdžių.

1. Neutralizacijos reakcija. Stipri rūgštis titruojama su
stipriu šarmu, arba atvirkščiai (pvz., HCl + NaOH)
Šiuo atveju tirpale gaminasi nesihidrolizuojanti druska (NaCl),
todėl, sumaišius ekvivalentinius rūgšties ir šarmo kiekius, t. y.
pasiekus ekvivalentinį tašką, tirpalas tampa neutralus (pH = 7).
Vadinasi, stiprių rūgščių ir stiprių šarmų titravimo ekvivalentinis
taškas sutampa su neutraliuoju tašku.
Siekdami supaprastinti titravimo kreivės skaičiavimą tarkime,
kad tirpiniai yra visiškai suskilę į jonus ir kad titravimo metu tirpalo
tūris nekinta. Tarkime, kad 1 N HCl titruojame su 1 N NaOH.
1 pav. HCl

titravimo natrio šarmu
kreivė

Šarmų pridėta
10 20 30 40 50
Etaloninio tirpalo tūris V, mL
E
,

V




0
,
4













0
,
8












1
,
2

77
Prieš pradedant titravimą 1 N HCl tirpale pH bus lygus:
pH = –lg 1 = 0.
Pridėjus 90 % reikalingų rūgščiai neutralizuoti šarmų, rūgšties koncentracija, o su ja ir vandenilio jonų
koncentracija, sumažės iki 0,1 dalies. Tuomet:

C
H
+
= 1/10; pH = –lg 0,1 = 1.

Pridėjus 99 % šarmų:

C
H
+
= 1/100; pH = –lg 0,01 = 2.

Pridėjus 99,9 % šarmų:

C
H
+
= 1/1000; pH = –lg 0,001 = 3.

Dabar užteks 1–2 šarmo tirpalo lašų, kad būtų peržengtas ekvivalentinis taškas, kuriame pH = 7. Pridėjus
100,1 % šarmų, tirpalas taps 1/1000 N OH

jonų atžvilgiu:

C
OH

= 1/1000 = 10
–3
; C
H
+
= 10
–14
/10
–3
= 10
–11
; pH = –lg 10
–11
= 11.

Nuo paskutiniųjų 1–2 šarmo tirpalo lašų pH reikšmė pašoka nuo 3 iki 11. Vadinasi, iš esmės vis tiek,
kuriame intervalo taške – nuo pH = 3 iki pH = 11 – laikysime titravimą baigtą, kadangi visas intervalas
peršokamas mažu šarmų tirpalo kiekiu. Tai vaizdžiai iliustruoja titravimo kreivė.

2. Oksidacijos-redukcijos reakcija. Moro druskos (Fe
2+
) titravimas su kalio dichromatu labai
rūgščioje (H
2
SO
4
) terpėje

Titravimo metu vyksta reakcija, kurios joninė forma yra tokia:

− 2
7 2
O Cr + 6Fe
2+
+ 14H
+
⇔2Cr
3+
+ 6Fe
3+
+ 7H
2
O.

Ekvivalentiniame taške nuo mažo titranto kiekio gaunamas staigus oksidacijos-redukcijos potencialo
padidėjimas (šuolis).

Darbo tikslas

Susipažinti su potenciometrinio titravimo technika. Potenciometrinis titravimas, vykdant neutralizacijos
ir oksidacijos-redukcijos reakcijas. Titravimo kreivių sudarymas.

Darbo priemonės ir reagentai

pH-metras–milivoltmetras, indikatoriniai Pt ir stiklo elektrodai, palyginamasis sidabro chloridinis
elektrodas, biuretė, magnetinė maišyklė, automatinės keičiamo tūrio pipetės.
0,1 N NaOH ir HCl tirpalai;
0,1 N K
2
Cr
2
O
7
ir Moro druskos (NH
4
)
2
Fe(SO
4
)
2
·6H
2
O tirpalai; 10 N H
2
SO
4
tirpalas.

78
Darbo eiga

a) Neutralizacijos metodas: į 50 mL stiklinėlę automatine pipete atmatuojama 10 mL 0,1 N HCl tirpalo,
įpilama dar apie 10 mL distiliuoto vandens, į gautą tirpalą pamerkiamas kombinuotas pH matavimo
elektrodas ir įdedamas magnetukas. Maišant tirpalą magnetine maišykle, HCl titruojamas 0,1 N NaOH
tirpalu nuolat užrašant pridėto šarmo tūrį ir pH. Titravimo pradžioje pridedama po 2 mL 0,1 N NaOH tirpalo
ir, sulaukus kol pH stabilizuojasi, užrašoma jo reikšmė. Prieš pat ekvivalentinį tašką pridedamo NaOH
tirpalo tūris mažinamas iki 0,1 mL (maždaug 2 lašai titranto). Po ekvivalentinio taško per kelis kartus dar
pridedama apie 1 mL titranto bei užrašomos pH reikšmės.
Titravimo rezultatai surašomi į tokią lentelę:

1 lentelė. Titravimo rezultatų lentelė

Titranto tūris, mL pH


Pagal lentelės rezultatus nubrėžiama titravimo kreivė; abscisių ašyje atidedamas titranto tūris, o
ordinačių – pH.

b) Oksidacijos-redukcijos metodas: titruojama taip pat kaip a) variante. Į stiklinėlę pilamas Moro
druskos tirpalas, kuris parūgštinamas 5 mL 10 N H
2
SO
4
tirpalo. Į tirpalą įmerkiami indikatorinis (Pt) bei
palyginamasis (sidabro chloridinis) elektrodai ir, maišant tirpalą magnetine maišykle, titruojama 0,1 N
K
2
Cr
2
O
7
tirpalu.
Titranto tūris ir oksidacijos-redukcijos potencialas E, mV surašomi į lentelę bei nubrėžiama titravimo
kreivė.

Atsiskaitymas

- atlikto darbo aprašymas. Jame turi būti trumpa teorinė dalis, užpildyta lentelė bei nubrėžta titravimo
kreivė.

Literatūra

1. Mickevičius, D. Cheminės analizės metodai. 2 dalis (Elektrocheminė ir chromatografinė analizė).
Vilnius: Žiburys, 1998, p. 39–41, 47–49, 63–65, 85.
2. Лайтинен, Г. А. Химический анализ / Пер. с англ. Москва: Химия, 1966, c. 415–422.

79
7. Molekulinė absorbcinė spektrinė
analizė (spektrofotometrija)

Trumpa teorinė dalis

Spektrofotometriniai analizės metodai pagrįsti šviesos
absorbcijos matavimu. Tiriamosios medžiagos tirpalo spalvos
intensyvumas lyginamas su standartinio tirpalo spalvos
intensyvumu. Šis metodas yra labai jautrus ir pakankamai
greitas. Jis taikomas tais atvejais, kai dėl mažos analitės
koncentracijos negalima naudoti svorio ar tūrio analizės
metodų.
Normali saulės skleidžiama šviesa yra vadinama „baltąja
šviesa“. Iš tikrųjų tai yra mišinys įvairaus bangos ilgio šviesos. Šią „baltąją šviesą“ galima išskaidyti į
sudėtines „spalvotas“ dalis, kurios skiriasi bangos ilgiu. Žmogaus akiai matomoje šviesos spektro dalyje
gaunamos vaivorykštės spalvos (žr. 1 lentelę).

1 lentelė. Spalvos priklausomybė nuo šviesos bangos ilgio.

Spalva
Šviesos bangos
ilgis, nm
Violetinė
Indigo
Mėlyna
Žalia
Geltona
Oranžinė
Raudona
380–446
446–464
464–500
500–578
578–592
592–620
620–780

Šviesa, kurios bangos ilgis yra mažesnis negu 380 nm, vadinama ultravioletine šviesa (UV spektro sritis).
Sritis, kur šviesos bangos ilgis yra didesnis negu 780 nm, vadinama infraraudonąja (IR) sritimi. Intervalas
tarp 380–780 nm vadinamas matomąja sritimi. Ultravioletinė ir infraraudonoji šviesa žmogaus akiai yra
nematomos.
Pagrindinis šviesos absorbcijos dėsnis. Jeigu šviesos srautą, kurio intensyvumas I
0
, nukreipsime į
kiuvetėje supiltą spalvotą tirpalą, tai dalis srauto, kurio intensyvumas I
r
, atsispindės nuo kiuvetės
paviršiaus, kita dalis (intensyvumas I
a
) bus absorbuota tirpalo, o trečia dalis (intensyvumas I
t
) pereis pro
tirpalą. Tarp šių keturių dydžių yra tokia priklausomybė:

0
I =
t a r
I I I + + . (1)

Kadangi atspindėtos šviesos srauto dalies intensyvumas I
r
, dirbant su vienodų optinių savybių
kiuvetėmis, yra pastovus ir nedidelis dydis, tai atliekant skaičiavimus į jį galima neatsižvelgti. Tada (1)
lygybę galima parašyti taip:

0
I =
t a
I I + . (2)

Ši lygybė apibūdina tirpalo optines savybes, t. y. jo savybę praleisti arba absorbuoti šviesą. Šviesos
absorbcijos intensyvumas priklauso nuo to, kiek tirpale yra spalvotų dalelių, kurios absorbuoja šviesą daug
labiau, negu tirpiklis. Perėjęs pro tirpalą šviesos srautas praranda tuo didesnę dalį intensyvumo, kuo didesnė
spalvoto junginio koncentracija tirpale ir kuo storesnis spalvoto tirpalo sluoksnis. Spalvotiems tirpalams
tarp monochromatinės (vienodo bangos ilgio) šviesos absorbcijos laipsnio, krintančios šviesos
intensyvumo, spalvoto junginio koncentracijos ir tirpalo sluoksnio storio yra tam tikra priklausomybė,
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
440 460 480 500 520 540 560 580 600
λ, nm
A
80
išreiškiama Lamberto-Bugerio-Bero dėsniu. Pagal šį dėsnį spalvoto tirpalo monochromatinės šviesos
absorbcija yra proporcinga tirpalo koncentracijai ir tirpalo sluoksnio storiui:

I =
l C
I
⋅ ⋅ −

ε
10
0

; (3)
čia:
I – perėjusio pro tirpalą šviesos srauto intensyvumas,
I
0
– krintančios šviesos srauto intensyvumas,
C – spalvoto junginio (nustatomo elemento) molinė koncentracija tirpale, mol/L,
ε – molinis absorbcijos koeficientas (sinonimas – ekstinkcijos koeficientas),
l – tirpalo sluoksnio storis (kiuvetės ilgis), cm.

Logaritmavę (3) lygybę, gausime:

I
I
0
lg = . l C ⋅ ⋅ ε (4)

Santykio tarp krintančios šviesos intensyvumo ir šviesos, perėjusios pro tirpalą, intensyvumo dešimtainis
logaritmas yra vadinamas tirpalo absorbcija arba optiniu tankiu ir žymimas raide A
2
:

I
I
0
lg = A,

A = . l C ⋅ ⋅ ε (5)

Matome, kad absorbcija yra proporcinga spalvoto junginio koncentracijai tirpale ir spalvoto tirpalo
sluoksnio storiui.
Molinis absorbcijos koeficientas ε – tai absorbcija tirpalo, kurio 1 cm storio sluoksnyje yra 1 mol/L
absorbuojančios medžiagos. Jis priklauso nuo absorbuojančios šviesą medžiagos cheminės sudėties bei fizinių
savybių ir nuo monochromatinės šviesos bangos ilgio. Kuo didesnė ε reikšmė, tuo jautresnė reakcija, t. y. tuo
mažesnius tiriamosios medžiagos kiekius galima nustatyti be papildomo jos koncentravimo.
Atvirkščias šviesos absorbcijai (A) dydis yra šviesos pralaidumas (T) (angl. Transmission). Pralaidumas
dažniausiai reiškiamas procentais. Tarp absorbcijos A ir pralaidumo T yra toks ryšys:

A = – log T.

Pavyzdžiui, T = 23,6 % = 0,236; tada A = –log 0,236 = 0,627.
Paprastai prieš taikant spektrofotometrinį metodą vienos ar kitos medžiagos kiekiui nustatyti, pirmiausia
nustatoma, kokio ilgio šviesos bangas spalvotas tirpalas absorbuoja labiausiai, t. y. sudaromas spalvoto
junginio tirpalo absorbcijos spektras (abscisių ašyje atidedamas šviesos bangos ilgis, o ordinačių ašyje –
absorbcija A) ir randamas λ
max
. Paskui, esant šiam bangos ilgiui, sudaromas kalibravimo grafikas naudojant
standartinius tirpalus su tiksliai žinomomis analizuojamos medžiagos koncentracijomis. Išmatavus šių tirpalų
absorbciją, brėžiamas kalibravimo grafikas abscisių ašyje atidedant koncentracijas, o ordinačių ašyje –
absorbciją (A.). Vėliau, išmatavus analizuojamo tirpalo absorbciją, pagal kalibravimo grafiką randama
ieškomos medžiagos koncentracija tirpale.
Spektrofotometriniai analizės metodai praėjo ilgą tobulėjimo kelią. Pradžioje buvo taikomi vizualiniai
kolorimetriniai (spalvos lyginimo) metodai, kai tiriamojo tirpalo spalva buvo vizualiai lyginama su standartų
spalvine skale. Vėliau buvo pradėti kurti ir tobulinti spalvų intensyvumo matavimo (lyginimo) prietaisai

2
Ankstesnėje literatūroje absorbcija (optinis tankis) buvo žymima raide D. Kai kuriose užsienio šalyse absorbcija
žymima raide E ir vadinama ekstinkcija.
81
(kolorimetrai, fotometrai, spektrofotometrai). 1 ir 2 pav. pateiktos vieno spindulio ir dviejų spindulių
spektrofotometrų principinės schemos.



1 pav. Vieno spindulio spektrofotometro principinė schema: 1 – šviesos šaltinis; 2, 5 – sferiniai veidrodžiai; 3 –
veidrodis; įėjimo ir išėjimo plyšys; 6 – prizmė; 7 – šviesos filtras; 8 – kiuvetės su tiriamuoju ir palyginamuoju tirpalais;
9 – fotoelementas; 10 – srovės stiprintuvas; 11 – mikroampermetras; 12 – maitinimo blokas



2 pav. Dviejų spindulių spektrofotometro principinė schema: 1 – šviesos šaltinis; 2 – šviesos filtras; 3 – prizmė;
4 – veidrodis; 5 – kiuvetės su tiriamuoju ir palyginamuoju tirpalais; 6 – plyšinė diafragma; 7 – fotoelementas; 8 – srovės
stiprintuvas; 9 – mikroampermetras

Darbo tikslas

1. Spalvotų medžiagų tirpalų šviesos absorbcijos maksimumo (λ
max
) nustatymas (absorbcijos spektro
sudarymas).
82
2. Absorbcijos (sugerties) (A) priklausomybės nuo tirpalo koncentracijos (C) A = f(C) nustatymas, t. y.
kalibracinės tiesės sudarymas.
3. Junginio ar elemento koncentracijos nustatymas tirpale naudojantis sudaryta kalibracine tiese.

Tyrimo objektas

Žinomos koncentracijos vandeniniai kalio permanganato (KMnO
4
) arba geležies kompleksinio junginio
su sulfosalicilo rūgštimi tirpalai.

Darbo priemonės ir tirpalai

Analitinės svarstyklės. Dejonizuotas vanduo. Matavimo kolbos. Automatinės pipetės.
Spektrofotometras. Kiuvetės.
Tirpalai;
1. 0,01 M KMnO
4
tirpalas. 1,5804 g KMnO
4
1 litro matavimo kolboje ištirpinama nedideliame distiliuoto
vandens kiekyje, įpilami 5 mL konc. H
2
SO
4
, tirpalas praskiedžiamas iki žymės ir gerai sumaišomas.
2. Standartinis geležies tirpalas. 0,8634 g FeNH
4
(SO
4
)
2
·12H
2
O per piltuvėlį suberiama į 1 litro matavimo
kolbą, ištirpinama nedideliame distiliuoto vandens kiekyje, įpilama 100 mL ledinės acto rūgšties, tirpalas
praskiedžiamas iki žymės ir gerai sumaišomas. 1 mL šio tirpalo yra 0,1 mg geležies (Fe
3+
) jonų.
3. Sulfosalicilo rūgšties tirpalas. 20 g sulfosalicilo rūgšties ištirpinama 100 mL distiliuoto vandens.

Darbo eiga

1. Spalvotų junginių tirpalų šviesos absorbcijos maksimumo (λ
max
, nm) nustatymas (absorbcijos
spektro sudarymas)

Dėstytojo nurodymu yra sudaromi KMnO
4
arba geležies kompleksinio junginio su sulfosalicilo rūgštimi
absorbcijos spektrai ir randama, kokio bangos ilgio šviesą spalvotas junginys absorbuoja labiausiai (λ
max
,
nm). Absorbcijos spektrui sudaryti naudojama 1 cm ilgio kiuvetė ir tokia tiriamojo tirpalo koncentracija, kad
A
max
≤1. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas distiliuotas vanduo. Absorbcija matuojama 450 ÷ 600 nm
šviesos bangos ilgio intervale. Pirmiausia sudaromas apytikris (grubus) absorbcijos spektras, kai šviesos
bangos ilgis keičiamas kas 50 nm. Kai apytikriai randama λ
max
vieta, ji tikslinama, keičiant šiame rajone
bangos ilgį kas 10 nm. Vėliau, sudarant kalibracinę tiesę, absorbcija matuojama esant būtent šiam (λ
max
, nm)
šviesos bangos ilgiui.
Matavimų rezultatai yra surašomi į 1 lentelę.

1 lentelė. Absorbcijos (A) priklausomybė nuo šviesos bangos ilgio (λ, nm)

Šviesos bangos ilgis λ, nm Absorbcija (A)



Pagal 1 lentelės rezultatus ant milimetrinio popieriaus arba kompiuteriu nubrėžiamas absorbcijos
spektras. Abscisių ašyje atidedamas šviesos bangos ilgis, o ordinačių ašyje – absorbcija A.
Suradus λ
max
, sudaroma kalibracinė tiesė.

2. Absorbcijos (sugerties) (A) priklausomybės nuo tirpalo koncentracijos (C) A = f(C) nustatymas
(kalibracinės tiesės sudarymas)

Dėstytojo nurodymu atliekamas šios darbo dalies 2.1. arba 2.2. punktas.

2.1. Jeigu kalibracinė tiesė sudaroma kalio permanganatui, tai į šešias 50 mL matavimo kolbutes imami
skirtingi (didėjančia tvarka) žinomos koncentracijos KMnO
4
standartinio tirpalo tūriai ir distiliuotu vandeniu
praskiedžiami iki žymės bei gerai sumaišomi (dėmesio: didžiausios koncentracijos tirpalo absorbcija A
neturėtų viršyti 1,00 absorbcijos vieneto).
83
Violetinės spalvos permanganato tirpalų absorbcija matuojama naudojant 1 cm ilgio kiuvetę, o kaip
palyginamasis tirpalas naudojamas distiliuotas vanduo. Gauti rezultatai surašomi į 2 lentelę ir atliekami visi
reikalingi skaičiavimai (kitaip tariant, visiškai užpildoma 2 lentelė).

2.2. Jeigu kalibracinė tiesė sudaroma geležies kompleksiniam junginiui su sulfosalicilo rūgštimi
(violetinės spalvos junginys), tai į septynias 50 mL matavimo kolbutes pilami skirtingi (didėjančia tvarka)
žinomos koncentracijos geležies standartinio tirpalo tūriai, į kiekvieną kolbutę įpilama po 1 mL sulfosalicilo
rūgšties tirpalo ir tirpalai distiliuotu vandeniu praskiedžiami iki žymės bei gerai sumaišomi. Visose kolbutėse
(išskyrus pirmąją) atsiranda daugiau ar mažiau intensyvi violetinė spalva. Šios spalvos intensyvumas yra
proporcingas tiktai Fe
3+
jonų koncentracijai, kadangi sulfosalicilo rūgšties visur imamas didelis perteklius.
Po 5 minučių (per tiek laiko iki galo susidaro kompleksinis junginys ir išsivysto spalva) išmatuojama visų
spalvotų tirpalų šviesos absorbcija esant tokiam šviesos bangos ilgiui, kai buvo gauta maksimali absorbcija.
Absorbcijos matavimams naudojama 1 cm ilgio kiuvetė, o kaip palyginamasis tirpalas – tirpalas Nr. 1.
Gauti rezultatai surašomi į 2 lentelę, apskaičiuojama geležies koncentracija mg/50 mL ir mg/L, taip pat
kiekvienos koncentracijos ekstinkcijos koeficientas ε bei faktorius F ir vidutinės jų reikšmės.
Dėmesio: į pirmąją kolbutę geležies standartinio tirpalo nepilama. Į ją įpilama tiktai 1 mL
sulfosalicilo rūgšties tirpalo, kuris distiliuotu vandeniu praskiedžiamas iki žymės bei gerai sumaišomas
(palyginamasis tirpalas).

2 lentelė. Kalibracinės tiesės sudarymas

Eil.
Nr.
Paimta mL
standartinio Fe
tirpalo
Fe koncentracija
A
F =
A
L mg C / ,

ε
mg/50 mL mg/L
1 0 Palyginamasis tirpalas Palyginamasis tirpalas
2 1,0
3 3,0
4 5,0
5 7,0
6 10,0
7 15,0


F =

ε =

Pagal 2 lentėlės duomenis brėžiamas kalibracinis grafikas. Abscisių ašyje atidedama geležies (Mn)
koncentracija C (mg/50 mL), o ordinačių ašyje – absorbcija A.
Naudojantis kalibracine tiese atliekama nežinomos koncentracijos geležies tirpalo kiekybinė analizė.
Iš dėstytojo sužinojus Fe koncentraciją analizuojamame tirpale, apskaičiuojama absoliutinė ir santykinė
nustatymo paklaida.

Atsiskaitymas

Atlikto darbo aprašymas. Jame turi būti:
a) absorbcijos priklausomybės nuo šviesos bangos ilgio lentelė ir grafikas;
b) užpildyta 2 lentelė ir kalibracinės tiesės grafikas.

Literatūra

Mickevičius, D. Cheminės analizės metodai. 1 dalis (Spektrinė analizė). Vilnius: Žiburio leidykla, 1998, p.
23–29; 99–130.

84
8. Skysčių tūrio matavimo priemonių (pipečių, biurečių,
matavimo kolbučių ir kt.) metrologinių charakteristikų
nustatymas

Trumpa teorinė dalis

Cheminės analizės rezultatų tikslumas ir patikimumas priklauso nuo
daugelio veiksnių:
naudojamų matavimo priemonių ir prietaisų tikslumo;
naudojamų reagentų švarumo;
analitiko kvalifikacijos;
analizei taikomo metodo charakteristikų.
Tūrio matavimo priemonės kokybę geriausiai apibūdina du standartiniai dydžiai – tikslumas (A) (angl.
Accuracy) ir variacijos koeficientas (CV) (angl. Coefficient of variation).
Tikslumas(A) – tai skirtumas procentais tarp realiai paimto nominalaus skysčio tūrio ir idealaus
nominalaus pipetės ar biuretės tūrio. Tikslumas ir yra tas dydis, kuris nustatomas atliekant kalibravimą.
Variacijos koeficientas (CV) (kartais dar vadinamas preciziškumu) – tai atsikartojamumo matas.
Variacijos koeficientas parodo daug kartų iš eilės atliekamų matavimų rezultatų glaustumą. Blogo variacijos
koeficiento priežastimi gali būti netikusi matavimo prietaiso ar priemonės konstrukcija, prietaiso ar
priemonės susidėvėjimas, bloga matavimo (pipetavimo) technika ir pan.
1 pav. pateikti taikinių pavidalo piešiniai labai gerai ir vaizdžiai iliustruoja tikslumo ir variacijos
koeficiento esmę. Taikinio centras vaizduoja planuojamąją (norimą) idealiąją tūrio vertę, o kiekvienas
pataikymas vaizduoja realiomis sąlygomis su šia priemone išmatuotas tūrių vertes.


1 pav. Atsikartojamumo ir tikslumo iliustracija
Blogas
atsikartojamumas.
Pataikymai labai
išsibarstę.
Blogas
atsikartojamumas.
Nėra didelių paklaidų,
bet pataikymai
išsibarstę.
Geras
atsikartojamumas.
Pataikymai arti vienas
kito.
Geras
atsikartojamumas.
Pataikymai arti vienas
kito.
Blogas tikslumas.
Pataikymai toli nuo
centro. Matavimo
priemonė bloga.
Geras tikslumas.
Vidutinė vertė yra arti
centro. Su šia
priemone galima
gauti gerus rezultatus.
Blogas tikslumas.
Pataikymai arti vienas
kito, bet toli nuo
centro. Sisteminė
paklaida.
Geras tikslumas.
Visi pataikymai arti
centro (nominalaus
tūrio vertės).

Darbo tikslas

Nustatyti analizei naudojamų pipečių (Moro, graduotųjų ir automatinių pipečių) bei biurečių
metrologines charakteristikas ir palyginti jas su gamintojų deklaruojamomis charakteristikomis. Iš gautų
rezultatų padaryti išvadas, kurios iš patikrintų tūrio matavimo priemonių yra tiksliausios ir gali būti
naudojamos svarbioms analizėms atlikti.

85
Darbo priemonės ir medžiagos

Dėstytojo nurodyta skysčių tūrio matavimo priemonė (priemonės). Svarstyklės, sveriančios ne mažesniu
negu ± 0,001g tikslumu. Distiliuotas arba dejonizuotas vanduo. Termometras.

Darbo eiga

- Dėstytojo nurodyta biuretė ar pipetė pripildoma distiliuoto vandens.
- Į svėrimo stiklinėlę supilamas nominalusis biuretės ar pipetės tūris (5, 10, 15, 25 mL ir pan.).
- Vanduo pasveriamas analitinėmis svarstyklėmis.
- Termometru pamatuojama ir užrašuose pasižymima distiliuoto vandens temperatūra.
- Apskaičiuojamas matavimo priemonės tūris, padarius temperatūros pataisą.
- Šios operacijos kartojamos 10 kartų. Statistiškai rezultatams apdoroti reikia turėti ne mažiau kaip
10 duomenų. Svėrimų rezultatai surašomi į lentelę:

Svėrimo
eil. Nr.
Matavimo priemonės nominalusis tūris,
mL
Svėrinio masė x
i
, g
Vidutinė svėrinių
masė , x g
1
2
3 ... 10

- Apskaičiuojamas matavimo priemonės tikslumas (A, %) ir variacijos koeficientas (CV, %).

Skaičiavimai

1. Svėrimo rezultatų vidurkis apskaičiuojamas pagal formulę:

x =
n
x
i
Σ
,
čia:
x
i
– svėrimų rezultatai, g,
n – svėrimų skaičius.

2. Vidutinis matavimo priemonės tūris (mL) apskaičiuojamas pagal formulę:
V = Z x ⋅ ,
čia:
Z – temperatūros pataisos koeficientas. Jis imamas iš priede esančios lentelės (pvz., 1,0029 mL/g, esant
20
o
C ir 1013 hPa).

3. Apskaičiuojamas matavimo priemonės tikslumas (± %):

A = 100 ⋅

0
0
V
V V
,
čia:
V
o
– matavimo priemonės nominalusis tūris, mL.

4. Standartinis nuokrypis (± mL) apskaičiuojamas pagal formulę:

s =
1
2

− Σ

n
) x x (
Z
i
.

86
5. Apskaičiuojamas variacijos koeficientas (± %):

CV =
V
s ⋅ 100
.

Atsiskaitymas

- pateikiamas atlikto darbo aprašymas;
- pateikiami nustatytų metrologinių charakteristikų apibrėžimai ir jų skaičiavimai;
- padaromos išvados apie tūrio matavimo priemonių tikslumą, arba palyginamas kelių tūrio matavimo
priemonių tikslumas.

Priedas

Pataisos koeficiento Z priklausomybė nuo vandens temperatūros

Temperatūra,
0
C
Pataisos koeficientas Z,
mL/g
Temperatūra,
0
C
Pataisos koeficientas Z,
mL/g
15,0 1,0020 23,0 1,0035
15,5 1,0020 23,5 1,0036
16,0 1,0021 24,0 1,0038
16,5 1,0022 24,5 1,0039
17,0 1,0023 25,0 1,0040
17,5 1,0024 25,5 1,0041
18,0 1,0025 26,0 1,0043
18,5 1,0026 26,5 1,0044
19,0 1,0027 27,0 1,0045
19,5 1,0028 27,5 1,0047
20,0 1,0029 28,0 1,0048
20,5 1,0030 28,5 1,0050
21,0 1,0031 29,0 1,0051
21,5 1,0032 29,5 1,0052
22,0 1,0033 30,0 1,0054
22,5 1,0034


87
O Or rg ga an ni in nė ė c ch he em mi ij ja a
Laboratoriniai darbai
Albinas Žilinskas

1. Distiliavimas

Skystoms ir kai kurioms kietoms medžiagoms gryninti yra naudojamas distiliavimas. Distiliavimas –
skysčio virtimas garais ir vėl jų kondensavimas į skystį. Medžiagų perskyrimas distiliavimu yra pagrįstas jų
lakumo skirtumu. Yra keli distiliavimo būdai: distiliavimas atmosferos ir sumažintu (vakuume) slėgiais, taip
pat distiliavimas vandens garais. Pagal išskiriamų iš mišinio medžiagų skaičių skiriamas paprastasis
distiliavimas, kai iš mišinio išdistiliuojama viena frakcija, ir frakcinis distiliavimas, kai gaunamos kelios
skirtingose temperatūrose verdančios frakcijos.

Frakcinis distiliavimas

Frakciniu distiliavimu išskiriame atskirus homogeninių skystų medžiagų komponentus, besiskiriančius
savo virimo temperatūromis. Perskirti galima tik tokius mišinius, kuriems verdant susidarę garai turi
skirtingą sudėtį negu skystis. Aceotropinių mišinių perskirti distiliavimu negalima, nes skystis ir garai turi
vienodą sudėtį, toks mišinys distiliuojasi nesikeičiant sudėčiai. Toliau pateikta frakcinio distiliavimo
aparatūra.



























Dviejų homogeninių medžiagų mišinio atskyrimas

Surenkama aparatūra frakciniam distiliavimui. Per piltuvėlį į kolbą supilamas distiliuojamasis mišinys,
įmetama keletas pemzos gabaliukų. Kolba pradedama šildyti. Po kiek laiko skystis kolboje pradeda virti ir
garai pradeda kondensuotis kondensatoriuje. Atsiradęs skystis nuteka į rinktuvą. Nusistovėjus temperatūrai,
pakeičiamas rinktuvas ir renkama pirmoji distiliacijos frakcija (iki tol, kol temperatūra pradeda greitai kilti).
Nenutraukiant šildymo, pakeičiamas rinktuvas ir renkama antroji (tarpinė) frakcija (kol virimo temperatūra
88
vėl nusistovi). Tada, pakeitus rinktuvą, renkama trečioji frakcija. Kai kolboje lieka keli mililitrai skysčio arba
virimo temperatūra vėl ima staigiai kilti, nustojama šildyti kolbą ir distiliavimas baigiamas.
Išmatuojamas frakcijų tūris (mL) ir nustatomi l ir 3 frakcijų lūžio rodikliai refraktometru. Brėžiama
distiliavimo kreivė (tūris, mL; virimo temperatūra, °C).
Kreivės horizontaliosios dalys – tai išskirtų frakcijų virimo temperatūros.
Frakcijų virimo temperatūros ir lūžio rodikliai palyginami su tam tikromis konstantomis žinyne. Kai
kurių medžiagų konstantos pateiktos 1 lentelėje.

1 lentelė. Kai kurių organinių junginių fizikinės konstantos

Pavadinimas Formulė Virimo temperatūra, °C n (lūžio rodiklis)
Trichlormetanas (chloroformas) CHC1
3
61 1,4455
Tetrachlormetanas CC1
4
76,8 1,4630
2-Propanonas (acetonas) CH
3
COCH
3
56 1,3589
Cikloheksanas C
6
Hi
2
80,8 1,4288
Benzenas C
6
H
6
80 1,5011
Toluenas C
6
H
5
– CH
3
110 1,4969
2-Propanolis CH
3
CHOHCH
3
82,4 1,3775
Etiletanoatas (etilacetatas) CH
3
COOC
2
H
5
77 1,3728

2. Kristalizacija

Kristalizacija yra dažniausiai naudojamas kietų medžiagų gryninimo metodas. Jis pagrįstas nevienodu
skirtingų medžiagų tirpumu šaltame ir karštame tirpiklyje. Junginys, kuris tirpsta blogiau, negu priemaišos,
kristalizuojasi šaldant karštą persotintą tirpalą; kitos medžiagos lieka tirpale.
Kristalizacijoje skiriame šiuos etapus: a) karšto sotaus medžiagos tirpalo atitinkamame tirpiklyje
paruošimą; b) karšto sotaus tirpalo atskyrimą nuo neištirpusių priemaišų; c) tirpalo šaldymą iki medžiagos
išsiskyrimo į nuosėdas; d) nuosėdų (kristalų) atskyrimą nuo tirpalo; e) kristalų džiovinimą.
Kristalizacijos sėkmė labai priklauso nuo tirpiklio parinkimo. Kokių taisyklių laikytis parenkant tirpiklį?
1) Gryninamoji medžiaga neturi reaguoti su tirpikliu.
2) Ji turi blogai tirpti šaltame tirpiklyje (priešingu atveju daug medžiagos liks tirpale, gryno produkto išeiga
bus nedidelė).
3) Ji turi gerai tirpti karštame tirpiklyje.
4) Tirpiklis turi geriau tirpinti priemaišas.
5) Tirpiklis turi lengvai atsiskirti nuo džiovinamos medžiagos.
6) Tirpiklio virimo temperatūra turi būti 10–15 °C žemesnė už gryninamosios medžiagos lydymosi
temperatūrą, priešingu atveju medžiaga gali išsiskirti alyvos pavidalu.
Parenkant tirpiklį, vadovaujamasi taisykle: „panašus tirpsta panašiame“, t. y., tos pačios klasės junginiai
tirpsta vieni kituose. Nepoliniuose tirpikliuose gerai tirpsta nepolinės medžiagos, bet netirpsta polinės ir
atvirkščiai. Angliavandeniliai gerai tirpsta angliavandeniliuose, alkoholiai, nesudėtingi angliavandeniai ir
karboksirūgštys tirpsta vandenyje, alkoholiuose. Ši taisyklė ne visada galioja, nes tirpumui dar turi įtakos ir
kitos, esančios molekulėje, funkcinės grupės, taip pat medžiagos molio masė.

Kristalizacijos atlikimas. Pasvertą gryninamąją medžiagą sudedame į kolbą, sujungtą su grįžtamuoju
kondensatoriumi. (Jei tirpiklis vanduo, kristalinti galima Erlenmejerio kolboje ar stiklinėje, nenaudojant
kondensatoriaus.) Į kolbą įmetame gabaliuką pemzos arba stiklinį užlydytu galu kapiliarą, siekiantį kolbos
kaklo vidurį. Per grįžtamąjį kondensatorių į kolbą įpilame tirpiklio, iš pradžių mažiau, negu reikia medžiagai
ištirpinti. Šildome. Tirpalas turi virti. Jei medžiaga neištirpsta, dar pilame tirpiklio. Jei tirpalas spalvotas, tai
pridedama aktyvuotos anglies arba kito spalvos šalintojo. Viriname 5–10 min. Karštas tirpalas filtruojamas
nuo netirpių priemaišų. Filtratas aušinamas, išsiskyrę kristalai atskiriami nuo tirpalo ir džiovinami.
Nustatoma junginio lydymosi temperatūra: užbėrus žiupsnelį medžiagos ant termometro gyvsidabrio
rutuliuko ir šildant jį virš elektrinės plytelės, stebima, kada medžiaga lydosi.


89
Benzenkarboksirūgšties kristalinimas

100 mL stiklinėje 50 mL vandens virinant ištirpinama 1 g benzenkarboksirūgšties. Karštas tirpalas
greitai filtruojamas pro lankstytąjį filtrą. Kad filtruojant besikristalizuojanti benzenkarboksirūgštis neužkištų
filtro, reikia piltuvėlį, kuriame yra įdėtas filtras, pašildyti. Tam imama 100 mL Erlenmejerio (kūginė)
kolbutė, į ją įpilama 5–10 mL vandens, įstatomas piltuvėlis su filtru ir šildoma. Kai vandens garai sušildys
piltuvėlį, ant filtro pilamas karštas benzenkarboksirūgšties tirpalas. Filtratas šaldomas vandens ir ledo
vonioje. Išsiskyrę kristalai filtruojami naudojant Biuchnerio piltuvą ir Bunzeno kolbą, džiovinami ore ir
sveriami. Apskaičiuojama išeiga procentais. Nustatoma lydymosi temperatūra (lyginama su žinyne pateikta
temperatūra).

3. Ekstrahavimas

Tai medžiagų atskyrimo būdas, besiremiantis skirtingu medžiagų tirpumų tarpusavyje nesimaišančiuose
tirpikliuose. Ekstrahavimas dažniausiai taikomas medžiagai išskirti iš vandens eteriu arba kitais su vandeniu
nesimaišančiais tirpikliais.
Ekstrahavimui naudojami dalijamieji piltuvai, o esant mažiems medžiagų kiekiams lašinamieji
piltuvėliai. Ekstrahuojama taip. Dalijamajame piltuve į medžiagos vandeninį tirpalą pilamas ekstrahentas
(tirpiklis). Piltuvas pripildomas skysčiu ne daugiau
2
/3 tūrio (tirpiklio (ekstrahento) tūris sudaro maždaug
l
/3
ekstrahuojamojo tirpalo). Piltuvą, užkimšę kamščiu, prilaikydami kamštį ir čiaupą, apverčiame kamščiu
žemyn ir kelis kartus supurtome.
Dėl tirpiklio garavimo piltuve susidaro padidėjęs garų slėgis. Garus reikia išleisti. Tam trumpam
atsukamas piltuvo čiaupas. Paskui, užsukus čiaupą, energingai purtoma keletą minučių, išleidžiant
susidariusių garų perteklių. Nustojus purtyti, piltuvas įtvirtinamas stove.
Sluoksniams atsiskyrus, atkemšamas kamštis ir, atsukus čiaupą, apatinis sluoksnis išleidžiamas į stiklinę.
Viršutinis sluoksnis išpilamas pro kaklą.

Junginių atskyrimas ekstrahavimu (rūgštinis-bazinis ekstrahavimas)

Darbo tikslas – išskirti junginius iš trikomponenčio mišinio, susidedančio iš neutralaus bei rūgštinėmis
ir bazinėmis savybėmis pasižyminčių komponentų, kurie parenkami iš šių medžiagų:

2 lentelė. Junginiai, iš kurių sudaromas trikomponentis mišinys ekstrahavimui

Formulė Pavadinimas Lydymosi temperatūra, °C
C
6
H
5
COOH Benzenkarboksirūgštis 121–123
C
6
H
5
– CH = CH – COO 3-Fenil-2-propeno (cinamono) rūgštis 132–133
C
6
H
5
CONH
2
Benzenkarboksamidas (benzamidas) 132
C
6
H
5
NHCOCH
3
N-Feniletanamidas (acetanilidas) 113
BrC
6
H
4
NH
2
4-Bromanilinas (p-bromanilinas) 66
Cl C
6
H
4
NH
2
4-Chloranilinas (p-chloranilinas) 72

Erlenmejerio kolbutėje 25 mL dietileterio ištirpinamas medžiagų mišinys. Tirpalas supilamas į dalijamąjį
piltuvėlį, o kolbutė praplaunama 5 mL dietileterio, kuris taip pat supilamas į piltuvėlį.
Organinė bazė ekstrahuojama dviem 25 mL 5 % druskos rūgšties tirpalo porcijomis. Ekstraktai
atskiriami ir supilami į vieną kolbutę. Eterinis sluoksnis plaunamas 10 mL vandens, kuris atskirtas supilamas
į ankstesnį ekstraktą. Gautas rūgštinis ekstraktas atšaldomas ledo vonioje ir pašarminamas 10 % natrio
hidroksido tirpalu, atsargiai jį lašinant iki silpnai šarminės reakcijos. Išsiskyrę kristalai filtruojami,
džiovinami, pasveriami ir nustatoma jų lydymosi temperatūra.
Organinė rūgštis iš likusio eterinio tirpalo ekstrahuojama dviem 25 mL 5 % natrio hidroksido tirpalo
porcijomis. Tada eterinis tirpalas dar plaunamas 10 mL vandens. Atskirti šarminiai ekstraktai ir praplovimo
vanduo supilami į vieną kolbutę. Ekstraktas atšaldomas ledo vonioje, neutralizuojamas koncentruota druskos
rūgštimi, atsargiai ją lašinant iki silpnai rūgščios terpės. Išsiskyrę kristalai filtruojami, džiovinami,
pasveriami ir nustatoma jų lydymosi temperatūra.
90
Likęs eterinis tirpalas iš piltuvėlio išpilamas į Erlenmejerio kolbutę, džiovinamas bevandeniais magnio
arba natrio sulfatais 10–15 minučių, retkarčiais supurtant kolbutę. Džioviklį nufiltravus, eteris atsargiai
išgarinamas (traukos spintoje!). Lieka neutralus junginys, kuris pasveriamas ir nustatoma jo lydymosi
temperatūra.
Atskirti junginiai identifikuojami palyginus jų lydymosi temperatūras su lentelėje pateiktų junginių
lydymosi temperatūromis.
Parašyti atliktų reakcijų lygtis.

4. Chromatografija (adsorbcinė)

Tai medžiagų atskyrimo, gryninimo ir identifikavimo metodas, kurio esmę sudaro medžiagos sąveika su
stacionaria bei pro ją praeinančia judria fazėmis.
Stacionari fazė – kietas adsorbentas, judri fazė – dujos arba skystis, praeinantys pro stacionarios fazės
sluoksnį. Chromatografavimo metu junginiai pasiskirsto tarp judrios ir nejudrios fazių. Judri fazė – eliuentas
(tirpiklis), praeidamas pro adsorbentą, sąveikauja su juo ir jame adsorbuota
medžiaga ir neša ją tolyn. Medžiagos skiriasi savo judrumu, nevienodai
sąveikauja su eliuentu (tirpikliu), praeinančiu adsorbentu (juda skirtingais
greičiais ir dėl to atsiskiria viena nuo kitos).
Chromatografinis atskyrimas – tai procesas, pagrįstas daugkartine medžiagų
sorbcija ir desorbcija joms judant judančios fazės sraute per nejudančią fazę.
Chromatografinės kolonėlės schema pateikta dešinėje.
Adsorbcinėje chromatografijoje plačiausiai naudojami pasiskirstymas
kolonėlėje ir ploname sluoksnyje. Pagal judančios fazės kryptį chromatografija
gali būti kylančioji ir nusileidžiančioji.
Pasiskirstymas kolonėlėje naudojamas medžiagoms atskirti. Kolonėlė
užpildoma sorbentu, dažniausiai silikageliu arba aliuminio oksidu (stacionari
fazė).
Ant viršutinio sorbento sluoksnio užpilamas medžiagų mišinys, ištirpintas
minimaliame eliuento kiekyje. Susigėrus šiam tirpalui, į kolonėlę parinktas tam
tikras eliuentas (judri fazė), kuris, leisdamasis savitaka žemyn, neša su savimi
atskirus komponentus. Kai medžiagos spalvotos, galima vizualiai stebėti jų
pasiskirstymą ir išėjimą iš kolonėlės. Ištekantis iš kolonėlės tirpalas nedidelėmis
porcijomis renkamas į atskirus indus ir analizuojamas. Išgarinus tirpiklį (eliuentą), gaunamos atskiros
medžiagos.

Plonasluoksnė chromatografija

Plonasluoksnėje chromatografijoje (kylančiojoje) naudojamos stiklo, metalo arba plastmasės plokštelės,
padengtos plonu adsorbento sluoksniu. Vienas ar keli lašai paruošto medžiagos arba jų mišinio l % tirpalo
kapiliaru užlašinami ant plokštelės krašto (1–1,5 cm atstumu nuo plokštelės apačios). Nugaravus tirpikliui,
plokštelė dedama į stiklinaitę su judria faze (eliuentu). Stiklinaitė uždengiama plokštele. Eliuento pilama
nedaug, jis neturi apsemti vietų, kuriose buvo užlašintas pavyzdys. Eliuentas kyla plokštele ir kartu neša
medžiagas. Plokštelė išimama iš eliuento (jam 1–1,5 cm nepasiekus plokštelės viršaus), išdžiovinama ir
ryškinama, įdedant ją į uždarą indą su jodu arba po ultravioletine lempa. Jodo garai su daugeliu organinių
medžiagų sudaro spalvotus kompleksus. Ultravioletinėje šviesoje junginiai matomi violetinių dėmių pavidalu
adsorbento fluorescuojančiame fone.









91
Nustatomas sulaikymo faktorius R
f
kaip parodyta schemoje. Čia a – atstumas nuo medžiagos starto
linijos iki dėmės centro; h – atstumas nuo starto linijos iki eliuento fronto linijos.
Eliuentas chromatografijai parenkamas eksperimentiškai, pradedant tirpikliu su nedidele eliuavimo galia.
Pagal eliuavimo galią silikageliui tirpikliai išsidėsto: cikloheksanas – pentanas – tetrachlormetanas –
toluenas – benzenas – trichlormetanas – dietileteris – etiletanoatas – etanolis – acetonas – acto rūgštis –
metanolis.

2,4-dinitrofenilhidrazonų sintezė

Karbonilinių junginių 2,4-dinitrofenilhidrazonai (DNFH) lengvai susidaro rūgščioje terpėje
karboniliniams junginiams reaguojant su 2,4-dinitrofenilhidrazinu.

O H
2
N
H
N
O
2
N
NO
2 N
H
N
O
2
N
NO
2
+ H
2
O +
H
+


DNFH turi tikslias lydymosi temperatūras, lengvai kristalizuojasi ir todėl taikomi karboniliniams
junginiams identifikuoti.
Be to, skirtingi DNFH labai skiriasi savo judrumu (sulaikymo faktoriumi R
f
), todėl chromatografija
ploname sluoksnyje dažnai naudojama jų mišinių analizavimui.
Darbo metu reikės susintezuoti kai kurių karbonilinių junginių (žr. 3 lentelę) 2,4-dinitrofenilhidrazonus,
nustatyti jų grynumą chromatografijos ploname sluoksnyje metodu (apskaičiuoti R
f
), taip pat lydymosi
temperatūrą.

3 lentelė. 2,4-dinitrofenilhidrazonų lydymosi temperatūros

Karbonilinis junginys Tam tikro 2,4-dinitrofenilhidrazono lydymosi
temperatūra, °C
Acetonas 126
2-Butanonas 111
Ciklopentanonas 146
Acetofenonas 250
Benzofenonas 239
Etanalis 168
Benzaldehidas 237
Butanalis 124–126
Propanalis 155–156

Reagentai: 0,5 g karbonilinio junginio,
0,4 g 2,4-dinitrofenilhidrazino,
60 mL 95 % etanolio,
2 mL konc. H
2
SO
4
.
25 mL talpos kolbutėje 0,4 g 2,4-dinitrofenilhidrazino tirpinama 2 mL konc. sieros rūgšties. Į mišinį
atsargiai, lašais, kolbutę supurtant, pilama 3 mL vandens ir 10 mL 95 % etanolio (dar į šiltą tirpalą).
Kitoje kolbutėje 20 mL etanolio tirpinama 0,5 g karbonilinio junginio ir į jį supilamas anksčiau paruoštas
2,4-dinitrofenilhidrazino tirpalas. Mišinys paliekamas stovėti kambario temperatūroje. Tirpalui auštant (po
5–10 min.) pradeda kristi tam tikro 2,4-dinitrofenilhidrazino kristalai. Kristalai atskiriami, kristalinami iš
95 % etanolio ir džiovinami.
Junginio grynumas patikrinamas plonasluoksne chromatografija. Paskui nustatoma jo lydymosi
temperatūra. Apskaičiuojama išeiga procentais.

Chromatogramos gavimas

Chromatografijai naudojamos 5x10 cm dydžio silufolo plokštelės.
92
Keli kristaliukai analizuojamo pavyzdžio kūginiame mėgintuvėlyje ištirpinami 2–3 mL etanolio ir
stikliniu kapiliaru vienas arba keli tirpalo lašai užlašinami ant plokštelės l cm atstumu nuo krašto. Šalia
lašinama po lašą pradinių medžiagų tirpalų 1,5 cm atstumu vienas nuo kito. Tirpikliui nugaravus, plokštelė
dedama į stiklinėlę su eliuentu (toluenu) ir uždengiama dangteliu. Eliuentas turi neapsemti vietų, kuriose
buvo užlašintas pavyzdys. Judri fazė kyla adsorbento sluoksniu, nepasiekdama plokštelės viršutinio krašto
(lcm). Tada plokštelė ištraukiama iš stiklinėlės, pažymima eliuento fronto vieta, nugarinamas tirpiklis.
Chromatograma ryškinama jodo garuose (eksikatoriuje su jodu). Apskaičiuojamas R
f
.

5. p-Toluensulfonrūgštis

CH
3
CH
3
SO
3
H
H
2
SO
4


Į trigurklę 100 mL talpos kolbą su mechaniniu maišikliu bei grįžtamuoju šaldytuvu supilama 32 mL
tolueno ir 19 mL konc. sieros rūgšties. Maišant mišinys silpnai virinamas, kol išnyksta sluoksniai (apie
1 val.). Tada šildyti nustojama, o reakcijos mišinys išpilamas į 100 mL vandens (kolba praplaunama
nedideliu vandens kiekiu). Pridėjus aktyvuotos anglies, tirpalas virinamas 10 min. Jei tirpalas lieka tamsus,
pridedama dar aktyvuotos anglies ir virinama pakartotinai. Bespalvis tirpalas nugarinamas stiklinėje iki
50 mL ir atšaldomas ledu.
Jei nesusidaro kristalai, tai tirpalas šaldomas ledu ir prisotinamas dujiniu vandenilio chloridu (gaunamas
lašinant sieros rūgštis ant natrio chlorido). Iškritusi p-toluensulfonrūgštis nufiltruojama per stiklo filtrą, gerai
ant jo nuspaudžiama ir džiovinama eksikatoriuje virš sieros rūgšties.
Lyd. t. 104–105 °C, išeiga – 35–40 g (65 %).

6. Benzenkarboksirūgštis

CH
3
COOH
1.KMnO
4
2.HCl


Į apvaliadugnę 200 mL talpos kolbą, sujungtą su dviejų atšakų alonžu, šaldytuvu ir maišikliu, sudedama
2,5 g tolueno, 3,2 g smulkiai sutrinto kalio permanganato ir 75 mL vandens mišinio. Reakcijos mišinys 4 val.
šildomas maišant verdančio vandens vonioje (kol tampa bespalvis). Jei reakcijos mišinys tebeturi rausvą
atspalvį, tai pridedami keli lašai etanolio (arba oksalo rūgšties), nes šie priedai redukuoja likusį kalio
permanganatą. Reakcijos mišinys atšaldomas, nufiltruojamas mangano (IV) oksidas, kuris 2 kartus
praplaunamas karšto vandens porcijomis po 10 mL. Sujungti filtratai koncentruojami šildant, garinant virš
vandens garų vonios iki 15–20 mL tūrio. Nufiltruojamas papildomai išsiskyręs mangano (IV) oksidas, kuris
praplaunamas 5 mL karšto vandens kiekiu. Sujungti filtratai parūgštinami praskiesta (1 : 1) druskos rūgštimi,
tirpalas atšaldomas, susidariusios nuosėdos nufiltruojamos, praplaunamos nedideliu šalto vandens kiekiu ir
džiovinamos ore. Benzenkarboksirūgšties išeiga – 2 g, lyd. t. 122 °C (iš vandens).

93
7. Acetonas


OH O
Na
2
Cr
2
O
7
(H
2
SO
4
)



Apvaliadugnė 200 mL talpos kolba sujungiama su dviejų atšakų alonžu, sujungtu su lašinamuoju piltuvu
ir šaldytuvu. Į kolbą supilama 20 mL 2-propanolio ir sulašinama nedidelėmis porcijomis (po 1–2 mL)
oksiduojančio mišinio, pagaminto nedidelėje stiklinėlėje į 60 mL vandens ištirpintą 22,8 g natrio bichromatą
atsargiai maišant ir pilant 20 mL konc. sieros rūgšties. Iš karto prasideda stipri egzoterminė reakcija, ir
kiekviena nauja oksiduojančio mišinio porcija pridedama po tam tikro reakcijos mišinio atvėsinimo. Tada
kolba 10 min. šildoma verdančio vandens vonioje, reakcijos mišinys atšaldomas, grįžtamasis šaldytuvas
pakeičiamas nutekamuoju (Libicho) ir acetonas nudistiliuojamas nuo vandens vonios į pasvertą indą,
surenkant frakciją, turinčią 55–58 C virimo temperatūrą. Gaunama apie 10 g acetono (išeiga – 66 %), vir. t.
56 °C.

8. 1-brombutanas


CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
OH CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
Br
KBr + H
2
SO
4



Į 250 mL talpos apvaliadugnę kolbą įdedama 30,5 g smulkaus kalio bromido, supilama 26 mL vandens ir
15 g butanolio-1. Įstačius grįžtamąjį šaldytuvą ir lašinamąjį piltuvą, supurtant nedidelėmis porcijomis,
sulašinama 20 mL konc. sieros rūgšties. Mišinys virinamas 1–1,5 val., kaitinant atvira liepsna per
skirstytuvą. Paskui, vietoj grįžtamojo šaldytuvo įstačius nuožulnųjį, nudistiliuojamas susidaręs
butilbromidas. Distiliatas dalijamajame piltuve plaunamas 25 mL vandens ir nuo jo atskiriamas. Dar kartą
plaunamas 10 mL atšaldytos sieros rūgšties, atskiriant nuo susidariusio dibutileterio ir nesočių
angliavandenilių. Atskyrus butilbromidą nuo sieros rūgšties, jis praplaunamas vandeniu, tada – 30 mL sotaus
natrio karbonato tirpalu ir dar kartą – vandeniu. Atskiriant sluoksnius plovimo metu, atkreiptinas dėmesys į
tai, kuriame, kuriam sluoksnyje yra butilbromidas! Džiovinama kalcio chloridu, nufiltruojama ir
perdistiliuojama. Renkama frakcija, verdanti 99–103 °C intervale (gryno butilbromido vir. t. 101 °C ).

9. Etiletanoatas


CH
3
CH
2
OH CH
3
COOH C
2
H
5
OCOCH
3
H
2
O
+ +



100 mL talpos Viurco kolboje 15 mL etilo alkoholio atsargiai sumaišoma su tokiu pat sieros rūgšties
kiekiu. Kolba užkemšama kamščiu, į kurį įstatomas dalijamasis piltuvas. Prijungiamas šaldytuvas ir šildoma
alyvos vonioje iki 140 °C (reakcijos mišinio temperatūra 110–120 °C). Į šiltą mišinį iš dalijamojo piltuvo
laipsniškai leidžiamas 30 mL etilo alkoholio ir 30 mL acto rūgšties mišinys. Lašinama tokiu greičiu, kokiu
distiliuojasi susidaręs esteris. Reakcijai pasibaigus, distiliatas plakamas su prisotintu natrio karbonato tirpalu
nesureagavusiai acto rūgščiai pašalinti, kol į viršutinį esterio sluoksnį įmerktas mėlynas lakmuso popierius
neberaudonuoja. Natrio karbonatas dedamas mažomis porcijomis, nes išsiskiriant CO
2
, tirpalas smarkiai
putoja. Mišinys perpilamas į dalijamąjį piltuvą, esteris atskiriamas nuo vandens ir alkoholio priemaišai
pašalinti suplakamas su 15 mL 50 % kalcio chlorido tirpalu. Esteris atskiriamas, išdžiovinamas bevandeniu
94
natrio sulfatu ir nudistiliuojamas. Atkreiptinas dėmesys į tai, kad etilacetatas yra lakus ir gerai tirpsta
vandenyje. Vir. t. 77 °C, išeiga – 30 g (70 %).

10. Ciklopentanonas


O
Ba(OH)
2
+ CO
2
+ H
2
O
COOH
COOH



100 g (0,67 mol) miltelių pavidalo adipo rūgšties gerai sumaišoma su 5 g (0,015 mol) kruopščiai sutrinto
kristalinio Ba(OH)
2
. Mišinys suberiamas į 500 mL talpos Viurco kolbą, sujungtą su šaldytuvu ir termometru,
kurio gyvsidabrio burbulėlis nuo kolbos dugno yra apie 5 mm. Tada Viurco kolba per vieną valandą
kaitinama iki 285–295 °C, ir ši temperatūra palaikoma tol, kol kolboje liks tik nedidelis kiekis sukepusios
masės (geriausia temperatūrą palaikyti 290 °C, nes 300 °C ir aukštesnėje pradeda distiliuotis adipo rūgštis).
Distiliavimas užtrunka apie 1,5 val.
Priimtuve surinktas ciklopentanonas turi vandens, todėl jis išsūdomas K
2
CO
3
. Kartu vandens sluoksnyje
sujungiamas nedidelis kiekis adipo rūgšties, kuri reakcijos metu gali būti persidistiliavusi į priimtuvą.
Ciklopentanono sluoksnis atskiriamas, džiovinamas CaCl
2
ir perdistiliuojamas. Išeiga – 40–45 g, vir. t.
128–130 °C,
n
D
20
1,4348.


Literatūra

1. Jakubkienė, V.; Urbonas, A. Organinė chemija.Vilnius: BĮ UAB „Litimo“, 2000. 63 p.
2. Butkus, E.; Purvaneckas, G.; Tumkevičius, S. Organinės chemijos laboratoriniai darbai. Vilnius: VU
leidykla, 1988. 142 p.
95
B Bi i o ol l o og gi i j j a a
Pratybos
Genovaitė Gedminienė

1. Šviesinis mikroskopas, jo sandara. Įvairaus dydžio ląstelių
stebėjimas

Darbo tikslas

Susipažinti su šviesaus lauko šviesinio mikroskopo sandara ir veikimo principu; stebėti įvairaus dydžio
ląsteles.

Tyrimo objektas

Šviesaus lauko šviesinis mikroskopas: didinimo geba, skiriamoji geba, kontrastiškumas; gyvieji ir
fiksuotieji biologiniai objektai.

Darbo eiga

Naudojantis prietaiso instrukcija, susipažinti su mikroskopo pagrindinėmis dalimis: okuliaru,
objektyvais, kondensoriumi, staleliu, makro- ir mikro- sraigtais, apšvietimu ir pan.
Stebėti fiksuotus bakterijų E. coli preparatus, parinkus apšvietimą ir reikiamo didinimo objektyvą.
Stebėti žmogaus audinių ląsteles, parinkus apšvietimą ir reikiamo didinimo objektyvą.
Stebėti žalio lapo audinio ląsteles ir chloroplastus jose.


96

Atsiskaitymas

Darbo užrašuose aprašyti darbo su mikroskopu eigą.
Įvertinti stebėtų biologinių objektų dydžius, µm, pagal okuliaro ir objektyvų didinimo gebos sandaugą.

Literatūra

1. Mader, Sylvia S. Biologija, I knyga. Vilnius: Šviesa, 1999, p. 57–79.
2. Lodish, H.; Berk, A.; Lawrence Zipursky, S.; Matsudaira, P.; Baltimore, D.; Darnell; J. B. Molecular cell
biology. New York, Second printing, 2000, p. 140–142.
97

2. Šiuolaikinė mikroskopija. Elektroninis mikroskopas

Darbo tikslas

Susipažinti su elektroniniu mikroskopu, jo sandara ir veikimo principu; paruošti biologinius objektus
elektroninei mikroskopijai; stebėti įvairaus dydžio objektus: bakteriofagus, augalų virusus, bakterijų E. coli
ląsteles.

Tyrimo objektas

Elektroninis mikroskopas. Biologinių objektų paruošimas elektroninei mikroskopijai. Elektroninio
mikroskopo didinimo geba, skiriamoji geba, kontrastiškumas.

Darbo eiga

98


Šis praktikos darbas atliekamas Lietuvos MA Botanikos instituto Virusologijos laboratorijoje, padedant
šios laboratorijos vadovui.
Stebimos skirtingai padidintos E. coli bakterijų ląstelės.
Stebimi augalų virusai.
Stebimi bakterijų virusai – bakteriofagai.

Atsiskaitymas

Darbo užrašuose aprašyti elektroninio mikroskopo veikimo principą; įvertinti stebėtų biologinių objektų
dydžius, nm.

Literatūra

1. Mader, Sylvia S. Biologija, I knyga. Vilnius: Alma littera, 1999, p. 57–79.
2. Lodish, H.; Berk, A.; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, P.; Baltimore, D.; Darnell, J. B. Molecular cell
biology. Second printing. New York. 2000, p. 147–152.

99
3. Paveldimumas ir kintamumas

Darbo tikslas

Sprendžiant uždavinius patikrinti genetikos žinias.

Tyrimo objektas

Remiantis G. Mendelio dėsniais: pirmosios kartos individų vienodumas, požymių išsiskyrimas, gametų
grynumas. Požymių, susijusių su lytimi, paveldėjimas.

Darbo eiga

Kiekvienas studentas gauna po tris uždavinius. Kaip sėkmingi jie sprendžiami, priklauso nuo to, ar
įsisavintas teorinis kursas: ląstelių dalijimasis, mitozė, mejozė; somatinės ir lytinės ląstelės; genotipas,
fenotipas, genai, aleliai, G. Mendelio dėsniai bei požymių, susijusių su lytimi, paveldimumas.

Uždavinių pavyzdžiai

1 uždavinys. Durnaropės žiedų purpurinė spalva ir spygliuotas sėklos lukštas – dominuojantys
požymiai; balta žiedų spalva ir lygus sėklos lukštas – recesyviniai. Kryžminamas homozigotinis individas
purpuriniais žiedais ir spygliuotomis sėklomis su baltažiede durnarope, kurios sėklos lygios. Kokie bus
antrosios kartos palikuonių fenotipai ir koks jų santykis?
2 uždavinys. Dešiniarankiškumas (sugebėjimas geriau valdyti dešinę ranką) ir ruda akių spalva –
dominuojantys požymiai; kairiarankiškumas ir mėlyna akių spalva – recesyviniai. Kokie galimi vaikų
fenotipai, jei jų tėvai rudaakiai, dešiniarankiai, heterozigotiniai pagal du požymius?
3 uždavinys. Hemofilija A yra liga, kuria sergant nekreša kraujas dėl faktoriaus FVIII stygiaus. Ši liga
paveldima kaip su X chromosoma susijęs recesyvinis požymis. Hemofilija A sergantis vyras vedė sveiką
moterį. Jiems gimė sveiki sūnūs ir dukros, kurie sukūrė šeimas su asmenimis, kurie nesirgo šia liga.
Nustatykite, ar sirgs hemofilija A trečiosios kartos asmenys – iš pradžių šių asmenų anūkai? Jei taip, tai
kokia yra tikimybė, kad jie sirgs?

Atsiskaitymas

1 uždavinys. Durnaropės žiedų purpurinę spalvą lemiantį geną pasižymime A, žiedų baltą spalvą – a,
spygliuotą sėklos lukštą – B, o lygų sėklos lukštą – b.

P A//A B//B × a//ab//b

F
1
A//aB//b

P A//aB//b × A//aB//b

Gametos: AB, Ab, aB, ab

F
2
palikuonims įvertinti sudarome Peneto gardelę:

Gametos AB Ab aB ab
AB A//A B//B A//A B//b A//a B//B A//a B//b
Ab A//A B//b A//A b//b A//a B//b A//a b//b
aB A//a B//B A//a B//b a//a B//B a//a B//b
ab A//a B//b A//a b//b a//a B//b a//a b//b

100
Atsakymas. Antroje kartoje skirtingų fenotipų palikuonių santykis − 9 : 3 : 3 : 1;
purpuriniais žiedais, spygliuotu lukštu : purpuriniais žiedais, lygiu lukštu : baltais žiedais, spygliuotu
lukštu : baltais žiedais, lygiu lukštu.
2 uždavinys Rudą akių spalvą lemiantį geną pažymime A, mėlyną – a, dešiniarankiškumą – B,
kairiarankiškumą – b. Požymius pažymime: dešiniarankiškumą – D, kairiarankiškumą – K, rudą akių spalvą
– R, mėlyną – M.

P A//aB//b × A//aB//b

Gametos AB, Ab, aB, ab AB, Ab, aB, ab.

Sudaroma, kaip ir pirmajame uždavinyje, Peneto gardelė. Po genotipais surašomi fenotipai.

Gametos AB Ab aB ab
AB
A//A B//B
DR
A//A B//b
DR
A//a B//B
DR
A//aB//b
DR
Ab
A//A B//b
DR
A//A b//b
DM
A//a B//b
DR
A//a b//b
DM
aB
A//a B//B
DR
A//a B//b
DR
a//a B//B
KR
a//a B//b
KR
ab
A//a B//b
DR
A//a b//b
DM
a//a B//b
KR
a//a b//b
KM

Atsakymas. Tėvai gali tikėtis keturių fenotipų palikuonių: dešiniarankių rudakių; dešiniarankių
mėlynakių; kairiarankių rudakių; kairiarankių mėlynakių.
3 uždavinio sprendimas. Vyro, sergančio hemofilija, genotipas yra X
h
Y. Moters genotipas − X
H
X
H
.
Visi sūnūs, gimę iš šios santuokos, bus sveiki (X
H
X
h
), o visos dukros – ligą lemiančio geno nešiotojos
(X
H
X
h
). Sūnų, vedusių sveikas moteris, šeimose visi vaikai gims sveiki; dukroms, ištekėjusioms už sveikų
vyrų, 25 % vaikų gims sergantys, t. y. sirgs tik tie jų sūnūs, kurie turės šį geną. Tikimybė, kad sūnūs paveldės
šį geną, yra 50 %.

Literatūra

1. Mader, Sylvia S. Biologija, I knyga, Vilnius: Alma littera, 1999, p. 235–250.
2. Grigaliūnienė, I. Molekulinės biologijos ir genetikos uždavinių rinkinys. Kaunas: Šviesa, 2000, 44 p.
101

4. Baltymų sintezė

Darbo tikslas

Patikrinti žinias iš baltymų sintezės kurso.

Tyrimo objektas

Baltymų sintezė.

Darbo eiga

Kiekvienas studentas gauna po penkis uždavinius. Jų sėkmingas sprendimas priklauso nuo to, kaip
įsisavintas teorinis kursas: genetinis kodas, komplementarioji sąveika, kodonai, antikodonai, genetinio kodo
ypatybės, transkripcija ir transliacija.


Uždavinių pavyzdžiai

1 uždavinys. Kokios aminorūgštys ir kokia tvarka susijungs į polipeptidinę grandinę, esant tokiai DNR
atkarpos struktūrai: – GAC – TCA – ATA – – CCA –, jei iRNR tripletas CUG koduoja aminorūgštį leuciną,
GUU – valiną, AGU – seriną, GCU – alaniną, UAU – tiroziną, GGU – gliciną?

2 uždavinys. Iš kokių 6 aminorūgščių ir kaip joms išsidėsčius sudarytas baltymas, jeigu žinoma, kad
paskutines tris aminorūgštis koduoja iRNR dalis: – GUU – UUU – ACU, o pirmutines tris – DNR atkarpa:
TTT – TAT – GAG –, ir yra žinoma, kad tRNR tripletai, „atpažįstantys“ aminorūščių įsijungimą į
polipeptidinę grandinę, yra: UUU – lizino, UGA – treonino, CAA – valino, GAG – leucino, UAU –
izoleucino, AAA – fenilalanino?

3 uždavinys. Susintetinta 14 baltymo molekulių. Kiek aminorūgščių reikės šių baltymo molekulių
sintezei, jei žinoma, kad įvyko dviejų iRNR, koduojančių šį baltymą, transkripcijos ir joms sunaudota 60
nukleotidų?

4 uždavinys. Duota tripeptido struktūra: argininas – tirozinas – alaninas. Taip pat žinomi tRNR
antikodonai (nukleotidų tripletai, „atpažįstantys“ amino rūgšties įsijungimo į tripeptidinę grandinę vietą):
arginino – GCA, alanino – CGG, tirozino – AUA. Kokia bus DNR molekulės, lemiančios šio polipeptido
sintezę, seka?

5 uždavinys. Nustatykite sintetinamo baltymo pirminę struktūrą, jei kai kurie DNR nukleotidai yra
nežinomi: než – než – než – C – A – než – než – C – C – G – než – G –A – než – než, o aminorūgščių, kurios
įeina į šio baltymo sudėtį, iRNR kodonai yra: triptofano – UGG, prolino – CCC, valino – GUU, glicino –
GGG, metionino − AUG?

Atsiskaitymas

1 uždavinio sprendimas. Duotai DNR atkarpai komplementari iRNR: CUG – AGU – UAU – GGU.
Aminorūgštys į polipeptidinę grandinę susijungs tokia tvarka: leucinas – serinas – tirozinas – glicinas.
2 uždavinio sprendimas. Visos iRNR struktūra: AAA – AUA – CUC – GUU – UUU – ACU. tRNR
antikodonai: UUU, UAU, GAG, CAA, AAA, UGA. Pirminė baltymo struktūra: lizinas – izoleucinas –
leucinas – valinas – fenilalaninas – tirozinas.
3 uždavinio sprendimas. Vienos iRNR transkripcijai sunaudota 30 nukleotidų, todėl vienos baltymo
molekulės sintezei bus sunaudota 10 aminorūgščių (30 : 3 = 10).
102
4 uždavinio sprendimas. Surašome tRNR antikodonus iš eilės pagal polipeptido struktūrą: GCA AUA,
CGG. iRNR, koduojant polipeptidą, yra: CGU – UAU – GCC. DNR atkarpos, koduojančios polipeptidą,
nukleotidų seka: – GCA – ATA – CGG –.
5 uždavinio sprendimas. Sugrupuojame DNR nukleotidus tripletais, nežinomus pažymėdami X. DNR
atkarpa: – XXX – CAX – XCC – GXG – AXX –. DNR atkarpai komplementari iRNR: XXX – GUX – XGG
– CXC – UXX. Sintetinamo baltymo pirminė struktūra: metioninas – valinas – glicinas – prolinas –
triptofanas.

Literatūra

1. Mader, Sylvia S. Biologija, I knyga. Vilnius: Alma littera, 1999, p. 235–250.
2. Grigaliūnienė, I. Molekulinės biologijos ir genetikos uždavinių rinkinys. Kaunas: Šviesa, 2000.


103

F Fi iz zi ik ki in nė ė c ch he em mi ij ja a
Laboratoriniai darbai
Gintaras Valinčius

1. Kietųjų medžiagų tirpimo entalpijos
nustatymas

Darbo tikslas

Nustatyti kietųjų medžiagų tirpimo entalpiją.

Tyrimo objektas

Tiriama nežinomos druskos arba organinės medžiagos
tirpimo entalpija. Nustatomas šiluminio efekto ženklas ir jo
absoliučioji reikšmė.

Matavimo priemonės

Kalorimetrinis indas, stiklinė, stiklinis mėgintuvėlis-ampulė su stikline nusmailinta lazdele. Termometras,
leidžiantis registruoti temperatūros kitimą 0,1–0,5 °C tikslumu. Kaitiklis su nuolatinės įtampos šaltiniu.

Darbo eiga

Darbas atliekamas dviem etapais. Pirmuoju etapu nustatoma kalorimetrinio indo konstanta (šiluminė talpa).
Antruoju etapu studentas gauna nežinomos druskos mėginį (gali būti keli mėginiai) ir nustato jos tirpimo šilumos
efekto ženklą ir dydį.

Kalorimetro konstantos nustatymas

Į kalorimetrinį indą įstatoma stiklinė su 50 g distiliuoto (dejonizuoto) vandens. Į kalorimetrinio indo dangtelį
įmontuojamas mėgintuvėlis-ampulė, į kurią suberiama studentui duota nežinoma druska ir įstatoma nusmailinta
stiklinė lazdelė, elektrinis kaitiklis, termometras. Įstatomo termometro apatinės dalies paviršių reikėtų kiek
sudrėkinti glicerinu arba sutepti vakuuminiu tepalu ar vazelinu. Kalorimetrinis indas uždengiamas dangteliu.
Bendroji surinkto kalorimetro schema pavaizduota 2 pav. Uždengus dangtelį ir palaikus maždaug 10–15 min.
stebimas temperatūros kitimas (jeigu toks vyksta) kalorimetre. Laukiama, kol temperatūros kitimo greitis taps
didesnis nei 0,5 laipsnio per 5 min.
Elektrinis kaitiklis prijungiamas prie nuolatinės įtampos šaltinio, nustatoma 2 V (patikslinti pas dėstytoją!)
įtampa. Fiksuojamas laikas ir įjungiamas nuolatinės įtampos šaltinis. Maždaug kas 30 sekundžių užrašomas
temperatūros kitimas kalorimetre. Matavimo metu kalorimetras atsargiai judinamas, kad skystis vidinėje
stiklinėje maišytųsi. Elektrinis kaitiklis irgi gali būti panaudotas vandeniui maišyti kalorimetro viduje.
Matuojama maždaug 300–500 s. Įtampa išjungiama, kai temperatūra kalorimetre pakyla 1,5–2,5 °C. Brėžiama
temperatūros t (°C) priklausomybės nuo laiko τ (s) kreivė ir apskaičiuojamas tiesės nuolinkio koeficientas α.
Tada randama kalorimetro konstanta k
cal
pagal formulę:

k
cal
= W/α, J/K,
čia:
W – elektrinio kaitiklio galingumas, lygus 0,5 W, kai pastoviosios srovės šaltinio įtampa lygi 2 V
(pasitikrinti dėl konkrečios reikšmės pas dėstytoją).
18
18,5
19
19,5
20
20,5
21
21,5
22
0 200 400 600
τ, s
t
,

o
C
δt
paskutinis taškas
prieš ampulę sudaužant
1 pav. Temperatūros kitimo kalorimetre
grafikas
104

2 pav. Bendroji kalorimetro schema:
1 – indas, kuriame palaikoma pastovi temperatūra 2 – dangtelis, 3 – stiklinė su vandeniu, 4 – kaitiklis, 5 – termometras,
6 – ampulė su tiriamąja medžiaga, 7 – putų polistireno pagrindas

Kalorimetro konstanta rodo, kiek džaulių energijos šilumos pavidalu turi išsiskirti kalorimetre, kad jo
temperatūra pakiltų 1 laipsniu. Žinodami šią konstantą, galime apskaičiuoti tirpimo proceso entalpiją.

Tirpimo šilumos matavimas

Vėl stebimas temperatūros kitimas per tam tikrą laiką. Sulaukiama tokio momento, kai temperatūra kinta
mažiau nei 0,5 °C per 5 min. Tada stiklinės lazdelės smailiuoju galu staigiu judesiu sudaužomas ampulės su
tiriamąja medžiaga dugnas. Fiksuojamas laiko momentas sudaužymo metu ir, gana intensyviai judinant
kalorimetrą, pasiekiama, kad visa druska ištirptų. Tirpimo proceso metu kas 30 sekundžių fiksuojamas
temperatūros kitimas. Temperatūros kitimas atvaizduojamas grafiškai. Nustatomas bendrasis temperatūros
pokytis ∆t (žr. 1 pav.), iš kurio pagal formulę apskaičiuojamas entalpijos pokytis:

∆H = − k
cal
⋅ ∆t, J.

Jei tirpimo proceso metu temperatūra pakilo, sistemos entalpija sumažėjo, tirpimo procesas yra egzoterminis
ir atvirkščiai.

Atsiskaitymas

- pateikiamos dvi skaitinės reikšmės – kalorimetro konstanta ir nežinomos medžiagos savitoji tirpimo
entalpija (J/g K);
- pateikiami kalibracinis ir temperatūros eksperimento metu kitimo grafikai;
- paaiškinami stebėti reiškiniai ir principai, kuriais remiantis buvo atliekami matavimai.

105
Literatūra

1. Daujotis, V.; Jankauskas, T.; Kaikaris, V.; Levinskas, A.; Skučas, V. Fizikinės chemijos laboratoriniai
darbai. Vilnius: Vilniaus Universitetas. 1986, p. 28–35.
2. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6
th
edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 108–
115.
3. Вильямс, В. Р.; Вильямс, Г. Б. Физическая химия для биологов. Москва: Мир, 1976, с. 76–85.

106

2. Koligatyviosios tirpalų savybės
1
.
Ebulioskopinis garavimo entalpijos nustatymas

Darbo tikslas

Nustatyti benzeno ar kito, dėstytojo nurodyto,
tirpiklio ebulioskopinę konstantą ir apskaičiuoti
molinę jo garavimo entalpiją.

Tyrimo objektas

Ebulioskopinis efektas – viena tirpalų
koligatyviųjų savybių, pasireiškianti tirpalo virimo
temperatūros padidėjimu, palyginti su grynuoju
tirpikliu. Šiame darbe bus tiriamas benzenas arba
kitas dėstytojo nurodytas tirpiklis.

Matavimo priemonės

Distiliacijos įranga: apvaliadugnė 250–
300 mL talpos kolbutė su šlifo atšaka, šaldytuvas,
cilindras distiliatui surinkti. Speciali distiliavimui
skirta elektrinė plytelė. Termometras, leidžiantis
registruoti virimo temperatūrą 0,1 °C tikslumu.
Pipetės. Techninės svarstyklės, leidžiančios sverti
0,1 g tikslumu. Individualiosios apsaugos
priemonės – apsauginiai akiniai arba apsauginis
skydas
2
, vienkartinės guminės pirštinės.

Darbo eiga

Surenkama distiliavimo aparatūra. Bendroji
distiliatoriaus schema parodyta 1 pav. Į kolbutę
dedama keli trupiniai susmulkinto stiklo ar keramikos, kad tolygiau virtų. Pro šoninę distiliavimo kolbutės atšaką
į kolbutę supilama 50 mL benzeno (apskaičiuojama ir užsirašoma įpilto benzeno masė, m
tirpiklio
, benzeno savitoji
masė yra 0,88 g/cm
3
). Surinkta distiliacijos aparatūra parodoma dėstytojui ar laborantui. Draudžiama jungti
kaitinimo plytelę, neparodžius dėstytojui paruoštos distiliavimo aparatūros.
Įjungiama elektrinė plytelė ir kaitinama tol, kol kolbutėje užverda benzenas. Tada pagal virimo intensyvumą
(jis neturi būti labai smarkus) gali tekti sumažinti kaitinimą. Termometro gyvsidabrio rezervuaras turi būti
pusiau pamerktas į tirpalą. Kaitinant stebimi distiliavimo aparatūros termometro rodmenys. Šios eksperimento
dalies užduotis − nustatyti tikslią benzeno virimo temperatūrą. Paprastai ji yra 80,1 °C, kai slėgis p = 1 atm,
tačiau gali kisti priklausomai nuo atmosferos slėgio. Kai iš šaldytuvo pradeda lašėti benzeno distiliatas, maždaug
kas 15 s intervalais užrašoma 10–12 termometro rodmenų. Nustačius tikslią benzeno virimo temperatūrą,

1
Koligatyviosios tirpalo savybės − tai savybės, priklausančios tik nuo tirpiklio fizikinio ir cheminio būvio, bet ne nuo
tirpinio. Vienintelis tirpinio parametras, turintis įtakos koligatyviosioms savybėms, yra šio tirpinio koncentracija (pvz.,
molinė dalis).
2
Šį darbą draudžiama dirbti be apsauginių akinių!


Distiliacijos
kolbutė
Šoninė atšaka
Termometras
Šaldytuvas
Cilindras
Elektrynė plytelė
1 pav. Bendroji distiliatoriaus schema
107
kaitinimo plytelė išjungiama. Distiliacija nutraukiama, atsargiai pakeliant distiliavimo aparatūrą. Išmatuojamas
distiliuoto benzeno tūris, reikšmė užsirašoma. Apskaičiuojama vidutinė benzeno virimo temperatūra T
benz
.
Atvėsus distiliavimo kolbutei tiek, kad ranka galima būtų atidaryti šoninės atšakos šlifo kamštį, pro ją į
benzeną suberiama 6,88 g bifenilo (dėstytojas gali nurodyti kitą medžiagą ir jos kiekį). Prieš tai elektros plytelę
reikia patraukti į šoną. Taip pat pro atšaką supilamas distiliuotasis benzenas. Atšaka užkemšama ir pradedama
kaitinti, kaip aprašyta anksčiau. Kadangi abiejų eksperimentų sąlygos yra vienodos, t. y. atmosferos slėgis per
20–30 minučių menkai tepakinta, tai pagal virimo temperatūros padidėjimą ∆T galima nustatyti ebulioskopinę
benzeno (ar kito tirpiklio) konstantą, kuri lygi santykiui

K
bp
= ∆T/m, (1)
čia:
∆T – virimo temperatūros pokytis, laipsniais, ∆T = T
tirp.
– T
benz.
,
T
tirp.
– tirpalo virimo temperatūra,
K
bp
– ebulioskopinė tirpiklio konstanta,
m – tirpinio molialumas, išreikštas mol ⋅ kg
−1
.
Taigi temperatūros pokytis nustatomas eksperimentiškai, o tirpinio molialumas apskaičiuojamas pagal lygtį:

m = m
x
/(M
x
m
tirpiklio
), (2)
čia:
m
x
– bifenilo (ar kito dėstytojo nurodyto tirpinio) masė gramais,
M
x
– tirpinio molio masė gramais,
m
tipriklio
– tirpiklio masė kilogramais.
Vykstant distiliacijai molialumas ir atitinkamai ∆T kis. Todėl kai tirpalas pradės virti, reikės užsirašyti ne tik
distiliacijos temperatūrą, bet ir distiliuotojo benzeno kiekį. Atliksime 12–15 matavimų maždaug kas 15 ± 5 s.
Sudarysime toliau pateikto pavyzdžio lentelę. Dviejose paskutiniosiose lentelės eilutėse pateiksime vidutinę
tirpalo virimo temperatūrą ir vidutinę ebulioskopinės konstantos reikšmę. Jas takysime toliau, skaičiuodami
molinę benzeno virimo entalpiją (J/mol):

bp
benz
benz vir
K
M
T R H
1000
2
.
⋅ ⋅ = ∆
čia:
R – universalioji dujų konstanta, lygi 8,314 J ⋅ K
−1
⋅ mol
−1
, M
benz
– benzeno (tirpiklio)molio masė gramais.
Savitoji tirpiklio garavimo entalpija, apskaičiuojama padalijant molinę entalpiją iš tirpinio masės (gramais
arba kilogramais).

Matavimo
nr.
Tirpalo
virimo
temperatūra,
°C
Virimo
temperatūros
pokytis ∆T,
°C
Distiliuotojo
benzeno masė
m
distil.
, kg
Distiliuojamo tirpalo molialumas,
mol ⋅ kg
−1

m = m
x
/[M
x
⋅(m
tirpiklio, pr.
– m
distil.
)],
m
tirpiklio, pr.
yra pradinė benzeno
masė, kg
Ebulioskopinė
konstanta

K
bp
= ∆T/m
1
2
3
4
5
Vidutinė tirpalo virimo temperatūra, T
tirp.
vidut.

Vidutinė ebulioskopinės konstantos reikšmė, K
bp
vidut.

108

Atsiskaitymas
- pateikiama nustatyto pavyzdžio eksperimentinių duomenų lentelė;
- apskaičiuojama molinė ir savitoji tirpiklio garavimo entalpijos.

Literatūra

1. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6
th
edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 297–
302.
2. Вильямс, В. Р.; Вильямс, Г. Б. Физическая химия для биологов. Москва: Мир, 1976, с. 137–143.

109

3. Reakcijos pusiausvyros konstantos
nustatymas
K KI I + +I I
2 2
↔ ↔↔ ↔ ↔ ↔↔ ↔K KI I
3 3

Darbo tikslas

Nustatyti cheminės reakcijos KI + I
2
↔ KI
3
pusiausvyros konstantą.

Tyrimo objektas

Tyrimo objektas yra cheminė trijų medžiagų vandenyje pusiausvyra: KI, I
2
ir KI
3
.
Norint nustatyti cheminės pusiausvyros konstantą, reikia žinoti šių trijų medžiagų pusiausvyrines
koncentracijas. Jodas lengvai nustatomas titruojant tiosulfato tirpalu, kaip indikatorių naudojant krakmolą.
Tačiau KI
3
junginys yra labai labilus, todėl tik pradėjus titruoti jodą tiosulfatu, KI
3
greitai skyla, taigi titruojant I
2

ir KI
3
pusiausvirąjį mišinį nustatomas bendras jodo (laisvojo ir susijungusio į KI
3
) kiekis tirpale. Ši problema
išsprendžiama pritaikant jodo savybę tirpti organiniame su vandeniu nesimaišančiame, tirpiklyje. Tam tektų
nustatyti molekulinio jodo pasiskirstymo tarp organinio tirpiklio ir vandens konstantą.

Matavimo priemonės

Dalijamasis piltuvas (100–250 mL talpos), kolbutė su kamščiu, 25 mL biuretė, graduotos 5 ir 10 mL pipetės,
50 mL stiklinėlės, sotusis jodo tirpalas anglies tetrachloride, 0,1 M KI tirpalas, sotusis KI tirpalas, 0,02 M
Na
2
S
2
O
3
tirpalas, krakmolo tirpalas vandenyje.

Darbo eiga

Iš pradžių nustatome molekulinio jodo pasiskirstymo tarp tetrachlorido ir vandens konstantą:

K
pasisk.
= [I
2
]
tetrachloridas
/[I
2
]
vanduo
(1)

Tam tikslui 5 mL sočiojo jodo tirpalo anglies tetrachloride sumaišoma užkemšamoje kolbutėje su 50 mL
vandens. Maždaug 15–20 minučių mišinys intensyviai kratomas. Tada mišinys perpilamas į dalijamąjį piltuvėlį,
pastatomas į stovą ir paliekamas nusistovėti, kad organinė ir vandes fazės visiškai atsiskirtų.
Fazės atskiriamos į skirtingas stiklinėles. Į Erlenmejerio kolbą imama 3 mL jodo tirpalo tetrachloride,
pridedama 2 mL vandens ir įlašinami keli lašai sočiojo KI vandeninio tirpalo, pridedami keli lašai krakmolo
tirpalo. Prieš pradedant titruoti ir titravimo metu mišinys intensyviai supurtomas. Titruojama 0,02 M tiosulfato
tirpalu, kol išnyksta mėlyna spalva. Pasižymime titravimui sunaudoto tiosulfato tirpalo tūrį A, mL.
Tokia pačia seka titruojama ir vandeninė jodo fazė. Tik imama 30 mL vandens tirpalo ir, pridėjus tik kelis
lašus krakmolo tirpalo, titruojama tiosulfato tirpalu, kol išnyksta mėlyna spalva. Sunaudoto tiosulfato tirpalo tūrį
pažymėsime B, mL.
Molekulinio jodo pasiskirstymo konstanta bus
1
:

K
pasisk.
= 10A/B. (2)

Antrajuoju etapu atliekame analogišką eksperimentą tik naudodami ne gryną vandenį, o 0,1 M KI tirpalą. Į
išplautą kolbutę su kamščiu vėl pridedama 5 mL sočiojo jodo tirpalo anglies tetrachloride ir 50 mL 0,1 M KI
tirpalo. Vėl 15–20 min. mišinys intensyviai kratomas. Dabar dalis jodo, buvusio sočiajame anglies tetrachlorido
tirpale, pereina į vandeninę terpę, ir susidaro kompleksas KI
3
. Laikome, kad pasiskirstymo konstanta nepriklauso

1
Paaiškinkite, kodėl pasiskirstymo konstantą paprasčiau skaičiuoti pagal (2), o ne pagal (1) lygtį.
110
nuo vandenyje vykstančios reakcijos KI + I
2
↔ KI
3
. Pastaba: KI
3
iš esmės netirpsta anglies tetrachloride. Po 15–
20 min. išplautame dalijamame cilindre leidžiama atsiskirti organinei ir vandens terpėms.
Iš pradžių titruojami 3 mL anglies tetrachlorido tirpalo. Titravimo procedūra yra tokia pati kaip ir pirmuoju
etapu. Sunaudoto tiosulfato tirpalo kiekis pažymimas A
1
.
Vandens fazei titruoti imama 30 mL vandens tirpalo. Jame yra ištirpęs laisvasis jodas ir KI
3
kompleksas,
kuris titravimo metu skils, atpalaiduodamas laisvąjį jodą. Taigi bendrąjį tiosulfato tirpalo tūrį (mL), sunaudotą
vandeniniam tirpalui titruoti, pažymėjus B
*
, galima užrašyti:

B
*
= B
1
+ B
2
, (3)
čia:
B
1
– tiosulfato tirpalo tūris (mL), sunaudotas laisvajam jodui vandeninėje terpėje titruoti,
B
2
– tiosulfato tirpalo tūris (mL), sunaudotas susijungusiam į KI
3
junginį jodui titruoti.
B
1
lengvai randame į lygtį (2) įrašę eksperimentinę reikšmę A
1
. Žinodami, kad jodas reaguoja su tiosulfatu
ekvimoliškai, galime apskaičiuoti reakcijoje dalyvaujančių junginių pusiausvyrines koncentracijas:

[I
2
] = B
1
⋅ [Na
2
S
2
O
3
]/30, (4)

[KI
3
] = (B
*
− B
1
) ⋅ [Na
2
S
2
O
3
]/30, (5)

[KI] = 0,1 − [KI
3
], (6)
čia:
[Na
2
S
2
O
3
] – natrio tiosulfato molinė koncentracija (0,02 M),
[KI] – lygus 0,1 M.
Žinodami visų trijų junginių pusiausvyrines koncentracijas, apskaičiuojame pusiausvyros konstantą:

K
pus.
= [KI
3
]/{[I
2
]⋅ [KI]}. (7)

Atsiskaitymas

- pateikiami eksperimentiniai titravimo duomenys: A, B, A
1
, B
*
;
- pateikiamos apskaičiuotos pasiskirstymo ir pusiausvyros konstantos;
- paaiškinama eksperimento „logika“, užrašoma titravimo reakcija.

Literatūra

Вильямс, В. Р.; Вильямс. Г. Б. Физическая химия для биологов. Москва: Мир, 1976, с. 161–172.

111

4. Jonų pernašos ypatumų tyrimas

Darbo tikslas

Ištirti jonų judėjimą elektriniame lauke. Nustatyti katijonų ir
anijonų pernašos skaičius.

Tyrimo objektas

Tiriama elektros pernaša dėl neorganinės ar organines
rūgšties (bazės) jonų judėjimo vandeniniame tirpale.

Matavimo priemonės ir tirpalai

Elektrolizės indelis su grafito elektrodais. 25 mL biuretė su stoveliu, 5 ir 10 mL pipetės, plokščiadugnė 50–
100 mL kolbutė arba stiklinėlė, du 25 mL matavimo cilindrai. Nuolatinės srovės šaltinis, vario kulonometras.
Analizinės svarstyklės. Darbinis tirpalas – 0,1 M HClO
4
arba 0,1 M KOH. Tirpalai – titravimui 0,01 M NaOH
arba 0,01 M HCl, fenolftaleino tirpalas, vario kulonometro tirpalas – 0,2 M CuSO
4
+ 0,1 M H
2
SO
4
+ 0,001 M
tiokarbamido.

Darbo eiga

Surenkama elektrolizės schema. Indelis pripildomas dėstytojo ar laboranto nurodyto elektrolito (0,1 M
HClO
4
arba 0,1 M KOH). Vario kulonometro elektrodas kruopščiai nuplaunamas vandeniu, nusausinamas,
pasveriamas analizinėmis svarstyklėmis (4 skaičių po kablelio tikslumu) ir įstatomas į kulonometro indelį
1
.


1 pav. Elektrolizės schema:
1 – indelis su tiriamuoju elektrolitu, 2, 3 – grafitiniai elektrodai (anodas ir katodas), 4 – vario kulonometras su katodu ir
anodu, 5 – nuolatinės įtampos šaltinis, 6 – indelis katolitui, 7 – indelis anolitui

1
Jeigu darbe dėstytojo nurodymu kulonometras nenaudojamas, tai pratekėjęs pro celę elektros kiekis apskaičiuojamas pagal
ampermetro rodmenis ir elektrolizės trukmę.

112
Sujungiama elektrinė elektrolizės schema (žr. 1 pav.). Ji parodoma dėstytojui ar laborantui. Draudžiama
srovės šaltinį jungti į tinklą, neparodžius sujungtos schemos dėstytojui. Įjungiamas nuolatinės įtampos
šaltinis ir užfiksuojamas elektrolizės proceso pradžios laikas. Elektrolizės įtampa nustatoma tokia (10–20 V),
kad tekančios srovės stiprumas būtų apie 20 mA. Elektrolizė vykdoma 40–50 min. Pasižymėjus elektrolizės
laiką, srovės šaltinis išjungiamas, o katolitas ir anolitas tuojau pat išpilami į atskirus matavimo cilindrus ir juos
naudojant išmatuojami abiejų tirpalų tūriai.
Tarkime, darbe buvo tiriamas vienbazės rūgšties tirpalas. Titravimo būdu nustatoma, kiek molių rūgšties yra
katolite ir anolite. Titravimui atskirai imsime po 2 mL anolito ir katolito. Kiekvieną titravimą kartosime 2 kartus.
Taip pat du kartus nutitruosime po 2 mL pradinio rūgšties tirpalo. Imsime titravimo rezultato vidurkį.
Po elektrolizės rūgšties koncentracija katolite sumažės, o anolite padidės, palyginti su pradine rūgšties
koncentracija. Žinodami pradinę rūgšties koncentraciją, galime nustatyti rūgšties kiekio pokyčius anolite ir
katolite. Tarkime, kad katolito buvo A mL. Tada rūgšties kiekis A mL katolito prieš elektrolizę yra:

n
kat,1
= [0,01 ⋅ V
š,1
⋅ A/2]/1000,
čia:
V
š,1
– pradiniam rūgšties tirpalui titruoti sunaudoto šarmo kiekis, mL (imame dviejų titravimų rezultatų
vidurkį).
Po elektrolizės likęs rūgšties kiekis katolite yra:

n
kat,2
= [0,01 ⋅ V
š,2
⋅ A/2]/1000,
čia:
V
š,2
– katolito po elektrolizės titruojant sunaudoto šarmo kiekis, mL.
Rūgšties kiekio pokytis (sumažėjimas) katolite yra:

∆n
kat
= n
kat,2
– n
kat,1
.

Analogiškai apskaičiuosime ir rūgšties kiekio pokytį (padidėjimą) anolite.
Rūgšties kiekio pokyčiai katolite ir anolite leidžia apskaičiuoti katijonų ir anijonų tiriamajame tirpale
pernašos skaičius:

− ∆n
kat
= ∆n
an
= t

(Q/F), t
+
= 1 − t

,
čia:
∆n
kat
ir ∆n
an
– rūgšties kiekio sumažėjimas ir padidėjimas atitinkamai katolite ir anolite,
t

ir t
+
– atitinkamai anijono ir katijono pernašos skaičius,
Q – elektrolizės metu pratekėjęs elektros kiekis,
F – Faradėjaus skaičius (96480 C).
Q randamas pagal vario kulonometro rodmenis:

Q = 2[(m
2
− m
1
)/63,5] ⋅ F,
čia:
m
1
ir m
2
– atitinkamai vario kulonometrinės plokštelės masė prieš elektrolizę ir po elektrolizės.
Kai vario kulonometras nenaudojamas, srovės kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:

Q = Iτ ,
čia:
I – srovės stiprumas (A),
τ − elektrolizės laikas (s).
Toks srovės kiekio apskaičiavimas tinka tada, kai I = const elektrolizės metu. Priešingu atveju reikia integruoti
srovę pagal laiką.

113
Atsiskaitymas:

- pateikiami tiramos rūgšties ar bazės jonų pernašos skaičiai;
- paaiškinami stebėtieji reiškiniai ir matavimo principai.

Literatūra

1. Baltrūnas, G. Fizikinės chemijos laboratoriniai darbai. Elektrochemija. Vilnius: Vilniaus Universitetas.
2001, p. 3–6.
2. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6
th
edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 365–
371.
114

5. Molekulių dipolinio momento nustatymas

Darbo tikslas

Nustatyti polinės molekulės dipolinį momentą.

Tyrimo objektas

Tiriama dėstytojo nurodyta organinė polinė medžiaga. Taikant
Debajaus lygtį nustatomi molekulės poliarizuojamumas bei
individualus dipolinis momentas. Plokščiojo kondensatoriaus talpos
matavimo metodu nustatoma organinės medžiagos dielektrinė skvarba.

Matavimo priemonės

Kompleksinis skaitmeninis matuoklis M890F
1
, darbinių elektrodų pora, 50 g svarelis, polietileno plėvelės
tarpinė, perforatorius – priemonė kiaurymei polietileno plėvelėje išsikirsti, kelios popierinės servetėlės, dvi
graduotos 1 mL pipetės, stiklinėlė tirpalui pasiruošti, vienkartinės guminės pirštinės.

Darbo eiga

Darbas atliekamas trimis etapais. Pirmuoju etapu išmatuojama tuščios elektrodų sistemos ( 1 pav.) elektrinė
talpa ir apskaičiuojama sistemos konstanta:

cell
K
d
A
C = ε =
0 0
,
čia:
C
o
– tuščios elektrodų sistemos talpa,
A – darbinių elektrodų plotas (apytiksliai 3,2 cm
2
),
d – atstumas tarp elektrodų (apytiksliai 0,01 cm),
ε
o
– vakuumo dielektrinė skvarba (8,85 ⋅ 10
−14
F/cm).




1 pav. Medžiagų dipolinio momento matavimo elektrodų sistema


1
Žr. darbo su matuokliu M890F aprašymą.
115
Mūsų analizuojamos sistemos parametrai leidžia įvertinti apytikslę šios konstantos reikšmę:

K
cell
= 3,2 ⋅ 8,85 ⋅ 10
−14
/0,01 = 28,32 ⋅ 10
−11
F (28,32 pF).

Ši reikšmė priklauso nuo tikslios matavimo sistemos geometrijos, o ypač nuo dielektriko plėvelės storio d.
Jungiamiesiems laidams, kuriais objektas jungiamas prie prietaiso, būdinga ir vadinamoji „parazitinė talpa“.
Taigi norint padidinti matavimų tikslumą bei išvengti parazitinių laidų talpų įtakos, labai rekomenduojama prieš
kiekvieną matavimą nustatyti tuščios sistemos konstantą K
cell
. Tai atliekama matuojant tuščios elektrodų
sistemos talpą.
Elektrodų sistemą sudaro pagrindo plokštelė (a-elektrodas, 1 pav.), ant kurios padedama polietileninė
maždaug 0,01 cm storio plėvelė su apskrita apytiksliai 2 cm skersmens kiauryme centre. Ant plėvelės dedama
antroji metalinė plokštelė (b-elektrodas, 1 pav.) ir prispaudžiama 50 g svareliu. Kalibracinio matavimo metu
elektrodų sistema turi būti idealiai sausa.
Antrasis etapas. Išmatavus celės talpą, svarelis ir b-elektrodas nuimami ir pipete ant a-elektrodo paviršiaus
centre užlašinamas lašas gryno nepolinio tirpiklio
1
. Naudosime benzeną, nors dėstytojas savo nuožiūra gali
nurodyti ir kitą nepolinį tirpiklį. b-elektrodas grąžinamas į vietą ir prispaudžiamas svareliu. Išmatuojama grynojo
tirpiklio elektrinė talpa C
1
, pagal ją apskaičiuojama dielektrinė tirpiklio konstanta:

ε
1
= C
1
/K
cell
.

Trečiasis etapas. Sausai nuvalius elektrodus po antrojo etapo matavimo, tarp elektrodų užlašinamas lašas
polinės medžiagos tirpalo benzene. Tirpalą iš anksto turi pasiruošti pats studentas taip, kad tirpinio molinė dalis
būtų 0,2. Išmatuojama tirpalo talpa C
tirp
. Pagal ją apskaičiuojama tirpalo dielektrinė konstanta:

ε
tirp
= C
tirp
/K
cell
.

Skaičiavimai

Kadangi tiriamoji polinė medžiaga (tirpinys) yra ištirpinta nepoliniame tirpiklyje, skaičiavimams taikysime
molinių poliarizacijų adityvumo principą:

P
tirp.
= P
1
X
1
+ P
2
X
2
, (1)
čia:
P
1
, P
2
, X
1
ir X
2
– atitinkamai tirpiklio (indeksas 1) ir tirpinio (indeksas 2) molinės poliarizacijos ir molinės
dalys.
Tirpinio molinė poliarizacija gali būti nesunkiai apskaičiuota iš (1) lygties:

P
2
= ( P
tirp.
− P
1
X
1
)/X
2
. (2)

Dešinėje lygybės pusėje esančios P
tirp
ir P
1
randamos iš dielektrinių konstantų pagal lygtis:

P
tirp.
= [(ε
tirp.
− 1)/( ε
tirp.
+ 2)] ⋅ (M
tirp.
/ρ) ir P
1
= [(ε
1
− 1)/(ε
1
+ 2)] ⋅ (M
1
/ρ),

M
tirp.
= M
1
X
1
+ M
2
X
2
(M
tirp.
yra vidutinė tirpalo masė), o tirpalo tankį prilyginsime tirpiklio (benzeno)
tankiui.
Apskaičiavę P
2
, užrašome tirpinio Debajaus lygtį:


1
Šis darbas turi būti atliekamas traukos spintoje arba labai gerai vėdinamoje patalpoje. Naudojami tirpikliai yra kenksmingi
sveikatai ir didesnės jų koncentracijos ore gali sukelti sunkius apsinuodijimus.
116
T k
N N
P
B
A A
0
2
0
2
9 3 ε
µ
+
ε
α
= , (3)
čia:
N
A
– Avogadro skaičius,
ε
0
– vakuumo dielektrinė skvarba 8,85 ⋅ 10
−14
F/cm,
k
B
– Bolcmano konstanta, lygi 1,3806 ⋅ 10
−23
J/K,
T – absoliučioji temperatūra,
α - poliarizuojamumas,
µ − dipolinis momentas.
Medžiagos poliarizuojamumas yra nustatomas atliekant molinės refrakcijos matavimus. Šiame darbe
poliarizuojamumų nenustatysime. Pasinaudodami lentelėse pateikiamomis žinomų organinių medžiagų
molekulių poliarizuojamumo reikšmėmis, pagal eksperimentinę P
2
reikšmę iš (3) lygties apskaičiuojame
molekulės dipolinį momentą. Kai kurių organinių medžiagų poliarizuojamumo reikšmės nurodytos priedo
lentelėje.

Atsiskaitymas

- pateikiama apskaičiuota dipolinio momento reikšmė;
- paaiškinami stebėti reiškiniai ir principai, kuriais remiantis buvo atliekami matavimai.

Literatūra

1. Daujotis, V.; Jankauskas, T.; Kaikaris, V.; Levinskas, A.; Skučas, V. Fizikinės chemijos laboratoriniai
darbai. Vilnius: Vilniaus Universitetas. 1986, p. 7–22.
2. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6
th
edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 700–
711.
3. Atkins, P. Physical Chemistry. W. H. Freeman and Company. San Francisco. Second Edition. 1978, p. 766–
778.

Priedas
Kai kurių organinių medžiagų poliarizuojamumas
1


Junginys α/10
−36
, J
−1
C
2
cm
2

CH
3
Cl 5,04
CH
2
Cl
2
7,57
CH
3
OH 3,59
Kamparas 0,365

1 debajus = 3,338×10
−30
C⋅m = 3,338 ×10
−28
C⋅cm


1
Kai kada molekulių poliarizuojamumai literatūroje pateikiami Å
3
arba cm
3
, t. y. tūrio vienetais. Šis dydis vadinamas
poliarizuojamumo tūriu ir žymimas α’. Poliarizuojamumą α galima apskaičiuoti iš α’ pagal lygtį:
α = α’ 4π ε
o
. Šioje lygtyje α’ turi būti išreikštas cm
3
, todėl reikia prisiminti, kad 1 Å
3
= 10
−24
cm
3
.
117

6. Difuzijos koeficiento nustatymas
sukamuoju diskiniu elektrodu

Darbo tikslas

Naudojant sukamąjį diskinį elektrodą nustatyti redokso
aktyviosios dalelės difuzijos koeficientą.

Tyrimo objektas

Nustatysime hidroksimetilferoceno difuzijos koeficientą,
tirdami jo oksidaciją

HMF – e <=> HMF
+
,

ant sukamo diskinio auksinio arba grafitinio elektrodo
1
.

Matavimo priemonės

Poliarografinis analizatorius PA-3, leidžiantis tiesiškai keisti poliarizuojamąją įtampą. Elektrocheminė celė
su lyginamuoju sidabro chloridiniu elektrodu, pripildytu sočiojo NaCl tirpalo, ir pagalbiniu Pt arba grafito
elektrodu. Sukamojo diskinio elektrodo stendas su dažniamačiu apsisukimų dažniui matuoti.
Matavimams naudojamas fosfatinis 0,1 M buferinis tirpalas (pH = 6,86), turintis 0,1 M NaClO
4
elektriniam
tirpalo laidumui padidinti
2
. Hidroksimetilferoceno 10 mM
3
tirpalas tame pačiame buferyje. Dvi 5 mL pipetės ir
50 mL stiklinėlė.

Darbo eiga

Tiriamasis tirpalas ruošiamas iš esamo buferinio ir hidroksimetilferoceno tirpalų. Pipete paimami 20 mL
buferio ir 5 mL hidroksimetilferoceno tirpalų, sumaišomi stiklinėlėje ir supilami į elektrocheminę celę. Celė
uždengiama dangteliu, o pro dangtelio kiaurymes sustatomi palyginamasis ir pagalbiniai elektrodai. Celė,
atsargiai prilaikant iš apačios, pakeliama ir užfiksuojama taip, kad sukamas diskinio elektrodo strypelis pasinertų
į tirpalą (kaip parodyta 2 pav.).
Sukamojo diskinio elektrodo apsukų matavimo blokelio koaksialinis laidas prijungiamas prie dažnimačio.
Jeigu bus naudojamas dažnimatis Ч3-33, tai kabelis jungiamas į „A“ lizdą, o dešinėje pusėje esančiomis
rankenėlėmis Nr. 1 ir Nr. 2 nustatomas dažnio matavimo režimas „f“ bei skaičiavimo laikas „1 s“. Taip
nustatytas dažnimatis rodys sukamojo elektrodo apsisukimų per 1 min. skaičių. Elektrodai jungiamaisiais laidais
prijungiami prie poliarografinio analizatoriaus. Valdymo rankenėlėmis Nr. 1, Nr. 2 ir Nr. 6 nustatomas pradinis
potencialas, skleidimo amplitudė ir potencialo skleidimo greitis, jungikliu Nr. 4 – potencialo skleidimo kryptis.
Priklausomai nuo konkrečios elektrocheminės sistemos šie parametrai gali skirtis, todėl dirbant būtina
pasikonsultuoti dėl šių dydžių su dėstytoju ar laborantu.
Įjungiamas sukamasis diskinis elektrodas ir palaukiama, kol stabilizuosis dažniamačio registruojamos
sukimosi reikšmės. Tada įjungiama celė ir dvikoordinačiu saviraščiu užrašoma ciklinė voltamperograma.
4


1
Dėstytojo nurodymu gali būti nustatomas kitos elektroaktyvios medžiagos difuzijos koeficientas.
2
Vietoj NaClO
4
kaip viena iš buferio sudėtinių medžiagų gali būti naudojamas 0,1 M KCl.
3
Hidroksimetilferocenas kambario temperatūroje neištirpsta iki 10 mM, todėl tirpalas yra drumstas. Hidroksimetilferoceno
tirpalą, prieš imant skiedimui, reikia pašildyti iki maždaug 50–60 °C.
4
Matavimų sekos aprašą studentas gauna laboratorijoje.
potencialas
s
r
o
v
ė
I
rib
1 pav. Srovės priklausomybė nuo
potencialo
118





Tipiška sukamojo diskinio elektrodo voltamperograma (srovės i priklausomybė nuo potencialo E) parodyta
1 pav. Šiame darbe reikia gauti kelias voltamperogramas, esant skirtingiems diskinio elektrodo sukimosi
greičiams
1
. Paprastai gaunamos 4–5 voltamperogramos.

Skaičiavimai

Užrašius 4–5 voltamperogramas, nustatomos difuzinės ribinės srovės reikšmės. Lygtis, susiejanti difuzijos
ribinę srovę I
rib.
su diskinio elektrodo sukimosi greičiu, vadinama Levičo (Levich) lygtimi ir yra [2]:

I
rib
= 0,620nFAD
o
2/3
ω
1/2
v
−1/6
C
o
*
. (1)
čia:
A – diskinio elektrodo plotas (cm
2
),
D
o
– elektroaktyviosios medžiagos difuzijos koeficientas (cm
2
/s),
ω – sukamojo diskinio elektrodo sukimosi greitis rad/s,
v – kinematinis klampis (cm
2
/s), kurio reikšmė praskiestų vandeninių tirpalų, kai t = 20 °C, yra
artima 0,01 cm
2
/s,
C
o
*
– elektroaktyvios medžiagos koncentracija tirpale (mol/cm
3
),
n – elektronų, dalyvaujančių redokso reakcijoje, skaičius,
F – Faradėjaus konstanta (96 500 C/mol).
Kaip matome iš lygties, tarp ribinės srovės ir kvadratinės šaknies iš diskinio elektrodo sukimosi greičio turi
būti tiesinė priklausomybė.


1
Sukamojo diskinio elektrodo sukimosi greičiai keičiami tik su laboranto ar dėstytojo pagalba ir jiems nurodžius.
Sukamojo disko
elektrodo kontaktas
Sukamasis diskinis
elektrodas
Palyginamasis
Ag/AgCl elektrodas
Elektrocheminė celė su
elektrolitu
Pagalbinis grafito elektrodas
2 pav. Matavimo priemonių surinkimo schema
119
Atsiskaitymas

- darbo rezultatai pateikiami tokios lentelės pavidalu:

Eil. nr. Sukimosi greitis, rad ⋅ s
−1
Ribinė srovė, A


Pagal šiuos duomenis brėžiama grafinė priklausomybė I
rib.
nuo ω
0,5
; nustatomas tiesės nuolinkio kampo
koeficientas α. Pagal (1) lygtį matome, kad:

α = 0,620nFAD
o
2/3
v
−1/6
C
o
*
,

- iš šios lygties randame elektroaktyvios medžiagos difuzijos koeficientą.

Literatūra

Bard, Allen J. and Faulkner, Larry R. Electrochemical Methods. John Willey & Sons, New York. 1980, p. 230–
231.

120

7. Elektrono pernašos greičio konstantos
nustatymas ciklinės voltamperometrijos
metodu

Darbo tikslas

Nustatyti heterogeninės elektrono pernašos konstantą ciklinės
voltamperometrijos metodu.

Tyrimo objektas

Tiriama elektrono pernaša kalio heksacianoferato redokso
reakcijoje ant inertinio Au (arba Pt) elektrodo. Joninė tiriamos
oksidacijos-redukcijos reakcijos lygtis:

Fe(CN)
6
3−
+ e <=> Fe(CN)
6
4−
.

Ši reakcija lengvai vyksta ant inertinių elektrodų, reakcijos reagentai ir produktai stabilūs.
1


Matavimo priemonės

Poliarografinis analizatorius PA-3, leidžiantis tiesiškai keisti poliarizuojamąją įtampą. Elektrocheminė celė
su darbiniu Au (arba Pt) elektrodu, palyginamasis sidabro chlorido elektrodas, pripildytas sočiojo KCl tirpalo,
pagalbinis Pt elektrodas. Matavimams − fosfatinis 0,01 M buferinis tirpalas (pH = 7,0), turintis 0,1 M KCl
elektriniam tirpalo laidumui padidinti. 0,1 M redokso medžiagos (K
4
Fe(CN)
6
arba K
3
Fe(CN)
6
) tirpalas tame
pačiame buferyje, 50 mL matavimo cilindras, 5 mL pipetė ir stiklinėlė.

Darbo eiga

Tiriamasis tirpalas ruošiamas iš esamo buferinio ir redokso medžiagos tirpalų. Pipete paimamas reikiamas
oksidacinės-redukcinės medžiagos tūris (alikvota) ir perkeliamas į matavimo cilindrą. Į stiklinėlę įpilame
buferinio tirpalo ir iš jos pamažu, atsargiai maišydami, perpilame reikiamą kiekį buferio į matavimo cilindrą.
Konkrečią tiriamo tirpalo koncentraciją nurodo dėstytojas. Studentas pats apskaičiuoja reikiamus tirpalų tūrius.
Skaičiavimo pavyzdys. Užduotis – pasiruošti 50 mL 0,01 M redokso medžiagos tirpalą fosfatiniame buferyje.
Imame 5 mL 0,1 M redokso medžiagos tirpalo ir perkeliame į matavimo cilindrą. Pridedame fosfatinio buferio
iki 50 mL.
Pagamintas tirpalas supilamas į elektrocheminę celę. Celė uždengiama dangteliu, o pro dangtelio kiaurymes
sustatomi darbinis, palyginamasis ir pagalbinis elektrodai. Elektrodai jungiamaisiais laidais prijungiami prie
poliarografinio analizatoriaus. Šio valdymo rankenėlėmis nustatomas pradinis potencialas, potencialo skleidimo
greitis ir skleidimo amplitudė, įjungiama celė ir dvikoordinačiu saviraščiu užrašoma ciklinė voltamperograma.
2

Tipinė voltamperograma (srovės i priklausomybė nuo potencialo E) parodyta 1 pav. Šiame darbe reikia gauti
kelias voltamperogramas, esant skirtingiems potencialo skleidimo greičiams.


1
Dėstytojas gali nurodyti tirti ir kitą oksidacijos-redukcijos reakciją.
2
Matavimų sekos aprašą studentas gauna laboratorijoje.

1 pav. Tipinė voltamperograma
121


Skaičiavimai

Tipiška voltamperograma turi du srovės maksimumus – katodinį, kuris esti skleidžiant potencialą neigiama
kryptimi, ir anodinį, kai potencialas sklinda teigiama kryptimi. Atstumas tarp šių maksimumų ∆E leidžia
apskaičiuoti heterogeninį elektrono pernašos greitį tarp redokso dalelės ir elektrodo. Kuo lėtesnė elektrono
pernaša, tuo didesnis atstumas tarp maksimumų. Kai pernaša vyksta labai greitai, ∆E artėja į ribą, kuri 298 K
temperatūroje yra lygi 58 mV, jei redokso reakcija yra vienelektronė. Labai svarbu, kad atstumas tarp srovės
maksimumų priklauso nuo potencialo skleidimo greičio. Didėjant skleidimo greičiui, atstumas didėja, todėl
įmanoma nustatyti greitesnių elektrono pernašos reakcijų konstantas.
Elektrono pernašos greičio konstanta skaičiuojama pagal lygtį (1):

[ ]
2 1
0
2
/
O
/
R
O
) RT / nF ( v D
k
D
D
π








= ψ
α
, (1)
čia:
k
0
– elektrono pernašos greičio konstanta (cm/s),
D
o
– oksiduotos redokso formos difuzijos koeficientas,
D
R
– redukuotos formos difuzijos koeficientas (cm
2
/s),
v – potencialo skleidimo greitis (V/s),
n – elektronų, dalyvaujančių oksidacijos-redukcijos reakcijoje, skaičius,
F – Faradėjaus konstanta (96500 C/mol),
R – universalioji dujų konstanta, lygi 8,31 J/(K mol),
T – absoliučioji temperatūra,
α – elektrodinio proceso simetrijos koeficientas (artimas 0,5).
Funkcija ψ yra bedimensė skaitinė funkcija, nusakanti ryšį tarp ∆E ir elektrono pernašos greičio konstantos.
Jos reikšmės pateiktos 1 lentelėje.

1 lentelė. Ryšys tarp kinetinės funkcijos ψ ir atstumo tarp katodinio ir anodinio srovės maksimumų

ψ
20 7 6 5 4 3 2 1 0,75 0,5 0,35 0,25 0,10
∆E,
mV
61 63 64 65 66 68 72 84 92 105 121 141 212

Jei atstumo tarp maksimumų reikšmės nėra lentelėje, ji randama tiesinės interpoliacijos būdu. Tokiu būdu
eksperimentiškai išmatavę ∆E, esant keliems potencialo skleidimo greičiams, pagal lygtį (1) apskaičiuojame
elektrono pernašos greičio konstantą. Skaičiuojama supaprastinus D
O
≈ D
R
, o D
O
reikšmė randama žinyne arba
nurodoma dėstytojo. Jeigu tiriama elektrono pernaša ferocianidinėje redokso sistemoje, taikoma D
O
reikšmė, lygi
0,6 ⋅ 10
−5
cm
2
/s.

Atsiskaitymas

- rezultatai pateikiami tokioje eksperimentinių duomenų lentelėje (2 lentelė):





122
2 lentelė

Apskaičiuota konstantos reikšmė, k
o
(cm/s) Potencialo skleidimo greitis, (V/s)



- apskaičiuojama vidutinė konstantos reikšmė ir standartinė paklaida.

Literatūra

1. Bard, Allen J. and Faulkner, Larry R. Electrochemical Methods. John Willey & Sons, New York 1980, p.
230–231.
2. Кулис, И.; Разумас, В. Биоамперометрия. Вильнюс: Мокслас, 1986, с. 51–58.

123

8. Koligatyviosios tirpalų savybės
1 11 1
.
Krioskopija

Darbo tikslas

Nustatyti nežinomos kietosios medžiagos
molekulinę masę, pritaikant koligatyvines tirpalų
savybes.

Tyrimo objektas

Krioskopinis efektas – viena tirpalų
koligatyvinių savybių, pasireiškianti tirpalo
stingimo temperatūros sumažėjimu, palyginti su
grynojo tirpiklio. Šiame darbe kaip tirpiklis bus
naudojamas išlydytas kamparas.

Matavimų priemonės

Skenuojantis diferencinis kalorimetras DSK
2
. Analizinės svarstyklės.

Darbo eiga

Į skenuojančio diferencinio kalorimetro aliumininį mikrokonteinerį atsveriama apie 40 ± 4 mg kamparo
kristalų (tiksli reikšmė pasižymima laboratoriniuose užrašuose). Į tą patį konteinerį taip pat atsveriama ir
įdedama apie 4–5 mg nežinomos medžiagos, kurią studentui pateikia laborantas arba dėstytojas. Tai yra
tiriamasis mišinys. Šias mases pasižymime užrašuose atitinkamai m
tirpiklio
ir m
x
. Į kitą (kontrolinį)
mikrokonteinerį atsveriama tik 40 mg kamparo kristalų. Reikia stengtis, kad ši masė nesiskirtų daugiau nei 1–
2 mg nuo į pirmąjį konteinerį atsvertos kamparo masės. Tai yra palyginamasis pavyzdys.
Nustatoma 130 °C pradinė skenuojančio kalorimetro temperatūra bei temperatūros didėjimo greitis
1 °C/min.
3
ir įjungiamas kalorimetro temperatūros skenavimas. Įjungus skenavimą, prietaisas automatiškai
didins pavyzdžio ir kontrolinio konteinerių temperatūrą nustatytu greičiu. Taigi kiekvienu laiko momentu atitiks
nustatytas pavyzdžių temperatūras. Pavyzdžiui, kai skenavimo greitis yra 1 °C/min., o pradinė temperatūra –
130 °C , praėjus 10 min. nuo eksperimento pradžios, pavyzdžių temperatūra bus 130 °C + 10 °C.
Kalorimetro veikimo metu, keliant tiriamojo ir palyginamojo pavyzdžių temperatūrą, matuojamas tiriamojo
mišinio ir palyginamojo pavyzdžio konteinerių šiluminės galios srautų skirtumas. Jei, tarkime, tam tikroje
temperatūroje įvyksta fazinis virsmas − lydymasis, kurio metu pavyzdys absorbuoja energiją, tai, norint
palaikyti nustatytąjį temperatūros kilimo greitį, tiekiamos energijos galią reikia padidinti – ir atvirkščiai. Tokiu
būdu, atliekant pavyzdžio diferencinį kalorimetrinį tyrimą, galima nustatyti fazinio virsmo – lydymosi
temperatūrą ir energijos kiekį, absorbuotą ir išskirtą fazinio virsmo metu. Šiame darbe mus domins tiksli fazinio
virsmo temperatūra.


1
Koligatyviosios tirpalo savybės − tai savybės, priklausančios tik nuo tirpiklio fizikinio ir cheminio būvių, bet ne nuo
tirpinio. Vienintelis tirpinio parametras, turintis įtakos koligatyvinėms savybėms, yra jo koncentracija (pvz., molinė dalis).
2
Principinė kalorimetro schema parodyta 1 pav., taip pat žiūrėkite darbo su skenuojančiu diferenciniu kalorimetru
aprašymą-instrukciją.
3
Dėstytojas gali nurodyti kitą pradinę kalorimetro temperatūrą ir skenavimo greitį.


Konteineris
Tiriamasis pavyzdys
Palyginamasis
pavyzdys
Kaitikliai
Kompiuteris, valdantis šilumos
srautus ir temperatūrą
1 pav. Principinė kalorimetro schema
124
-30
-10
10
30
50
70
0 20 40 60
Laikas, min,
G
a
l
i
a
,

s
a
n
t
y
k
i
n
i
a
i
s

v
i
e
n
e
t
a
i
s
∆T
Grynasis kamparas Tirpalas








2 pav. Tipinė diferencinė skenuojančio kalorimetro
termograma. Tirpalo lydymosi kreivės dalis pažymėta
raudonais, o grynojo tirpiklio – mėlynais taškais

Tipiška diferencinė kalorimetrinė kreivė – termograma pavaizduota 2 pav. Kaip matome, keliant temperatūrą
(laiko koordinatės ašis), kreivė iš pradžių kinta gana monotoniškai. Pasiekus tirpalo lydymosi tašką, kreivė
staigiai kyla. Šis kilimas susijęs su tirpiklio lydymusi, esant tirpinio. Kadangi vykstant lydymosi procesui
sunaudojama energija, galios srautas tiriamojo mišinio konteineryje yra žymiai didesnis nei grynojo tirpiklio
(kamparo) palyginamajame konteineryje, kreivė tada siekia maksimumą.
Išsilydžius tirpalui, toliau kylant temperatūrai, pasiekiamas grynojo tirpiklio lydymosi taškas. Dabar jau
palyginamojo konteinerio galios srautas žymiai viršija galios srautą į tiriamąjį konteinerį, todėl kreivė krinta iki
minimumo. Užfiksavus visą kreivę, pagal maksimumo ir minimumo padėčių skirtumą temperatūros ašyje galima
nustatyti stingimo temperatūros depresiją (sumažėjimą) ∆T.
1
Tirpiklio stingimo temperatūros pokytį ir tirpinio
molialinę koncentraciją nusako ši sąsaja:

∆T = K
fp
m, (1)
čia:
∆T – stingimo temperatūros pokytis laipsniais,
K
fp
– krioskopinė tirpiklio konstanta, kuri kamparo yra lygi 40 K kg⋅mol
−1
,
m – molialinė tirpinio koncentracija, išreikšta mol⋅kg
−1
.
Kadangi eksperimentiškai nustatome ∆T ir žinome K
fp
, tai pagal (1) lygtį nesunkiai galime apskaičiuoti mūsų
tiriamos nežinomos medžiagos molialinę koncentraciją. Žinant molialinės koncentracijos reikšmę, pagal
molialinės koncentracijos apibrėžimą:

m = n
x
/m
tirpiklio
= m
x
/(M
x
m
tipriklio
),
čia:
n
x
– nežinomos medžiagos atsvertų molių skaičius,
M
x
– randama nežinomos medžiagos molinė masė.
Pagal diferencinės kalorimetrinės kreivės plotį įvertiname molinės masės nustatymo paklaidą.


1
Skenavimą gali tekti kartoti kelis kartus. Mat dėl netolygaus kietųjų medžiagų susimaišymo pradiniame mišinyje mišinio
lydymosi temperatūros intervalas gali būti labai neaiškus, pasklidęs. Todėl, rekomenduojama tą patį mišinį skenuoti bent
3−4 kartus.
125



Atsiskaitymas

- pateikiama diferencinė termograma. Nustatoma temperatūros depresija ir įvertinama galima ∆T paklaida.
Pagal diferencines kalorimetrines kreives įvertinama kamparo lydymosi temperatūra;
- pateikiama apskaičiuota nežinomos medžiagos molinė masė. Dėstytojui pateikus procentinę nežinomos
medžiagos elementinę sudėtį studentai privalo nustatyti vieną ar keletą galimų tirpinio izomerų.

Literatūra

1. Valinčius, G. Darbo su DSK aprašymas. Vilnius, 2003.
2. Barrow, G. M. Physical Chemistry. 6
th
edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1996, p. 297–
302.



126
B Bi io oc ch he em mi ij jo os s p pa ag gr ri in nd da ai i
Laboratoriniai darbai
Romualdas Marcišauskas, Vilma Michailovienė, Jolanta Giedrienė, Artūras Jakubauskas, Aurelija Žvirblienė

1. Kiekybiniai baltymų nustatymo metodai
Romualdas Marcišauskas

Darbo tikslas

Nustatyti baltymų koncentraciją mėginiuose Lowry, Bradfordo ir spektrofotometriniu metodais.

Tyrimo objektas

Jaučio serumo albuminas (JSA).

Matavimo priemonės

Automatinės 20 µL, 200 µL, 1000 µL, 5000 µL pipetės, maišyklė, spektrofotometras SF26, svarstyklės.

Darbo eiga

Lowry metodas:
Metodas pagrįstas specifine baltymo sąveika su Folino reagentu ir susidariusio komplekso matavimu
spektrofotometriškai, kai bangos ilgis yra 750 nm.
Tirpalai:
1. Reagentas A: 1 % CuSO
4
⋅ 5H
2
O tirpalas, 100 mL.
2. Reagentas B: 2 % NaK tartrato tirpalas, 100 mL.
3. Reagentas C: 0,2 N NaOH tirpalas, 1000 mL.
4. Reagentas D: 4 % Na
2
CO
3
tirpalas, 500 mL;
5. Reagentas E: ruošiamas prieš pat baltymų nustatymo bandymą. 49 mL reagento C sumaišoma su 49 mL
reagento D ir pridedama po 1 mL reagento A ir reagento B.
6. Reagentas F: 10 mL Folino reagento sumaišoma su 10 mL distiliuoto vandens.
7. JSA tirpalas: 50 mg JSA ištirpinama 50 mL distiliuoto vandens. Iš šio pradinio tirpalo imami žinomo
tūrio mėginiai (žr. lent.), ir iki 25 mL skiedžiami distiliuotu vandeniu.

Eil. nr. JSA pradinio tirpalo tūris, mL
Iki 25 mL skiesto JSA tirpalo koncentracija, C
mg/mL
1 0,25 0,01
2 0,50 0,02
3 0,75 0,03
4 1,00 0,04
5 1,25 0,05
6 1,75 0,07
7 2,50 0,10
8 3,75 0,15

Matavimo eiga:
Atliekamas bandymas baltymų kalibracinei tiesei sudaryti. Į pirmąjį mėgintuvėlį pilama 0,5 mL
distiliuoto vandens, o į 2–9 mėgintuvėlius − po 0,5 mL skiesto JSA tirpalo (žr. lentelę, 1–8 mėginiai). Tada į
visus mėgintuvėlius pilama po 2,5 mL reagento E. Mėginiai skubiai išmaišomi maišyklėje ir po 10 min.
pridedama po 0,25 mL reagento F (Folino reagentas). Greitai išmaišoma ir laikoma 30 min. tamsoje. Po
30 min. mėginiai matuojami spektrofotometru, esant bangos ilgiui 750 nm. Pirmasis mėgintuvėlis
127
kontrolinis. Remiantis gautomis optinio tankio reikšmėmis brėžiamas grafikas – šviesos sugerties
priklausomybė nuo baltymo kiekio. Gaunama kalibracinė baltymų kiekio nustatymo tiesė.
Nežinomas baltymo kiekis nustatomas imant 0,5 mL tiriamojo baltymo tirpalo ir atliekant visas anksčiau
aprašytas operacijas. Gauti rezultatai palyginami su kalibracine tiese.
Bradfordo metodas
Metodas pagrįstas specifine baltymo sąveika su dažu Coomasie Brilliant Blue G-250 (CBB) ir
susidariusio komplekso koncentracijos matavimu spektrofotometriškai, kai bangos ilgis 595 nm.
Tirpalai:
1. CBB tirpalas (Bradfordo reagentas): 100 mg CBB dažo ištirpinama 50 mL etilo alkoholio, tirpalas
filtruojamas pro stiklo filtrą, į filtratą pridedama 100 mL 85 % arba 134,64 mL 70 % ortofosforo rūgšties
ir skiedžiama vandeniu iki 1000 mL.
2. JSA standartinis tirpalas (žr. Lowry metodą).
Matavimo eiga:
Atliekamas bandymas baltymų kalibracinei tiesei sudaryti. Į pirmąjį mėgintuvėlį pilama 0,2 mL
distiliuoto vandens, o į 2–9 mėgintuvėlius − po 0,2 mL skiesto JSA tirpalo (1–8 mėginiai, žr. lentelę). Tada į
visus mėgintuvėlius pilama po 2,5 mL CBB tirpalo. Mėginiai skubiai išmaišomi maišyklėje ir po 15–20 min.
matuojami spektrofotometru, esant bangos ilgiui 595 nm. Pirmasis mėgintuvėlis bus kontrolinis.
Remiantis gautomis optinio tankio reikšmėmis brėžiamas grafikas − šviesos sugerties priklausomybė
nuo baltymo koncentracijos. Gaunama kalibracinė baltymų kiekio nustatymo tiesė.
Nežinomas baltymo kiekis nustatomas imant 0,2 mL tiriamojo baltymo tirpalo ir atliekant visas anksčiau
aprašytas operacijas. Gautieji rezultatai palyginami su kalibracine tiese.
Spektrofotometrinis metodas
Baltymų tirpalai sugeria ultravioletinius spindulius 280 nm srityje. Aromatinių aminorūgščių (tirozino,
fenilalanino, triptofano), kurios sugeria spindulius esant bangos ilgiui 280 nm, kiekis įvairiuose baltymuose
nėra vienodas, todėl šis nustatymo būdas nėra griežtai kiekybinis. Apytikriai galima teigti, kad
spektrofotometro kiuvetėje, esant baltymo koncentracijai 1 mg/mL, tirpalo sluoksnio storiui 1 cm (kiuvetės
storis), optinis tankis lygus 1. Nustatomas nežinomas baltymo kiekis tirpale.

Atsiskaitymas
- Pateikiamos Lowry ir Bradfordo metodų kalibracinės baltymų nustatymo tiesės;
- nustatoma tiriamojo baltymo kiekis:
Lowry metodu;
Bradfordo metodu;
spektrofotometriniu metodu.

Literatūra

1. Lowry, O.; Rosebruoght, N.; Farr, A.; Randall, R.; J. Bio. Chem. 193, 1951, p. 265–275.
2. Марцишаускас, Р.; Тарасявичене, Л.; Канопкайте, С. В кн.: Методы в биохимии. Вильнюс. 1975.
с. 5–13.
3. Bradford, M. Anal. Biochem. 72, 1976, p. 248–254.
4. Практикум по биохимии (Под ред. С. Е. Северина и Г. А. Соловъевой) Изд. МГУ. 1989, с. 80–83.

128

2. Alkoholdehidrogenazės pradinio fermentinės reakcijos greičio ir
aktyvumo nustatymas
Romualdas Marcišauskas

Darbo tikslas

Nustatyti alkoholdehidrogenazės (ADH) pradinį reakcijos greitį ir aktyvumą.

Tyrimo objektas

Mielių ADH.
Matavimo priemonės

Automatinės 200 µL, 1000 µL, 5000 µL pipetės, spektrofotometras SF26 su kiuvete, kurioje palaikoma
pastovi temperatūra, svarstyklės.

Darbo eiga

Darbo esmė. Fermentas ADH priklauso oksidoreduktazių klasei ir katalizuoja reakciją:

ADH
C
2
H
5
OH + NAD
+
↔ CH
3
CHO + NADH + H
+


Vykstant oksidacijos-redukcijos procesams, kuriuos katalizuoja nikotininių kofermentų turinčios
dehidrogenazės, kinta kofermentų absorbcijos maksimumai. NAD
+
ir NADH absorbuoja šviesą, esant bangos
ilgiui 260 nm. Tačiau esant bangos ilgiui 340 nm, absorbuoja tik NADH, o NAD
+
absorbcija iš esmės
nevyksta. Todėl vienos kofermento formos perėjimą į kitą labai patogu sekti registruojant spektrofotometru
optinio tankio kitimą, esant bangos ilgiui 340 nm.
Kai fermentinės reakcijos grįžtamosios, reakcijos produktai turi didelės įtakos fermentinių reakcijų
greičiui, todėl dažnai labai svarbu nustatyti pradinį reakcijos greitį.
Tirpalai:
1. 0,06 M natrio pirofosfatinis buferis, pH 8,5, 500 mL.
2. 3 M etilo alkoholio tirpalas, 100 mL.
3. 0,015 M NAD
+
tirpalas (50 mg NAD
+
ištirpinama 5 mL distiliuoto vandens) ruošiamas prieš bandymą.
4. ADH tirpalas (1 mg ADH ištirpinama 1 mL distiliuoto vandens). Iš šio tirpalo prieš bandymą ruošiami
25, 50 ir 100 kartų skiesti tirpalai.
Pradinio fermentinės reakcijos greičio nustatymas
NADH absorbcijos pokytis matuojamas spektrofotometru 30 °C temperatūroje, esant bangos ilgiui
340 nm. Į 3 mL talpos spektrofotometro kiuvetę įpilama:
• 2,2 mL distiliuoto vandens;
• 0,5 mL 0,06 M natrio pirofosfatinio buferinio tirpalo, pH 8,5;
• 0,1 mL 3 M etilo alkoholio;
• 0,1 mL 0,015 M NAD
+
(galutinė koncentracija kiuvetėje 0,5 mM);
• 0,1 mL skiesto fermentinio tirpalo.
Prieš įpilant fermentinį tirpalą į kiuvetę, į kontrolinę kiuvetę įpilama 3 mL distiliuoto vandens ir
sureguliuojamas į kiuvetę patenkantis šviesos srauto kiekis. Tada į kiuvetę įpilama 0,1 mL fermentinio
tirpalo, greitai išmaišoma automatine pipete (įtraukiant ir atgal išpilant į kiuvetę tirpalą) ir kas 15 s 2–3 min.
registruojamas optinis tankis. Bandymas atliekamas su 100, 50 ir 25 kartus skiestais ADH tirpalais.
Pradinis reakcijos greitis išreiškiamas µM susidariusio produkto (NADH) per 1 minutę. Nubraižomi
optinio tankio (gauto per 2–3 min.) priklausomybės nuo laiko grafikai. Nubraižomos liestinės, kurios eina
per koordinačių pradžios tašką (žr. pav.). Nubraižomas pradinio reakcijos greičio priklausomybės nuo
fermento kiekio (praskiedimo) grafikas.
129



















Pradinio ADH reakcijos greičio nustatymas

Skaičiavimai

Pradinis fermentinės reakcijos greitis.
NADH molinis ekstinkcijos koeficientas yra lygus 6,22 ⋅ 10
3
, o mikromolinis – 0,00622.
Pradinis fermentinės reakcijos greitis skaičiuojamas taip:

s / A 15
340
∆ =
( ) ( )
2
30 45 15 30 s s s s
A A A A − + −
,

kadangi A = εxC,
A – optinis tankis, kai bangos ilgis 340 nm per minutę,
ε − NADH mikromolinis ekstinkcijos koeficientas,
C – pradinis fermentinės reakcijos greitis, išreikštas µM/min.

C =
00622 0
min.
340
,
/ A ∆
⋅ fermento praskiedimo kartai.

Fermento aktyvumas.
Kadangi ADH aktyvumo vienetu laikomas toks fermento kiekis, kuris generuoja 1 µmol NADH
susidarymą per 1 min., ir išreiškiamas aktyvumo vienetais mL (E/mL), tai 3 mL kiuvetėje susidariusio
produkto bus:

1000 mL −
00622 0
min.
340
,
/ A ∆
⋅ fermento praskiedimo kartai, arba C.

3 mL – X X =
1000 00622 0
min. 3
340

∆ ⋅
,
/ A
⋅ fermento praskiedimo kartai ⋅ 10.

Dauginame iš 10, nes į spektrofotometro kiuvetę įpilta 0,1 mL fermentinio tirpalo.
Gauname fermento aktyvumą (E/mL).




40 60 80 20

A
[NADH]

t (s) 100
130
Atsiskaitymas

- optinio tankio (gauto per 2–3 min. reakcijos) priklausomybės nuo laiko grafikai, skirtingai praskiedus
fermentą;
- pradinio reakcijos greičio priklausomybės nuo fermento kiekio grafikas;
- ADH pradinis reakcijos greitis (µM/min.);
- ADH aktyvumas (E/mL).

Literatūra

1. Valee, B. L.; Hoch, F. L. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 41, 1955, p. 327–338.
2. Walker , J. R. L. Biochem. Educ. 20(1), 1992, p. 42–43.
131

3. Nukleorūgščių nustatymo kiekybiniai metodai
Romualdas Marcišauskas

Darbo tikslas

Nustatyti bendrą nukleorūgščių (NR) kiekį Escherichia coli ląstelių biomasėje ir DNR bei RNR kiekį
tirpaluose.

Tyrimo objektas

E. coli ląstelių biomasė, DNR ir RNR tirpalai.

Matavimo priemonės

Automatinės 20 µL, 200 µL, 1000 µL, 5000 µL pipetės, spektrofotometras SF26, centrifuga K24,
svarstyklės, vandens vonia.

Darbo eiga

Bendrojo NR kiekio nustatymas
Kiekybinio nustatymo metodai pagrįsti į NR sudėtį įeinančių heterociklinių bazių geba absorbuoti šviesą
ultravioletinėje spektro dalyje. Tam būtina NR ekstrahuoti iš biologinio objekto ir jas hidrolizuoti iki
mononukleotidų. Vienas iš spektrofotometrinių NR nustatymo metodų, pasiūlytas A. Spirino, grindžiamas
nukleorūgščių ekstrakcija iš biologinio objekto karšta perchlorato rūgštimi ir tolesniu ekstrakto absorbcijos
nustatymu ultravioletinėje spektro dalyje, esant bangos ilgiams 270 nm ir 290 nm. NR kiekis
apskaičiuojamas pagal A. Spirino pasiūlytą formulę.
Tirpalai:
0,2 M HClO
4
tirpalas, 500 mL;
0,5 M HClO
4
tirpalas, 500 mL.
500 mg E. coli biomasės patalpinama į centrifuginį mėgintuvėlį ir užpilama 10 mL atšaldytos 0,2 M
perchlorato rūgšties. Mėgintuvėlio turinys kruopščiai sumaišomas ir centrifuguojama 5 min. 10000 × g
greičiu 0 °C temperatūroje. Šio proceso metu iš audinio pašalinami rūgštyje tirpūs laisvieji nukleotidai.
Centrifuguotos nuosėdos suspenduojamos 10 mL 0,5 M HClO
4
, perkeliamos į stiklinį mėgintuvėlį,
užkemšama kamščiu su įstatytu stikliniu vamzdeliu, šaldomu oro, ir 30 min. kaitinamos verdančio vandens
vonioje. NR visiškai ekstrahuojamos iš ląstelių ir hidrolizuojamos. Susidaro rūgštyse tirpūs produktai.
Hidrolizatas atšaldomas, centrifuguojamas (10 min. 10000 × g), nupilamas iki nuosėdų, skiedžiamas 200 ir
500 kartų 0,5 M HClO
4
ir matuojama spekrofotometru šviesos absorbcija, esant bangos ilgiams 270 nm ir
290 nm. Kaip kontrolinis tirpalas naudojama 0,5 M HClO
4
. Pagal formulę apskaičiuojamas 1 mL NR tirpale
esantis fosforo kiekis:

P C
g µ
=
19 0
290 270
,
D D −
,

0,19 – perskaičiavimo koeficientas, atitinkantis 1 µg NR fosforo, 1 mL tirpalo.
Norint apskaičiuoti NR kiekį, reikia fosforo kiekį padauginti iš koeficiento 10,3 ir praskiedimo kartų.

C
µg
NR = C
µg
P ⋅ 10,3 ⋅ praskiedimo kartai.

Gauname NR kiekį µg/mL.
Praskiesto NR tirpalo šviesos absorbcija matuojama dar kartą, esant bangos ilgiui 260 nm. Optinis tankis
turi būti apytikriai lygus reikšmei, gautai matuojant, kai bangos ilgis 270 nm (galimi ±15 % nuokrypiai).

132
DNR kiekio tirpaluose nustatymas
Tirpalai:
Jaučio blužnies DNR tirpalas.
DNR tirpalai sugeria ultravioletinius spindulius 260 nm srityje. Nustatyta, kad tirpalo sluoksnio storiui
esant 1 cm (kiuvetės storis) ir optiniam tankiui D = 1, DNR koncentracija atitinka 50 µg/mL.
Imami 4 mėgintuvėliai: į pirmuosius du mėgintuvėlius įpilama po 10 µL DNR tirpalo ir po 3 mL
distiliuoto vandens (skiedžiama 300 kartų), į antrus du − po 20 µL DNR tirpalo ir po 3 mL distiliuoto
vandens (skiedžiama 150 kartų). Tirpalai gerai išmaišomi maišyklėje. Mėginiai matuojami spektrofotometru,
esant bangos ilgiui 260 nm, kaip kontrolinį naudojant distiliuotą vandenį. Mėginių optinis tankis nustatomas
ir kai bangos ilgis 280 nm. Optinių tankių santykis 260 nm /280 nm rodo DNR tirpalų švarumą. Šis santykis
turi būti lygus arba didesnis nei 1,8.
Žinant praskiestų DNR tirpalų, esant bangos ilgiui 260 nm, optinio tankio reikšmes, apskaičiuojamas
DNR kiekis, µg/mL. Taikoma formulė:

C
µg
⋅ DNR/mL = D
260
⋅ 50 ⋅ praskiedimo kartai.

RNR kiekio tirpaluose nustatymas
Tirpalai:
Mielių RNR tirpalas.
RNR tirpalai sugeria ultravioletinius spindulius 260 nm srityje. Nustatyta, kad tirpalo sluoksnio storiui
esant 1 cm (kiuvetės storis) ir optiniam tankiui D = 1, RNR yra 40 µg/mL. Darbas atliekamas taip pat, kaip
ir nustatant DNR kiekį.
RNR kiekis, µg/mL, apskaičiuojamas pagal formulę:

C
µg
RNR/mL = D
260
⋅ 40 ⋅ praskiedimo kartai.

RNR tirpalų optinių tankių 260 nm/280 nm santykis turi būti ne mažesnis nei 1,8.

Atsiskaitymas

- NR koncentracija E. coli ląstelių biomasės ekstrakte (µg/mL);
- DNR tirpalo koncentracija (µg/mL);
- RNR tirpalo koncentracija (µg/mL).

Literatūra

1. Спирин, А. С. Биохимия 23(4), 1958, c. 656–662.
2. Маниатис, Т. ; Фрич, Э.; Сэмбрук, Дж. В кн.: Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984,
с. 410.

133

4. DNR išskyrimas iš Escherichia coli ląstelių biomasės
Romuoaldas Marcišauskas

Darbo tikslas

Išskirti DNR iš E. coli ląstelių biomasės, nustatyti DNR išeigą ir švarumą.

Tyrimo objektas

E. coli ląstelių biomasė.

Matavimo priemonės

Automatinės 20 µL, 200 µL, 1000 µL, 5000 µL pipetės, centrifuga K23D, spektrofotometras SF26,
ultratermostatas U15.

Darbo eiga

Tirpalai:
1. Ląstelių lizės buferinis tirpalas, 50 mL: 0,1 M EDTA tirpalas, pH 8,0, turintis 0,15 M NaCl. Pradiniai
tirpalai – 0,2 M EDTA, pH 7,5, 1 M NaCl.
2. Fermento lizocimo tirpalas: 10 mg lizocimo tirpinama 1 mL distiliuoto vandens (tirpalas ruošiamas prieš
naudojant).
3. Na dodecilsulfato tirpalas, 100 mL: 0,1 M Tris-HCl buferinis tirpalas, turintis 1 % Na dodecilsulfato ir
0,1 M NaCl, pH 9,0.
4. Distiliuoto fenolio buferinis tirpalas: 80 mL šviežiai perdistiliuoto fenolio sumaišoma su 20 mL
buferiniu tirpalu Nr. 3.
5. 0,15 M Na citrato tirpalas, turintis 1,5 M NaCl, 100 mL.
6. 0,0015 M Na citrato tirpalas, turintis 0,015 M NaCl pH 7,0, 100 mL (1 mL tirpalo Nr. 5 skiedžiamas iki
100 mL).
7. Ribonukleazės be deoksiribonukleazinių priemaišų tirpalas: 10 mg ribonukleazės A ištirpinama 5 mL
0,15 M NaCl tirpalo. Tirpalas pakaitinamas 10 min 80 °C (tirpalas ruošiamas prieš naudojant).
8. 0,15 M NaCl tirpalas, 100 mL.
9. 0,01 M Tris-HCl buferinis tirpalas pH 7,5, turintis 0,02 M NaCl, 100 mL.
10. 96 % etilo alkoholis.

Ląstelių lizė ir DNR išskyrimas
1 g E. coli ląstelių biomasės suspenduojama 1 mL ląstelių lizės buferinio tirpalo (Nr. 1), gerai išmaišoma
ir pridedama 0,2 mL lizocimo tirpalo (Nr. 2). Bakterijos lizuojamos 20 min. 37 °C temperatūroje
ultratermostate. Ląstelių lizė atliekama stikliniame centrifuginiame mėgintuvėlyje. Tada į mėgintuvėlį
pridedama 8,3 mL Na dodecilsulfato tirpalo, ir mišinys atsargiai maišant laikomas ultratermostate 10 min.
60 °C temperatūroje. Mėgintuvėlis statomas į ledo vonią atšaldyti. Pridedamas toks pat tūris fenolinio
buferinio tirpalo (Nr. 4), maišoma stikline lazdele 10 min. leduose. Fenolis denatūruoja baltymus. Mišinys
centrifuguojamas 20 min. 5000 aps./min. greičiu. Centrifuguojant DNR, baltymų ir fenolio mišinys
pasiskirsto sluoksniais (žr. pav.).

DNR
Baltymas
Fenolio frakcija
DNR
Baltymas
Fenolio frakcija
DNR, baltymų ir fenolio frakcijos pasiskirstymas centrifuginiame mėgintuvėlyje
134
Viršutinis sluoksnis su ištirpusia DNR atsargiai automatine pipete nusiurbiamas į 10–20 mL matavimo
cilindrą. Į centrifuginį mėgintuvėlį su baltymų ir fenolio frakcijos sluoksniais įpilama 2–3 mL lizės buferinio
tirpalo (Nr. 1), leduose maišoma 5 min. ir 20 min. centrifuguojama 5000 aps./min. greičiu. DNR viršutinis
sluoksnis atsargiai nusiurbiamas į tą patį 10–20 mL talpos cilindrą. DNR tirpalas supilamas į menzūrėlę
(100 mL) ir veikiamas 2,5 tūrio šalto etilo alkoholio (–20 °C). Mišinys 0,5 val. statomas į šaldytuvą
(–20 °C). Iškritę į nuosėdas DNR siūlai vyniojant lazdele ištraukiami iš spiritinio tirpalo į mėgintuvėlį.
Mėgintuvėlyje lazdele nuspaudžiamas spiritas ir DNR perkeliama į kitą mėgintuvėlį. Pridedama 9 mL
buferinio tirpalo Nr. 6 ir mėgintuvėlis statomas savaitei į šaldytuvą (+4 °C), kad DNR brinktų ir tirptų.

DNR gryninimas
Ištirpus DNR, į tirpalą įpilama 1 mL tirpalo Nr. 5 ir ribonukleazės A tirpalo (Nr. 7) RNR priemaišoms
pašalinti. Į 1 mL DNR tirpalo pridedama 50 µg ribonukleazės A ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūros
vandens vonioje. Tirpalas statomas į ledo vonią ir veikiamas tokiu pat tūriu fenolio buferinio tirpalo (Nr. 4).
Mišinys maišomas 5 min. ledo vonioje ir centrifuguojamas 5000 aps./min. greičiu. Viršutinis sluoksnis su
ištirpusia DNR atsargiai automatine pipete nusiurbiamas į 10–20 mL talpos matavimo cilindrą. DNR tirpalas
supilamas į menzūrėlę (100 mL) ir veikiamas 2,5 tūrio šalto etilo alkoholio (–20 °C). Mišinys 0,5 val.
statomas į šaldytuvą (–20 °C). Iš spiritinio tirpalo DNR išimama stikline lazdele ir tirpinama 3 mL tirpalo
Nr. 9. Mėgintuvėlis statomas savaitei į šaldytuvą (+4 °C). Ištirpus DNR, nustatoma koncentracija ir
švarumas. DNR tirpalas, prieš matuojant optinį tankį, skiedžiamas. Imami 2 mėgintuvėliai: į pirmąjį
mėgintuvėlį įpilama 10 µL DNR tirpalo ir 3 mL distiliuoto vandens (skiedžiama 300 kartų), į antrą – 20 µL
DNR tirpalo ir 3 mL distiliuoto vandens (skiedžiama 150 kartų). Tirpalai gerai išmaišomi maišyklėje.
Mėginiai matuojami spektrofotometru, esant bangos ilgiui 260 nm, naudojant distiliuotą vandenį kaip
kontrolinį. Mėginių optinis tankis nustatomas ir bangos ilgiui esant 280 nm. Optinių tankių santykis
260 nm/280 nm rodo DNR tirpalų švarumą. Šis santykis turi būti ne mažesnis nei 1,8.
Žinant optinio tankio reikšmes, apskaičiuojama DNR koncentracija (µg/mL) pagal formulę:

CµgDNR/mL = D
260
⋅ 50 ⋅ praskiedimo kartai.

Atsikaitymas

- DNR kiekis 1g E. coli ląstelių biomasės;
- DNR švarumas.

Literatūra

1. Георгиев, Г. И. Биохимия 24(3), 1959, c. 472–480.
2. Практикум по биохимии (Под ред. Северина, С. Е и Соловьевой, Г. А.). Москва: Изд. МГУ. 1989,
с. 166–171.
135

5. RNR išskyrimas iš Eschrichia coli ląstelių biomasės
Romualdas Marcišauskas

Darbo tikslas

Išskirti RNR iš E. coli ląstelių biomasės, nustatyti RNR išeigą ir švarumą.

Tyrimo objektas

E. coli ląstelių biomasė.

Matavimo priemonės

Automatinės 20 µL, 200 µL, 1000 µL, 5000 µL pipetės, centrifuga K23D, ultratermostatas U7,
spektrofotometras SF26.

Darbo eiga

Tirpalai:
1. Ląstelių lizės buferinis tirpalas, 100 mL: 0,015 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,45 M sacharozė, 0,008 M EDTA.
Pradiniai tirpalai – 1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 M EDTA, pH 7,5.
2. Fermento lizocimo tirpalas: 6 mg lizocimo ištirpinami 1 mL distiliuoto vandens (tirpalas ruošiamas prieš
naudojant).
3. Distiliuoto fenolio buferinis tirpalas,100 mL: 80 mL šviežiai perdistiliuoto fenolio sumaišoma su 20 mL
0,01 M Tris-HCl buferio, pH 7,5.
4. Chloroformo / izopentilo alkoholio mišinys − 24 : 1 (200 mL).
5. 40 % kalio acetato tirpalas (KCH
3
COO), 10 mL.
6. 96 % etilo alkoholis.
7. 1 M MgCl
2
tirpalas, 10 mL.
8. 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,025 M MgCl
2
tirpalas, 100 mL.
9. Deoksiribonukleazės I, neturinčios ribonukleazių priemaišų, tirpalas: 1 mg fermento ištirpinamas 1 mL
tirpalo Nr. 8.

Ląstelių lizė ir RNR išskyrimas
1 g E. coli ląstelių biomasės suspenduojama 1 mL ląstelių lizės buferiniame tirpale (Nr. 1) ir dar
pridedama 14 mL lizės buferinio tirpalo. Stikline lazdele išmaišoma iki homogeniškos suspensijos,
pridedama 80 µL lizocimo tirpalo (Nr. 2) 1 mL ląstelių suspensijos. 5 min. laikoma leduose. Lizocimas
suardo ląstelių sieneles. Visa tai atliekama stikliniame centrifuginiame mėgintuvėlyje.
Gautas lizatas veikiamas dvigubu fenolio buferinio tirpalo (Nr. 3) tūriu ir 10 min. maišoma stikline
lazdele leduose. Fenolis denatūruoja baltymus. Visa tai centrifuguojama 20 min. 5000 aps./min. greičiu.
Centrifugavimo metu RNR, baltymų ir fenolio mišinys pasiskirsto sluoksniais (žr. pav.).









RNR, baltymų, fenolio frakcijos bei RNR, baltymų ir chloroformo/izopentilo alkoholio pasiskirstymas centrifuginiuose
mėgintuvėluose

RNR
Baltymas
Fenolio frakcija
RNR
Baltymas
Chloroformas/izopentilo
alkoholis
136
Viršutinis sluoksnis su ištirpusia RNR atsargiai nusiurbiamas automatine pipete ir surenkamas į 10–
20 mL matavimo cilindrą. Į centrifuginį mėgintuvėlį su baltymų ir fenolio sluoksniais įpilama 2–3 mL lizės
buferinio tirpalo, 5 min. maišoma leduose ir 20 min. centrifuguojama 5000 aps./min. greičiu. RNR
vandeninė fazė atsargiai nusiurbiama, fazės sujungiamos ir veikiamos tokiu pat chloroformo/izopentilo
alkoholio mišinio tūriu. Mišinys maišomas 5 min. leduose, centrifuguojamas 10 min. 5000 aps./min. greičiu.
Viršutinis RNR tirpalo sluoksnis atsargiai nusiurbiamas į 10–20 mL matavimo cilindrą, pridedama 40 %
KCH
3
COO tirpalo iki galutinės 2 % koncentracijos ir 2,5 tūrio šalto etilo alkoholio (–20 °C). Mišinys
savaitei statomas į šaldytuvą (–20 °C).

RNR gryninimas
Su DNR priemaišomis iškritusios RNR nuosėdos centrifuguojamos 10 min. 5000 aps./min. greičiu.
Viršutinis spirito sluoksnis nupilamas. Mėgintuvėlis statomas į stiklinėlę su filtravimo popieriumi dugnu
aukštyn ir 10 min. laikomas šaldytuve +4 °C temperatūroje. Nuosėdos tirpinamos 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0,
buferyje, turinčiame 0,025 M MgCl
2
. Palaipsniui iki 10 mL pilama buferinio tirpalo. Tirpalas veikiamas
deoksiribonukleazės I tirpalu (Nr. 9) (50–100 vienetų) ir laikomas kambario temperatūroje 25 min. Tada
statomas į ledo vonią ir veikiamas dvigubu tūriu fenolio tirpalo (Nr. 3). Mišinys 5 min. maišomas leduose,
10 min. centrifuguojamas 5000 aps./min. greičiu. Viršutinis sluoksnis su ištirpusia RNR atsargiai
nusiurbiamas ir surenkamas į 10–20 mL matavimo cilindrą, pridedama 40 % KCH
3
COO tirpalo iki galutinės
2 % koncentracijos ir 2,5 tūrio šalto etilo alkoholio (–20°C). Mišinys savaitei statomas į šaldytuvą (–20°C).
Iškritusios RNR nuosėdos centrifuguojamos 10 min. 5000 aps./min. greičiu. Viršutinis spirito sluoksnis
nupilamas. Mėgintuvėlis statomas į stiklinėlę su filtriniu popieriumi dugnu aukštyn ir 10 min. laikomas
šaldytuve +4 °C temperatūroje. Nuosėdos tirpinamos 2 mL distiliuoto vandens. Nustatoma RNR
koncentracija ir švarumas. Apskaičiuojamas išskirtas RNR kiekis.
Išskirta RNR yra E. coli ląstelių suminė RNR. Ją sudaro ribosomų 23S, 16S, 5S rRNR ir transportinė 4S
tRNR.
RNR tirpalas, prieš matuojant optinį tankį, skiedžiamas. Imami 2 mėgintuvėliai: į pirmąjį įpilama 30 µL
RNR tirpalo ir 3 mL distiliuoto vandens (skiedžiama 100 kartų), į antrąji – 60 µL RNR tirpalo ir 3 mL
distiliuoto vandens (skiedžiama 50 kartų). Tirpalai gerai išmaišomi maišyklėje. Mėginiai matuojami
spektrofotometru, esant bangos ilgiui 260 nm, naudojant kaip kontrolinį distiliuotą vandenį. Mėginių optinis
tankis nustatomas ir kai bangos ilgis 280 nm. Optinių tankių santykis 260 nm/280 nm rodo RNR tirpalų
švarumą. Šis santykis turi būti ne mažesnis nei 1,8. Žinant praskiestų RNR tirpalų optinio tankio reikšmes,
kai bangos ilgis 260 nm, apskaičiuojama RNR koncentracija (µg/mL) :

C
µg
⋅ RNR/mL = D
260
⋅ 40 ⋅ praskiedimo kartai.

Atsiskaitymas

- RNR kiekis 1 g E. coli ląstelių biomasės;
- RNR švarumas.

Literatūra

1. Маниатис, Т.; Фрич, Э.; Сэмбрук, Дж. В кн.: Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984, с.
402–407.
2. Практикум по биохимии (Под ред. Северина, С. Е. и Соловьевой, Г. А. Mосква: Изд. МГУ, 1989,
с. 166–171.
137

6. Restriktazės EcoRl aktyvumo nustatymas
Romualdas Marcišauskas

Darbo tikslas

Gauti fago lambda DNR restriktogramą, nustatyti restriktazės EcoRI aktyvumą.

Tyrimo objektas

Restriktazė EcoRI (AB „Fermentas“).

Matavimo priemonės

Automatinės 20 µL, 200 µL, 1000 µL, 5000 µL pipetės, horizontalus elektroforezės aparatas, srovės
šaltinis, ultratermostatas U2, svarstyklės, chromatoskopas.

Darbo eiga

Restriktazės yra fermentai, specifiškai atpažįstantys ir skaidantys tam tikrą DNR nukleotidų seką.
Restriktazė EcoRI atpažįsta ir skaido tokią DNR seką:
5’…G↓AATTC…3’
3’…CTTAA↑G…5’
Fago lambda DNR restriktazė EcoRI atpažįsta penkiose vietose ir skaido jo DNR į šešis fragmentus.
Restriktazės aktyvumo vienetas – toks fermento kiekis, kuris per 1 val. visiškai suskaido 1 µg fago
lambda DNR 50-yje µL reakcijos mišinio.
Suskaidytos DNR fragmentai išskiriami agarozės gelyje elektroforezės būdu. Fragmentų išsidėstymo
vaizdas vadinamas restriktograma.
Tirpalai:
1. Koncentruotas restriktazės EcoRI reakcijos buferinis tirpalas.
2. Fago lambda DNR tirpalas.
3. Buferinis tirpalas restriktazei skiesti (20 mM KH
2
PO
4
, pH 7,4, 200 mM KCl, 1 mM EDTA, 7 mM 2-
merkaptoetanolio, 10 % glicerolio, 0,2 mg/mL jaučio serumo albumino).
4. „Stop“ buferinis tirpalas – tirpalas fermentinei reakcijai sustabdyti (60 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio
mėlio, 50 % glicerolio).
5. Agarozės tirpalas (0,7–1 g agarozės užpilama 100 mL elektroforezės buferinio tirpalo Nr. 6).
6. Elektroforezės buferinis tirpalas (2 mM EDTA, 0,2 M natrio borato, pH 8,2).
7. 6,25 mg/mL etidžio bromido tirpalas.

Reakcijos mišinio paruošimas
Naudodami reagentus Nr. 1 ir Nr. 2 paruošiame 400 µL reakcijos mišinio taip, kad 50 µL šio mišinio
būtų 1 µg lambda fago DNR. Į mėgintuvėlį eilės tvarka įpilame:
40 µL koncentruoto EcoRI reakcijos buferio (Nr. 1);
20 µL fago lambda DNR (0,4 mg/mL) (Nr. 2);
340 µL distiliuoto vandens;
Gerai išmaišome.
Iš viso: 400 µL



Šį reakcijos mišinį išpilstome į šešis mėgintuvėlius po 50 µL. Stovelį su mėgintuvėliais įdedame į
vonelę, kurioje įdėta ledo.

Fermento EcoRI paruošimas
138
Tiriamas restriktazės preparatas yra koncentruotas, todėl nustatant jo aktyvumą skiedžiama 20 kartų
fermento skiedžiamuoju buferiniu tirpalu (Nr. 3). Fermento aktyvumas − 10 vnt./µL. Į mėgintuvėlį įpilame:
190 µL skiedžiamojo buferinio tirpalo (Nr. 3);
10 µL EcoRI su 190 µL skiedžiamojo buferinio tirpalo;
Gerai išmaišome.
Iš viso: 200 µL



Į paruoštus mėgintivėlius: 1 2 3 4 5 6
pilama skiesto fermento preparato: – 1 µL 1,5 µL 2 µL 2,5 µL 3 µL.

Pirmasis mėgintuvėlis kontrolinis – į jį fermento nepilame.
Mėgintuvėlius inkubuojame 1 val. 37 °C temperatūroje.

Pasiruošimas elektroforezei ir elektroforezė
0,7–1 g agarozės užpilame 100 mL elektroforezės buferinio tirpalo (Nr. 7) 250 mL kolboje. Šildome, kol
agarozė ištirpsta. Tada tirpalą atšaldome iki 60–70 °C ir atsargiai supilame į paruoštą gelio formavimo vietą
horizontaliame elektroforezės aparate. Sustingus agarozei, ištraukiame „šukas“, kuriomis buvo suformuotos
duobutės pavyzdžiams, nuimame bortelius ir pripildome elektroforezės aparatą elektroforezės buferinio
tirpalo (Nr. 6) taip, kad gelis būtų apsemtas.
Po inkubacijos stovelį su mėgintuvėliais perkeliame į vonelę su ledais. Reakciją stabdome pridėdami po
25 µL „stop“ buferinio tirpalo (Nr. 4). Po 30 µL kiekvieno mėginio įpilame į gelio duobutes. Vykdome
elektroforezę − paleidžiame 150 mA elektros srovę, kol dažai pasieks gelio kraštą (maždaug 1 val.). Baigus
elektroforezę, išjungiamas srovės šaltinis, nuimamas gelis, įdedamas į vonelę ir užpilamas etidžio bromido
tirpalu (Nr. 7). Po 10 min. etidžio bromido tirpalas nupilamas, o gelis užpilamas distiliuotu vandeniu
(laikoma 10 min.).
Elektroforezės buferinis tirpalas iš elektroforezės aparato ir etidžio bromido tirpalas iš vonelės supilami
atgal į indus kitam kartui.

Fermento aktyvumo apskaičiavimas
DNR fragmentų išsidėstymas gelyje po elektroforezės stebimas ultravioletinėje šviesoje chromatoskopu.
Nupiešiame gautą restriktogramos vaizdą. Nustatome minimalų restriktazės kiekį, µL, kuris visiškai suskaido
1 µg DNR (kad DNR visiškai suskaidoma, akivaizdu tada, kai padidinus restriktazės kiekį restriktogramos
vaizdas nesikeičia). Apskaičiuojame restriktazės aktyvumą, vnt./µL, pagal formulę:

C
vnt./µL
=
A
l 20 ⋅
,
čia:
l – fago lambda DNR kiekis µg mėginyje,
20 – kiek kartų atskiestas fermentas,
A – skiesto fermento kiekis mėginyje µL (1–3 µL), kai DNR suskaidoma visai.

Atsiskaitymas

- fago lambda DNR restriktograma;
- restriktazės EcoRI aktyvumas (vnt./µL).

Literatūra

MBI „Fermentas“ katalogas 2002–2003, p. 22, 61.

139

7. Baltymų molekulinės masės nustatymas gelfiltracijos metodu
Vilma Michailovienė

Darbo tikslas

Nustatyti nežinomo baltymo molekulinę masę.

Matavimo priemonės:

1. Stiklinė 44 × 1,0 cm (ilgis × skersmuo) kolonėlė, pripildyta sorbento (arba gelio).
2. Peristaltinis siurbliukas (tekėjimo gretis – 0,6 mL/min.).
3. Detektorius. 280 nm, 0,2 AVPS (absorbcijos vienetai per skalę).
4. Saviraštis. Greitis – 1 mm/min.
5. Sorbentas: Toyopearl HW-50F (dalelių dydis 30–60 µm, porų dydis 125 Å, globulinių baltymų
frakcionavimo ribos 500–60 000 Da).
6. Eliuentas: 0,01 M KH
2
PO
4
/K
2
HPO
4
, pH 7,0, 0,2 M NaCl, 0,02 % NaN
3
.
7. Standartiniai baltymai.

Standartai: Molekulinė masė Koncentracija, mg/mL
7.1. Mėlynasis dekstranas 2000000 1
7.2. Jaučio serumo albuminas 67000 5
7.3. Ovalbuminas 43000 5
7.4. Ribonukleazė 13700 5

Standartiniai baltymai tirpinami eliuente.

Darbo eiga

Paruošiami mėlynojo dekstrano ir žinomos molekulinės masės baltymų tirpalai eliuente (5–3 mg/mL).
Kolona pusiausvirinama eliuento tirpalu (10 kololonos tūrių) ir įdedama mėlynojo dekstrano, tik tada
atliekama standartinių baltymų ir nežinomo baltymo pavyzdžių chromatografija. Injekcijos tūris – 0,5 mL
(ne daugiau kaip 1–2 % kolonos tūrio). Pagal gautas chromatogramas skaičiuojami šių baltymų išplovimo
tūriai ir kiti chromatografiniai parametrai: V
b
– bendrasis kolonos tūris , V
o
– laisvasis kolonos tūris (kolonos
tūris, nepripildytas sorbento dalelių, mėlynojo dekstrano išplautasis tūris), V
e
– baltymų išplautieji tūriai
(eliuento kiekis, ištekėjęs iš kolonos nuo pavyzdžio eliuavimo pradžios iki tol, kol detektoriuje buvo
užfiksuota jo smailės viršūnė). Skaičiuojamas kiekvieno baltymo K
v
. Braižoma kalibracinė kreivė, kuri
parodo santykį tarp baltymų išplautųjų tūrių ir jų molekulinių masių logaritmų (X ašyje atidedamas baltymo
K
v
, Y ašyje – šio baltymo molekulinės masės logaritmas). Apskaičiavus nežinomo baltymo K
v
, iš
kalibracinės kreivės nustatoma jo molekulinė masė.

Skaičiavimai

Kolonos tūris skaičiuojamas pagal formulę:

V
b
= π r
2
H,
čia:
H – išmatuotas sorbento aukštis kolonoje, cm,
r – išmatuotas kolonos spindulys, cm.
Tuomet V
b
= 3,14
.
0,5
2

.
44 = 34,5 mL.
Laisvasis kolonos tūris apskaičiuojamas pagal mėlynojo dekstrano chromatogramą. Išmatuojamas
atstumas nuo chromatogramos pradžios iki nuo mėlynojo dekstrano smailės viršūnės nubrėžto statmens (žr.
pav. smailė A). Išmatuojamas eliuento tekėjimo gretis V.
18 mm – išmatuotas atstumas,
140
0,6 mL/min. – išmatuotas eliuento tekėjimo greitis,
1 mm/min. – nustatytas saviraščio greitis.
Tuomet V
o
= 18/1
.
0,6 = 10,8 mL.
Gauname, kad mėlynojo dekstrano eliuavimo tūris yra 10,8 mL. Tai ir yra laisvasis kolonos tūris.
Tokiu pat metodu skaičiuojami ir baltymų eliuavimo tūriai.
Dabar skaičiuojamas kitas baltymų eliuavimo parametras – K
v
– pasiskirstymo konstanta, kuri rodo
baltymo prasiskverbimo į poras lygį:

K
v
=
o b
o e
V V
V V


.

Tuomet mėlynojo dekstrano

K
v
=
o b
o e
V V
V V


=
8 10 5 34
8 10 8 10
, ,
, ,


.

Baltymų didelių molekulių, kurios neprasiskverbia į sorbento poras, K
v
= 0. Jos išsiplauna su laisvuoju
kolonos tūriu (žr. pav. smailė A). Baltymų smulkių molekulių (pvz., druskų) K
v
≤ 1. Jos prasiskverbia į
smulkiausias sorbento poras (pav. smailė D). Matome, kad šis koeficientas gali būti nuo 0 iki 1.

























V
o
− mobilios fazės tūris tarp sorbento dalelių,
V
i
− mobilios fazės tūris sorbento dalelių porose,
V
t
= V
o
+ V
i
,
MM – molekulinė masė.

Kalibracinė kreivė – baltymų eliuavimo tūrių priklausomybė nuo jų molekulinė masės logaritmo.
Viršuje standartinių baltymų chromatograma

Gautus duomenis atidedame grafike. Apskaičiavę nežinomo baltymo K
v
iš kalibracinės kreivės
nustatome jo molekulinę masę (žr. pav.).
Baltymo eliuavimo tūris, laikas arba K
v


141

Atsiskaitymas

- baltymų eliuavimo tūrių priklausomybės nuo jų molekulinės masės logaritmo kalibracinė kreivė;
- tiriamo baltymo molekulinė masė.

Literatūra

Остерман, Л. А. В кн.: Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Москва: Наука, 1985, с. 109–
162.
142

8. Baltymų elektroforezė 12 % poliakrilamidiniame gelyje
Jolanta Giedrienė

Darbo tikslas

Tiriamų baltymų santykinės molekulinės masės nustatymas taikant baltymų elektroforezę 12 %
poliakrilamidiniame gelyje denatūracijos sąlygomis.

Tyrimo objektas

Baltymų preparatai.

Matavimo priemonės

Elektroforetinė celė Mini-PROTEAN II BIO-RAD, rinkinys geliui užpyilti, stovelis BIO-RAD, aparatas
geliui fotografuoti ULTRA LŪM, srovės šaltinis EC 250-90.

Tirpalai

1. 30 % akrilamido – Bis tirpalas.
2. 1,5 M Tris-HCl/Na dodecilsulfato (NDS) buferinis tirpalas, pH 8,8.
3. 0,5 M Tris-HCl/NDS buferinis tirpalas, pH 6,8.
4. 10 × elektrodinio buferio koncentratas. Elektrodinis buferis (25 mM Tris-HCl, 192 mM glicino).
5. 10 % amonio persulfato tirpalas (APS).
6. Pavyzdžio buferinis tirpalas (1 M Tris-HCl/NDS buferinis tirpalas, pH 6,8, 2 % NDS, 0,001 %
bromfenolio mėlio, 40 % glicerolio).
8. 1 M DTD tirpalas.
9. TEMED tirpalas.
10. Gelio dažas (0,1 % Coomasie Brilliant Blue G-250, 40 % etanolio, 10 % acto rūgšties).

Darbo eiga

1. Surenkama kasetė geliui užpilti ir įstatoma į stovelį.
2. Pažymima vieta, iki kurios bus užpilamas apatinis gelio sluoksnis (1,5 cm žemiau „šukų“ apačios).
3. Paruošiamas apatinis – skiriamasis gelio sluoksnis: į 10–15 mL mėgintuvėlį pilama:
30 % akrilamido – Bis tirpalo 2,0 mL,
1,5 M Tris-HCl/NDS buferinio tirpalo, pH 8,8 1,25 mL,
dejonizuoto vandens 1,75 mL.
Tirpalas išmaišomas ir dar įpilama:
10 % APS 17 µL,
TEMED 10 µL.
Gerai išmaišoma ir supilama tarp stiklų iki pažymėtos vietos. Ant tirpalo paviršiaus užpilama 1,0 mL
vandens. Geliui sustingus (maždaug po 20 min.) paviršius nusausinamas filtriniu popieriumi.
4. Paruošiamas viršutinis – koncentruojamasis gelio sluoksnis: į 10–15 mL mėgintuvėlį pilama:
30 % akrilamido – Bis tirpalo 325 µL,
0,5 M Tris-HCl/NDS buferinio tirpalo, pH 6,8 625 µL,
dejonizuoto vandens 1500 mL.
Tirpalas išmaišomas ir dar įpilama:
10 % APS 10 µL,
TEMED 10 µL.
Tirpalas gerai išmaišomas, supilamas tarp stiklų ir įkišamos „šukos“.
143
5. Geliui sustingus (po 30–40 min.), „šukos“ ištraukiamos tiesiai į viršų, nepakreipiant. Susidarę
„šulinėliai“ praplaunami vandeniu. Kasetė su geliu įstatoma į aparatą ir įdedama į rezervuarą. Į
viršutiniam buferiui skirtą vietą supilama 350 mL elektrodinio buferinio tirpalo.
6. Paruošti pavyzdžiai bei molekulinės masės standartai įpilami į „šulinėlius“ viršutiniame gelyje. Imamas
toks pavyzdžio tūris, kad baltymo kiekis jame būtų 10–20 µg.
7. Paruošiamas mėginys: baltyminis tirpalas praskiedžiamas iki 50 µL, pridedama 40 µL pavyzdžio buferio
ir 10 µL 1 M DTD. Pavyzdys vandens vonioje virinamas 1 minutę.
8. Įpylus pavyzdžius, elektroforetinė celė uždengiama dangčiu. Leidžiama 13 mA elektros srovė, kol
bromfenolio mėlynojo frontas pasiekia skiriamąjį gelį (apie 20 min.). Tada srovė padidinama iki 30 mA.
9. Elektroforezė baigiama, kai bromfenolio mėlynojo frontas pasiekia gelio apačią (apie 1 val.).
Išjungiamas srovės šaltinis, nuimamas gelis ir įdedamas į gelio dažo tirpalą. Dažoma 2 ir daugiau
valandų (paprastai per naktį).
10. Nudažytas gelis blukinamas 20 % etanolio ir 10 % acto rūgšties tirpale, kol gelio pagrindas tampa
švarus.
11. Išblukintas gelis nufotografuojamas.

Skaičiavimai

1. Nudažius ir nufotografavus gelį, apskaičiuojama nežinomo baltymo santykinė molekulinė masė.
Išmatuojamas atstumas R (cm) nuo skiriamojo gelio pradžios iki bromfenolio mėlynojo juostos gelio
apačioje, taip pat atstumai r
1
, r
2
…r
i
(cm) nuo skiriamojo gelio pradžios iki standartinių baltymų ir
nežinomo baltymo nudažytų juostelių.
2. Santykinis kiekvieno baltymo (standartinio, nežinomo) nueitas kelias R
f
apskaičiuojamas pagal formulę:

R
f
= r
i
/R.

3. Braižomas grafikas: ordinačių ašyje atidedami standartinių baltymų santykinių molekulinių masių
dešimtainiai logaritmai, o abscisių – R
f
.
Iš gautos priklausomybės pagal nežinomo baltymo R
f
apskaičiuojama jo santykinė molekulinė masė
(žr. pav.):

3,5
3,7
3,9
4,1
4,3
4,5
4,7
4,9
5,1
5,3
5,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
R
f
lgM


Baltymų molekulinės masės dešimtainio logaritmo priklausomybė nuo R
f


Atsiskaitymas

- baltymų molekulinės masės dešimtainio logaritmo priklausomybės nuo R
f
grafikas;
144
- tiriamųjų baltymų santykinės molekulinės masės.

Literatūra

1. Current Protocols in Molecular Biology, 1999. 10.2B 1–34.
2. Mickevičius, D. Cheminės analizės metodai 2. Vinius: Žiburio leidykla, 1999, p. 282–302.
145

9. Restrikcijos endonukleazių aktyvumo nustatymas. Restrikcijos
endonukleazių preparatų kokybės įvertinimas
Artūras Jakubauskas

Darbo tikslas

Restrikcijos endonukleazių aktyvumo nustatymas. Restrikcijos endonukleazių preparatų kokybės
įvertinimas pagal ilgalaikės restrikcijos perteklinį fermento kiekį ir restrikcijos-ligavimo-restrikcijos testais.

Tyrimo objektas

Restrikcijos endonukleazių preparatai.

Matavimo priemonės

Elektroforezės aparatas, srovės šaltinis B5-50, “Ultra-Lum“ gelių dokumentavimo sistema, termostatas,
automatinės pipetės.

Reagentai

1. Koncentruotų restrikcijos endonukleazių buferinių tirpalų rinkinys, naudojamas UAB „Fermentas“.
2. λ fago DNR tirpalas (0,3 mg/mL).
3. Tiriamų restrikcijos endonukleazių preparatai.
4. Buferinis tirpalas restrikcijos endonukleazių preparatams skiesti (20 mM KP
i
(pH 7,4), 200 mM
KCl, 1 mM EDTA, 7 mM 2-merkaptoetanolio, 10 % glicerolio, 0,2 mg/mL BSA).
5. T4 DNR ligazės preparatas.
6. 25 mM ATP tirpalas.
7. 125 mM DTT tirpalas.
8. „Stop“ buferis – tirpalas fermentinei reakcijai sustabdyti (60 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio
mėlynojo, 50 % glicerolio).
9. Agarozė.
10. Elektroforezės buferis (0,1 M natrio borato (pH 8,2), 2 mM EDTA, 0,5 µg/mL etidžio bromido).

Darbo eiga

Restrikcijos endonukleazių aktyvumo nustatymas

Pagal UAB „Fermentas“ katalogą parenkame tiriamai restrikcijos endonukleazei rekomenduojamą
reakcijos buferį. Naudodami reagentus (Nr. 1−2), paruošiame 300 µL reakcijos mišinio taip, kad 50-yje µL
šio mišinio būtų 1 µg λ fago DNR. Mišinį išpilstome į 6 mėgintuvėlius po 50 µL. Stovelį su mėgintuvėliais
įdedame į ledų vonelę. Tiriamasis restrikcijos endonukleazės preparatas yra koncentruotas, todėl siekdami
nustatyti jo aktyvumą, skiedžiame jį 20−30 kartų buferiu (Nr. 4). 1, 1,5, 2, 2,5 ir 3 µL praskiesto restrikcijos
endonukleazės preparato pilame į paruoštus mėgintuvėlius (paskutinis mėgintuvėlis kontrolinis) ir
sumaišome. Inkubuojame 1 val. 37 °C temperatūroje.
0,7−1 g agarozės užpilame 100 mL elektroforezės buferio (Nr. 10). Kaitiname, kol agarozė visiškai
ištirpsta. Tirpalą atvėsiname iki 60−70 °C ir atsargiai supilame į paruoštą gelio formavimo vietą. Sustingus
agarozei, ištraukiame „šukas“, kuriomis buvo suformuoti šulinėliai pavyzdžiams, nuimame bortelius ir
įdedame gelį į elektroforezės aparatą. Pripilame elektroforezės buferio (Nr.10) tiek, kad gelis būtų apsemtas.
Po inkubacijos stovelį su mėgintuvėliais perkeliame į ledų vonelę. Reakciją stabdome pridėdami po
25 µL „stop“ buferio (Nr. 8). Po 20−30 µL kiekvieno mėginio įpilame į gelio šulinėlius. Atliekama
elektroforezė.
DNR fragmentų išsidėstymas gelyje po elektroforezės stebimas ultravioletinėje šviesoje ir
fotografuojamas. Nustatomas minimalus restrikcijos endonukleazės kiekis (µL), kuris visiškai suskaldo 1 µg
146
DNR (DNR visiškai suskaldyta, kai padidinus restrikcijos endonukleazės kiekį restriktogramos vaizdas
nebesikeičia). Restrikcijos endonukleazės aktyvumas (vnt./µL) apskaičiuojamas pagal formulę:

c(vnt./µL) = X×Y/A,
čia:
X – λ fago DNR kiekis mėginyje (µg);
Y – fermento skiedimas (kartais);
A – skiesto fermento kiekis mėginyje (µL), kai DNR visiškai suskaldoma.

Restrikcijos endonukleazių preparatų kokybės įvertinimas

Restrikcijos endonukleazės preparato kokybei įvertinti atliekame du testus:
1. Ilgalaikę inkubaciją.
2. Restrikciją-ligavimą-restrikciją.

1. Nespecifinių nukleazių priemaišas restrikcijos endonukleazės preparate įvertiname inkubuodami
perteklinį fermentinio preparato kiekį su 1 µg λ fago DNR 17 val. 37 °C temperatūroje. 2, 3, 5 µL
koncentruoto restrikcijos endonukleazės preparato dedame į mėgintuvėlius su reakcijos mišiniu
(paruošiamu taip pat kaip ir aktyvumui nustatyti). Inkubuojame per naktį. Reakciją stabdome pridėdami
25 µL „stop“ buferio (Nr. 8). Gautus DNR fragmentus išskiriame elektroforezės būdu. Jeigu
fermentiniame preparate nėra nespecifinių nukleazių, elektroforetinis vaizdas visais atvejais turi atitikti
standartinį (žr. UAB „Fermentas“ kataloge) ir nepriklausyti nuo įdėto restrikcijos endonukleazės
preparato kiekio.
2. DNR restrikcijos-ligavimo-restrikcijos kokybės testas atliekamas trim etapais:
a) Pirminė restrikcija. Į du mėgintuvėlius su 60 µL reakcijos mišinio, turinčio 9 µg λ fago DNR,
įdedame 10 ir 30 vnt. tiriamos restrikcijos endonukleazės ir inkubuojame per naktį 37°C
temperatūroje. Elektroforezei imame po 10 µL iš kiekvieno mėgintuvėlio, pridedame po 20 µL
vandens ir 15 µL „stop“ buferio (Nr. 8) (pirminės restrikcijos kontrolė – R1). Restrikcijos
endonukleazė likusiame mėginyje inaktyvinama, kaitinant 20 min. 65 °C temperatūroje.
b) Ligavimo reakcija. Į mėginius su inaktyvinta restrikcijos endonukleaze įdedame po 2 µL ATP,
2 µL DTT ir 2 µL T4 DNR ligazės preparato. Inkubuojame 1 val. 22 °C temperatūroje. Ligazė
inaktyvinama kaitinant 20 min. 65 °C temperatūroje. Ligavimo kontrolei imame po 12 µL kiekvieno
mėginio, pridedame po 18 µL vandens ir 15 µL „stop“ buferio (L).
c) Antrinė restrikcija. Į mėginius su ligavimo reakcijos produktais įdedame po 30 vnt. tiriamos
restrikcijos endonukleazės ir inkubuojame 1 val. 37 °C temperatūroje. Po inkubacijos iš kiekvieno
mėginio paimame po 16 µL, pridedame po 14 µL vandens ir 15 µL „stop“ buferio (kontrolė antrinei
restrikcijai – R2).
Gauti pirminės restrikcijos (R1), ligavimo (L) ir antrinės restrikcijos (R2) pavyzdžiai analizuojami
elektroforetiškai (į gelį pavyzdžiai pilami tokia tvarka: R1, L, R2). Jei fermento kokybė gera, tai
pirminės restrikcijos metu gauti fragmentai turi būti suliguoti, o antrinės restrikcijos vaizdas turi būti
identiškas pirminės restrikcijos vaizdui.

Atsiskaitymas

– pateikiami apskaičiuotas tiriamos restrikcijos endonukleazės aktyvumas ir restriktograma, pagal kurią jis
nustatytas;
– pateikiamos restrikcijos endonukleazės preparato kokybės įvertinimo restriktogramos ir išvados.

Literatūra

1. UAB „Fermentas“ katalogas, 2004–2005, p. 20–21.
2. Roberts, R.J.; Belfort, M.; Bestor, T.; Bhagwat, A.S.; Bickle, T.A.; Bitinaite, J. et al. A nomenclature for
restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res.
31, 2003. p. 1805–1812.
147
3. Pingoud, A.; Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res.
29, 2001. p. 3705–3727.
148
10. Specifinių antikūnų titro nustatymas imunofermentiniu metodu
Aurelija Žvirblienė

Darbo tikslas

Nustatyti antikūnų prieš alfa-interferoną lygį (titrą) imunizuoto gyvūno kraujo serume.
Šis metodas pagrįstas imobilizuoto antigeno ir jam specifiškų antikūnų sąveika. Antigenas – šiuo atveju
žmogaus alfa-interferonas – adsorbuojamas specialioje plokštelėje, skirtoje imunofermentinei analizei.
Plokštelė inkubuojama su tiriamuoju pavyzdžiu – imunizuoto triušio kraujo serumu, kuris prieš tai
skiedžiamas nuo 100 iki 100 000 kartų. Kraujo serume esantys specifiniai antikūnai prisijungia prie
imobilizuoto antigeno. Pašalinus neprisijungusius antikūnus, į plokštelę pridedama peroksidaze žymėtų
antikūnų prieš triušio imunoglobulinus (antikūnus). Po inkubacijos pridedamas peroksidazės substrato
tirpalas. Vyksta fermentinė reakcija. Spalvos intensyvumas (optinis tankis), kuris yra proporcingas specifinių
antikūnų kiekiui tiriamajame pavyzdyje, matuojamas spektrofotometru. Antikūnų titras atitinka tokį serumo
praskiedimą, kuriam esant optinis tankis sumažėja perpus, palyginti su didžiausiuoju optiniu tankiu.

Tyrimo objektas

Imunizuoto triušio kraujo serumas.

Matavimo priemonės

Spektrofotometras Multiskan, mikropipetės, svarstyklės, pH-metras.

Medžiagos ir reagentai

1. Plokštelė imunofermentinei analizei.
2. Antigenas – žmogaus alfa-interferonas.
3. Imunizuoto triušio kraujo serumas.
4. Antikūnai prieš triušio imunoglobulinus, konjuguoti su peroksidaze (konjugatas).
5. Imobilizacijos buferis (0,05 M Na-karbonatinis buferis, pH 9,5).
6. Buferis PBS (0,05 M K/Na-fosfatinis buferis su 0,15 M NaCl, pH 7,2–7,4).
7. Buferis PBS-T (PBS su 0,1 % detergento Tween-20).
8. Blokavimo buferis (PBS su 1 % albumino).
9. Substratinis buferis (0,025 M Na-acetatinis buferis, pH 5,0).
10. o-fenilendiaminas.
11. 19 % vandenilio peroksido tirpalas.
12. 10 % sieros rūgšties tirpalas.





Darbo eiga

1. Antigeno imobilizacija. Paruošiamas 5 µg/mL antigeno (alfa-interferono) tirpalas imobilizacijos
buferyje. Į plokštelės šulinėlius išpilstoma po 50 µL šio tirpalo. Plokštelė inkubuojama 16 val. 37 °C
temperatūroje.
2. Blokavimas. Laisvas plokštelės paviršius blokuojamas albuminu. Į plokštelę išpilstoma po 150 µL
blokavimo buferio, inkubuojama 30 min. kambario temperatūroje.
3. Tiriamojo serumo titravimas. Tiriamasis serumas atskiedžiamas PBS-T 100 kartų. Į plokštelės „A“
šulinėlius įpilama po 100 µL šio tirpalo. Į plokštelės „B-H“ šulinėlius įpilama po 50 µL buferio PBS-T.
Iš „A“ šulinėlių perkeliama 50 µL antikūnų tirpalo į „B“ šulinėlius, gerai sumaišoma, toliau perkeliama
50 µL į „C“, iš „C“ – į „D“, ir t. t. Taigi tiriamasis serumas kiekvieną kartą atskiedžiamas 2 kartus. Po
149
titravimo visuose šulinėliuose turi likti po 50 µL tirpalo. Plokštelė inkubuojama 1 val. kambario
temperatūroje.
4. Inkubacija su žymėtaisiais antikūnais prieš triušio imunoglobulinus. Plokštelė 5 kartus praplaunama
PBS-T buferiu. Konjugatas atskiedžiamas 1000 kartų PBS-T buferiu. Į plokštelės šulinėlius išpilstoma
po 50 µL šio tirpalo. Plokštelė inkubuojama 1 val. kambario temperatūroje.
5. Fermentinės reakcijos išryškinimas. Paruošiamas peroksidazės substrato tirpalas: 5 mg o-
fenilendiamino ištirpinama 10 mL substratinio buferio ir pridedama 30 µL vandenilio peroksido tirpalo.
Į plokštelės šulinėlius išpilstoma po 100 µL šio tirpalo. Plokštelė inkubuojama 10–15 min., kol išryškėja
spalva. Tada fermentinė reakcija sustabdoma, pridedant po 50 µL sieros rūgšties tirpalo. Optinis tankis
išmatuojamas spektrofotometru, esant šviesos bangos ilgiui 492 nm.

Skaičiavimai

Braižoma kalibracinė kreivė: ordinačių ašyje atidedamos gautos optinio tankio reikšmės, abscisių ašyje –
atitinkamuose šulinėliuose esančio serumo praskiedimo kartai (žr. pav.). Specifinių antikūnų titras atitinka
didžiausią serumo praskiedimą, kuriam esant, kaip nustatyta, optinis tankis sumažėjęs 50 %, palyginti su
didžiausiuoju optiniu tankiu.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
1
0
0
2
0
0
4
0
0
8
0
0
1
6
0
0
3
2
0
0
6
4
0
0
1
2
8
0
0
2
5
6
0
0
5
1
2
0
0
1
0
2
4
0
0
Serumo praskiedimas, kartai
O
p
t
i
n
i
s

t
a
n
k
i
s
,

4
5
0

n
m
.
Specifinių antikūnų titro nustatymo kreivė

Atsiskaitymas

- specifinių antikūnų titro nustatymo kreivė;
- specifinių antikūnų titras.

Literatūra

1. Abbas, A. K.; Lichtman, A. H. Basic immunology. Philadelphia: W. B. Saunders Co., 2001, p. 6–22.
2. Roitt, I.; Brostoff, J.; Male, D. Immunology. 5th ed. St. Luois, USA: Mosby, 2000, 14–26, p. 71–80.
150


11. Alfa-interferono kiekybinis nustatymas imunofermentiniu
metodu
Aurelija Žvirblienė

Darbo tikslas

Imunofermentiniu metodu nustatyti alfa-interferono koncentraciją tiriamajame pavyzdyje, naudojant
monokloninius antikūnus.
Alfa-interferonui (IFN) nustatyti taikomas dviejų epitopų imunofermentinės analizės metodas.
Monokloniniai antikūnai prieš IFN (klonas 9D3) imobilizuojami plokštelėje. Tada plokštelė inkubuojama su
IFN standartu ir tiriamaisiais pavyzdžiais. IFN specifiškai prisijungia prie imobilizuotų antikūnų. Prisijungęs
IFN aptinkamas, inkubuojant su kitais monokloniniais antikūnais (klonas 4E10), konjuguotais su
peroksidaze. Pridėjus peroksidazės substrato tirpalo, spektrofotometru išmatuojamas fermentinės reakcijos
metu gauto junginio spalvos intensyvumas (optinis tankis). Jis yra tiesiogiai proporcingas IFN
koncentracijai. Braižoma kalibracinė kreivė: optinio tankio priklausomybė nuo IFN standarto koncentracijos.
Iš kalibracinės kreivės nustatoma IFN koncentracija tiriamajame pavyzdyje.

Tyrimo objektas

Žmogaus alfa-interferonas.

Matavimo priemonės

Spektrofotometras Multiskan, mikropipetės, svarstyklės, pH-metras.

Medžiagos ir reagentai

1. Plokštelė imunofermentinei analizei.
2. Žmogaus alfa-interferono standartas (0,18 mg/mL arba 7,2×10
7
TV/mL).
3. Monokloniniai antikūnai 9D3 prieš žmogaus alfa-interferoną.
4. Monokloniniai antikūnai 4E10, konjuguoti su peroksidaze (konjugatas).
5. Imobilizacijos buferis (0,05 M Na-karbonatinis buferis, pH 9,5).
6. Buferis PBS (0,05 M K/Na-fosfatinis buferis su 0,15 M NaCl, pH 7,2–7,4).
7. Buferis PBS-T (PBS su 0,1 % detergento Tween-20).
8. Blokavimo buferis (PBS su 1 % albumino).
9. Substratinis buferis (0,025 M Na-acetatinis buferis, pH 5,0).
10. o-fenilendiaminas.
11. 19 % vandenilio peroksido tirpalas.
12. 10 % sieros rūgšties tirpalas.

Darbo eiga

1. Monokloninių antikūnų 9D3 imobilizacija. Paruošiamas antikūnų 9D3 tirpalas: 5 µL antikūnų
suspensijos ištirpinama 5 mL imobilizavimo buferio. Į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilama po 50 µL
antikūnų tirpalo. Plokštelė inkubuojama 16 valandų +37 °C temperatūroje.
2. Blokavimas. Laisvas plokštelės paviršius blokuojamas albuminu. Į plokštelę išpilstoma po 150 µL
blokavimo buferio, inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Šulinėlių turinys išpilamas, ir plokštelė
tris kartus praplaunama PBS-T buferiu.
3. Standartinių tirpalų paruošimas. Standartiniai tirpalai ruošiami iš IFN-α2b substancijos tirpalo
(010398), kuriame IFN koncentracija yra 0,18 mg/mL (7,2×10
7
TV/mL), skiedžiant PBS-T buferiu.
Paruošiami standartiniai tirpalai, kuriuose IFN koncentracija yra: 500, 800, 1000, 1500, 2000, 2500,
3000 TV/mL.
151
4. Pavyzdžių paruošimas. Tiriamieji pavyzdžiai skiedžiami PBS-T buferiu tiek kartų, kad numatoma IFN
koncentracija būtų 500–3000 TV/mL koncentracijų.
5. Inkubacija su standartais ir pavyzdžiais. Į plokštelės 1, 6 ir 12 eilutes įpilama po 100 µL IFN
standartinių tirpalų. Į kitus šulinėlius įpilama po 100 µL tiriamųjų pavyzdžių. Plokštelė inkubuojama 1
valandą 37 °C temperatūroje. Tada šulinėlių turinys išpilamas, plokštelė 5 kartus praplaunama PBS-T
buferiu.
6. Inkubacija su konjugatu. Konjugatas 4E10 atskiedžiamas 1000 kartų PBS-T buferiu. Į visus plokštelės
šulinėlius įpilama po 100 µL konjugato tirpalo. Plokštelė inkubuojama 1 val. kambario temperatūroje.
Tada šulinėlių turinys išpilamas, plokštelė 10 kartų plaunama PBS-T buferiu ir 2 kartus distiliuotu
vandeniu.
7. Fermentinės reakcijos nustatymas. Paruošiamas peroksidazės substrato tirpalas: 5 mg o-
fenilendiamino ištirpinama 10 mL substratinio buferio ir pridedama 30 µL vandenilio peroksido tirpalo.
Į plokštelės šulinėlius išpilstoma po 100 µL šio tirpalo. Plokštelė inkubuojama tamsoje 10–15 min., kol
išryškėja spalva. Tada fermentinė reakcija sustabdoma, pridedant po 50 µL sieros rūgšties tirpalo.
Optinis tankis išmatuojamas spektrofotometru, esant šviesos bangos ilgiui 492 nm.

Skaičiavimai

Braižoma kalibracinė kreivė: ordinačių ašyje atidedamos gautos optinio tankio reikšmės, abscisių ašyje –
IFN standarto koncentracija, TV/mL (žr. pav.). IFN koncentracija tiriamuosiuose pavyzdžiuose nustatoma iš
kalibracinės kreivės, įvertinant praskiedimą. Braižant kalibracinę kreivę ir nustatant IFN koncentraciją
rekomenduojama naudoti Origin, GraphPad ar kitą kompiuterinę programą.

500 1000 1500 2000 2500 3000
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
O
p
t
i
n
i
s

t
a
n
k
i
s
,

4
9
2

n
m
IFN koncentracija, TV/ml

INF koncentracijos nustatymo imunofermentiniu metodu kalibracinė kreivė

Atsiskaitymas

- INF koncentracijos nustatymo kalibracinė kreivė;
- INF koncentracija tiriamajame tirpale.

Literatūra

1. Abbas, A. K.; Lichtman, A. H. Basic immunology. Philadelphia: W. B. Saunders Co., 2001, p. 125–146.
2. Roitt, I.; Brostoff, J.; Male, D. Immunology. 5th ed. St. Luois, USA: Mosby, 2000, p. 381–394.

152
B Bi io oo or rg ga an ni in nė ė c ch he em mi ij ja a
Laboratoriniai darbai
Albinas Žilinskas

1. Aminorūgštys ir baltymai

Aminorūgštys

Aminorūgštimis vadinami junginiai, kurių sudėtyje yra –NH
2
ir –COOH grupių. Yra aminorūgščių,
kurios turi kelias šias grupes arba imido grupę –NH (cikle), arba dar papildomai –OH, –SH grupes.
Klasifikacija. Pagal radikalus aminorūgštys skirstomos į aciklines ir ciklines (aromatines ir
heterociklines), o pagal funkcines grupes – į monoaminomonokarbonines, monoaminodikarbonines,
diaminomonokarbonines, hidroksiaminorūgštis, merkaptoaminorūgštis.
Izomerija. Aminorūgštys turi: 1) grandinės, 2) funkcinių grupių tarpusavio padėties, 3) optinius
izomerus.
Nomenklatūra. Aminorūgščių nomenklatūra niekuo nesiskiria nuo kitų organinių junginių
nomenklatūros, tačiau dažniau vartojami trivialieji aminorūgščių pavadinimai.
Gavimas. Dauguma gamtinių aminorūgščių yra α-aminorūgštys. Jos gaunamos halogenintas rūgštis
veikiant amoniaku, hidrolizuojant baltymus ir kt. būdais.
Fizikinės savybės. Aminorūgštys yra kristalinės medžiagos, įvairiai tirpstančios vandenyje.
Cheminės savybės. Pasižymi ir amino, ir karboksi- grupei būdingomis cheminėmis savybėmis.
Biologiškai svarbios aminorūgščių reakcijos: a) dekarboksilinimas – susidaro aminai, b) dezamininimas –
susidaro rūgštys; hidrolizinio dezamininimo produktas – hidroksirūgštys, oksidacinio – oksorūgštys,
redukcinio – sočiosios rūgštys; kai tiesiog atskyla amoniakas – nesočiosios rūgštys, c) peptidų bei
polipeptidų (baltymų) susidarymas iš gretimų aminorūgščių –COOH ir –NH
2
grupių atskylant H
2
O
molekulei ir d) transamininimas – amino grupės pernešimas oksorūgštims.

Baltymai

Tai labai sudėtingos struktūros polipeptidai, t. y. biopolimerai (jų yra daugiau kaip 20 rūšių), sudaryti iš
aminorūgščių. Baltymą sudaro per 100 aminorūgščių.
Klasifikacija. Pagal sudėtį baltymai (proteinai) skirstomi į paprastuosius, - tik iš aminorūgščių, ir
sudėtinius, kuriuose yra ir nebaltyminė prostetinė grupė, prisijungusi kovalentinėmis, joninėmis bei
koordinacinėmis jungtimis. Sudėtiniai baltymai, kurių prostetinė grupė yra angliavandeniai, vadinami
glikoproteinais; jei nukleino rūgštys – nukleoproteinai, jei lipidai – lipoproteinai ir t. t. (sudėtiniai baltymai
dar vadinami proteidais). Pagal molekulės formą ir tirpumą baltymai skirstomi į globulinius ir fibrilinius.
Nomenklatūra. Dažniausiai trivialioji, pavyzdžiui, miozinas yra raumenų (gr. myos) baltymas.
Savybės. Baltymai kaip ir aminorūgštys yra amfoteriniai junginiai. Jų tirpalų stabilumą lemia molekulių
krūvis ir hidratinio vandens sluoksnis. Baltymai išsiskiria nuosėdomis, kai praranda vieną arba abu stabilumo
veiksnius.
Baltymai, veikiami katalizatorių, hidrolizuojasi. Jiems būdingos spalvinės reakcijos.
Reikšmė. Baltymai svarbūs pramonėje: jie yra natūralios odos, vilnos, šilko pagrindas, iš jų gaminama
želatina. Šis iš dalies hidrolizuoto jungiamojo audinio baltymo kolageno polipeptidų mišinys vartojamas
fotopopieriui, kino juostoms gaminti, poligrafijoje, kulinarijoje ir kt. Biologinės baltymų funkcijos kartu su
nukleino rūgščių aktyvumu sudaro gyvybės procesų pagrindą. Baltymai įeina į ląstelių sandarą, reguliuoja
visas chemines reakcijas (visi fermentai, kai kurie hormonai, pvz., insulinas), saugo nuo infekcijos
(antikūniai), lemia judėjimą (raumenų baltymai) ir kt.

Aminorūgščių tirpalų pH nustatymas

Aminorūgščių tirpalų pH priklauso nuo to, kokių disocijuojančių į jonus grupių – rūgštinių ar bazinių –
jų molekulėse yra daugiau, ir nuo šių grupių disociacijos laipsnio.

153
Darbo eiga

1. Ant filtravimo popieriaus juostelės lygiais tarpais vienas nuo kito užlašinami keli lašai universaliojo
indikatoriaus ir ant jų – po lašą įvairių aminorūgščių tirpalų (2–4 %).
2. Lašų spalva palyginama su universaliojo indikatoriaus spalvų skale ir apytiksliai nustatoma
aminorūgščių tirpalų pH reikšmė.

Aminorūgščių amfoterinės savybės

Aminorūgštys turi ir bazinių, ir rūgštinių grupių, todėl joms būdingos dvejopos – rūgšties ir bazės
savybės.

Darbo eiga

A.
1. Į vieną mėgintuvėlį įlašinami 4 lašai 4 % glicino tirpalo, į kitą – 4 lašai vandens.
2. Į abu mėgintuvėlius įlašinus po lašą 1 % fenolftaleino spiritinio tirpalo, nė viename mėgintuvėlyje
skysčiai nenusidažo avietine spalva, būdinga fenolftaleinui šarminiame tirpale (pH > 8).
3. Tada į abu mėgintuvėlius įlašinama po lašą 0,01 N NaOH. Aminorūgšties tirpale spalva neatsiranda, nes
su NaOH glicinas sureaguoja kaip rūgštis, o mėgintuvėlyje, kuriame yra pašarmintas vanduo,
fenolftaleinas įgyja būdingą avietinę spalvą.
B.
1. Į vieną mėgintuvėlį įlašinami 4 lašai 4 % glicino tirpalo, į kitą – 4 lašai vandens, į abu – po lašą 0,2 %
indikatoriaus metiloranžo tirpalo. Nė vienas tirpalas nenusidažo raudonai – spalva, būdinga rūgštiesiems
tirpalams (pH < 4).
2. Tada į abu mėgintuvėlius įlašinama po lašą 0,01 N HCl. Aminorūgšties tirpalas lieka bespalvis, nes su
HCl glicinas sureaguoja kaip bazė, o mėgintuvėlyje, kuriame yra stipria rūgštimi parūgštintas vanduo,
metiloranžas įgyja raudoną spalvą.

Aminorūgščių kompleksniai junginiai su vario druskomis

Aminorūgštys su vario katijonais sudaro kompleksines mėlynos spalvos druskas – chelatus. Laisvieji
azoto elektronai įsijungia į laisvas išorines vario atomo orbitales:

Darbo eiga

Į mėgintuvėlį įlašinama po lašą 0,2 N CuSO
4
, 4 % glicino ir 2 N NaOH tirpalų. Tirpalas įgyja vario
kompleksams būdingą intensyviai mėlyną spalvą.
Bandyme svarbu atsižvelgti, kokie junginiai tiriami – pavyzdžiui, glicino natrio druska ar laisvasis
glicinas, lizino ir HCl druska ar laisvasis lizinas.

Aminorūgščių reakcija su nitrito rūgštimi

Aminorūgštys, veikiamos nitrito rūgštimi, virsta hidroksirūgštimis. Reakcijoje išsiskiria N
2
:

NH
2
O
O H
2
N
O
O
Cu
glicino vario chelatas
R CH COOH
NH
2
HONO R CH COOH
OH
H
2
O N
2
(NaNO
2
+ HCl)
+ + +
.
154

Darbo eiga

Į mėgintuvėlį įlašinama po lašą 2 N HCl, 2–4 % aminorūgšties ir 0,5 N NaNO
2
tirpalų. Tuojau pradeda
skirtis azotas.

Aminorūgščių reakcija su formaldehidu

Formaldehidas reaguoja su aminorūgšties –NH
2
grupe ir susidaro N-metilenaminorūgštis:


Kadangi blokuojama –NH
2
, tai disocijuoja tik –COOH grupė, ir tirpalas parūgštėja. Formaldehidas
tirpale yra hidrato HO–CH
2
–OH pavidalo, todėl gali susidaryti tokie N– dariniai: –NH, –CH
2
OH ir
–N(CH
2
OH)
2
.

Darbo eiga

A.
1. Į mėgintuvėlį įlašinama 3 lašai formalino ir 1 lašas 0,2 % indikatoriaus metilo raudonojo. Formaline yra
skruzdžių rūgšties, todėl tirpalas parausta.
2. Plonu užlydytu stikliniu kapiliaru į tirpalą įlašinama labai nedaug 2 N NaOH, ir tirpalas tampa neutralus
(geltonas).
3. Į kitą mėgintuvėlį įlašinama 3 lašai 4 % glicino ir 1 lašas to paties indikatoriaus tirpalų. Glicino tirpalas
neutralus, todėl metilo raudonasis nudažo jį geltonai. Šį glicino tirpalą supylus į mėgintuvėlį su
formaldehido tirpalu, skystis tuoj pat parausta, nes susidaro N-metilenglicinas.
B.
pH pakitimai stebimi įlašinus universaliojo indikatoriaus.

Baltymų biureto reakcija

Vario jonai labai šarminėje terpėje su baltymų peptidinėmis jungtimis sudaro violetinės spalvos
kompleksinį junginį:




R CH COOH
NH
2
R CH COOH
N
H
2
O.
+ + CH
2
O CH
2
C NH
2
O
C
NH
OH
Tautomerija
NH CHR
1
C
OH
N CHR
2
CO N CHR
3
CO
H
N CHR
4
CO N CHR
5
C
OH
N CHR
6
CO
Cu
155
Reaguoja junginiai, kuriuose yra ne mažiau kaip dvi peptidinės jungtys: biuretas (nuo to kilo
pavadinimas), tripeptidai, be to, kai kurios aminorūgštys. Reakcija gali būti taikoma baltymų kiekiui
nustatyti.

Darbo eiga

Į mėgintuvėlį įpilama po 1 mL baltymų, 2 N NaOH ir 1 lašas 0,2 N CuSO
4
tirpalų. Nusidažo rausvai
arba mėlynai violetine spalva.
Jei baltymų nedaug, imama daugiau CuSO
4
ir atsargiai sienele supilama į mėgintuvėlį, nesumaišant su
šarminiu baltymo tirpalu. Susidaro violetinis žiedas.
Bandymams dažniausiai vartojamas kiaušinio albuminų tirpalas (vieno kiaušinio baltymas kratant
sumaišomas su 100–200 mL vandens ir globulinai nufiltruojami pro audeklą).

Ninhidrino reakcija su baltymais

Veikiamos indan-1,2,3-triono hidrato (ninhidrino) α-aminorūgštys oksiduojasi, dezamininamos ir
dekarboksilinamos. Ninhidrinas, susidaręs redukuotas ninhidrinas ir NH
3
kondensuojasi į mėlynos spalvos
konjuguotų jungčių produktą:

Reaguojant peptidams bei baltymams, CO
2
neišsiskiria.


Darbo eiga

Į 5 lašus baltymų tirpalo įlašinama tiek pat 0,1 % ninhidrino tirpalo ir pavirinama apie minutę. Nusidažo
violetine, o ataušus – mėlyna spalva.
Reakcija taikoma aminorūgščių chromatografijoje ir kolorimetrinėje analizėje.

Ksantoproteino reakcija

Veikiant koncentruotąja HNO
3
, baltymų aromatinės aminorūgštys nitrinasi, ir susidaro geltoni (gr.
xantos) nitrojunginiai:


Tokia reakcija vyksta azoto rūgščiai patekus ant odos.



O
O
OH
OH
R CH COOH
NH
2
O
O
H
OH
R
O
H
CO
2
NH
3
+ + + +
t
O
O
H
OH
NH
3
O
O
HO
HO
HO
O O
O
N
-3H
2
O
+ +
.
.
HO CH
2
CH COOH
NH
2
HO CH
2
CH COOH
NH
2
O
2
N
O
2
N
+2 HNO
3
-2 H
2
O
.
156
Darbo eiga

1. Į mėgintuvėlį įpilama 1 mL nepraskiestų baltymų ir lašinama koncentruotoji HNO
3
, kol išsiskiria
baltymų nuosėdos. Galima imti 5 lašus baltymų tirpalo (10 %) ir 3 lašus koncentruotosios HNO
3

2. Mėgintuvėlį atsargiai pakaitinus, tirpalas ir nuosėdos įgyja geltoną spalvą.

Folio reakcija

Sieros turinčios aminorūgštys cisteinas (Cis) ir cistinas (Cis-S-S-Cis), bet ne metioninas (Met),
baltymuose nustatomos pagal jų molekulėse randamą sierą.

Darbo eiga

A.
Į 5 lašus baltymų tirpalo įlašinama tiek pat 2 N NaOH ir kaitinama kelias minutes. Ataušintame skystyje
nustatomas sulfido jonas.
B.
Galima virinti baltymų tirpalą su Folio reagentu. Šis reagentas ruošiamas taip: į 5 % švino acetato tirpalą
įpilama tiek 2 N natrio šarmo tirpalo, kad ištirptų susidariusios Pb(OH)
2
nuosėdos. Gaunamas natrio
pliumbitas Na
2
PbO
2
. Šis junginys ir reaguoja su sulfidu:

(CH
3
COO)
2
Pb + 2NaOH Pb(OH)
2
+ 2CH
3
COONa,
Pb(OH)
2
+ 2NaOH Na
2
PbO
2
+ 2H
2
O,
Na
2
PbO
2
+ Na
2
S + 2H
2
O PbS + 4NaOH.

2. Angliavandeniai

Klasės pavadinimas rodo, kad daugelio šių junginių molekulinę formulę galima nagrinėti kaip sudarytą
iš anglies ir vandens tam tikru santykiu (pvz., gliukozė C
6
H
12
O
6
= 6C : 6H
2
O). Nors dabar yra žinoma tokių
angliavandenių, kurių sudėtis nėra išreiškiama tokia formule, ir daugelis turi N, S atomų, bet terminas
„angliavandeniai“ vartojamas plačiausiai (sinonimai – sacharidai, karbohidratai).
Angliavandeniai klasifikuojami į paprastuosius, t. y. monosacharidus, kurie negali būti hidrolizuoti iki
paprastesnių molekulių, ir į sudėtinguosius, t. y. polisacharidus, kurie hidrolizuojami skyla į n molekulių
monosacharidų. Kai n = 2 – 10, angliavandeniai vadinami oligosacharidais (gr. oligos – nedaug). Svarbiausi
iš jų yra disacharidai.
Reikšmė. Iš organinių junginių Žemėje daugiausia yra angliavandenių. Jų reikšmė įvairiapusė. Gryna
celiuliozė yra vata ir filtravimo popierius. Šis polisacharidas yra popieriaus, lininių ir medvilninių audinių,
viskozinio šilko bei celofano pagrindas. Svarbūs ir celiuliozės esteriai: iš acetilceliuliozės gaminamas
acetatinis šilkas, kino juostos, lakai. Iš visiškai nitrintos celiuliozės (piroksilino) gaminamas bedūmis
parakas. Mažiau nitrinta celiuliozė (koloksilinas) vartojama kolodijui, nitrolakams, celiulioidui gaminti. Iš
celiuliozės gaunama gliukozė, o iš jos – etilo alkoholis (hidrolizinis). Pektinai dėl hidrofiliškumo ir tirpalų
želatinėjimo vartojami maisto, kosmetikos pramonėje. Daug sacharozės suvartojama konditerijoje. Iš jos
gaminami vertingi detergentai, dervos, lakai ir kt. Biologinės angliavandenių funkcijos įvairios.
Angliavandeniai yra būtina sudėtinė maisto dalis. Kaip energijos šaltinis krakmolas yra pagrindinis žmogaus
(celiuliozė – kai kurių gyvūnų, pvz., vabzdžių termitų) maisto komponentas. Krakmolas augalų, o glikogenas
gyvūnų ląstelėse yra rezervinės energijos šaltinis. Daugelis junginių, susijusių su medžiagų apykaitos
procesais, turi angliavandeninį komponentą (nukleino rūgštys, kofermentai, kai kurie hormonai, fermentai ir
kt.). Polisacharidai reikšmingi struktūriniu požiūriu: membranose, jungiamajame audinyje ir pan. jie sudaro
kompleksus su baltymais ir lipidais (hialurono rūgštis, chondroitinsulfatai). Augalų ląstelių struktūros
pagrindą sudaro celiuliozė, pektinai, vėžiagyvių – chitinas. Specifinės biologinės organizmo savybės (kraujo
grupių specifiškumas, imunitetas) taip pat susijusios su angliavandeniais. Medicinoje gliukozės tirpalo
įšvirkščiama į veną tada, kai organizmo ląsteles reikia greitai aprūpinti maisto medžiagomis (energija),
pavyzdžiui, sutrikus širdies veiklai. Gliukozės įdedama į tabletes, pavyzdžiui, kartu su vitaminu C. Šis
vitaminas bei šešias –OH grupes turintis alkoholis sorbitolis (skiriamas diabetikams) sintetinami iš gliukozės.
Sacharozė vartojama suteikti saldumo vaistams (milteliams) arba jiems konservuoti (sirupai). Krakmolas gali
157
būti vartojamas tabletėms gaminti, pabarstams. Yra vaisių (obuolių), kurie vertingi tuo, kad jų pektinai
žarnyne sujungia kenksmingus produktus. Celiuliozės (medvilnės) dirbiniai yra bintas, marlė, vata, ligoninių
skalbiniai. Tam tikrų bakterijų gaminami polisacharidai dekstranai vartojami, kaip kraujo plazmos pakaitalai
nukraujavus. Be to, iš jų gaminami sefadeksai, kuriuos panaudojant nustatoma baltymų molekulinė masė.

Angliavandenių hidroksilo grupių reakcija

Angliavandenių molekulėse, kaip ir glicerolyje, viena greta kitos yra keletas hidroksilo grupių. Todėl
šarminiuose tirpaluose jos, kaip ir glicerolis, reaguoja su Cu(II) jonais ir sudaro spalvotus kompleksinius
junginius.

Darbo eiga

Į mėgintuvėlį įlašinama po 1 lašą (1 %) tirpalų: į I − gliukozės, į II − fruktozės, į III − sacharozės, į IV −
laktozės arba maltozės, po 6 lašus 2 N NaOH ir po lašą 0,2 N CuSO
4
.
Išsiskiria melsvos Cu(OH)
2
nuosėdos. Supurčius jos ištirpsta, susidaro mėlynos spalvos vario ir
sacharido chelatas.

Angliavandenių aldehidinės grupės reakcija

Nors dauguma gliukozės ir kitų angliavandenių molekulių yra ciklinės formos, bet oksidacijos reakcijoje
jos dalyvauja būdamos tautomerinės formos – aldehido pavidalo. Kaip oksidatoriai dažniausiai būna metalų
kompleksiniai junginiai šarminiame tirpale. Reakcijos metu oksidatoriai redukuojasi, todėl visi
angliavandeniai, kurie turi aldehidinę grupę arba juose yra laisvasis pusacetalinis hidroksilas, vadinami
redukuojančiaisiais sacharidais.
Monosacharidai. Aldozės oksiduojasi lengvai. Ketozės, veikiamos šarmų, izomerizuojasi į aldozes per
tarpinį enolį (endiolinį junginį), todėl jos taip pat lengvai redukuoja metalus:


Iš disacharidų reaguoja tik tie, kurie turi laisvą pusacetalinę hidroksilo grupę. Polisachariduose laisvų
aldehidinių grupių nedaug (pvz., krakmole − viena šimtams gliukozės vienetų), todėl pagal šias reakcijas jos
neaptinkamos. Tačiau mažesnės polisacharidų molekulės (dekstrinai) gali redukuoti metalus.
Reagentai: 1) vario hidroksidas (Tromerio reagentas); 2) vario gliceratas (Haineso reagentas); 3) vyno
rūgšties kalio ir natrio druskos vario alkoholiatas (Felingo reagentas).
C
CH
2
OH
O C
C
OH
H OH
C
C
OH
H O
H
.
C H OH
O
C H O COOH
[O]
2 CuSO
4
H
2
O+ [O] + 2 CuOH .
t
Cu
2
O + H
2
O
raudonas
OKSIDACIJA
REDUKCIJA
ketozė enolinė forma aldozė
158
Šiuose cheminiuose reagentuose yra Cu(II) jonų. Jiems redukuojantis iki Cu(I) jonų, angliavandeniliai
oksiduojasi į rūgštis, pavyzdžiui, oksiduojant gliukozę šarminėje terpėje, susidaro glicerolio, glikolio,
skruzdžių rūgštys, t. y. produktai, kurių mažesnis C atomų skaičius.
Kaip oksidatoriai gali būti ir kiti metalai: Ag(I), Bi(III), Fe(III). Šių metalų redukcija pagrįsti metodai
taikomi gliukozei nustatyti kraujyje, šlapime. Tačiau biologiniuose skysčiuose gali būti ir kitų redukuojančių
junginių (šlapimo rūgšties, kai kurių vaistų ir kt.). Specifiškiausias yra fermentinis metodas gliukozei
nustatyti gliukozės oksidaze.

Darbo eiga

A. Tromerio reakcija. Į 4 mėgintuvėlius su kompleksiniais vario sacharato tirpalais, gautais praeitame
laboratoriniame darbe, įlašinama po 5–6 lašus H
2
O. Mėgintuvėliai pakreipiami nedideliu kampu ir kaitinama
tik viršutinė skysčio dalis (apatinė dalis yra kontrolinė), kol užverda (nevirinti, nes gali skilti Cu(OH)
2
ir
oksiduotis kiti junginiai). Pašildytos skysčio dalies spalva iš mėlynos Cu(OH)
2
pasikeičia į geltoną CuOH
arba raudoną Cu
2
O spalvą.
B. Haineso reakcija. Į 4 mėgintuvėlius įlašinama po 5 lašus CuSO
4
, 10 lašų NaOH, 5 lašus glicerolio;
supurčius susidaro tamsiai mėlynas vario glicerato tirpalas. Tada įlašinama po 5 lašus H
2
O ir gautas tirpalas
pakaitinamas iki virimo. Mėgintuvėliai pakreipiami ir ant sienelės užlašinama po 3 lašus angliavandenių
tirpalų. Viršutiniame karšto reagento sluoksnyje įvyksta oksidacijos ir redukcijos reakcija.
C. Felingo reakcija. Į 4 mėgintuvėlius įlašinama po 5 lašus Felingo-I ir Felingo-II ir po 3 lašus
angliavandenių tirpalų. Mėgintuvėliai kaitinami verdančio vandens vonioje arba degiklio liepsna, kol
pasirodo redukuotų vario junginių spalva.
D. Tolenso reakcija. Į 4 mėgintuvėlius įlašinama po 1 lašą 0,2 N AgNO
3
ir 2 lašus 2 N NaOH tirpalų.
Susidariusios nuosėdos ištirpinamos 3–4 lašuose 2 N NH
4
OH. Į kiekvieną mėgintuvėlį įlašinama po 1 lašą
angliavandenių tirpalų. Mėgintuvėliai truputį pašildomi virš degiklio liepsnos, kol susidrumsčia tirpalai
(išsiskiria laisvasis Ag). Blizgančiu sluoksniu (sidabro veidrodis) sidabras nusėda tik tada, jei mėgintuvėlio
sienelės buvo švariai nuplautos (neriebaluotos).
Ši reakcija taikoma veidrodžiams, eglutės žaislams gaminti.

Ketozių reakcija

Ketoheksozės, šildomos su praskiesta HCl, dehidratuojasi iki 5-hidroksimetilfurfuralio (ketopentozės-
iki furfuralio). Gautas aldehidas kondensuojasi su rezorcinoliu (arba kitais fenoliais bei aromatiniais
aminais), sudarydamas spalvotą junginį:


Šioje F. Selivanovo pasiūlytoje reakcijoje aldoheksozės reaguoja 15–20 kartų lėčiau, todėl metodas
būdingas ketozėms.

Darbo eiga

1. Į mėgintuvėlį įlašinama 5 lašai angliavandenių tirpalų ir 5 lašai Selivanovo reagento (0,01 g rezorcinolio,
ištirpinto 10 mL koncentruotosios HCl ir 10 mL H
2
O mišinyje) arba įmetama kruopelė sauso
rezorcinolio ir įlašinami 2 lašai koncentruotosios HCl.
CH
2
OH
OH
H
HO
H
H OH
O
HOH
2
C
O
HOH
2
C
O
H
rezorcinolis
-H
2
O
Raudonos spalvos kondensacijos
produktai
H
+
159
2. Mėgintuvėlis 2 min. laikomas verdančio vandens vonioje. Spalva mėgintuvėlyje su fruktoze tampa
ryškiai raudona.
Paaiškinkite, kodėl mėgintuvėlyje su sacharoze tirpalas tampa raudonas. Išsiaiškinkite, kaip šioje
reakcijoje pakinta disacharidai, kad galėtų įvykti Selivanovo reakcija.

Angliavandenių hidrolizė

Monosacharidai nesihidrolizuoja. Disacharidai suskyla į dvi, polisacharidai – į n monosacharidų
molekulių. Hidrolizei būtini katalizatoriai (rūgštys, fermentai). Polisacharidai hidrolizuojasi pakopomis:
didelės jų molekulės skyla į vis mažesnio polimerizacijos laipsnio polisacharidus, toliau susidaro
disacharidai ir pagaliau – monosacharidai.
Hidrolizės produktai nustatomi spalvinėmis reakcijomis.

Sacharozė + Vanduo → Gliukozė + Fruktozė
[α]
D
(+66°) [α]
D
(+52°) [α]
D
(–92°)


Sacharozės hidrolizė. Sacharozė, esant katalizatoriams (rūgštims, o organizme – žarnyno fermentams),
suskyla į gliukozę ir fruktozę:
Reakcijos pabaigą galima sekti cheminiu (oksiduojant) arba fizikiniu (matuojant poliarizuotos šviesos
lyginamąjį sukimo kampą [α]) būdu.

Darbo eiga

1. Į du mėgintuvėlius įlašinama po 1 lašą 2 % sacharozės, 1 lašą 2 N HCl ir 6 lašus H
2
O.
2. Vienas mėgintuvėlis labai pakreipiamas ir nuolat supurtant (atsargiai!) 30 s kaitinamas degiklio
liepsnoje.
3. Į abu mėgintuvėlius įlašinama po 2 lašus 2 N NaOH, 5 lašus Felingo-I ir 5 lašus Felingo-II tirpalų.
4. Abu mėgintuvėliai kaitinami. Kodėl spalva pasikeičia tik viename mėgintuvėlyje? Parašykite reakcijos
lygtį struktūrinėmis formulėmis.

Krakmolo hidrolizė

Krakmolas hidrolizuojasi palaipsniui veikiant H
2
O ir katalizatoriumi:


(C
6
H
10
O
5
)
n


(C
6
H
10
O
5
)
x


(C
6
H
10
O
5
)
1-2
n/2 C
12
H
22
O
11
n C
6
H
12
O
6
krakmolas tirpusis krakmolas dekstrinai maltozė gliukozė

Kai katalizatorius yra rūgštis, hidrolizė vyksta kaitinant, krakmolas virsta α-gliukoze. Kai hidrolizės
katalizatorius yra fermentas amilazė, procesas vyksta nešildant, o pagrindinis produktas yra maltozė.
Hidrolizės produktai aptinkami atliekant reakciją su jodu arba oksidacijos reakciją. Jodo molekulė įsiterpia į
amilozės spiralės pavidalo molekulės vidų, susidaro spalvotas kompleksas.
Katalizatorius rūgštis
1. Į vieną mėgintuvėlį įlašinami 5 lašai 0,5 % krakmolo kleisterio ir 2 lašai H
2
O (kontrolinis
palyginamasis mėgintuvėlis).
2. Verdančio vandens vonioje mėgintuvėliai laikomi 5 min. Tada kas 1–2 min. iš pirmojo mėgintuvėlio 1
lašas hidrolizato ant stiklelio arba mėgintuvėlyje sumaišomas su 1 lašu labai praskiesto jodo tirpalo
(atskirame mėgintuvėlyje 1 lašas jodo praskiedžiamas 5 lašais H
2
O). Taip pat daroma ir su kontroliniu
mėgintuvėliu. Krakmolas su jodu sudaro mėlynai violetinės spalvos produktą, o hidrolizės reakcijoje
susidarę vis mažėjančio polimerizacijos laipsnio tarpiniai produktai dėl jodo įgyja violetinę, vėliau –
raudonai violetinę spalvą. Maltozė ir gliukozė su jodu nereaguoja (išlieka gelsva jo tirpalo spalva). Šiuos
angliavandenius galima nustatyti vykstant bet kokiai oksidacijos reakcijai; prieš tai tirpalą reikia
160
neutralizuoti ir pridėti šarmo perteklių, pavyzdžiui, į hidrolizatą įlašinama 6–8 lašai 2 N NaOH, 1 lašas 0,2
CuSO
4
ir šildoma.
Krakmolo hidrolizės reakcija taikoma gliukozei gauti.
Katalizatorius fermentas.
Mėgintuvėlyje gerai sumaišoma 5 lašai krakmolo kleisterio ir 5 lašai savo seilių. Po 1–2 min. hidrolizės
substratas krakmolas (reakcija su jodu) ir šio proceso produktas maltozė (oksidacija) analizuojami taip pat,
kaip ir vartojant rūgštinį katalizatorių.

Celiuliozės hidrolizė

Celiuliozė per tarpinius produktus, veikiant H
2
O ir katalizatoriui (rūgščiai, o žolėdžių gyvūnų – žarnyno
mikroorganizmų fermentams), suskyla į β-gliukozę:

(C
6
H
10
O
5
)
n


(C
6
H
10
O
5
)
x
n/2 C
12
H
22
O
11
n C
6
H
12
O
6
celiuliozė amiloidas celiobiozė gliukozė

Celiuliozės dalinė hidrolizė. Trumpai paveikto pakankamai koncentruotu H
2
SO
4
tirpalu popieriaus
paviršiuje susidaro dalinės hidrolizės produktas amiloidas, kuris užpildo poras ir suklijuoja plaušelius. Toks
popierius nepraleidžia vandens, riebalų, yra stiprus. Juo pakuojami medikamentai, maisto produktai
(sviestinis popierius).

Darbo eiga

1. Filtravimo popieriaus juostelė (0,5×4 cm) iki pusės įmerkiama į porcelianinę lėkštelę su 70 % H
2
SO
4
tirpalu ir palaikoma 15–20 s.
2. Tada juostelė gerai išplaunama tekančiu vandeniu ir vandeniu, į kurį įlašinta keli lašai NH
4
OH.
Palyginama abiejų juostelės pusių tankis, tvirtumas.
Celiuliozės hidrolizė iki gliukozės. Kadangi celiuliozė vandenyje netirpsta, ji ištirpinama koncentruotoje
H
2
SO
4
, paskui įpilama vandens, kad vyktų hidrolizė (sieros rūgštis ne tik tirpina – ji veikia sudėtingiau: kartu
celiuliozė esterinama, vyksta jos destrukcija, susidaro rusvi sudėtingos struktūros produktai ir kt.).
Ši reakcija taikoma pramonėje gliukozei, o iš jos − hidroliziniam spiritui gauti (celiuliozės žaliava čia –
medienos atliekos).

Darbo eiga

1. Į mėgintuvėlį įdedamas nedidelis (0,5×1 cm) gabalėlis filtravimo popieriaus ir įlašinami 3–5 lašai
koncentruotos H
2
SO
4
. Trinant ir maišant lazdele, celiuliozė ištirpsta (galima pašildyti; atsargiai!).
2. Įlašinus (atsargiai!) 10 lašų H
2
O, mišinys kaitinamas verdančio vandens vonioje.
3. Po 20 min. prie 2 lašų hidrolizato pridedami 8 lašai 2 N NaOH ir 1 lašas 0,2 N CuSO
4
tirpalo – vyksta
Tromerio reakcija.

3. Nukleino rūgštys

Nukleino rūgštys yra biopolimerai, sudaryti iš mononukleotidų, t. y. jos yra polinukleotidai.
Nukleozidai yra pentozių N-glikozidai su heterociklinėmis azoto bazėmis, t. y. sudaryti iš bazės ir
pentozės.
Nukleotidai – nukleozidų fosfatai, t. y. sudaryti iš bazės, pentozės ir fosforo rūgšties.
Struktūra. Nukleino rūgštys yra dviejų tipų: DNR ir RNR. Jų sudėtis (DNR − dezoksiribozė ir timinas,
RNR − ribozė ir uracilas), struktūra ir biologinės funkcijos skirtingos.
Reikšmė. Mononukleotidai – nukleozidų 5-monofosfatai – sudaro nukleino rūgštis. ATP yra pagrindinis
ląstelių junginys, kurio dviejose makroenergetinėse fosfatinėse jungtyse susikaupia įvairių junginių
biologinės oksidacijos metu atsipalaiduojanti energija. Būdama cheminės energijos atsarginė forma, ATP
aktyvuoja junginius vykstant jų skilimo reakcijoms (gliukozė virsta gliukozės-6-fosfatu) ir ypač biosintezės
reakcijoms. Pavyzdžiui, aminorūgštis, reaguodama su ATP, prisijungia AMP ir sudaro aminoaciladenilatą
161
(šio darinio pavidalu ir pradedama baltymų sintezė). Analogiškas vaidmuo ir kitų trifosfatų: GTP dalyvauja
baltymų, UTP − polisacharidų biosintezėje. Be to, ATP reikalingas, kad susitrauktų raumenys bei
medžiagoms transportuoti per membranas ir kt.
Kalcio adenozinmonofosfatas (CaAMP) yra ypatingas ląstelės metabolizmo ir įvairių fiziologinių
procesų reguliatorius, svarbus hormonų funkcionavimui, polinukleotidų DNR ir RNR funkcijoms – ląstelių
genetinės informacijos saugojimui, perdavimui ir realizavimui. Medicinoje ATP natrio arba kalcio druskomis
gydomos raumenų ir kraujagyslių ligos.

Nukleoproteinų hidrolizė

Nukleoproteinai yra nukleino rūgščių nekovalentiniai junginiai su baltymais, pavyzdžiui, ląstelių
branduoliuose DNR fosfatinės jonizuotos grupės sąveikauja su šarminių baltymų histonų aminorūgščių
šarminėmis grupėmis. Nukleoproteinų daug ląstelėse, kurios intensyviai dauginasi bei kuriose vyksta aktyvi
baltymų sintezė.
Nukleoproteinų hidrolizė in vitro (mėgintuvėlyje) atliekama veikiant rūgštiniu katalizatoriumi, o in vivo
(gyvame organizme) vyksta dėl fermentų poveikio. Hidrolizės produktai nustatomi pagal būdingas reakcijas.
Parašykite reakcijos schemą.

Darbo eiga

1. Gabalėlis supresuotų mielių (apie 1 g) pirštais sutrupinama ir sumetama į ilgą mėgintuvėlį arba į kolbutę.
2. Mielės užpilamos 20 mL 2 N H
2
SO
4
. Mėgintuvėlis užkemšamas kamščiu su oro šaldytuvu – 30 cm ilgio
stiklo vamzdeliu – ir įtvirtinamas stove nuožulniai. Šaldytuvo anga nukreipiama į langą.
3. Mėgintuvėlio turinys silpnai virinamas, kaitinant mėgintuvėlį per asbesto tinklelį apie 1 h (atsargiai!).
4. Ataušęs hidrolizatas filtruojamas pro popieriaus filtrą į mėgintuvėlį.
5. Polipeptidai nustatomi pagal biureto reakciją. Į 5 lašus hidrolizato įlašinama 10 lašų 2 N NaOH ir 1 lašas
0,2 N CuSO
4
– tirpalas nusidažo rausvai violetine spalva.
6. Pentozės nustatomos atliekant Tromerio reakciją. Į 5 lašus hidrolizato įlašinama 10 lašų 2 N NaOH ir
lašinamas 0,5 N CuSO
4
tirpalas, kol susidaro neišnykstančios Cu(OH)
2
nuosėdos. Pašildžius tirpalą iki
virimo, susidaro geltonos CuOH arba raudonos Cu
2
O nuosėdos.
7. Purino bazės nustatomos pagal susidariusias sidabro druskas. 10 lašų hidrolizato neutralizuojama 1 lašu
koncentruoto amoniako ir įlašinami 5 lašai 0,2 N AgNO
3
. Po 5 min. susidaro negausių rusvų nuosėdų –
purino sidabro darinių (jo imidazolo ciklo –NH grupės H
+
pakeičiamas į Ag
+
).
8. Fosforo rūgštis nustatoma pagal molibdeninę reakciją. Į 10 lašų molibdeno reagento (amonio molibdato
tirpalo azoto rūgštyje) įlašinama tiek pat hidrolizato ir virinama kelias minutes (degiklio liepsna).
Tirpalas pageltonuoja, o iš ataušusio išsiskiria geltoni kompleksinio junginio kristalai. Reakcijos lygtis
tokia:

12(NH
4
)
2
MoO
4
+ H
3
PO
4
+ 21HNO
3
→ (NH
4
)
3
PO
4
·12MoO
3
+ 21NH
4
NO
3
+ 12H
2
O.

Glikoproteinų prostetinės grupės nustatymas

Glikoproteinai yra baltymai, kovalentinėmis jungtimis prisijungę angliavandenius. Pavyzdžiui, seilių
glikoproteinų (mucinų) prostetinė grupė yra oligosacharidai, O-glikozidine jungtimi prisijungę prie baltymo
–OH grupių. Žmogaus seilių mucinuose yra sialo rūgšties, N-acetilgalaktozamino, galaktozės ir kt. Šie
angliavandeniai gali būti nustatyti atliekant Molišo reakciją (analogiška Selivanovo reakcijai).

Darbo eiga

1. Į mėgintuvėlį surenkama 2 mL seilių ir įlašinami 5 lašai koncentruotos acto rūgšties.
2. Susidariusios mucino nuosėdos lazdele perkeliamos į kitą mėgintuvėlį, įlašinami 2 lašai 1 % spiritinio α-
naftolio tirpalo ir sumaišoma.
3. Per pakreipto mėgintuvėlio sienelę atsargiai įleidžiama 1 mL koncentruotos H
2
SO
4
.
Skysčių paviršiuje ties riba susidaro violetinis žiedas (jei nesusidaro, reikia dar pridėti H
2
SO
4
).
Vietoj naftolio paėmus timolio, susidaro raudonas žiedas, jei dedama difenilamino – mėlynas.
162
4. Lipidai

Vieni iš svarbiausių junginių, priklausančių lipidams, yra riebalai. Jie yra glicerolio ir aukštesniųjų
sočiųjų ir nesočiųjų karboninių lyginio C atomų skaičiaus (C
16
, C
18
) rūgščių esteriai − trigliceridai. Glicerolis
esterinamas vienodomis arba (dažniau) įvairiomis rūgštimis.
Pagal tirpumą organiniuose tirpikliuose į riebalus panašios esti įvairios struktūros medžiagos. Jos sudaro
kitas lipidų klases. Lipidams priskiriami biologiškai svarbūs junginiai, kuriuose yra esterinių jungčių:
fosfatidai (glicerolio dariniai), sfingolipidai (nesočiojo amino alkoholio sfingozino dariniai), steridai
(policiklinio nesočiojo alkoholio, turinčio ciklopentanoperhidrofenantreno žiedą, dariniai), vaškai
(aukštesniųjų alkoholių dariniai). Fosfatidai yra fosfatido rūgšties ir aminoalkoholių etanolamino, cholino
arba serino esteriai. Jų bazinių savybių aminogrupė prisijungia protoną iš fosforo rūgšties, ir susidaro vidinė
druska.
Nomenklatūra ir klasifikacija. Riebalai vadinami pagal juos sudarančias rūgštis, pavyzdžiui, tristearinas.
Jei rūgštys nevienodos, nurodoma, kuris glicerolio hidroksilas sudaro esterį su ta ar kita rūgštimi, pavyzdžiui
1,3-dioleoil-2-stearoilglicerolis. Praktikoje jie dažniausiai vadinami trivialiais vardais, pavyzdžiui,
saulėgrąžų aliejus, žuvų taukai. Pagal konsistenciją, kuri priklauso nuo sočiųjų ir nesočiųjų rūgščių santykio,
riebalai skirstomi į kietuosius (juose vyrauja sočiosios, stearino ir palmitino rūgštys) ir skystuosius (juose
daugiau nesočiųjų rūgščių − oleino, linolio, linoleno), vadinamus aliejais.
Savybės. Riebalų cheminis aktyvumas daugiausia priklauso nuo jų sudėtyje esančių nesočiųjų rūgščių.
1. Riebalų nesotumą nusako jodo skaičius, t. y. jodo, prisijungusio prie 100 g riebalų, kiekis, g.
2. Riebalų molekulinę masę apibūdina sumuilinimo skaičius. Jis rodo, kiek kalio šarmo miligramų reikia
1 g riebalų sumuilinti.
3. Ore kai kurie aliejai (linų ir kt.) sudaro kietas plėveles. Šio proceso metu nesočiosios rūgštys
polimerinasi ir oksiduojasi.
4. Aliejai ilgainiui apkarsta, nes jie suyra veikiami mikroorganizmų fermentų: gliceridai hidrolizuojasi,
laisvosios nesočiosios rūgštys oksiduojasi per vandenilio peroksido stadiją iki aldehidų, ketonų, dažnai
nemalonaus kvapo. Dėl panašios ląstelių membranų lipidų peroksidinės oksidacijos, ypač kai trūksta
vitamino E, pažeidžiama membranų struktūra ir funkcijos.
5. Hidrogenizuojamų aliejų nesočiosios rūgštys virsta sočiosiomis, susidaro kietas produktas.
6. Svarbi riebalų savybė yra jų geba hidrolizuotis.
Reikšmė. Linų ir kiti džiūstantieji aliejai vartojami dažams, linoleumui gaminti. Hidrogeninami aliejai
sukietėja, į produktą pridėjus pieno, kiaušinių trynių, vitaminų – gaunamas margarinas. Iš riebalų gaminami
muilai. Riebalai vartojami kosmetikoje. Medicinoje kai kurie vaistai, įšvirkščiami po oda, būna ištirpinti
aliejuose. Biologiškai svarbios yra aukštesniosios polieninės rūgštys. Organizmas pasisavina vitaminus A, D,
E, K, ištirpusius riebaluose. Biologinė lipidų reikšmė įvairi. Riebalai saugo kūną, kad neatšaltų ir nuo
smūgių. Jie yra cheminės energijos atsarginė forma. Fosfatidai sudaro pagrindinę ląstelių membranų dalį. Jie
reikalingi medžiagoms transportuoti per membraną. Sfingomielinų taip pat yra membranose, jų daug
nervinio audinio ląstelėse. Du trečdaliai kraujo palzmos cholesterolio yra susijungę į esterius – cholesteridus.
Bičių vaškas yra savita struktūrinė medžiaga. Jame yra palmitino rūgšties ir miricilo alkoholio esterio.
Augalų vaškai taip pat yra aukštesniųjų rūgščių ir alkoholių esteriai. Lapus, vaisius vaškas saugo nuo
išdžiūvimo, mikroorganizmų ir kt. Jūrų planktono, kuriuo minta daugelis jūros gyventojų, pagrindinis
lipidinis komponentas yra vaškai.

Riebalų hidrolizė ir susidariusių produktų nustatymas

Riebalai, kaip ir visi esteriai, hidrolizuojasi. Esant šarmų, susidaro glicerolis ir riebiųjų rūgščių druskos –
muilai, todėl šarminė hidrolizė vadinama muilinimu. Kad susidarė muilas, galima nustatyti pagal tirpumą
vandenyje (riebalai netirpsta) arba iš to, kad muilas, sumažindamas paviršiaus įtempimą oro ir vandens
sąlyčio paviršiuje, sudaro putas.

163

CH
2
CH
CH
2
O
O
O
CO
CO
CO
C
17
H
33
C
15
H
31
C
17
H
31
+ 3 NaOH
t
CH
2
CH
CH
2
OH
OH
OH
+
C
17
H
33
COONa
C
15
H
31
COONa
C
17
H
31
COONa
.


Riebalų hidrolizė

Darbo eiga

1. Į porceliano lėkštelę įlašinama 20 lašų aliejaus ir 20 lašų 40 % NaOH tirpalo.
2. Mišinys maišomas stikline lazdele ir 6–8 min. laikomas verdančio vandens vonioje; galima kaitinti
degiklio liepsna per asbestuotą tinklelį.
3. Vietoj išgaravusio vandens retkarčiais įlašinama 5 lašai naujo.
4. Riebalų hidrolizė laikoma baigta, kai gelsvas vienalyčio skysčio lašas, o ilgiau pakaitinus − baltos masės
gabalėlis, visiškai ištirpsta vandenyje (1 mL).
5. Suplakus gauto muilo tirpalą, susidaro putų.
Hidrolizuoti galima saulėgrąžų arba lengviau reaguojantį ricinos aliejų.

Glicerolio nustatymas riebalų hidrolizės produktuose

Darbo eiga

Į mėgintuvėlį įlašinama 5 lašai tirpalo, gauto sumuilinus riebalus, 1 lašas 0,2 N CuSO
4
tirpalo ir
suplakama.
Susidaro mėlynas tirpus vario gliceratas.

Laisvųjų riebiųjų rūgščių išskyrimas iš muilo

Stipri neorganinė rūgštis išstumia karbonines rūgštis iš jų druskų:


Muilas yra tirpus, o iš jo susidariusios laisvosios riebalų rūgštys – netirpios, pagal tai ir sprendžiama apie
reakciją.

Darbo eiga

1. Į mėgintuvėlį įdedamas pagaminto muilo gabalėlis, įlašinama 5–7 lašai distiliuoto vandens.
2. Mėgintuvėlio turinys maišomas ir plakamas, kol ištirpsta muilas.
3. Įlašinami 3 lašai 2 N H
2
SO
4
tirpalo. Mišinys turi būti rūgštus – tikrinama mėlyno lakmuso popierėliu.
4. Tuoj pat išsiskiria baltos nuosėdos – laisvosios riebalų rūgštys. Mišinį pašildžius, rūgštys susikaupia
paviršiuje.
5. Įlašinami 5 lašai bromo vandens – bromo spalva išnyksta. Vadinasi, aliejuje yra nesočiųjų riebiųjų
rūgščių. Jas galima nustatyti ne tik laisvąsias, bet ir įeinančias į aliejaus sudėtį.

5. Alkaloidai, terpenai, steroidai

Alkaloidai. Tai grupė sudėtingos struktūros junginių, kurių molekulėse yra heterociklai su azoto (N)
atomais. Alkaloidų pavadinimai dažniausiai yra trivialūs, pavyzdžiui, rodo gavimo šaltinį (kokainas – iš
augalo kokamedžio lapų).
2 C
15
H
31
COONa + H
2
SO
4
2 C
15
H
31
COOH + Na
2
SO
4 .
natrio palmitatas palmitino r.
164
Dauguma alkaloidų yra kristalinės medžiagos; kai kurie – skysčiai, pavyzdžiui, nikotinas. Dažniausiai jie
vandenyje netirpsta, o alkoholyje, chloroforme tirpsta. Alkaloidai su vienomis organinėmis rūgštimis (vyno,
obuolių, citrinų, oksalo) sudaro tirpiąsias druskas – šių jų druskų randama augaluose, o kitų rūgščių (pikrino,
tanino) ir alkaloidų druskos netirpios. Su neorganinėmis rūgštimis alkaloidai taip pat sudaro tirpiąsias (HCl,
H
2
SO
4
) ir netirpiąsias (fosfomolibdeno) druskas.
Kai kurie alkaloidų junginiai yra spalvoti (su HNO
3
ir kt.).
Dėl azotinių heterociklų alkaloidams yra būdingos bazinės savybės (arab. ai gilj – šarmai). Alkaloidų
randama tam tikrų rūšių augaluose; juose alkaloidai yra sudarę druskas su organinėmis rūgštimis. Kita
būdinga alkaloidų savybė yra jų stiprus fiziologinis veikimas: daugelis alkaloidų labai nuodingi (pvz., keli
lašai nikotino – apie 0,05 g – yra mirtina dozė žmogui). Dauguma alkaloidų mažomis dozėmis vartojami
medicinoje (atropinas – akių ligoms, chininas – maliarijai gydyti, morfinas – skausmui malšinti, rezerpinas –
kraujospūdžiui mažinti ir t. t.).
Baltymuose yra tokių pat heterociklų, kaip ir alkaloiduose, todėl tais pačiais reagentais galima nusodinti
(arba nudažyti) šių abiejų grupių junginius.
Terpenai. Tai didelė grupė gyvajame pasaulyje paplitusių junginių. Jų bendroji formulė (C
5
H
8
)
n
; čia
n > 2, t. y. molekulėse kartojasi izopreno fragmentas (izoprenoidiniai junginiai). Terpenų cikluose arba
šoninėse grandinėse yra dvigubųjų jungčių. Vieni jų yra alifatinės struktūros, kiti turi ciklų arba yra cikliniai.
Izoprenoidams priklauso karotinoidai, steroidai, kaučiukas ir kiti gamtiniai junginiai, kurie dažnai atlieka
vitaminų (A, E, K), hormonų (antinksčių žievės – kortikosteroidai, lytiniai), antibiotikų (nistatinas) funkcijas.
Juose izopreno grandys susijungia dažniausiai „galva – uodega“ padėtyje (izopreno taisyklė), bet gali būti ir
kitų jungimosi variantų: „uodega – galva“ ir „uodega – uodega“.
Skvalenas yra tarpinis cholesterolio, iš kurio susidaro kiti steroidai, biosintezės produktas. Šiame procese
susidaro ir farnezolio pirofosfatinis esteris. Farnezolis paplitęs augalų eteriniuose aliejuose (liepų žiedų,
pakalnučių kvapioji medžiaga). Šis terpenas yra kamanių feromonas (biologinės signalizacijos medžiaga),
drugelių hormonas. Farnezolio acetatas dėl rožių kvapo vartojamas parfumerijoje.
Čia nagrinėsime tik tuos ciklinius terpenus, kurių bendroji formulė yra C
10
H
16
(monoterpenus).
Pagrindinės jų grupės yra: 1) monocikliniai terpenai (turi l ciklą ir 2 dvigubąsias jungtis), iš kurių svarbiausi
mentano dariniai, pavyzdžiui, limonenas; 2) bicikliniai terpenai (turi 2 ciklus ir l dvigubą jungtį). Svarbūs
yra pinano (pvz., pinenas) ir bornano dariniai (pvz., kamparas).
Terpenų, laisvųjų arba esterių pavidalo, yra augalų eteriniuose aliejuose. Jie dažnai sudaro šių aliejų
pagrindinę dalį. Žiedai, lapai, vaisiai kvepia dėl lakiųjų terpenų klasės ir kitų junginių.
Terpenų pavadinimai dažnai empiriniai, rodantys gavimo šaltinį arba savybę, iš dalies − struktūrą,
pavyzdžiui, pinenas (lot. pinus – pušis, priesaga -en- rodo esant dvigubąją jungtį). Galima juos pavadinti ir
pagal tarptautinės nomenklatūros taisykles, pavyzdžiui, mentanas yra 4-izopropil-l-metilcikloheksanas.

Terpenų klasifikacija

Tipas Izopreninių fragmentų skaičius Anglies atomų skaičius Pavyzdys
Monoterpenai 3 C
10
limonenas, mentolis,
Seskviterpenai 4 C
15
farnezolis
Diterpenai 6 C
20
retinolis
Triterpenai 8 C
30
skvalenas
Tetraterpenai n C
40
p-karotinas
Politerpenai (10
3
–10
6
) eilės C
5n
kaučiukas

Terpenų chemines savybes dažniausiai nulemia juose esančios dvigubosios jungtys. Terpentinai
vartojami parfumerijoje, maisto pramonėje, medicinoje ir kt. Daugelio augalų eteriniai aliejai dirgina
audinius, kuriuos liečia, todėl jais įtrinama oda (kamparo aliejus, terpentinas ir kt.). Terpentinas gaunamas iš
spygliuočių sakų; tai – tirpiklis. Jo pagrindinė dalis yra pinenas, iš kurio gaunamas kamparas, panaudojamas
celiulioidui gaminti (fotografinės ir kino juostos, žaislai), medicinoje – širdies veiklai skatinti. Terpinhidratas
padeda atsikosėti.
Steroidai. Ciklopentano perhidrofenantrenas, arba steranas, yra biologiškai svarbių junginių – steroidų
pagrindas. Iš steroidų svarbiausi yra sterinai (steroliai), pavyzdžiui cholesterolis, be to, vitaminai D, tulžies
rūgštys, steroidiniai hormonai (antinksčių žievės, lytiniai), augalų steroidai (širdį veikiantys glikozidai ir kt.).
165
Tulžies rūgštys būtinos riebalams virškinti, vitaminai D – kalcio ir fosforo apykaitai, antinksčių žievės
hormonai reguliuoja medžiagų apykaitą, lytiniai hormonai susiję su specialiomis organizmo funkcijomis,
cholesterolis įeina į biologines membranas, iš jo susidaro minėtieji junginiai. Cholesterolio apykaitos
sutrikimas – vienas iš aterosklerozės vystymosi veiksnių. Tai labai paplitusi liga, pasireiškianti patologiniais
kraujagyslių pokyčiais: jų elastingumo praradimu, susiaurėjimu ir kt. Širdį veikiantys glikozidai skatina
miokardo susitraukimus.

Kofeino išskyrimas iš arbatžolių sublimacijos būdu

Kofeinas yra viena iš medžiagų, kurios lengvai sublimuojasi, todėl pasinaudojant šia savybe gali būti
išskiriamas iš mišinių.
Kofeino yra kavos pupelėse (iki 1,5 %), arbatžolių lapeliuose (iki 3 %). Šis heterociklinis junginys –
purino darinys. Jis ekstrahuojamas iš arbatžolių gamybos atliekų arba susintetinamas. Kofeinas skatina
centrinės nervų sistemos ir širdies veiklą. Būdamas panašios struktūros kaip nukleino rūgščių purino bazės –
kofeinas yra silpnas mutagenas, t. y. sukelia mutacijas – nukleino rūgščių struktūros pokyčius. Kofeino
sublimacijos temperatūra t
S
= 180 °C, t
lyd
= 235 °C.

Darbo eiga

1. Į porceliano lėkštelę įberiama 0,5 g smulkių sausų arbatžolių.
2. Stiklinio piltuvėlio anga užkemšama vata ir juo apvožiama lėkštelė. Kad sublimato kristalai nekristų
atgal, lėkštelė uždengiama filtravimo popieriaus skritulėliu, kuriame pradurta keletas skylučių.
3. Lėkštelė kaitinama smėlio vonioje; smėlio temperatūra sekama termometru. Vonios nereikia per daug
įkaitinti, kad nepradėtų lydytis kofeinas, nes tada labai sumažėja medžiagos paviršius, ir sublimacija
sulėtėja.
4. Išsiskyrus vandens garams, iš arbatžolių pradeda sublimuotis kofeinas: balzganomis šilkinėmis
adatėlėmis jis kaupiasi ant piltuvėlio sienelių.
5. Nustojama šildyti ir leidžiama lėkštelei ataušti.
6. Kofeino kristalai atsargiai nugramdomi nuo piltuvėlio sienelių ir ištirpinami keliuose mililitruose
vandens.
7. Į kofeino tirpalą įpylus tanino arba kito alkaloidų reagento tirpalo, susidaro nuosėdos.
Darbą galima atlikti ir paprasčiau: arbatžolių įberiama į porcelianinį tigliuką ir uždengiama objektiniu
stikleliu. Tiglis kaitinamas per asbestuotą tinklelį.

Alkaloidų bendrosios reakcijos (nusodinimas)

Alkaloidai paprastai yra išsiskiriami netirpių druskų pavidalu. Dažniausiai tai atliekama veikiant
alkaloidų turinčius tirpalus kai kuriomis rūgštimis (pikrino rūgštimi, taninu – reaguoja su alkaloidais,
turinčiais fenolinių hidroksilų) ir kitais junginiais (gyvsidabrio druskomis, jodo tirpalu kalio jodide).

Darbo eiga

1. Mėgintuvėlyje l lašas 1 % chinino druskos su vandenilio chloridu (arba kito alkaloido tirpios druskos
tirpalo) praskiedžiamas 5 lašais H
2
O.
2. Skirtingose objektinio stiklelio vietose užlašinami 3 lašai tirpalo.
3. Šalia pirmojo lašo, kad susiliestų, užlašinamas l lašas I
2
tirpalo KI, šalia antro – l lašas 0,5 % tanino
tirpalo, šalia trečio – l lašas sočiojo pikrino rūgšties tirpalo. Tose vietose, kur liečiasi lašai, susidaro
nuosėdos.
Šiais bendrais alkaloidų reagentais naudojamasi teismo medicinoje, kai įtariama apsinuodijus
alkaloidais. Norint įrodyti, koks yra alkaloidas, reikia atlikti specifines reakcijas, pavyzdžiui, chinino druskų
tirpalai fluorescuoja.




166
Terpenų dvigubųjų jungčių nustatymas

Dvigubosios jungtys terpenuose prijungia halogenus. Joms oksiduojantis, susidaro dihidroksiliai
alkoholiai:

Darbo eiga
Į 2 mėgintuvėlius su KMnO
4
ir Br
2
tirpalais įlašinami 1–2 lašai terpentino ir sumaišoma – tuoj pat
pasikeičia tirpalų spalva.

Terpenų oksidavimas oro deguonimi

Terpenų dvigubąją jungtį lengvai oksiduoja oro deguonis. Susidaro peroksidai. Šie vėliau skyla
išsiskirdami atominį deguonį, kuris reaguodamas su oro deguonimi sudaro ozoną. Ozono skilimo metu
išsiskyręs atominis deguonis oksiduoja jodido anijoną iš KI iki laisvojo jodo I
2
, kuris aptinkamas pagal
būdingą reakciją su krakmolu:

Terpeno dviguboji jungtis Terpeno peroksidas Terpeno oksidas Ozonas

Spygliuočių miškų aromatas būna gaivus ne tik dėl eterinių aliejų, bet ir dėl ozono.

Darbo eiga

Į mėgintuvėlį įlašinama 2 lašai 0,5 % krakmolo kleisterio, l lašas 0,5 N KI ir l lašas terpentino. Po keleto
sekundžių laisvasis jodas nudažo krakmolo tirpalą mėlynai. Kai susidaręs HI oksiduojasi, kalio jodido
hidrolizės pusiausvyra pasistumia į dešinę.

Terpino dehidratacija

Dehidratuojant dihidroksilį alkoholį terpiną koncentruota H
2
SO
4
, susidaro nesotusis monohidroksilis
alkoholis terpineolis:









+
CH
3
H
3
C
CH
3
CH
3
H
3
C
CH
3
Br
Br
Br
2
CH
3
H
3
C
CH
3
CH
3
H
3
C
CH
3
HO
HO
[O], H
2
O
C C CH CH
O O
O
C C
O
2
O
2 +
O
3
O
2
[O]
KI + HOH KOH + HI 2 HI + [O] H
2
O + I
2
.
CH
3
H
3
C
OH
CH
3
OH
CH
3
H
3
C
OH
CH
3
IR
CH
3
H
3
C
CH
2
CH
3
H
3
C
CH
3
3
H
2
SO
4
IR
167
Priklausomai nuo to, iš kur atskyla H
2
O, susidaro skirtingi izomerai. Dėl malonaus kvapo jie vartojami
parfumerijoje.

Darbo eiga

1. Keletas terpinhidrato kristalėlių (terpinas kristalizuojasi su viena H
2
O molekule) įmetama į mėgintuvėlį
ir įlašinami 5–6 lašai H
2
O.
2. Reakcijos mišinys kaitinamas iki virimo.
3. Į karštą tirpalą atsargiai įlašinami 5–6 lašai koncentruotos H
2
SO
4
. Koks jaučiamas kvapas?

Literatūra

Šatinskienė, R.; Kondratas, D.; Grigaliūnienė, V.; Praškevičius, A. Organinės chemijos laboratoriniai darbai.
Vilnius: Mokslas, 1988. 280 p.

168
B Bi io oc ch he em mi in ni ia ai i m me et to od da ai i
Laboratoriniai darbai ir pratybos
Valdas Stanislovas Laurinavičius ir Bogumila Kurtinaitienė

1. Statistinis duomenų apdorojimas

Čia pateikiamos pagrindinės statistiniam eksperimentinių duomenų apdorojimui reikalingos formulės,
terminai ir lentelės.
Matavimų vidurkis (Mean), x :

x =
n
x
n
i
i

=1
, (1.1)

x – eksperimentiniai duomenys (nuo 1 iki n),
n – matavimų skaičius.

Standartinis nuokrypis (Std. Dev), s:

1
2


=

n
| x x |
s
, (1.2)


čia n – 1 – laisvės laipsnių skaičius .

Variacijos koeficientas (CV, %):

100
x
s
CV = %. (1.3)

Standartinė paklaida (St. err.), S:

n
s
S = .
(1.4)

Tikroji matuojamojo dydžio reikšmė (X) įvertinama taip:

St x X ± = , (1.5)

čia t – Stjudento koeficientas, arba t skirstinys.
Jis išreiškiamas kaip statistikos skirstinys:

n s
X
t
/
µ −
= , (1.6)
čia:
s – empirinis standartinis nuokrypis,
ξ – empirinis vidurkis,
µ – populiacijos vidurkis,
n – imties dydis.
169
Stjudento koeficiento dydis priklauso nuo atliktų matavimų skaičiaus ir patikimumo lygio. Koeficientų
reikšmės pateiktos 1 lentelėje.
Eksperimentiniai duomenys yra patikimi, jeigu jie (x) neišeina už ribų:
s x x × ± = 2 (95 % patikimumo intervalas) arba s x x × ± = 3 (99% patikimumo intervalas).
Biologiniuose-biocheminiuose eksperimentuose paprastai yra pakankamas 95% (0,05) patikimumo
intervalas.
Duomenų nepatikimumą galima nustatyti ir kitu būdu. Jeigu eksperimentinių matavimų (to paties
parametro) yra nedaug (iki 10), galima taikyti kriterijaus Q metodą:

R
x x
Q
2 1

= , (1.7)
čia:
x
1
– įtartinas duomuo,
x
2
– artimiausias skaitine reikšme duomuo,
R = x
maks.
– x
min.
, t. y. viso duomenų masyvo didžiausiojo ir mažiausiojo duomenų skirtumas.
Gautas kriterijaus Q reikšmes palyginame su 2 lentelės reikšmėmis. Jeigu gautosios kriterijaus Q
reikšmės yra didesnės už lentelėje pateiktas, galime teigti, kad matavimas yra nepatikimas, ir jo duomenis,
skaičiuojant toliau, galima atmesti.

1 lentelė. Stjudento koeficientų reikšmės

Patikimumo
lygis
0,9 0,95 0,98 0,99 0,999
Laisvės laipsnių
skaičius
Stjudento koeficientų reikšmės

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
6,31
2,92
2,35
2,13
2,02
1,94
1,90
1,86
1,83
1,81
1,80
1,78
1,77
1,76
1,75
1,75
1,74
1,73
1,73
1,73
12,71
4,30
3,18
2,78
2,57
2,45
2,37
2,31
2,26
2,23
2,20
2,18
2,16
2,15
2,13
2,12
2,11
2,10
2,09
2,09
31,82
6,97
4,54
3,75
3,37
3,14
3,00
2,90
2,82
2,76
2,72
2,68
2,65
2,62
2,60
2,58
2,57
2,55
2,54
2,53
63,66
9,93
5,84
4,60
4,03
3,71
3,50
3,36
3,25
3,17
3,11
3,06
3,01
2,98
2,96
2,92
2,90
2,88
2,86
2,85
636,62
31,60
12,94
8,61
6,86
5,96
5,41
5,04
4,78
4,59
4,44
4,32
4,22
4,14
4,07
4,02
3,97
3,92
3,88
3,85










170
2 lentelė. Kriterijaus Q reikšmės

n
i
Patikimumas
0,9 0,95 0,99
3
4
5
6
7
8
0,89
0,68
0,56
0,48
0,43
0,40
0,94
0,77
0,64
0,56
0,51
0,48
0,99
0,89
0,76
0,70
0,64
0,58



3 lentelė. Kvantilių t
T
reikšmės

n
i
Patikimumas
0,9 0,95 0,99
3
5
8
10
15
20
25
1,41
1,79
2,04
2,15
2,33
2,45
2,54
1,41
1,87
2,17
2,29
2,49
2,62
2,72
1,41
1,96
2,37
2,54
2,8
2,96
3,07

Jeigu matavimų daugiau, apie 10–20, tada nepatikimiems duomenims nustatyti verta taikyti kvantilių
metodą. Įtartinos visada bus pačios mažiausios arba pačios didžiausios matavimų reikšmės. Tada reikia rasti
skirtumą tarp didžiausiosios arba mažiausiosios reikšmės (x
i
) ir matavimų vidurkio ξ ir tą skirtumą padalyti
iš standartinio nuokrypio s:

s
x x
t
i
T

=
maks.
. (1.8)

Tada gautas kvantilių t
T
reikšmes palyginti su 3 lentelėje pateiktomis reikšmėmis. Jeigu gautosios
kvantilių reikšmės didesnės, vadinasi, įtartinas duomuo yra nepatikimas ir jo, skaičiuojant toliau, galima
netaikyti.

Koreliacinė ir regresinė analizė

Yra skiriamos tokios regresijos rūšys:
kintamųjų atžvilgiu:
• paprastoji (ryšys tarp dviejų kintamųjų),
• grupinė (ryšys tarp keleto kintamųjų),
formos atžvilgiu:
• tiesinė;
• netiesinė, arba kreivinė.
pobūdžio atžvilgiu:
• teigiama (didėjant x didėja y),
• neigiama (didėjant x mažėja y).

Regresija įvertina statistinio ryšio formą, o koreliacinė analizė to ryšio stiprumą. Koreliacinė analizė
padeda įvertinti statistinio ryšio y = f(x
i
) stiprumą ir kartu atrinkti veiksnius.

171
Paprastoji tiesinė regresija

Regresinėje analizėje priklausomasis kintamasis būna tas, kurio kitimą norime išsiaiškinti, o
nepriklausomasis – kuriuo bandome aiškinti priklausomojo pokyčius. Šiame skyrelyje nagrinėsime situaciją,
kai du kintamuosius gali sieti tiesinė priklausomybė.
Turint surinktus duomenis apie nagrinėjamus kintamuosius, įprasta iš pradžių pavaizduoti juos grafiškai
vadinamojoje sklaidos diagramoje (angl. scatter diagram). Ši diagrama leidžia vizualiai parinkti geriausiai
tinkantį regresinį modelį. Tik tuo atveju, kai diagramos taškai grupuojasi apie tiesę, turime pagrindą taikyti
paprastąją tiesinę regresiją. Diagramai sudaryti ir duomenims apdoroti panaudosime vieną iš Statsoft
produktų – kompiuterinę programą SIGMA PLOT.
Tarkime, turime eksperimentinių duomenų, kuriuos suvedame į lentelę (Data Worksheet). I stulpelyje
yra nepriklausomieji duomenys (x), o II stulpelyje – matavimų rezultatai (y). Reikia ištirti statistinę
priklausomybę tarp jų. Pagal šiuos duomenis sudarysime grafiką taikydami SIGMA PLOT galimybes. Iš
pagrindinio meniu parenkame Graph, Create Graph,…2D Cartesian Line/Scatter…OK. Pažymėję
priklausomąjį ir nepriklausomąjį kintamuosius, gausime norimą sklaidos diagramą. Kaip gauti tokią tiesinę
funkciją, kuri geriausiai atspindėtų turimus duomenis? Dažniausiai tam taikoma matematinė procedūra,
vadinama mažiausiųjų kvadratų metodu. Šis metodas leidžia tarp visų galimų tiesių rasti tokią, kuri
nutolusi nuo eksperimento duomenų mažiausiai. Mažiausiųjų kvadratų metodo pavadinimas atspindi tai, kad
minimizuojama atstumų tarp tiesės ir duomenų kvadratų suma. Tiesinės regresijos lygties ŷ = b
o
+ b
1
x
parametrai (koeficientai b
o
ir b
1
) parenkami iš sąlygos, kad Σ (y
i
– ŷ
i
)
2
turi įgyti mažiausią galimą reikšmę. Jų
reikšmės skaičiuojamos pagal formules:

2 2
1
x x
y x y x
b

⋅ −
= ,
(1.9)
. x b y b
1 0
− =


Naudojant SIGMA PLOT programą, tiesinės regresijos lygties parametrus galima gauti keletu būdų. Iš
pagrindinio meniu reikia pasirinkti Graph, Design Summary… ir lange Regressions nurodyti regresinės
kreivės tipą Order 1. Mygtuku View results… atidarome langą. Jame randame tiesinės regresijos lygties
koeficientus bei determinacijos koeficientą r
2
. Pažymėjus „varnele“ atitinkamus kvadratėlius Regressions
lange, grafike atsiranda regresinė tiesė. Kitas būdas yra duomenų aproksimavimas curve fit programa.
Ar gerai regresinė kreivė atitinka eksperimentinius duomenis? Vienas iš svarbiausių tinkamumo matų
yra apibrėžties koeficientas. Jis žymimas r
2
ir išreiškiamas santykiu:



(1.10)



čia:
KSR – regresinio nuokrypio kvadratų suma
KSB – klaidų nuokrypio kvadratų suma.

0 ≤ r
2
≤ 1.

Aišku, kad kuo r
2
yra arčiau vieneto, tuo regresinė kreivė geriau atitinka eksperimentinius duomenis.
Dažniausiai taikomas koreliacijos tarp kintamųjų stiprumo matas vadinamas koreliacijos koeficientu. Jis
žymimas raide r ir apibrėžiamas kaip kvadratinė šaknis iš determinacijos koeficiento. Koreliacijos
koeficientas įgyja reikšmes tarp –1 ir 1.
,
) y y (
) y y ˆ (
KSB
KSR
r
n
i
i
n
i
i

=

=


= =
1
2
1
2
2
172
Daugelis kreivinės regresijos lygčių, šiek tiek pertvarkius ir elementariai pažymėjus, gali būti suvestos į
tiesinę regresiją. Tada labai nesunkiai randami regresijos ir koreliacijos koeficientai bei įverčio klaidų
išraiškos.

2. Eksperimentinių duomenų aproksimavimas

Programos SIGMA PLOT galimybės leidžia gautus eksperimentinius duomenis aproksimuoti tiesinės
regresijos lygtimi y = ax + b, gauti regresijos koeficientus a ir b, šių koeficientų paklaidas ir išvesti
patikimumo intervalų ribas. Programa taip pat leidžia automatiškai aproksimuoti duomenis laipsnine eilute
(iki 10 eilės). Pvz., antrosios eilės regresija yra duomenų aproksimavimas lygtimi y = ax
2
+ bx + c. Programa
pateikia šios lygties koeficientus ir šalia eksperimentinių taškų išveda regresinę kreivę. Kartais tyrėjas turi
savo matematinį modelį, pagal kurį nori aproksimuoti eksperimentinius duomenis. Tam naudojama
paprogramyje Math esanti programa curve fit.
1 pavyzdys. Turime eksperimentinių duomenų masyvą, kurio I stulpelyje yra nepriklausomieji
duomenys (x), o II stulpelyje yra matavimų rezultatai (y). Manoma, kad tarp šių duomenų egzistuoja tiesinė
priklausomybė. Reikia aproksimuoti eksperimentinius duomenis tiesinės regresijos lygtimi y = ax + b ir
apskaičiuoti tiesės lygties koeficientus bei jų paklaidas.
Manome, kad koeficientų a ir b reikšmes galima pradėti skaičiuoti nuo 0. Taip pat žinome, kad a gali
būti tik teigiamasis skaičius. (Šios sąlygos gali būti skirtingos kiekvienam eksperimentui).
Komandiniame lauke surenkame:
[Parameters]
a = 0
b = 0
[Variables]
x = col(1)
y = col(2)
[Equations]
f = a*x + b
fit f to y
[Constraints]
a > 0

Programa pateikia tiesės lygties y = ax + b parametrų a ir b reikšmes, jų paklaidas ir variacijos
koeficientus.

2 pavyzdys. Matavome fermentu katalizuojamos reakcijos greičio priklausomybę nuo substrato
koncentracijos. Eksperimentiniai duomenys įvedami į SIGMA PLOT programos duomenų lentelę. Stulpelyje
I yra substrato koncentracija (mmol/L), o stulpelyje II − išmatuotas reakcijos greitis (µmol/min.). Manome,
kad reakcijos greičio priklausomybė nuo substrato koncentracijos gali būti aprašoma Michaelio ir Menten
lygtimi:

,
S K
S V
v
M
+
×
=

(1.11)
čia:
v – reakcijos greitis,
V – maksimalus reakcijos greitis,
S – substrato koncentracija,
K
M
– Michaelio konstanta.
Reikia patikrinti, kaip tiksliai eksperimentiniai duomenys atitinka pasirinktą modelį ir rasti konstantų V
ir K
M
reikšmes.
Tam paprogramėje Math pasirenkame programą Curve fit.
Manome, kad koeficientus reikėtų pradėti skaičiuoti nuo 0 reikšmės. Skaičiavimams palengvinti
apibrėžiame, kad K ir V gali būti tik teigiamieji skaičiai.
173






Komandiniame lauke surenkame:
[Parameters]
V = 0
K = 0
[Variables]
x = col(1)
y = col(2)
[Equations]
f = V*x/(K + x)
fit f to y
[Constraints]
K > 0
V > 0
[Options]



.
Programa pateiks:
• koeficientų V ir K reikšmes (Value),
• koeficientų paklaidas (Std Err),
• variacijos koeficientus (CV, %),
• priklausomumo koeficientus (Dependencies). Jeigu priklausomumo koeficientai yra artimi vienetui, tai
rodo, kad pasirinktame matematiniame modelyje per daug nežinomųjų;
• teorines y reikšmes (Functions), kurias galima nukopijuoti į laisvą stulpelį ir nubrėžti teorinę kreivę per
tuos taškus.

3 pavyzdys. Turime eksperimentinių duomenų masyvą (2 pav.). Manome, kad šie duomenys gali būti
aprašyti hiperboline priklausomybe y = a/x. Tam komandiniame lauke surenkame:







[Parameters]
a = 0
[Variables]
x = col(1)
y = col(2)
[Equations]
f = a/x
fit f to y
[Constraints]
[Options]


0 10 20 30 40 50
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8


Y

r
e
i
k
š
m
ė
s
nepriklausomas kintamasis X

1 pav. Eksperimentinių duomenų aproksimavimas hiperbolės
Michaelio ir Menten lygtimi
2 pav. Eksperimentinių duomenų aproksimavimas atvirkštine
priklausomybe pagal 3 pavyzdį
R
e
a
k
c
i
j
o
s

g
r
e
i
t
i
s
,

µ
m
o
l
/
m
i
n
R
e
a
k
c
i
j
o
s

g
r
e
i
t
i
s
,

µ
m
o
l
/
m
i
n
.

Substrato koncentracija, mmol/L
Nepriklausomasis kintamasis X
174
Programa pateiks koeficiento a reikšmę (Parameter), jo standartinę paklaidą, variacijos koeficientą,
teorines y reikšmes (Functions) ir jų skirtumus nuo eksperimentinių y reikšmių (Residuals).
Galime grafiką papildyti nauja kreive, kurią suformuojame pagal tą patį x duomenų stulpelį ir teorines y
reikšmes. Jeigu matome, kad teoriniai skaičiai blogai aproksimuoja eksperimentinius duomenis, hiperbolės
modelį galime daryti sudėtingesnį, pvz., y = a*x/(b + x), arba y = c + a*x/(b + x).
Tada komandiniame langelyje atitinkamai surenkame:
[Parameters] arba: [Parameters]
a = 0 a = 0
b = 0 b = 0
[Variables] c = 0
x =col(1) [Variables]
y = col(2) x = col(1)
[Equations] y = col(2)
f = a*x/(b+x) [Equations]
fit f to y f=a*x/(b+x)+c*x
[Constraints] fit f to y
[Constraints]
[Options]
[Options]










Netiesines priklausomybes galime nesunkiai aprašyti lygtimi y = (cx + a)/(b + x), kvadratinėmis arba
kubinėmis lygtimis.
Pvz., y = a + bx + cx². Tada komandiniame lauke po užrašu [Equations] rašome: f = a + b*x + c*x^2.
Kiekvienas gali susikurti savo modelį, geriausiai aproksimuojantį jo duomenis.

Uždaviniai

Statistiniam apdorojimui pateikiami gliukozės nustatymo kraujo serume duomenys. Svarbu žinoti:
• Gliukozė yra vienas iš svarbiausių metabolitų;
• suaugusio sveiko žmogaus kraujyje yra 3,6 ÷ 6,1 mmol/L gliukozės;
• sergant cukriniu diabetu, gliukozės koncentracija kraujo serume gali sumažėti iki 2 mmol/L ar dar labiau
(hipoglikemija) arba pakilti iki 30–35 mmol/l (hiperglikemija);
• fiziologiškai svarbus gliukozės koncentracijos pokytis yra 0,5 mmol/L;
• fiziologiškai pagrįstas variacijos koeficientas (CV) – 11,2 %;
• analitinis rekomenduojamas CV – 5 %.

1 užduotis

Taikant naują gliukozės nustatymo metodą buvo išmatuota gliukozės koncentracija viename kraujo
serumo pavyzdyje. Gautieji rezultatai (mmol/L):
8,81; 8,52; 8,83; 9,01; 8,21; 8,85; 7,21; 8.33; 8,47; 9,00; 8,27; 8,47; 8,31.
apskaičiuokite:
• matavimų vidurkį ( x );
• standartinį nuokrypį (s);
• standartinę paklaidą (S);
0 10 20 30 40 50
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
2.0


Y

r
e
i
k
š
m
ė
s
X reikšmės

3 pav. Eksperimentinių duomenų aproksimavimas hiperboline
priklausomybe pagal 3 pavyzdį
175
• raskite nepatikimus matavimų rezultatus ir pašalinkite juos iš duomenų masyvo;
• perskaičiuokite visus aunksčiau minėtuosius rodiklius;
• apskaičiuokite 95 % patikimumo intervalą, kuriame yra tikroji gliukozės koncentracijos kraujo serume
reikšmė (X).

2 užduotis

Į 10 to paties kraujo serumo pavyzdžių buvo pridėta koncentruoto vandeninio gliukozės tirpalo tiek, kad
kiekviename kitame pavyzdyje gliukozės koncentracija būtų 1 mmol/L didesnė negu ankstesniame. A
metodu nustatyta gliukozės koncentracija kiekviename pavyzdyje. Rezultatai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė

Pridėtos gliukozės
koncentracija, mmol/L
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nustatytoji, mmol/L 5,4 6,2 7,5 8,7 9,4 10,6 11,2 12,5 13,7 14,7

• Nubraižykite dvikoordinatį grafiką: nustatytosios gliukozės koncentracijos priklausomybė nuo į serumą
pridėtos gliukozės koncentracijos.
• Aproksimuokite eksperimentinius duomenis tiesės lygtimi, nustatykite tiesės lygties parametrus ir jų
paklaidas. Apskaičiuokite koreliacijos koeficientą.

3 užduotis

Į 13 to paties kraujo serumo pavyzdžių pridėta koncentruoto gliukozės tirpalo tiek, kad gliukozės
koncentracija kiekviename kitame pavyzdyje padidėtų 2, 4, 6 ir t. t. mmol/L. Tokiuose pavyzdžiuose B
metodu nustatyta gliukozės koncentracija. Rezultatai pateikti 2 lentelėje.

2 lentelė

Pridėtos gliukozės
koncentracija, mmol/L
(x) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Išmatuotoji gliukozės
koncentracija, mmol/L
(y) 8,5 10,0 13,8 14,1 18,1 18,3 20,1 21,2 23,1 23,2 24,5 24,5 25,0

• Nubraižykite dvikoordinatį grafiką: nustatytosios gliukozės koncentracijos priklausomybė nuo pridėtosios
gliukozės koncentracijos.
• Įvertinkite kreivės tiesinę dalį.
• Nubraižykite grafiką, naudodami tik į tiesinę dalį patenkančius eksperimentinius taškus.
• Apskaičiuokite tiesės lygties koeficientus, jų paklaidas ir koreliacijos koeficientą.
• Palyginkite 2 ir 3 užduotyse taikytus metodus tikslumo požiūriu.

4 užduotis

Pritaikant praktikoje naująjį gliukozės nustatymo metodą kartu buvo atlikti tų pačių serumo pavyzdžių
matavimai naujuoju ir referentiniu metodais. Žinoma, kad taikant referentinį metodą:
• galima gauti tiesinę signalo priklausomybę nuo gliukozės koncentracijos serume nuo 2 iki 30 mmol/L;
• metodo variacijos koeficientas visame tiesinio veikimo diapazone neviršija 5 %.
Gautieji rezultatai pateikti 3 lentelėje.





176
3 lentelė

Metodas

gliukozės koncentracija, mmol/L
Referentinis
(x)
2,2 2,7 3,0 5,0 2,0 9,0 3,5 12,1 15,9 27,3
Naujasis
(y)
2,6 2,6 3,4 5,1 1,8 8,5 3,9 13,1 15,6 23,0
Referentinis
(x)
19,8 4,6 28,0 12,5 21,7 6,3 18,5 25,3 3,5 21,2
Naujasis
(y)
20,1 4,4 24,1 12,3 20,5 6,5 18,1 22,5 3,4 19,5

• Nubraižykite dvikoordinatį grafiką: x ašyje − gliukozės koncentracija, nustatyta referentiniu metodu, y
ašyje − gliukozės koncentracija, nustatyta naujuoju metodu.
• Nubraižykite koreliacinę kreivę.
• Įvertinkite koreliacinės kreivės tiesinę dalį.
• Atmeskite taškus, kurie išeina už tiesinės dalies ribų, ir perbraižykite koreliacinę kreivę.
• Apskaičiuokite tiesės lygties koeficientus, jų paklaidas, koreliacijos koeficientą.

5 užduotis

Tikrinamai laboratorijai buvo pateikiami kontrolinio serumo pavyzdžiai ir buvo prašoma nustatyti juose
gliukozės koncentraciją. Kartu gliukozės koncentracija tuose pačiuose pavyzdžiuose buvo nustatoma
referentinėje laboratorijoje. Rezultatai pateikti 4 lentelėje.
• Judeno metodu įvertinkite tikrinamos laboratorijos darbo kokybę;
• Suformuluokite rekomendacijas tikrinamai laboratorijai.

4 lentelė

Gliukozės koncentracija, nustatyta c, mmol/L
referentinėje laboratorijoje (x) 5,55 5,4 5,37 5,6 5,2 5,6 5,8 5,6 5,2 5,6
tikrinamoje laboratorijoje (y) 5,7 5,9 5,6 5,8 5,5 5,5 5,6 5,3 5,2 5,78
referentinėje laboratorijoje (x) 5,56 5,3 5,6 5,7 5,2 5,5 5,6 5,2 5,8 5,54
tikrinamoje laboratorijoje (y) 5,62 5,6 5,7 5,79 5,2 5,8 5,9 5,5 5,3 5,7





















⌧+s

+2s ⌧
-s
⌧-2s

+s
+2s
-s
-2s

4 pav. Judeno grafikas
177
3. Fermentinių kinetinių konstantų nustatymas

Pagrindinės charakteristikos, nusakančios fermento katalitines savybes, yra:
• aktyvumas (E),
• Michaelio konstanta (K
M
),
• katalitinė konstanta (k).
Fermentinis aktyvumas rodo, kokiu greičiu fermentas geba katalizuoti substrato virtimą produktu.
Fizikine prasme fermentinis aktyvumas yra greitis, kuris dažniausiai yra išreiškiamas µmol
susidariusio produkto (arba sunaudoto substrato) per minutę (µmol/min). Labai mažo aktyvumo
fermentų aktyvumai kartais normuojami ne minutei, o valandai ar net parai. SI sistemoje fermentinio
aktyvumo vienetas yra mol/s ir vadinamas kataliu. Taigi praktikoje tokie dideli greičiai pasitaiko itin
retai, todėl reikėtų taikyti 10
–8
–10
–9
eilės katalių reikšmes.
Fermento aktyvumui nustatyti parenkamos tokios sąlygos, kad gautųsi maksimalus reakcijos greitis:
naudojama didelė substrato koncentracija (paprastai 5–10 kartų viršijanti K
M
). Parenkamas tam fermentui
optimalus reakcijos terpės pH. Temperatūra gali būti įvairi. Dažniausiai parenkama 20 °C, 25 °C arba 37 °C.
Fermentinio aktyvumo vienetas yra fermento kiekis, kuris paverčia produktu 1 mikromolį
substrato per minutę. Jis vadinamas tarptautiniu vienetu ir dažniausiai žymimas raide E arba U. Jo
dimensija yra µmol/min. Fermentinis aktyvumas normuojamas fermento svorio vienetui, paprastai
miligramui arba gramui. Normuotas aktyvumas vadinamas santykiniu arba specifiniu aktyvumu ir
išreiškiamas µmol min
–1
mg
–1
. Pvz., firmos SIGMA parduodama gliukozės oksidazė, išskirta iš Aspergillus
niger, turi specifinį aktyvumą 2 000–10 000 U/g. Tai reiškia, kad 1 mg tokio preparato geba katalizuoti nuo 2
iki 10 µmol gliukozės oksidaciją per minutę.
Ne visada pavyksta tiksliai nustatyti fermento koncentraciją preparate. Labai dažnai fermentas būna
negrynas. Fermentiniame preparate priemaišos (dažniausiai kiti baltymai arba neorganinės druskos) sudaro
žymią dalį (iki 90 %) preparato svorio. Tokiu atveju fermentinis aktyvumas normuojamas preparato svorio
vienetui, dažniausiai − miligramui, tačiau pasitaiko aktyvumo normavimo gramui ir net kilogramui. Kartais,
kai parduodamas fermento tirpalas, fermentinis aktyvumas normuojamas tūrio vienetams – mililitrui (mL)
preparato, decilitrui (dL) ar litrui (L). Klinikinėje biochemijoje kraujyje esančių fermentų aktyvumas
normuojamas litrui, decilitrui arba mililitrui kraujo.
Bendra baltymų koncentracija tirpaluose yra apytiksliai nustatoma spektrofotometriškai, kai šviesos
bangos ilgis 280 nm. Todėl kartais fermentinis aktyvumas normuojamas baltymų masės vienetui. Pvz.,
firmos SIGMA parduodamas fermentas katalazė (išskirtas iš jaučio kepenų) yra suspenduotas 3,2 M amonio
sulfato tirpale. Fermento aktyvumas − 10 000–30 000 U/mg baltymų. Tai reiškia, kad 1 mg baltymų, esančių
šioje suspensijoje, geba katalizuoti 10–30 milimolių vandenilio peroksido skilimą iki vandens ir deguonies,
tačiau tai dar nereiškia, kad visas preparate esantis baltymas yra katalazė.
Fermentinis aktyvumas, normuotas normalinei fermento koncentracijai, vadinamas fermento katalitine
konstanta (k). Dauguma fermentų turi po vieną aktyvųjį centrą, todėl jų normalinė koncentracija yra lygi
molinei koncentracijai. Fermento katalitinė konstanta paprastai normuojama sekundei, o suvartoto substrato
(ar susidariusio produkto) kiekis išreiškiamas moliais.

[ ] E
V
k
. maks
= ,
čia:
V
maks.
– maksimalusis reakcijos greitis (mol/s),
[E] – aktyvaus fermento kiekis reakcijos mišinyje, (mol).
Fermento katalitinė konstanta rodo, kiek substrato molekulių viena fermento molekulė geba paversti
produktu per sekundę. Katalitinė konstanta dar vadinama „fermento apsukų skaičiumi“ ir nusako fermento
kaip katalizatoriaus efektyvumą. Fermentų katalitinė konstanta k svyruoja nuo 10
–2
iki 10
5
s
–1
.
Michaelio konstanta (K
M
) nusako substrato giminingumą fermentui. Eksperimentiškai Michaelio
konstanta nustatoma matuojant fermentinės reakcijos greitį esant skirtingoms substrato koncentracijoms.
Michaelio konstanta skaičiuojama iš Michaelio ir Menten lygties:

[ ]
[ ]
M
. maks
K S
S V
v
+
×
= ,
178
čia:
v – fermentinės reakcijos greitis,
[S] – substrato koncentracija,
K
M
– Michaelio konstanta.
K
M
vertės gali būti nuo 10
–2
mol/L iki 10
–7
mol/L.

Uždaviniai

Darbo tikslas

Naudojantis atlikto eksperimento duomenimis išmokti apskaičiuoti reakcijoje dalyvaujančių medžiagų
koncentraciją, fermentinės reakcijos greitį ir fermento kinetines konstantas. Paprastai apskaičiuotus ir
kompiuteriu gautus rezultatus įvertinti tikslumo požiūriu.

Tyrimo objektas

Fermentas alkoholdehidrogenazė (ADH) išskirtas iš mielių. Alkoholdehidrogenazė katalizuoja alifatinių
alkoholių (metanolio, etanolio, blogiau − propanolio) oksidaciją. Oksidatorius – NAD
+
molekulė:

Etanolis Acetaldehidas



Matavimo priemonės

Spektrofotometras UV-VIS su saviraščiu. Esant 340 nm bangos ilgiui nustatomas NADH susidarymo
greitis.

Eksperimento aprašymas

Mielių homogenizatas buvo frakcionuojamas. Surinkta frakcija, turinti ADH aktyvumą.
Chromatografiniais metodais parodyta, kad šią frakciją sudaro homogeniškas baltymas, kurio molekulinė
masė 141 000 Da. Fotometriniu metodu (esant 280 nm bangos ilgiui) nustatyta baltymo koncentracija
frakcijoje − 12 mg/mL. Manoma, kad tai ADH.
Paruošiami darbui reikalingi tirpalai:
• 0,1 mol/L fosfatinis buferis, pH = 7,0;
• NADH tirpalas matavimo sistemai graduoti. Tam 91,37 mg NADH (M = 709,4 g/mol) ištirpinama 1 mL
buferio;
• 1 mol/L NAD
+
tirpalas buferyje;
• 0,5 mol/L etilo alkoholio tirpalas buferyje (substratas).
Prieš nustatant fermento aktyvumą reikia sugraduoti matavimo sistemą. Tam į fotometro kiuvetę
įpilama 1,8 mL buferinio tirpalo ir užfiksuojama saviraščio plunksnos padėtis („0“). Tada į fotometro kiuvetę
įpilama 0,2 mL NADH tirpalo ir užfiksuojama nauja saviraščio plunksnos padėtis.
ADH aktyvumas matuotas taip:
Į fotometro kiuvetę supilama:
• 1 290 µL buferio;
• 500 µL alkoholio tirpalo;
• 200 µL NAD
+
tirpalo.
Įjungiamas saviraštis ir užfiksuojama pradinė plunksnos padėtis. Įsitikinama, kad plunksnos poslinkio
laikui bėgant nėra (nėra jokių pašalinių reakcijų, kurios keistų šviesos sugertį kiuvetėje).
CH
3
-CH
2
-OH CH
3
-C
O
H
Alkoholdehidrogenazė
NAD
+
NADH
179
Tada į kiuvetę įpilama 10 µL fermento ir tirpalas greitai išmaišomas. Registruojamas sugerties didėjimas
fotometro kiuvetėje (2–4 min.). Kalibravimo ir aktyvumo matavimo vaizdas pateiktas 1 paveiksle.




















1 užduotis

ADH aktyvumo nustatymas.

Darbo eiga

• Apskaičiuokite saviraščio padalos (1 mm) vertę µmol NADH (naudodamiesi 1 pav. vaizdu).
• Apskaičiuokite NAD ir substrato koncentracijas fotometro kiuvetėje.
• Apskaičiuokite fermentinės reakcijos greitį fotometro kiuvetėje (naudodamiesi 1 pav. vaizdu)
• Apskaičiuokite fermento aktyvumą tarptautiniais vienetais (µmol/min.) ir kataliais (mol/s)
• Apskaičiuokite ADH katalitinę konstantą.
• Apskaičiuokite fermento santykinį aktyvumą tarptautiniais vienetais (µmol min.
–1
mg
–1
).

2 užduotis

ADH Michaelio konstantos nustatymas.
ADH aktyvumas buvo išmatuotas esant skirtingoms substrato koncentracijoms. Tam į fotometro kiuvetę
buvo įpilti skirtingi substrato kiekiai. Reakcijos mišinio kiuvetėje tūris visais atvejais buvo vienodas – 2 mL.
Reagentų tūriai pateikti 1 lentelėje:
1 pav. ADH aktyvumo nustatymo vaizdas diagraminiame popieriuje ir saviraščio juostos
gradavimas
180

1 lentelė

Buferio tūris,
µL
1775 1770 1765 1760 1750 1740 1730 1720 1700 1680 1660 1630 1580
NAD
+
tirpalo
tūris, µL
200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
Fermento
tūris, µL
20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
Substrato
tūris, µl
5 10 15 20 30 40 50 60 80 100 120 150 200
Substrato
koncentracija,
mmol/L

Reakcijos
greitis,
µmol/min.


Darbo eiga

Užpildykite 1 lentelę:
• Apskaičiuokite substrato koncentraciją kiekviename eksperimente;
• Apskaičiuokite kiekviename eksperimente fermentinės reakcijos greitį (µmol/min) (naudojantis 3.2 pav.
vaizdu);


2 pav. Fermentinės reakcijos greičiai, matuoti esant skirtingoms etanolio koncentracijoms reakcijos mišinyje. Vaizdas
diagraminiame popieriuje. Skaičiais nurodyta, koks bazinio etanolio tirpalo tūris įpiltas į 2 mL reakcijos mišinį
kiuvetėje


181
• Ant milimetrinio popieriaus nubraižykite fermentinės reakcijos greičio priklausomybės nuo substrato
koncentracijos grafiką;
• Lineweaver ir Burk metodu apskaičiuokite alkoholdehidrogenazės K
M
pagal čia pateiktą pavyzdį.

1/substrato koncentracija
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
1
/
r
e
a
k
c
i
j
o
s

g
r
e
i
t
i
s
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
-1/K
M
1/V
maks


3 pav. Lineweaver ir Burk grafikas

Tam Michaelio ir Menten lygtis yra invertuojama:

S V
K
V v
maks
M
maks . .
1 1
+ = .

Koordinatėse 1/v − 1/S turėtume gauti tiesę.

3 užduotis

Taikydami SIGM PLOT programą aproksimuokite eksperimentinius duomenis Michaelio ir Menten
lygtimi ir apskaičiuokite:
• ADH Michaelio konstantą, jos standartinę paklaidą (s) ir variacijos koeficientą (CV);
• Maksimalų reakcijos greitį (V
maks.
), jo standartinę paklaidą (s) ir variacijos koeficientą (CV).
• Koreliacijos koeficientą.

4 užduotis

Taikydami SIGMA PLOT programą bei Lineweaver ir Burk metodą apskaičiuokite:
• ADH Michaelio konstantą,
• maksimalų reakcijos greitį (V
maks.
).



182
5 užduotis

Tas pačias konstantas galime gauti Eadie ir Hofstee metodu. Tam invertuotą Michaelio ir Menten lygtį
dauginame iš v:


S V
K
V
v
. maks
M
. maks
+ = 1 ,

ir pertvarkome:

S
V
K V v
M . maks
− = .

Koordinatėse v nuo v/S turėtume gauti tiesinę priklausomybę (4 pav.). Regresinės tiesės koeficientai
atitinka V
maks.
ir K
M
.


v/S
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
v
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
V
maks
nuolinkis = -K
M


4 pav. Eadie ir Hofstee koordinatės


Apskaičiuokite
• ADH Michaelio konstantą, jos standartinę paklaidą (s) ir variacijos koeficientą (CV);
• Maksimalų reakcijos greitį (V
maks.
), jo standartinę paklaidą (s) ir variacijos koeficientą (CV).


6 užduotis

Apskaičiuokite K
M
ir V
maks.
Hanės metodu. Tam invertuotą Michaelio ir Menten lygtį dauginame iš s:

. maks
M
. maks
V
K
V
S
v
S
+ = .
183

Atidėję duomenis koordinatėse S nuo S/v taip pat turėtume gauti tiesinę priklausomybę.
Atlikę duomenų aproksimavimą tiesės lygtimi, apskaičiuokite:
• ADH Michaelio konstantą;
• maksimalų reakcijos greitį (V
maks.
).
• Palyginkite tarpusavyje visais metodais apskaičiuotą K
M
konstantos reikšmę.


S
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60
S
/
v
0
1
2
3
-K
M
nuolinkis = 1/V
maks


5 pav. Hanės koordinatės


4. Analitinių sistemų metrologinis įvertinimas

Darbo tikslas

Išmokti atlikti biocheminės analitinės sistemos metrologinę patikrą.

Darbo priemonės

• Gliukozės analizatorius EKSAN-G;
• 0,01 mol/L fosfatinis buferis pH 7,2 ÷ 7,4 su 0,1 mol/L KCl ir 1 mmol/L EDTA;
• 0,1 mol/L buferinis gliukozės tirpalas (bazinis tirpalas);
• kraujo serumas, arba kontrolinis serumas;
• mėgintuvėliai;
• 10 mL ir 1 mL talpos graduotos pipetės;
• pipetinis dozatorius su keičiamu tūriu (nuo 20 iki 200 µL).


184

Analitinės sistemos aprašymas

Darbui naudojamas gliukozės analizatorius „Eksan-G“. Analizatoriaus schema yra pateikta 1 pav.




















1 pav. Gliukozės analizatoriaus „Eksan-G“ principinė veikimo schema. 1 – elektrocheminė gardelė, kurios tūris 1 mL;
2 – poliarografinis H
2
O
2
elektrodas; 3 – dviejų kanalų peristaltinis siurblys; 4 – atliekų surinkimo indas; 5 – magnetinis
maišiklis; 6 – pagalbinis titaninis elektrodas; 7 – fermentinė membrana

Gliukozės analizatoriaus veikimo principas.
Peristaltiniu siurbliu (1 pav.) elektrocheminė gardelė praplaunama buferiniu tirpalu. Siurbliui sustojus,
gardelė lieka pripildyta buferinio tirpalo. Jos tūris visą laiką išlieka pastovus (1 mL). Į gardelę įpilama 50 µL
tiriamo tirpalo, 20 kartų praskiedžiama ir magnetine maišykle išmaišoma. Terpėje esanti gliukozė ir kitos
mažos molekulės difunduoja į fermentinės membranos vidų. Geliniame membranos sluoksnyje imobilizuota
gliukozooksidazė katalizuoja tokią reakciją:

β-D-gliukozė + O
2
+ H
2
O Gliukono laktonas + H
2
O
2

Susidarantis vandenilio peroksidas difunduoja prie platinos elektrodo, kurio paviršiuje vyksta
elektrocheminis vandenilio peroksido oksidavimas:

H
2
O
2
O
2
+ 2H
+
+ 2e
-

Platinos elektrodo anodinio signalo dydis tiesiog proporcingas gliukozės koncentracijai tiriamame
pavyzdyje.
Gliukozės analizatorius „Eksan-G“ turi būti iš anksto, bent prieš valandą, paruoštas darbui, t. y. ant
elektrodo uždėta fermentinė membrana, gardelė pripildyta buferinio tirpalo ir analizatorius sugraduotas.

Darbo eiga

1 užduotis

Reagentų paruošimas

Buferinį tirpalą galima ruošti patiems arba įsigyti jo sauso pakuotėse. 1 pakelį reikia ištirpinti 1 litre
distiliuoto vandens. Paruošto buferio vartojimo trukmė − 1 savaitė. Gliukozės bazinis tirpalas ruošiamas
185
bent prieš parą iki eksperimento pradžios. Šio laiko reikia, kad nusistovėtų gliukozės α ir β anomerinių
formų pusiausvyra tirpale. Bazinis gliukozės tirpalas ruošiamas pagal tokią metodiką. Gliukozė išdžiovinama
džiovinimo krosnyje 105 °C temperatūroje iki pastovaus svorio. 1,8016 g išdžiovintos gliukozės supilama į
100 mL matavimo kolbutę, užpilama 50–60 mL buferinio tirpalo ir ištirpinama kambario temperatūroje.
Kai visa gliukozė ištirpsta, į kolbutę iki žymės pripilama buferinio tirpalo. Paruoštas bazinis gliukozės
tirpalas laikomas šaldytuve gerai užkimštas ne ilgiau kaip mėnesį. Jei gliukozės tirpalas laikomas
nešvariuose induose arba naudojamasi nešvariomis pipetėmis, į tirpalą gali patekti mikroorganizmų, dėl jų
veiklos atsiranda drumzlių ir keičiasi gliukozės koncentracija. Toks gliukozės tirpalas tolesniam darbui
netinka.
Laboratoriniams darbams tinka ir žmogaus, ir galvijų kontrolinis kraujo serumas. Galima naudoti kitus
kontrolinius serumus. Laboratoriniam darbui atlikti reikia 7 mL serumo.
Iš bazinio gliukozės tirpalo paruoškite 2, 5, 10, 15, 20, 25 ir 30 mmol/L gliukozės tirpalus.
• Apskaičiuokite, kokį tūrį bazinio gliukozės tirpalo ir buferio reikia paimti, kad gautumėte po 10 mL
reikiamos koncentracijos gliukozės tirpalų.
• 1 ir 10 mL pipetėmis paruoškite tirpalus 12–15 mL talpos mėgintuvėliuose ir gerai juos išmaišykite.
Tirpalai tinka vartoti 1 dieną.
• Iš serumo ir bazinio gliukozės tirpalo paruoškite serumo pavyzdžius su didėjančia gliukozės
koncentracija juose. Apskaičiuokite, kiek bazinio gliukozės tirpalo ir buferio reikės pridėti prie 0,9 mL
serumo, kad galima būtų gauti 1 mL serumo pavyzdžius su didėjančia (2; 4; 6; 8; 10 mmol/L) gliukozės
koncentracija. Ruošdami tirpalus naudokite reguliuojamo tūrio pipetinį dozatorių. Paruošti tirpalai tinka
vartoti 1 dieną.

2 užduotis

Analizės tikslumas. Vandeninio gliukozės tirpalo analizė. Statistinis duomenų apdorojimas.
• Gliukozės analizatoriumi atlikite 10 mmol/L gliukozės tirpalo 10 matavimų.
Apskaičiuokite:
• matavimų vidurkį ( x );
• standartinį nuokrypį (s);
• matavimų variacijos koeficientą (CV, %);
• standartinę paklaidą (S);
• išmatuoto gliukozės tirpalo koncentraciją (X) ir patikimumo lygio (0,95) ribas ( St x X ± = ).

3 užduotis

Analizės teisingumas. Serijos gliukozės tirpalų analizė. Grafinis duomenų apdorojimas, paklaidų
skaičiavimas.
• Po tris kartus išmatuokite gliukozės koncentracijas visuose paruoštuose (2, 5, 10, 15, 20, 25 ir 30
mmol/L) buferiniuose gliukozės tirpaluose.
• Nubraižykite grafiką, gautus rezultatus atidėję koordinatėse − gliukozės analizatoriaus rodmenų
priklausomybė nuo gliukozės koncentracijos.
• Aproksimuokite duomenis tiesės lygtimi.
Apskaičiuokite:
• pirmojo laipsnio regresijos lygties koeficientus;
• koeficientų standartinę paklaidą (S) ir patikimumo lygio ribas (0,95);
• koreliacijos koeficientą r.
Pagrįskite išvadą apie analizės teisingumą.

4 užduotis

Gliukozės nustatymas kraujo serume priedų metodu.
• Išmatuokite po tris kartus visų 6 paruoštų serumo pavyzdžių gliukozės koncentracijas.
• Gautus rezultatus atidėkite koordinatėse: gliukozės analizatoriaus rodmenų priklausomybė nuo pridėtos
gliukozės koncentracijos.
186
• Aproksimuokite duomenis tesės lygtimi.
Apskaičiuokite:
• pirmojo laipsnio regresijos lygties koeficientus;
• koeficientų standartinę paklaidą (s) ir patikimumo lygio ribas (0,95);
• koreliacijos koeficientą;
• nustatykite gliukozės koncentraciją kraujo serume.

5 užduotis

Gliukozės analizatoriaus gradavimo tiesės ribų nustatymas.
Nustatykite gliukozės analizatoriaus gradavimo tiesės ribas.
Tam:
• paruoškite 10; 20; 30; 40; 50; 80; 100 mmol/L gliukozės tirpalus, skiesdami bazinį (100 mmol/L) tirpalą
buferiu;
• atlikite po tris kiekvieno gliukozės tirpalo matavimus;
• gautus rezultatus atidėkite koordinatėse: analizatoriaus rodmenų priklausomybė nuo gliukozės
koncentracijos;
• įvertinkite gradavimo kreivės tiesinę dalį, t. y. suraskite gliukozės koncentracijų intervalą, kuriame
analizė atliekama tiksliai ir teisingai.

6 užduotis

Gliukozės analizatoriaus gradavimo kreivės apatinės ribos nustatymas.
Nustatykite gliukozės analizatoriaus gradavimo kreivės apatinę ribą. Tam:
• paruoškite 2; 1,5; 1,0; 0,5; 0,2, 0,1 mmol/L gliukozės tirpalus;
• atlikite po penkis gliukozės matavimus kiekviename tirpale;
• apskaičiuokite variacijos koeficientą kiekvienai matavimų serijai, atliktai naudojant vienos
koncentracijos tirpalą;
• gautus rezultatus atidėkite koordinatėse: variacijos koeficiento priklausomybė nuo gliukozės
koncentracijos tirpale;
• raskite gliukozės koncentraciją, kuriai esant CV < 5 %.
Egzistuoja ir kitas apatinės matavimo ribos nustatymo būdas.
• Atlikite 10 buferinio tirpalo matavimų;
• apskaičiuokite „tuščiojo matavimo“ standartinę paklaidą (s). Vidurkinis „tuščiojo matavimo“ signalas +
2s yra apatinė matavimo riba.
• Palyginkite šiuos du matavimo prietaiso apatinės matavimo ribos nustatymo metodus.
187

5. Fermentų inhibicijos tyrimas

1 užduotis
E. coli biosintezės metu susidaro metioninas – fermentinio homocisteino 5-metil-
tetrahidropteroiltriglutamato metilinimo produktas. Buvo atliktas eksperimentas, kurio metu matuota
susidariusio metionino kiekio priklausomybė nuo substrato koncentracijos esant inhibitoriui ir be jo. Gauti
tokie rezultatai (1 lentelė):

Darbo eiga

• nubraižykite produkto kiekio priklausomybės nuo substrato koncentracijos grafikus (tiesioginėse ir
atvirkštinėse koordinatėse) pagal 1 lentelės duomenis,
• nustatykite inhibicijos tipą,
apskaičiuokite inhibicijos konstantos K
i
reikšmę.

1 lentelė

Substrato koncentracija,
(µmol/L)
Susidariusio metionino kiekis, (nmol)
pridėjus 30 µmol/L
inhibitoriaus
be inhibitoriaus
10 143 500
12,5 172 526
16,7 218 555
25 286 589
50 455 714


2 užduotis

Salicilatas inhibuoja glutamato dehidrogenazės veikimą.
• Pagal 2 lentelės duomenis grafiniu analizės metodu nustatykite inhibicijos tipą,
• nustatykite fermento K
M
ir inhibicijos konstantos K
i
reikšmę.

2 lentelė

Substrato koncentracija,
mmol/L
Reakcijos produkto susidarymo greitis,
mg/min
Reakcijos produkto susidarymo greitis,
mg/min, esant 40 mmol/L salicilato
1,5
2
3
4
8
16
0,21
0,25
0,28
0,33
0,44
0,435
0,08
0,10
0,12
0,13
0,16
0,18

3 užduotis

Gliukozės oksidazės inhibicijos tyrimas. Inhibicijos tipo nustatymas

Darbo priemonės:

⇒ EKSAN-G ekspresanalizatorius su saviraščiu,
⇒ gliukozės oksidazė; tirpalas buferyje, 2 mg/mL,
188
⇒ 0,01 mol/L fosfatinis buferis (pH − 7,2–7,4 su 0,1 mol/L KCl ir 1 mmol/L EDTA),
⇒ 3 % vandenilio peroksido tirpalas,
⇒ 100 mmol/L D-gliukozės tirpalas tame pačiame buferyje (bazinis tirpalas),
⇒ 1 mol/L D-gliukozės tirpalas,
⇒ 1 mol/L inhibitoriaus D-gliukalio tirpalas,
⇒ 10–15 mL talpos mėgintuvėliai,
⇒ 10 mL ir 1 mL talpos graduotos pipetės,
⇒ 50 µL talpos pipetinis dozatorius,
⇒ 2–20 µL talpos pipetinis dozatorius.

Darbo eiga

Darbo priemonių paruošimas

Gliukozės oksidazės tirpalas (2 mg/mL) ruošiamas eksperimento atlikimo dieną. Vandenilio peroksido
tirpalą paruoškite taip: 3 % H
2
O
2
tirpalą (iš vaistinės) praskieskite 1000 kartų vandeniu 100 mL matavimo
kolboje. Gauto tirpalo koncentraciją patikrinkite spektrofotometru (sugerties koeficientas
ε
240
= 39,4 L·mol
−1
·cm
−1
).
Analizatorius turi būti paruoštas darbui, prijungtas prie saviraščio. Iš elektrocheminės gardelės
pašalinama fermentinė membrana. Rekomenduojamas saviraščio popieriaus juostos slinkimo greitis 1
cm/min.
Elektrocheminės gardelės kalibravimas. Gardelė pripildoma buferinio tirpalo (gardelės tūris − 1 mL),
įjungiamas saviraštis ir užregistruojamas bazinio signalo dydis (srovės stipris, kai gardelėje nėra analitės). Į
gardelę įpilama 50 µL nustatytos koncentracijos vandenilio peroksido tirpalo ir registruojamas stacionariojo
signalo dydis. Peroksido įpilama keleta kartų. Po kalibravimo gardelė kruopščiai plaunama. Liniuote
išmatuojami signalų pokyčiai saviraščio juostoje, atsiradę įpylus vandenilio peroksidą.
• Apskaičiuokite kelių signalų vidurkį (mm).
• Apskaičiuokite saviraščio skalės padalos vertę (µmol H
2
O
2
/mm).
Fermentinės reakcijos greičio matavimas. Į analizatoriaus 1 mL gardelę įpilama 50 µL 1 mol/L
gliukozės tirpalo. Registruojamas elektrodo signalo dydis. Nestabdant saviraščio ir nusistovėjus stacionariam
signalui į gardelę įpilama 20 µL fermento (gliukozės oksidazės) tirpalo.
Reakcijos metu susidaro vandenilio peroksidas. Jo koncentracijos didėjimą atspindi elektrodo
registruojamos anodinės srovės didėjimas. Jis užrašomas saviraščio juostoje. Įdedamo fermento kiekį ir
juostos slinkimo greitį galima kaitalioti, parenkant tokius, kad kreivė su laiko ašimi sudarytų maždaug 45
o

kampą. Įrašas atliekamas ne ilgiau kaip 5 min. Tada gardelė plaunama. Per kreivės stacionariosios fazės dalį
išvedama liestinė.
• Apskaičiuokite fermento koncentraciją gardelėje.
• Apskaičiuokite reakcijos greitį v, išreikšdami jį per 1 minutę susidariusio vandenilio peroksido kiekiu
(µmol/min).

Gliukozės oksidazės inhibicijos tyrimas

Paruoškite gliukozės tirpalus iš bazinio tirpalo (100 mmol/L) taip, kaip nurodyta 3 lentelėje.

3 lentelė

Mėgintuvėlio Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8
Gliukozės
koncentracija,
mmol/L
2 4 8 12 20 30 40 100
Bazinio gliukozės
tirpalo tūris, mL
0,2 0,4 0,8 1,2 2,0 3,0 4,0 10
Buferio tūris, mL 9,8 9,6 9,2 8,8 8,0 7,0 6,0 0
189

Įpilant šių tirpalų į 1 mL gardelę po 50 µL, gardelėje bus: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,0; 1,5; 2,0 ir 5,0 mmol/L
gliukozės.
• Įpilkite į analizatoriaus gardelę 50 µL 100 mmol/L gliukozės tirpalo ir saviraščiu užregistruokite
srovės stiprį. Nusistovėjus pastoviam signalui, į gardelę įpilkite 20 µL gliukozės oksidazės tirpalo.
Reakcijos greitį fiksuokite 3–5 min. Išplaukite gardelę. Su visais paruoštais gliukozės tirpalais iš
eilės išmatuokite reakcijos greitį, naudodami visuose eksperimentuose vienodą to paties fermento
tirpalo tūrį.
• Apskaičiuotus reakcijos greičius surašykite į 4 lentelę ir nubraižykite greičio priklausomybės nuo
gliukozės koncentracijos grafikus tiesioginėse ir atvirkštinėse koordinatėse.
• Apskaičiuokite fermento K
M
.

4 lentelė

Gliukozės
koncentracija, mmol/L
0,1 0,2 0,4 0,6 1,0 1,5 2,0 5,0
Reakcijos greitis,
µmol/min.

Reakcijos greitis,
pridėjus inhibitoriaus,
µmol/min.


Eksperimentų seriją pakartokite, naudodami tuos pačius gliukozės tirpalus (koncentracija gardelėje −
nuo 0,1 iki 5 mmol/L), tik pridėdami į kiekvieną mėginį po 0,05 mL inhibitoriaus D-gliukalio 1 mol/l tirpalo.
• Apskaičiuokite inhibitoriaus koncentraciją reakcijos mišinyje.
• Apskaičiuokite reakcijos greičių reikšmes, gautas pridėjus inhibitoriaus, įrašykite į lentelę 5.4.
• Į anksčiau nubraižytus grafikus įrašykite reakcijos greičių reikšmes, gautas pridėjus inhibitoriaus.
• Nustatykite gliukozės oksidazės inhibicijos D-gliukaliu tipą.
• Apskaičiuokite inhibicijos konstantą K
i
.


190
M Mo od de el li ia ai i b bi io ol lo og gi ij jo oj je e
Pratybos
Alfonsas Juška

1. Funkcijų skaičiavimas ir grafinis vaizdavimas. Tiesinės ir pusiau
logaritminės koordinatės

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir atvaizduoti funkcijas grafikais:

Darbo eiga

Pratybų lape (Pratybos.xls) pasirinkite langelius (eilutę) modelių
(funkcijų) parametrams (patartina 8 eilutę, viršutinę lapo dalį paliekant
laisvą), taip pat lauką lentelėms (patartina nuo 10 eilutės).
Nepriklausomo kintamojo ir parametrų reikšmės gali būti (beveik) bet
kokios; pradžiai patartina įrašyti tokias, kokios yra Excel pavyzdžių
lape. (9 eilutę patartina palikti žymenims: t, f
1
, f
2
…)
Sudarykite nepriklausomo kintamojo (t) reikšmių stulpelį: A10
langelyje įrašykite 0, A11 – 1 (ar kokį kitą skaičių >0), tada šiuos
langelius pažymėkite, užvesdami pelės rodyklę ant A10, nuspausdami
pelės klavišą ir, jo neatleidę, pervesdami rodyklę į A11, kaip parodyta
paveikslėlyje; žr. taip pat Excel Help, Selecting Cells, paskui kiek
pratęskite žemyn pažymėtąjį stulpelį, užvesdami pelės rodyklę ant
dešiniojo apatinio pažymėtų langelių kampo [juodo kvadratėlio; pelės rodyklė šiuo atveju turi pavirsti „+“
(pliuso ženklu)] ) ir tempdami pelės rodyklę žemyn kaip parodyta paveikslėlyje. Excel užpildo stulpelio
langelius pagal du pirmuosius (šiuo atveju pagal aritmetinę progresiją). Jei susidarė ~ 15–20 Jūsų kintamojo
reikšmių stulpelis, galima baigti, jei ne, – tęsti. (Tęsti galima ir vėliau, ir ne tik 1, bet kelis stulpelius iš
karto.)
a. Išreikškite pateiktą funkciją langelių, kuriuose (yra ar bus) įrašytos kintamojo, parametrų ir funkcijos
reikšmės, adresais. Tegu funkcijos reikšmių lentelė bus B stulpelis, nepriklausomo kintamojo (t) stulpelis yra
A, o γ parametras te bus B8 langelyje. Užveskite pelės rodyklę ant B10 langelio (jį Excel pažymės
rėmeliu), paskui rodyklę užveskite ant „=“ (lygybės ženklo) formulių juostoje Formula bar spustelėkite
pelės klavišą, po „=“ ženklo įrašykite pateiktą formulę atitinkamų langelių adresais, t. y. 2^(B8*A10);
užveskite rodyklę ant formulių juostoje ir spustelėkite klavišą. B10 langelyje iškart pasirodys
skaičiavimo rezultatas. Nukopijuokite šio langelio turinį ir „įterpkite“ jį kaip formulę (Paste special,
Formulas) kuriame nors kitame šio stulpelio langelyle (pvz., B13). ). Atkreipkite dėmesį į tai, kad B13
langelio turinys netapatus (lygties prasme) B10 langelio turiniui: =2^(B10*A13). Pakito ne tik
nepriklausomojo kintamojo adresas (kaip ir turėjo būti), bet ir parametro adresas (kuris turėjo likti tas pat).
Kad to neatsitiktų, B10 langelyje formulę reikia patikslinti – tarp parametro langelio koordinačių (raidės ir
skaičiaus) įterpti $ (dolerio simbolį): 2^(B$8*A10). Pataisę formulę, pakartokite kopijavimo ir „įterpimo“
veiksmus ir įsitikinkite, kad skaičiuojama teisingai. Sudarykite funkcijos reikšmių stulpelį tokiu pat būdu,
kaip ir nepriklausomojo stulpelį, t. y. tęsdami už dešiniojo kampo stulpelį žemyn.

( )
. x f , e x ) , e f )
, e f ) , e f )
, , e f ) , f )
t α τ / t
t α – t α
t t γ
= = =
− = =
α ± = β = =

⋅ ⋅
⋅ β ⋅
6 3
5 2
4 1
6 3
1 5 2
4 2 1
A B
8
9
10 0
11 1
12
13 Žemyn!
1
+
1
191

Pastabos:
• jei kairėje nuo sudaromojo stulpelio jau yra reikiamo ilgio stulpelis, naująjį galima sudaryti paprasčiau:
užvesti pelės rodyklę ant langelio, nuo kurio norima tęsti, apatinio dešiniojo kampo, kad rodyklė pavirstų
„+“, tuomet dukart spustelėti pelės klavišą;
• rašydami formules, galite nepaisyti didžiųjų ar mažųjų raidžių: 2^(B$8*A10) ir 2^(b$8*A10) Excel
„supranta“ vienodai;
• formules nebūtina rinkti po simbolį. Po „=“ formulių juostoje reikiamą adresą galima (ir patartina)
nurodyti, atvedus pelės rodyklę į atitinkamą langelį ir spustelėjus klavišą; taip galima surinkti visą
formulę, vėliau beliks tik sudėlioti, kur reikia, $.
b. Pažymėkite (Select) ką tik sudarytą lentelę (užpildytus stulpelius, pradedant nuo 9 eilutės).
Užveskite pelės rodyklę ant mygtuko (Chart Wizard), spustelėkite pelės klavišą, paskui
spustelėkite (XY (Scatter)), tada laužtinę liniją (Chart sub-type). Iškart bus pavaizduotas
modeliujamosios funkcijos grafikas. Pertempkite pele šį paveikslą, suėmę jį už balto lauko (Chart
Area) pakraščio ir neatleisdami pelės klavišo, į pasirinktą vietą, uždengdami nereikalingą lentelės dalį,
perstumkite paaiškinimą (Legend) į laisvą paveikslo sritį (Plot Area), išplėskite šią sritį per visą
paveikslą (Chart Area), pakeiskite paveikslo dydį, pakeiskite skaičius pagal koordinačių ašis
sveikaisiais ar su tam tikru dešimtainių ženklų skaičiumi (dukart spustelėkite klavišu atvedę rodyklę ant
ašies Format axis/Number/Decimal places).
1. a ir b. Tokiu pat būdu sudarykite f
2
funkcijos reikšmių stulpelį (nuo C10), α parametrui paskirdami A8
langelį. Pažymėkite (Select) visą paveikslą, užvesdami ant jo balto lauko (Chart Area) pelės rodyklę ir
spustelėdami klavišą: pagrindinėje menu juostelėje vietoje Data atsiras Chart. Spustelėkite Chart,
paskui Add Data. Atsiradusiame langelyje galima įrašyti duomenų adresus (diapazoną), t. y. nuo C9 iki
Cn langelio. Galima padaryti ir paprasčiau: užveskite rodyklę ant C9 langelio ir, neatleisdami klavišo,
tempkite žemyn, kol bus aprėptas reikalingas diapazonas (jei stulpelio pradžią ar pabaigą dengia Add
Data dialogo paveiksliukas, nutempkite jį šalin, kad netrukdytų). Atleiskite klavišą ir spustelėkite OK.
Pažymėkite ką tik atsiradusią kreivę, kad skirtųsi nuo ankstesniosios: užvedę rodyklę ant šios kreivės,
dukart spustelėkite klavišą; dialogo Format Data Series langelyje Patterns skyrelyje Marker
pažymėkite Automatic (arba Custom, tuomet reikės dar pasirinkti Style, Foreground ir
Background) ir spustelėkite OK.
2. a ir b. Sudarykite f
3
funkcijos reikšmių stulpelį (nuo D10), τ parametrui paskirdami D8 langelį,
papildykite paveikslą šios funkcijos grafiku. Pažymėkite šią kreivę, kaip tai darėte anksčiau. Parodykite,
kad f
3
galima sutapatinti su f
1
(ar f
2
).
3. a ir b. Sumodeliukite f
4
funkciją su β = α arba β = –α, pavaizduokite atskirame paveiksle. (Nurodymas:
β išreikškite kaip sandaugą β = α * δ, o δ galės būti 1 arba –1; šiam parametrui paranku paskirti langelį,
pvz. E8, taigi D8=E8*A8).
c. Nukopijuokite šį paveikslą ir „įterpkite“ jį greta, nustatykite tinkamą dydį. Pakeiskite vertikaliosios
ašies mastelį į logaritminį: atveskite rodyklę į šios koordinatės zoną [Value (Y) Axis] ir dukart
spustelėkite klavišą; spustelėkite Scale ir pažymėkite ( ) Logarithmic scale, spustelėkite OK.
Pakeiskite α parametro ženklą (t. y. δ parametro dydį: iš 1 į –1 arba atvirkščiai). Atkreipkite dėmesį į tai,
kaip kinta 2 ir 3 pavekslai. Pakaitaliokite α parametro ženklą pirmyn–atgal (patogu naudotis Undo,
Redo).
4. Sumodeliuokite f
5
funkciją, kai β < 0.
Nukopijuokite 2 paveikslą, „įterpkite“ jo kopiją greta 3, nustatykite tinkamą dydį, papildykite jį f
5

modeliu. Atkreipkite dėmesį į tai, kad šių kreivių suma lygi 1, kaip bekaitaliotumėte α parametrą.
5. Sumodeliuokite f
6
funkciją, pavaizduodami ją atskirame paveiksle. Palyginkite su ankstesniuoju
paveikslu, atkreipdami dėmesį į koordinačių ašis ir skaičius. Pakaitaliokite parametrus.
Nukopijuokite šį paveikslą ir „įterpkite“ jo kopiją greta, nustatykite tinkamą dydį. Pakeiskite
horizontaliosios ašies mastelį ir ribas: Minimum nustatykite 1, pažymėkite Logarithmic scale,
paspauskite OK. Palyginkite paveikslus tarpusavyje ir su ankstesniaisiais.

192
2. Dispersinė analizė. Modelio patikra

Užduotis

Sudaryti Excel funkcijos FDIST(x; Deg_freedom1; Deg_freedom2) skaičiavimo programą. Čia
Deg_freedom1, Deg_freedom2 (arba n
1
, n
2
) – laisvės laipsniai; x vietoje įstatyti Fisherio santykį, kiti
žymenys aiškinami darbo eigos metu.



Darbo eiga

Pradžioje įsitikinkite, kad Excel pavyzdyje pateikta programa veikia ir pateiktas modelis neprieštarauja
bandymų duomenims: FDIST(F; n
1
; n
2
) > 0,05. Pakaitaliokite parametrų reikšmes, stebėdami, kaip kinta
FDIST. Išvalykite (delete) vieną kitą duomenų lentelės langelį. Atkreipkite dėmesį į tai, kad FDIST beveik
nekinta. Panaikinkite pakeitimus (Undo). Pakeiskite duomenis (ne visus iš karto, o po vieną langelį ir ne
gretimuose langeliuose, o parinkdami atsitiktinai): dabar FDIST turi labiau kisti. Undo. Pakeiskite patį
modelį. Dabar modelinė kreivė turi gerokai nukrypti nuo duomenų, o FDIST labai sumažėti.
Duomenų lentelėje (Pratybos.xls) sudarykite nepriklausomojo dydžio stulpelį (tiesinė skalė).
Pavaizduokite duomenis grafiku.
G stulpelyje skaičiuokite vidurkius (
i
Y ): pažymėję G10 langelį, spustelėkite klavišą ant „=“ ženklo
formulių juostoje, šioje juostoje pasirinkite reikiamą funkciją (AVERAGE), pažymėkite vidurkintiną
duomenų eilutę (nuo C iki F, kaip tai darėte, papildydami paveikslą naujais duomenimis) ir paspauskite OK.
Vidurkių liniją pavaizdukite laužtine (pirminiai duomenys tegu lieka pavaizduoti pabirais taškais).
H stulpelyje skaičiuokite p
i
, t. y. kiek atlikta bandymų (matavimų), atitinkančių tos eilutės
nepriklausomojo dydį: pasirinkite funkciją COUNT, pažymėkite skaičiuotinų duomenų eilutę (nuo C iki F),
paspauskite OK (funkcija COUNT skaičiuoja tik langelius su skaičiais, tuščių neskaičiuoja).
J, K, L ir M stulpeliuose skaičiuokite atitinkamo matavimo rezultato nuokrypio nuo vidurkio kvadratus,
t. y. ( )
2
i ij
Y Y − . Turėkite omeny, kad, jei matavimo nėra (langelis tuščias), nuokrypio taip pat neturi būti. Šią
sąlygą gali automatiškai patikrinti Excel funkcija IF(logical, any, any): čia logical reiškia loginę sąlygą
(pvz., langelis tuščias), any – langelio turinį (turinys, jei tai ne skaičius, žymimas kabutėse: " " reiškia, kad
langelyje yra tarpo simbolis, o "", kad jame nieko nėra). Taigi ( )
2
10 1 10
Y Y
,
− = IF(C10="";"";(C10-G10)^2).
I stulpelyje skaičiuokite
2
|
|
¹
|

\
|

^
i i i
Y Y p , taip pat turėdami omeny, kad nuokrypis skaičiuojamas tik tuo
atveju, kai yra atitinkamas vidurkis (ir p
i
) taigi naudokitės Excel funkcija IF.
N stulpelyje skaičiuokite sumas ( ) ∑
=

i
p
j
i ij
Y Y
1
2
, naudodamiesi Excel funkcija SUM. Pasirinkę šią funkciją
formulių juostoje, pažymėkite atitinkamus langelius (J –M), paspauskite OK.
Užpildykite lentelę iki paskutinės eilutės, kurioje yra nepriklausomas kintamasis, tempdami žemyn už
dešiniojo apatinio kampo visą G10 – N10 eilutę.
Skaičiavimai 8 eilutėje: F langelyje – modelio parametrų skaičių (q) [COUNT(A8:E8)], G langelyje –
vidurkių skaičių (COUNT), H langelyje – visų Y matavimų skaičių (Σp
i
, SUM), I langelyje susumuokite I
stulpelio (nuo I10) rezultatus, N langelyje susumuokite N stulpelio (nuo N10) rezultatus, J langelyje –
n
1
= n – q, K langelyje – n
2
= Σp
i
– n, L langelyje – Fisherio santykį F(0,05; n
1
; n
2
), M langelyje – FDIST(F;
n
1
; n
2
).
Jei FDIST(F; n
1
; n
2
) < 0,05, modelis atmetamas.
( )
.
Y Y
Y Y p
n
n
F
n
i
p
j
i ij
n
i
^
i i i
i

=

=

=

|
|
¹
|

\
|

=
1 1
2
2
1
1
2
193
Pamėginkite aproksimuoti šiuos duomenis paprasčiausiu Jums žinomu (tiesiniu) modeliu.
Aproksimuokite duomenis sudėtingesniu modeliu.

3. Ribotojo augimo modelis

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:

Darbo eiga

Sumodeliuokite f
1
funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo
dydį, koordinačių ašis (Excel pavyzdys).
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f
2
funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle, kaip ir
anksčiau. Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo ankstesniosios.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f
3
funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle, kaip ir
anksčiau. Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo ankstesniųjų.
Atkreipkite dėmesį į skirtumą tarp f
1
ir f
2
funkcijų. Pakaitaliokite b parametro reikšmę, stebėdami, kaip
kinta kreivės pavidalas; pakeiskite ją taip, kad f
2
kreivė priartėtų prie f
1
.
Nukopijuokite šį paveikslą ir „įterpkite“ jo kopiją greta, nustatykite jos dydį. Pakeiskite vertikaliosios
ašies mastelį ir ribas: nustatykite Minimum, pažymėkite Logarithmic scale, paspauskite OK.
Sumažinkite b reikšmę ir atkreipkite dėmesį į tai, jog f
2
kreivė, priešingai nei f
1
ar f
3
, antrajame paveksle
nešsitiesina.

4. Grįžtamojo proceso modeliavimas

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:


Darbo eiga

Sumodeliuokite p funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo dydį,
koordinačių ašis (Excel pavyzdys).
Tokiu pat būdu sumodeliuokite q, r ir s funkcijas, pavaizduokite jas grafikais tame pačiame paveiksle,
kaip ir anksčiau. Pažymėkite kreives papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi viena nuo kitos.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle, kaip ir
anksčiau. Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo ankstesniųjų.
Atkreipkite dėmesį į skirtumą tarp p ir q funkcijų. Pakaitaliokite β parametro dydį, stebėdami, kaip kinta
kreivės pavidalas; pakeiskite jį taip, kad q kreivė priartėtų prie p.
Nukopijuokite šį paveiksliuką ir „įterpkite“ jo kopiją greta, nustatykite jos dydį. Panaikinkite šiame
paveiksle r kreivę. Pakeiskite vertikaliosios koordinatės mastelį ir ribas: nustatykite Minimum, pažymėkite
Logarithmic scale, paspauskite OK. Sumažinkite β reikšmę ir atkreipkite dėmesį į tai, jog q kreivė,
priešingai nei p ar s, antrajame paveiksle „nešsitiesina“.

. Aq f ) , e s 4) , q r 3) , e q 2) , e p 1)
t – t ) ( t –
= = =
β + α
β
+
β + α
α
= =
γ β + α α
5 – 1

( )
. e a f 3) ,
e
b
a
e a
f ) , e a f )
t β
t α
t α
t α
=
− +
= =
3 2 1
1 1
2 1
194
5. Bifermentės sistemos modeliavimas

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:

Darbo eiga

Sumodeliuokite f
1
funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo
dydį, koordinačių ašis (Excel pavyzdys).
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f
2
funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle, kaip ir
anksčiau. Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo ankstesniosios.
Atkreipkite dėmesį į skirtumą tarp f
1
ir f
2
funkcijų. Pakaitaliokite q
1
, b ir λ parametrų dydžius,
stebėdami, kaip kinta kreivės pavidalas; pakeiskite juos taip, kad f
2
kreivė sutaptų su f
1
.

6. Jonų pernašos per ląstelės membraną modeliavimas

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:

1) . e e A c f ) ), e ( e A f
t t t t
(
¸
(

¸

|
|
¹
|

\
|
µ + λ
λ

µ
µ + λ
− − = − λ
µ
µ + λ
=
µ − λ − µ − λ −
1 1 2 1
0 2 1


Darbo eiga

Sumodeliuokite f
1
funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo
dydį, koordinačių ašis (Excel pavyzdys).
Atkreipkite dėmesį į tai, kad ši funkcija kinta greičiau, todėl reikės daugiau nepriklausomojo dydžio
reikšmių. Patartina pasinaudoti standartinėmis Excel funkcijomis:
αe
–αt
= EXPONDIST(t; α; FALSE)
ir
1 – e
–βt
= EXPONDIST(t; β; TRUE).
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f
2
funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle.
Priartinkite f
2
kreivę prie duomenų (Pratybos.xls).
Nurodymas. Pradžioje nustatę µ, parametro nekaitaliokite.

7. Paprastosios kinetikos modeliavimas. Skatinimas. Slopinimas

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:

( ) ( ). e
b
e q f 2) , e a e q f 1)
t t
2
/ t / t λ − λ − τ − τ −
− ⋅
λ
+ ⋅ = − ⋅ τ ⋅ + ⋅ = 1 1
1 0 1
. d 0 , c , B ), dr cs ( B f 8) , b , a 0 , A ), bp aq ( A f )
,
z x
x
u 6) ,
y x
x
t 5) ,
x
s 4) ,
x
x
r ) , p q 2) ,
x
x
p )
1 1 0 0 1 0 1 0 7
3 1 1
2 1
≤ < ≤ < > + = ≤ < ≤ < > + =
ζ + ξ +
=
η +
η

ξ +
=
χ +
χ
=
χ +
= − =
ξ +
=
195
Darbo eiga

Sumodeliuokite p funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo dydį,
koordinačių ašis (Excel pavyzdys).
Pakeiskite horizontaliosios ašies mastelį ir ribas: nustatykite Minimum tokį, kokia mažiausia x reikšmė,
pažymėkite Logarithmic scale, paspauskite OK.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite q, r, ir s funkcijas, pavaizduokite jas grafikais tame pačiame paveiksle,
kaip ir anksčiau. Pažymėkite kreives papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo p.
Atkreipkite dėmesį į tai, kad p ir r (taip pat q ir s) funkcijos iš esmės nesiskiria. Pakaitaliokite η
parametro reikšmę, stebėdami, kaip r kreivė slankioja p kreivės atžvilgiu (s kreivė − q atžvilgiu); pakeiskite
η taip, kad r kreivė sutaptų su p (s su q).
Nukopijuokite šį paveikslą ir „įterpkite“ jo kopiją greta, nustatykite jos dydį. Pakeiskite horizontaliosios
ašies mastelį ir ribas: nustatykite Minimum = 0, nuimkite nuo Logarithmic scale, spustelėkite OK.
Atkreipkite dėmesį į tai, kaip šiuose paveiksluose skiriasi kreivių pavidalas.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite t ir u funkcijas, pavaizduokite jas grafikais pirmajame paveiksle, kaip ir
anksčiau. Pažymėkite kreives papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo kitų. Pakaitaliokite y ir η
parametrus, stebėdami, kaip kinta t funkcija. Pakaitaliokite z ir ζ parametrus, stebėdami, kaip kinta u
funkcija.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f
1
ir f
2
funkcijas, pavaizduokite jas atskirame paveiksle. Pakaitaliokite jų
parametrus.

8. Atsako slopinimas ligando pertekliumi

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:
Darbo eiga

Sumodeliuokite p funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo dydį,
koordinačių ašis (Excel pavyzdys).
Pakeiskite horizontaliosios ašies mastelį ir ribas: nustatykite Minimum tokį, kokia mažiausia x reikšmė,
pažymėkite Logarithmic scale, paspauskite OK.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite q funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle, kaip ir
anksčiau. Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo p. Pastaba. Kadangi į lygtį
τ ir θ parametrai įeina tik kartu kaip τ/θ santykis, šis santykis laikytinas vienu parametru; į Excel
modeliuojamą funkciją pakanka įrašyti tik šį santykį.
Pakaitaliokite ξ parametrą stebėdami, kaip q kreivė slankioja p kreivės atžvilgiu. Kokia turi būti šio
parametro reikšmė, kad p ir q kreivių pradžia sutaptų? Pakaitalioite τ/θ santykį, stebėdami, kaip kinta kreivės
pavidalas. Koks turi būti šis santykis, kad q kreivė priartėtų prie p? Pakaitaliokite ω parametrą tokiu būdu,
kad kreivė neslankiotų, tik kistų jos pavidalas. (Nurodymas. Išreikškite ω per ξ.) Koks turi būti ω ir ξ
santykis, kad q priartėtų prie p?
Sumodeliuokite f funkciją ir pritaikykite ją prie bandymų duomenų.

.
x
θω
τ
x
θ
τ
ξ
x
q ,
χ x
x
p
2
1 + |
¹
|

\
|
+ +
=
+
=
196
9. Dviejų vienodų sąveikos vietų kinetikos modelis

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:

Darbo eiga

Sumodeliuokite p funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo dydį,
koordinačių ašis (Excel pavyzdys).
Pakeiskite horizontaliosios ašies mastelį ir ribas: nustatykite Minimum tokį, kokia mažiausia x reikšmė,
pažymėkite Logarithmic scale, paspauskite OK.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite q funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle, kaip ir
anksčiau.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle, kaip ir
anksčiau (pradžioje lai A = 1). Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo p ir q.
Pakaitaliokite a, b ir c parametrų reikšmes, stebėdami, kaip kinta f kreivės pavidalas. Kokios turi būti šių
parametrų reikšmės, kad f kreivė sutaptų su p? Kad sutaptų su q?

10. Dviejų nevienodų sąveikos vietų kinetikos modelis

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:


Darbo eiga

Sumodeliuokite p funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo dydį,
koordinačių ašis (Excel pavyzdys).
Pakeiskite horizontaliosios ašies mastelį ir ribas: nustatykite Minimum tokį, kokia mažiausia x reikšmė,
pažymėkite Logarithmic scale, paspauskite OK.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite q funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle, kaip ir
anksčiau. Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo p. Atkreipkite dėmesį į tai,
kad p ir q kreivės iš esmės nesiskiria. Pakaitaliokite η parametro reikšmę, stebėdami, kaip q kreivė slankioja
p kreivės atžvilgiu; pakeiskite η taip, kad q kreivė sutaptų su p.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle, kaip ir
anksčiau (pradžioje tegu A = 1). Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo p ir
q.
Pakaitaliokite a, b ir c parametrų reikšmes, stebėdami, kaip kinta f kreivės pavidalas. Kokios turi būti šių
parametrų reikšmės, kad f kreivė sutaptų su p?

( ). cp bpq aq A f )

, p q ) ,
x
x
p )
2 2
2 3
1 2 1
+ + =
− =
ξ +
=
| | { }. ) cpq ) p ( q ) q ( p b ) q )( p ( a A f )
,
x
x
q ) ,
x
x
p )
+ − + − ⋅ + − − ⋅ =
η +
=
ξ +
=
1 1 1 1 3
2 1
197
11. Kooperatinio veikimo kinetikos modeliavimas

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:

Darbo eiga

Sumodeliuokite p funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo dydį,
koordinačių ašis (Excel pavyzdys) (patartina imti mažesnius nepriklausomojo intervalus ir daugiau jo
reikšmių).
Pakeiskite horizontaliosios ašies mastelį ir ribas: nustatykite Minimum tokį, kokia mažiausia x reikšmė,
pažymėkite Logarithmic scale, paspauskite OK.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite q ir r funkcijas, pavaizduokite jas grafikais tame pačiame paveiksle, kaip
ir anksčiau. Pažymėkite kreives papildomomis žymėmis (Marker).
Padarykite greta šio paveikslo kopiją. Tokiu pat būdu sumodeliuokite pagalbines f ir g funkcijas, paėmę
ω < 1 (vaizduoti nereikia). Taip pat sumodeliuokite u ir v funkcijas, pavaizduokite jas grafikais antrajame
paveiksle. Pažymėkite kreives papildomomis žymėmis (Marker), kad skirtųsi nuo kitų.
Padarykite greta šio paveikslo kopiją. Panaikinkite jame q ir r kreives. Tokiu pat būdu sumodeliuokite w
funkciją, pavaizduokite ją.
Pakaitaliokite ω parametro reikšmę, stebėdami, kaip kinta u, v, ir w kreivių statumas. Atkreipkite dėmesį
į tai, kad pastaroji kreivė (w) susilieja su p, kai ω priartėja prie 1.

12. Imunofermentinės analizės modeliavimas

Užduotis

Sudaryti šių funkcijų reikšmių lenteles ir pavaizduoti funkcijas grafikais:

Darbo eiga
( )
( )
. C
D D ξ D
D x D ξ x D ξ x A
f
,
D jei , AD
D jei , C A
f , C
B
) B ( A
f
n n n
n n
n
n
+
− + + − + ξ +
|
|
¹
|

\
|
⋅ − + + − + +
=
¦
¹
¦
´
¦
> ⋅ ⋅
≤ ⋅ +
= +
+
+
=
− − −
− −

4 1 1
2 4 2 2
1 2 2
1 2
2 1
1
2
2
3
2 1
( )
. g v , f x u , f ξ g
,
ω ξ ω ξ x ω ξ x ξω x x
f
, p r , p q ,
ξ x
x
p
4 3
− = = =
+ + + +
=
− − = =
+
=
1
4 6 4
1
1 1
4 4
4 3 2 2 2 3 4
2 2
198
Sumodeliuokite f
1
funkciją, kaip tai darėte anksčiau, pavaizduokite ją grafiku, nustatykite paveikslo
dydį, koordinačių ašis (Excel pavyzdys).
Priartinkite f
1
kreivę prie duomenų (Pratybos.xls).
Atkreipkite dėmesį į tai, kad iš esmės neįmanoma pakeisti kreivės pavidalo, kai parinktas jos višutinis
lygmuo ir fonas. Ji gali slankioti tik horizontalia kryptimi.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f
2
funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle.
Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker). Priartinkite apatinę dešiniąją jos dalį prie duomenų.
Atkreipkite dėmesį į tai, kad jos pavidalas taip pat nekinta, kai parinktas fono lygmuo. Ji gali slankioti tik
horizontalia kryptimi.
Tokiu pat būdu sumodeliuokite f
3
funkciją, pavaizduokite ją grafiku tame pačiame paveiksle.
Pažymėkite kreivę papildomomis žymėmis (Marker). Priartinkite ją prie duomenų (pradžiai galite nustatyti
tokius pat parametrų dydžius, kaip Excel pavyzdyje). Atkreipkite dėmesį į tai, kad jos pavidalas priklauso
nuo ξ parametro dydžio.
199
G Ge en nų ų i in nž ži in ne er ri ij jo os s p pa ag gr ri in nd da ai i
Laboratoriniai darbai
Gintautas Žvirblis, Meilutė Meizeraitytė, Valerija Chmieliauskaitė

1. E. coli RRI kamieno transformacija, naudojant plazmidinę DNR
Meilutė Meizeraitytė, Gintautas Žvirblis

Teorinis įvadas

Rekombinantinės DNR įvedimas į bakterinę ląstelę yra vienas iš svarbiausių molekulinio klonavimo
etapų. Tam, kad bakterinės ląstelės efektyviai įjungtų DNR, jos yra atitinkamai apdorojamos. Dėl to padidėja
jų membranų pralaidumas. Pvz., ląsteles paveikus tokiomis metalų druskomis, kaip MgCl
2
, RbCl ar CaCl
2
,

padidėja membranų gebėjimas praleisti į ląstelės vidų transformacijai naudojamą DNR. Pastaruoju metu
dažniausiai naudojami du bakterijų transformacijos metodai: elektroporacijos (membranų pralaidumą sukelia
stiprus elektros laukas) ir cheminis (paveikiant ląsteles minėtosiomis metalų druskomis). Transformacijos
efektyvumas siekia 10
5
–10
9
kolonijų/mikrogramui panaudotos plazmidinės DNR ir priklauso nuo
mikroorganizmų prigimties, DNR struktūros (ar tai linijiniai DNR fragmentai, ar plazmidinė DNR yra
žiedinė, ar pastaroji turi superspiralinę struktūrą) ir naudojamo transformacijos metodo. Patekus į bakteriją
plazmidinei DNR, prasideda jos replikacija ir pasireiškia atsparumo genai (žymenys). Dėl to transformantai
įgyja atsparumą antibiotikams.

Darbo tikslas

Transformuoti plazmidę pUC18 į E. coli RRI kamieną ir įvertinti transformacijos efektyvumą.

Darbo priemonės bei reagentai:

1. Šaldoma Hetticho centrifuga.
2. Sterilūs mėgintuvėliai ir Petri lėkštelės.
3. Ledo vonia.
4. Vandens termostatas.
5. Glaistikliai.
6. Spiritinis degiklis.
7. Terpė LB (triptono 10 g/L; mielių ekstrakto 5g/L; NaCl 10g/L).
8. Agarizuotoji terpė (terpė LB + Bakto agaras 15g/L).
9. Transformacijos buferis (100 mM CaCl
2
; 10 mM Tris-HCl pH 7,0; 5 mM MgCl
2
).
10. 100 mg/mL ampicilino tirpalas.
11. Etanolis.

Darbo eiga

1. Kompetentinių ląstelių paruošimas
1. Iš vakaro į mėgintuvėlį su sterilia terpe (3,5 mL) užsėjame E.coli RRI kamieno kultūrą ir inkubuojame
per naktį purtant 37 °C temperatūroje.
2. Ryte 50 µL naktinės bakterijų kultūros įpilame į mėgintuvėlį su sterilia terpe (5 mL) ir inkubuojame
purtant 2–4 val. 37 °C temperatūroje. (Rekomenduojama, kad ląstelių kultūra būtų logaritminėje augimo
fazėje.)
3. Ląstelių kultūrą atšaldome ledo vonioje 10 min. ir centrifuguojame 3000 aps./min. 10 min. 4 °C
temperatūroje.
4. Steriliai supernatantą nupilame, o ląsteles resuspenduojame tokiame pat tūryje (t. y. 5 mL) sterilaus,
atšaldyto lede transformacijos buferio (100 mM CaCl
2
; 10 mM Tris-HCl pH 7,0; 5 mM MgCl
2
). Laikome
leduose 30 min.
200
5. Ląstelių kultūrą centrifuguojame 5 min. 3000 aps./min. greičiu 4 °C temperatūroje. Steriliai nupilame
supernatantą, o ląsteles resuspenduojame 200 µl sterilaus, lede atšaldyto transformacijos buferio, Ląstelės
išlieka kompetentinės 12–24 val., laikant jas 4 °C temperatūroje.
2. Kompetentinių ląstelių transformacija
1. Į mėgintuvėlį su kompetentine ląstelių kultūra steriliai pridedame 0,05–0,1 µg (mikrogramų)
plazmidinės DNR (pUC18) buferiniame tirpale. Mėginį supurtome ir laikome leduose 30 min.
2. Mėginį pernešame į 42 °C temperatūros vandens termostatą ir inkubuojame 2 min. Po termošoko
mėginį palaikome 1 min. ledo vonioje.
3. Į mėgintuvėlį su mėginiu steriliai pripilame 1 mL sterilios terpės LB ir inkubuojame 1 val. 37 °C
temperatūroje. Per tą laiką bakterijose vyksta atsinaujinimo procesai ir prasideda atsparumo antibiotikams
genų ekspresija.
4. Atsargiai (nespausdami) glaistikliu paskleidžiame po 50–100 µL ląstelių kultūros ant lėkštelių su
agarizuotąja LB terpe ir ampicilinu (100 µg /mL). Glaistoma, kol agaro paviršius lieka sausas.
5. Lėkšteles inkubuojame per naktį 37 °C temperatūroje.
6. Skaičiuojamas transformacijos efektyvumas, t. y. kiek transformantų kolonijų gauta skaičiuojant
vienam mikrogramui plazmidės DNR. Skaičiavimas atliekamas pagal formulę (reikia atsižvelgti, kiek µg
DNR teko vienai išsėtai lėkštelei):

Transformantų skaičius
Transformacijos efektyvumas =  .
Plazmidės DNR kiekis, (µg)

Kontrolinai klausimai

1. Kodėl ruošiant kompetentinę kultūrą ląsteles reikia paveikti metalų druskomis?
2. Koks gali būti transformacijos efekyvumas vienam mikrogramui intaktinės DNR?
3. Kokioje augimo fazėje turi būti ląstelės ruošiant kompetentinių ląstelių kultūrą?
4. Įvertinkite iš savo eksperimentinių duomenų gautąjį transformacijos efektyvumą.

Atsiskaitymas

Pateikiamas atlikto darbo aprašymas, kuriame yra nustatytas atliktos DNR transformacijos efektyvumas.

Literatūra

1. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000.
2. Рыбчин, В. Н. Основы генетической инжинерии. Санкт-Петербург: Из-во СПбГТУ, 1999.
3. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold
Spring Harbor Laboratory press, 1989.
4. Льюин, Б. Гены. Москва: Мир, 1987.
5. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. Москва: Мир, 1976.
6. Sambrook, J.; Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. 7. old Spring
Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.
7. Short protocols in molecular biology. Ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc.,
1999.









201
2. Plazmidinės DNR hidrolizė restrikcijos endonukleazėmis
Valerija Chmieliauskaitė, Gintautas Žvirblis

Teorinis įvadas

Restrikcijos endonukleazės (restriktazės) – fermentai, atpažįstantys tam tikras sekas dvigrandėje DNR ir
skeliantys DNR molekulę šiose vietose. Restriktazės klasifikuojamos į tris tipus. I ir III tipo fermentai
pasižymi DNR modifikuojančiuoju (metilinančiuoju) ir kartu ATP priklausomu restrikciniu aktyvumais.
Abiejų tipų restrikcijos endonukleazės atpažįsta nemetilintas sekas DNR substrate, tačiau I tipo fermentai
hidrolizuoja atsitiktines sekas, o III tipo fermentai hidrolizuoja DNR tik specifinėse vietose.
II tipo fermentai – tai didžiausia restriktazių klasė apimanti aštuonis subtipus [1]. Dažniausiai II tipo
restrikcijos – modifikacijos sistema, sudaryta iš dviejų atskirų fermentų restriktazės ir metilazės. Tačiau IIT
tipo fermentai sudaryti iš dviejų skirtingų subvienetų – restrikcijos ir modifikacijos, IIG tipo fermentai – iš
vieno polipeptido su restrikcijos ir modifikacijos aktyvumais. Buvo išskirta daugiau negu 1000 restriktazių,
priklausančių II tipui. Dauguma iš jų buvo panaudotos molekulinio klonavimo darbuose. Šie fermentai
hidrolizuoja DNR atpažįstamos sekos (taikinio) viduje arba šalia jos. Restrikcijos sekos paprastai sudarytos
iš 4–8 nukleotidų, dažniausiai turinčių simetrinę (palindrominę) struktūrą. Pvz., restriktazė HindIII atpažįsta
restrikcijos tokią seką:

5’-AAGCTT-3’
^
3’-TTCGAA-5’
^
Po skėlimo susidaro DNR fragmentai:

5’-A AGCTT-3’
3’-TTCGA A-5’

Jie turi „lipnius“ galus (atsiranda trumpos, komplementarios viengrandės sekos).
Restriktazė Eco47III atpažįsta seką:

5’-AGCGCT-3’
^
3’-TCGCGA-5’
^

Po skėlimo susidaro fragmentai:

5’-AGC GCT-3’
3’-TCG CGA-5’

Jie turi „bukus“ galus (po hidrolizės nėra viengrandžių komplementarių sekų).
Restriktazė AluI atpažįsta seką:

5’-AGCT-3’
^
3’-TCGA-5’
^

Dauguma restriktazių yra gana labilūs baltymai, todėl saugomi –20 °C temperatūroje specialios
paskirties buferyje, turinčiame savo sudėtyje 50 % glicerolio (kad neužšaltų). Eksperimento metu restriktazės
būtinai dedamos į ledo vonią. Jei fermentą reikia skiesti, naudojamas specialus skiedimo buferis.
Labai svarbus reakcijos buferio komponentas yra Mg
2+
jonai, atliekantys kofaktoriaus vaidmenį beveik
visoms restrikcijos endonukleazėms. Pastaruoju metu restrikcijos reakcijai atlikti parengta ir naudojama
202
unifikuota penkių buferių sistema. Darbui su konkrečia restriktaze rekomenduojamas vienas iš penkių
buferių. Lentelėse lygiagrečiai nurodomas fermento aktyvumas (%) likusiuose keturiuose buferiuose.
Restrikcijos reakcija atliekama rekomenduojamoje temperatūroje, dažniausiai 37 °C, ir nutraukiama
pridedant etilendiaminotetraacto rūgšties (EDTA) jonų, specifiškai surišančių dvivalenčius metalų jonus
(Mg
2+
).
Restriktazės aktyvumo vienetu laikomas toks fermento kiekis, kuris per vieną valandą savo optimalioje
temperatūroje ir buferyje visiškai hidrolizuoja 1µg substratinės DNR, esančios 50 µl bendrojo reakcijos tūrio.

Darbo tikslas

Hidrolizuoti pBR322 DNR restriktazėmis HindIII, Eco47III, AluI ir elektroforeze identifikuoti
susidarančius DNR fragmentus.

Prietaisai

1. Mikrocentrifuga.
2. Elektroforezės aparatas.
3. Srovės šaltinis.
4. Termostatas, 37 °C.
5. Automatinė pipetė, 20 µL.
6. Antgaliai automatinėms pipetėms: geltoni.
7. Ependorfiniai mėgintuvėliai.
8. Vonelė agarozės geliui dažyti.
9. UV šaltinis.
10. Guminės pirštinės.
11. Svarstyklės.
12. Kaitinimo plytelė.
13. Vaizdo dokumentacijos sistema.

Tirpalai

1. Buferis Y/Tango: 33 mM Tris-acetatas (pH 7,9, kai 37 °C), 10 mM Mg-acetatas, 66 mM K-acetatas,
0,1 mg/mL jaučio serumo albumino.
2. Buferis R: 10 mM Tris-HCl (pH 8,5, kai 37 °C), 10 mM MgCl
2
, 100 mM KCl, 0,1 mg/mL jaučio serumo
albumino.
3. Buferis O: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5, kai 37 °C), 10 mM MgCl
2
, 100 mM NaCl, 0,1 mg/mL jaučio
serumo albumino.
4. Dažas mėginiams įnešti į agarozės gelį: 60 % glicerinas, 50 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio mėlis.
5. Etidijaus bromido tirpalas (0,5 µg/mL).
6. pBR322 DNR tirpalas (0,5 mg/mL).
7. Restrikcijos endonukleazės: HindIII, Eco47III, AluI.
8. Buferis elektroforezei: 0,04 M Tris-acetatas (pH 7,5), 0,002 M EDTA.
9. 1,5 % agarozės tirpalas.

Darbo eiga

Nustatyta tvarka supilstomi komponentai:
H
2
O 14 µL,
10xbuferis R, O ar Y/Tango 2 µL,
pBR322 DNR 2 µL,
restriktazė 2 µL.
Lašus surenkame centrifuguodami mikrocentrifugoje 5–10 sek., mėgintuvėlius supurtome ir vėl
centrifuguojame 5–10 sek. Mėgintuvėlius inkubuojame 2 val. 37 °C temperatūroje.
203
Agarozės geliui paruošti atsveriame 0,75 g agarozės, ištirpiname virindami 50 mL elektroforezės
buferio. Kai agarozės tirpalas pasidaro skaidrus, ataušiname iki 50–60 °C ir išliejame į parengtą formą apie
25 mL agarozės tirpalo.
Po 2 val. nutraukiame fermentinę reakciją pridėdami 4 µL dažo, sumaišome ir 12 µL įnešame į agarozės
gelį, esantį elektroforezės aparate. Mėginius įnešame tokia tvarka:
pBR322 DNR (nerestriktuota), su dažu elektroforezei 4 µL,
pBR322+HindIII 12 µL,
pBR322+Eco47III 12 µL,
pBR322+AluI 12 µL,
1 kb DNR fragmentų dydžio standartas 7 µL.
Elektroforezę atliekame 1–1,5 val., esant 100 V įtampai, kol mėlynas dažas nueina du trečdalius gelio
ilgio. Baigus elektroforezę, pirmiausia išjungiamas srovės šaltinis. Gelis išimamas ir įdedamas į vonelę su
etidijaus bromido tirpalu 15 min. Paskui plaunama du kartus iš čiaupo ir vieną kartą distiliuotu H
2
O. Gelis
fotografuojamas UV šviesoje. Jei plazmidinė DNR visiškai hidrolizuota, tai elektroforeograma turi atrodyti
taip, kaip pateikta 1 pav.

Kontroliniai klausimai

1. Apibūdinti sąvoką „lipnūs“ DNR fragmentų galai.
2. Apibūdinti sąvoką „buki“ DNR fragmentų galai.
3. Ką laikome restriktazės aktyvumo vienetu?
4. Koks turi būti fragmentų skaičius, hidrolizavus žiedinę plazmidinę DNR viena, dviem ir trimis
skirtingomis restriktazėmis?


1 2 3 4 5

1 pav. Elektroforetinė pBR322 DNR hidrolizės produktų analizė: 1 – nerestriktuota pBR322 DNR;
2 – pBR322+HindIII; 3 – pBR322+Eco47III; 4 – pBR322+AluI; 5 – 1 kb fragmentų dydžiai bazių poromis (10000,
8000, 6000, 5000, 4000, 3500,3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250)

Atsiskaitymas

Atlikto darbo aprašymas, kuriame pateikiamas DNR restrikcijos produktų elekroforezės gelio vaizdas.

Literatūra

1. Pingoud, A.; Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases, Nucleic Acids
Research, 2001, 29(18):3705–3727.
204
2. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000.
3. Рыбчин, В. Н. Основы генетической инжинерии. Санкт-Петербург: Из-во СПбГТУ, 1999.
4. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold
Spring Harbor Laboratory press, 1989.
5. Льюин, Б. Гены. Москва: Мир, 1987.
6. Sambrook, J. Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor
Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.
7. Short protocols in molecular biology. Ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc.,
1999.
205

3. Plazmidinės DNR išskyrimas ir jos koncentracijos nustatymas
Meilutė Meizeraitytė, Gintautas Žvirblis

Teorinis įvadas

Plazmidės – tai nechromosominiai genetiniai elementai, galintys autonomiškai (atskirai nuo
chromosominės DNR) replikuotis. Tai dvigrandė, žiedinė DNR, kurios dydis gali būti nuo 1 iki 200
kilobazių (kb, arba tūkstančių nukleotidų porų). Kai kurios plazmidės gali integruotis į chromosominę DNR
ir replikuotis kartu su ja. Fenotipiniai požymiai, kuriuos lemia plazmidžių genai, gali būti šie: atsparumas
antibiotikams, kolicinų ir enterotoksinų sintezė, restrikcijos–modifikacijos fermentų sintezė, organinių
junginių hidrolizė bei kai kurie kiti požymiai.
Žinomi du plazmidžių replikacijos tipai: griežtosios arba susilpnintosios replikacijos kontrolės tipai.
Pirmuoju atveju plazmidžių skaičius griežtai kontroliuojamas, ir jų replikacija priklauso nuo šeimininko
chromosominės DNR replikacijos. Todėl bakterinėje ląstelėje būna tik viena arba kelios plazmidės kopijos.
Esant susilpnintai replikacijos kontrolei, plazmidžių kopijų skaičius gali siekti nuo 10 iki 1000 vienoje
ląstelėje. Šiuo atveju kai kurių plazmidžių skaičių galima dar padidinti iki kelių tūkstančių kopijų, naudojant
antibiotiko chloramfenikolo inicijuojamą plazmidės amplifikaciją. Chloramfenikolas sustabdo bakterijos
baltymų sintezę, o plazmidės replikacija nenutrūksta, dėl to santykinai padidėja plazmidės kiekis
chromosominės DNR ir ląstelės baltymų atžvilgiu.
Dauguma plazmidžių išskyrimo metodikų paremtos tuo, kad ląstelėje plazmidės yra stabilios
kovalentiškai sujungtos žiedo formos, be to, jos yra daug mažesnės negu bakterinė chromosominė DNR.
Pvz., Escherichia coli genomas turi 4,7 ⋅ 10
6
bazių porų, o stambiausių plazmidžių – 2 ⋅ 10
5
, bet paprastai
neviršija 10
4
bazių porų. Šiuo metu vienas iš dažniausiai naudojamų plazmidinės DNR išskyrimo metodų yra
šarminės ekstrakcijos, arba Birnboimo-Doly metodas [1] bei įvairios šio metodo modifikacijos. Metodas
paremtas tuo, kad, paveikus ląsteles natrio šarmo ir SDS (natrio dodecilsulfato) tirpalu, jos yra lizuojamos ir
denatūruoja dvigrandės linijinės DNR molekulės (atsiskiria komplementariosios DNR grandinės).
Denatūracija intensyviausiai vyksta su chromosomine bakterijos DNR, o nedidelės plazmidinės DNR
molekulės lieka mažai paveiktos. Šarminis lizato pH pervedamas į rūgštinį, naudojant didelį natrio arba kalio
acetato perteklių. Chromosominės DNR, membraninių baltymų bei SDS kompleksas dėl to iškrenta į
nuosėdas, o plazmidinė DNR lieka ištirpusi supernatante (po nuosėdų centrifugavimo). Stabiamolekulinė
RNR gali būti pašalinama į gautą plazmidės preparatą pridėjus 10 M LiCl ir atšaldžius (priemaišinė RNR
iškrenta į nuosėdas ir atskiriama centrifuguojant) arba kitais atvejais RNR yra degraduojama panaudojus
RNR nukleazę, kuri vėliau pašalinama fenolo ekstrakcijos būdu. DNR reikia saugoti nuo DNR nukleazių
poveikio, kurių nemažai yra ląsteliniuose ekstraktuose. Todėl DNR preparatuose stengiamasi atsikratyti nuo
visų baltymų (kartu ir nukleazių), naudojant fenolinės ekstrakcijos metodą, be to, į daugumą DNR tirpalų yra
pridedami nukleazių inhibitorių, tokių kaip EDTA, kurie suriša nukleazių aktyvumui reikalingus metalų
jonus.

Darbo tikslas

Išskirti plazmidinę DNR (pUC18) iš transformuotojo E. coli RRI kamieno ir nustatyti galutinio DNR
preparato koncentraciją.



Darbo priemonės

1. Laminarinis boksas.
2. Termostatuojama purtyklė.
3. Kriošaldiklis – 70 °C ar žemesnės temperatūros.
4. Šaldoma centrifuga ir minicentrifuga.
5. Spektrofotometras.
6. Automatinės pipetės.
206
7. Eppendorfo tipo mėgintuvėliai.

Tirpalai ir reagentai

1. TE tirpalas: 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA.
2. Lizavimo tirpalas: 0,2 M NaOH, 1 % SDS (natrio dodecilsulfatas).
3. 3 M natrio acetatas, pH 4,8.
4. 10 M LiCl.
5. Etanolis.
6. Izopropanolis.
7. Chloroformas.

Darbo eiga

Biomasės auginimas: Šviežiai transformuotos E. coli RRI kolonijos nuo agaro lėkštelės užsėjamos į
mėgintuvėlį su 5 mL LB terpės ir 100 µg/mL ampicilino. Auginama per naktį +37 °C temperatūroje
intensyviai purtant.
Biomasės suspendavimas: Užaugintos naktinės kultūros centrifuguojamos 5 min. 4000 aps./min.
greičiu Hetticho šaldymo centrifugoje (+4 °C). Supernatantas (skystis virš nuosėdų) atsargiai nupilamas, o
biomasė suspenduojama 200 µl atšaldyto TE buferio ir suspensija perkeliama į vieną Eppendorfo tipo
mėgintuvėlį.
Ląstelių lizavimas: Į 200 µl mL ląstelių suspensijos pridedama šviežiai paruošto lizavimo tirpalo
(400 µl). Atsargiai vartant inkubuojama 5 min. kambario temperatūroje (kt°). Tirpalas pasidaro skaidresnis ir
klampus.
Chromosominės DNR išsodinimas: Į mėgintuvėlius pridedama 300 µl atšaldyto (+4 °C) natrio acetato
ir 30 µl chloroformo. Atsargiai vartant inkubuojama 15 min. ledo vonelėje arba šaldytuve +4 °C.
Chromosominės DNR, membraninių baltymų bei SDS komplekso nuosėdos centrifuguojamos 10 min.
14 000 aps./min. greičiu kt° minicentrifuga.
Plazmidinės DNR išsodinimas (I): Supernatantas nusiurbiamas į švarų Eppendorfo tipo mėgintuvėlį ir
pridedama 0,6 mL izopropanolio (~0,7 tūrio nuo supernatanto tūrio) ir 5 min. vartant inkubuojama kt°. DNR
nuosėdos centrifuguojamos 10 min. 14 000 aps./min. greičiu minicentrifuga kt°.
RNR išsodinimas: Supernatantas kuo švariau nusiurbiamas, o nuosėdos ištirpinamos 200 µl TE,
pridedama 400 µl LiCl tirpalo ir mėgintuvėliai 20 min. šaldomi skystajame azote arba kriogeniniame
šaldytuve (–70 °C arba žemesnėje temperatūroje). Nuosėdos centrifuguojamos 5 min. 14000 aps./min.
greičiu kt° minicentrifuga.
Plazmidinės DNR išsodinimas (II): Supernatantas perkeliamas į naujus mėgintuvėlius ir pridėjus
450 µl izopropanolio šaldomas 10 min. –70 °C. Centrifuguojama 10 min. 14 000 aps./min. greičiu kt°.
minicentrifuga. Supernatantas atsargiai nusiurbiamas (nuosėdų lieka labai nedaug ir jos labilios), o
mėgintuvėliai su nuosėdomis praplaunami 70 % etanoliu. Dar kartą trumpai (1–2 min.) centrifuguojama ir
etanolis sausai nusiurbiamas. Nuosėdos ištirpinamos 50 µl TE buferio.
Spektrofotometrinis DNR koncetracijos nustatymas: DNR koncentracija matuojama
spektrofotometru esant šviesos bangos ilgiui 260 nm.

C
DNR
= A ⋅ E ⋅ R,
čia:
C
DNR
– DNR koncentracija µg/mL;
A – šviesos absorbcija optiniais vienetais (o.v.);
E – ekstinkcijos koeficientas, kuris dvigrandei DNR lygus 50 µg/mL;
R – tiriamojo tirpalo praskiedimas (kartais).
Apskaičiavimo pavyzdys: Prieš matuojant, DNR preparatas buvo atskiestas 100 kartų (į 3 mL
distiliuoto H
2
O pridėta 30 µl analizuojamos plazmidės tirpalo). Nustatyta, kad praskiesto DNR preparato
šviesos absorbcija lygi 0,1 o.v., taigi:

C
DNR
= 0,1 ⋅ 50 ⋅ 100 = 500 µg/mL = 0,5 mg/mL.
207

Kontroliniai klausimai

1. Kokiomis savybėmis pasižymi plazmidė?
2. Kokie yra žinomi plazmidžių replikacijos tipai?
3. Kuo paremtas plazmidinės DNR šarminės ekstrakcijos metodas?
4. Kokius fenotipinius bakterijų požymius nulemia plazmidės?
5. Kokie būna plazmidinės DNR ir bakterinio genomo dydžiai?

Atsiskaitymas

Pateikiamas atlikto darbo aprašymas, kuriame yra nustatyta išskirtos plazmidinės DNR koncentracija.

Literatūra

1. Birnboim, H. C.; Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.
Nucleic Acids Res., vol. 7, 1979, p. 1513–1523.
2. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000.
3. Рыбчин, В. Н. Основы генетической инжинерии. Санкт-Петербург: Из-во СПбГТУ, 1999.
4. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold
Spring Harbor Laboratory press, 1989.
5. Sambrook, J.; Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor
Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.
6. Short protocols in molecular biology. Ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc.,
1999.
208

4. Plazmidinės DNR ligavimas
Valerija Chmieliauskaitė, Gintautas Žvirblis

Teorinis įvadas

Fermentai, naudojami sujungti dviem fragmentams DNR, yra vadinami DNR ligazėmis. Genų
inžinerijoje parastai naudojamos dviejų rūšių DNR ligazės: bakteriofago T4 DNR ligazė ir E. coli DNR
ligazė. Dirbant su pastarąja, būtinas kofaktorius NAD
+
, o norint sujungti „bukus“ galus, būtina pridėti
polietilenglikolio arba fikolio (šie komponentai sumažina reakcijos tūrį, kartu padidėja liguojamųjų
fragmentų galų koncentracija). E. coli DNR ligazė buvo panaudota cDNR klonavimo darbuose. Paprastai šis
fermentas nėra plačiai naudojamas, kadangi daug efektyvesnė T4 bakteriofago DNR ligazė, gebanti sujungti
„bukus“ DNR fragmentų galus netgi nesant polietilenglikolio. Taigi molekulinio klonavimo eksperimentuose
dažniausiai naudojama bakteriofago T4 DNR ligazė yra skiriama iš bakteriofagų T4 infekuotų E. coli
ląstelių. Tai 68 kDa dydžio polipeptidas, katalizuojantis fosfodiesterinio ryšio susiformavimą tarp DNR
3’-OH ir 5’-fosfatinės grupių. Ši ligazė gali būti panaudota:
• DNR fragmentams su „lipniais“ galais sujungti – suliguoti, pvz.:

5’ -pApCpG
OH
pApApTpTpCpGpT- 3’
3’ -TpGpCpTpTpApAp
HO
GpCpAp- 5’

↓ ↓↓ ↓ + Mg
2+
, ATP, bakteriofago T4 DNR ligazė

5’ -pApCpGpApApTpTpCpGpT- 3’
3’ -TpGpCpTpTpApApGpCpAp- 5’

• Sujungti DNR molekulėms, turinčioms „bukus“ galus, viena su kita arba su sintetiniais linkeriais, pvz.:

5’ -pCpGpA
OH
pCpGpTpA- 3’
3’ -GpCpTp
HO
GpCpApTp- 5’

↓ ↓↓ ↓ + Mg
2+
, ATP, bakteriofago T4 DNR ligazė

5’-pCpGpApCpGpTpA- 3’
3’ -GpCpTpGpCpApTp- 5’

• Trūkių dvigrandėje DNR, RNR arba DNR – RNR hibride reparacijai.

Suliguoti galima tik DNR fragmentus, turinčius suderinamus „lipnius“ galus, t. y. sujungti DNR
fragmentus, turinčius „EcoRI – lipnius“ galus, arba „HindIII – lipnius“ galus ir t. t. Negalima suliguoti DNR
fragmento, turintčio „lipnų – EcoRI“ galą su DNR fragmentu, turinčiu „lipnų – HindIII“ galą ir t. t.
Bakteriofago T4 DNR ligazė gali sujungti bet kokius „bukus“ galus.
Bakteriofago T4 DNR ligazės neinhibuoja reakcijos mišinyje esantys dNTP
(dezoksiribonukleozidtrifosfatai), be to, ligavimo reakciją galima atlikti buferiuose, naudojamose restrikcijos
endonukleazėms. Šį fermentą inhibuoja NaCl ir KCl druskos, jei jų koncentracijos viršija 200 mM. Paprastai
liguojama 15–22 °C temperatūroje 0,5–2 val. Jeigu norima gauti kuo daugiau rekombinantinių klonų arba
ligavimas 15–22 °C temperatūroje buvo nepilnas, tai liguojama 4 °C temperatūroje per naktį. Jei norima
sujungti „bukus“ galus, dedama dvigubai daugiau ligazės.

Darbo tikslas

Suliguoti plazmidinę DNR pUC19, hidrolizuotą restrikcijos endonukleaze HindIII, naudojant
bakteriofago T4 DNR ligazę, ir elekroforezės būdu patikrinti ligavimo efektyvumą.

209
Prietaisai

1. Mikrocentrifuga.
2. Elektroforezės aparatas.
3. Srovės šaltinis.
4. Automatinės pipetės: 20 µL, 200 µL.
5. Geltoni antgaliai automatinėms pipetėms.
6. Ependorfiniai mėgintuvėliai.
7. Vonelė agarozės geliams dažyti.
8. UV šaltinis.
9. Vaizdo dokumentacijos sistema.
10. Svarstyklės.
11. Maišyklė.
12. Guminės pirštinės.
13. Kaitinimo plytelė.

Tirpalai

1. Buferis T4 DNR ligazei: 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl
2
, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (pH 7,8 esant
25 °C).
2. Plazmidinės DNR pUC19 + HindIII tirpalas: 0,1 mg/mL.
3. T4 DNR ligazė: 5 vienetai/µL.
4. Dažas mėginiams įnešti į agarozės gelį: 60 % glicerinas, 50 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio mėlis.
5. Etidijaus bromido tirpalas: 0,5 µg/mL.
6. Buferis elektroforezei: 40 mM Tris-acetatas (pH 7,5), 2 mM EDTA.
7. 1 % agarozės tirpalas.

Darbo eiga

Nustatyta tvarka supilstomi komponentai:
H
2
O 39 µL,
10 x buferis ligazei 5 µL,
DNR (pUC19 + HindIII) 5 µL,
T4 DNR ligazė 1 µL.
Lašus surenkame centrifuguodami mikrocentrifugoje 5–10 sek., mėgintuvėlį supurtome ir vėl
centrifuguojame 5–10 sek. Reakcijos mišinį inkubuojame 22 °C temperatūroje 0,5 val. Fermentinę reakciją
nutraukiame pridėdami 10 µL dažo, sumaišome ir 12 µL įnešame į agarozės gelį.
Agarozės geliui paruošti atsveriame 0,5 g agarozės, ištirpiname virindami 50 mL elektroforezės buferio,
ataušiname iki 50–60 °C ir išpilame į parengtą formą apie 25 mL agarozės tirpalo.
Mėginius į agarozės gelį įnešame tokia tvarka:
pUC19 DNR (nerestriktuota), su dažu 12 µL,
pUC19 DNR + HindIII, su dažu 12 µL,
reakcijos mišinys po ligavimo 12 µL.
Elektroforezę atliekame 1–1,5 val., esant 100 V įtampai, kol mėlynas dažas nueina du trečdalius gelio
ilgio. Baigus elektroforezę, pirmiausia išjungiamas srovės šaltinis. Gelis išimamas ir dedamas į vonelę su
etidijaus bromido tirpalu 10–15 min. Paskui plaunama du kartus iš čiaupo ir vieną kartą distiliuotu vandeniu.
Jei ligavimas įvyko, tai elektroforeograma turi atrodyti taip, kaip pateikta 1 pav.

Kontroliniai klausimai

1. Kokią reakciją katalizuoja DNR ligazės?
2. Kokius DNR fragmentų galus gali sujungti bakteriofago T4 DNR ligazė?
3. Kokius DNR fragmentų galus laikome suderinamais ligavimui?
4. Kokius DNR fragmentų galus laikome nesuderinamais ligavimui?

210

1 2 3

1 pav. Elektroforetinė pUC19 DNR ligavimo produktų analizė: 1 – nerestriktuota pUC19 DNR; 2 – pUC19 DNR +
HindIII; 3 – pUC19 DNR + HindIII + T4 DNR ligazė

Atsiskaitymas

Atlikto darbo aprašymas, kuriame pateikiamas vaizdo dokumentacijos sistema remiantis gautas ligavimo
produktų elekroforezės gelio vaizdas.

Literatūra

1. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000.
2. Рыбчин, В. Н. Основы генетической инжинерии. Санкт-Петербург: Из-во СПбГТУ, 1999.
3. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold
Spring Harbor Laboratory press, 1989.
4. Льюин, Б. Гены. Москва: Мир, 1987.
5. Sambrook; J. D.; Russell, W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor
Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.
6. Short protocols in molecular biology, ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc.,
1999.
211

5. Ekspresinės plazmidės palaikymas E. coli kamiene ir jos stabilumo
kontrolė
Meilutė Meizeraitytė, Gintautas Žvirblis

Teorinis įvadas

Po ekspresinės plazmidės transformacijos į tinkamą E. coli kamieną gaunamas reikalingo baltymo
producentas, kurio ekspresines ir kitas biologines sąvybes būtina stabiliai išlaikyti. Be to, svarbu nustatyti, ar
producento ekspresinė plazmidė yra stabiliai išlaikoma E.coli kamiene jo kultyvavimo metu.
Pagrindiniai metodai, naudojami producentų ilgalaikiam palaikymui, būtų šie:
• mikroorganizmų liofilizacija (užšaldytų preparatų arba skysčio išdžiovinimas vakuume);
• mikroorganizmų kultūrų laikymas ant agarizuotos terpės po vazelino arba parafino sluoksniu;
• kriogeninis konservavimo metodas, t. y. producento užšaldymas ultražemoje temperatūroje (nuo –70 °C
iki –196 °C).
Pastaruoju metu populiarus ir atskiro plazmidės bei E. coli kamieno konservavimo metodas, atliekant
transformaciją prieš pat producento kultyvavimą.
Dažnai naudojamas kriogeninis konservavimas atliekamas užšaldant dviem arba trimis etapais: pirmuose
etapuose naudojant lėtąjį užšaldymą (ne greičiau kaip 1 °C/min.) iki –25 °C, o toliau šaldant greitai iki –
70 °C arba –196 °C. Ląstelių gyvybingumui reikšmės turi ne tik šaldymo greitis bei temperatūra, bet ir
atšildymo greitis, apsauginės terpės sudėtis. Užšaldomas ląsteles nuo žuvimo gerai saugo 10–20 % glicerinas
arba sacharozė. Mikroorganizmai dažniausiai atšildomi greitai.
Svarbi kiekvieno gero producento sąvybė yra stabilus savo ekspresinės plazmidės išlaikymas E. coli
kamiene. Producentai, kurie kultyvavimo metu pameta plazmides arba jų fragmentus, vėliau negali
produkuoti pakankamai didelio rekombinantinio baltymo kiekio. Plazmidės paprastai turi atsparumo
antibiotikui geną. Kadangi producentas kultyvuojamas terpėje su tuo antibiotiku, tai ląstelės, pametusios
plazmidę arba atsparumo antibiotikui geną, žūva. Tačiau, jei tokių ląstelių dalis yra pakankamai didelė (10 %
ir daugiau), tai pastebimai sulėtina producento augimo greitį ir pablogina jo kultyvavimo sąlygas bei
rekombinantinio baltymo išeigą. Taigi, patikrinus producento plazmidės stabilumą, galima įvertinti jo
kokybę ir kai kuriais atvejais nustatyti mažos rekombinantinio baltymo išeigos priežastį.
Producento plazmidės stabilumas gali būti nustatomas replikų metodu arba titruojant išaugusių ląstelių
skaičių terpėse, pridėjus ir nepridėjus antibiotikų. Replikų būdu tiriant plazmidės stabilumą, atskiros
producento kolonijos yra pernešamos nuo agarizuotos terpės be antibiotikų ant terpės su antibiotikais, kurių
atsparumo geną neša analizuojama ekspresinė plazmidė. Skaičiuojamas kolonijų kiekis (ne mažiau kaip
100), išaugęs po 18 val. ant abiejų tipų lėkštelių. Nustatomas kolonijų, neišaugusių ant terpės su antibiotikais
skaičius ir lyginamas su skaičiumi kolonijų, užaugusių ant terpės be antibiotikų. Šis santykis ir rodo
tiriamojo producento plazmidės stabilumo procentą.
Nustatant producento plazmidės stabilumą titravimo būdu, įvairaus praskiedimo ląstelių suspensijos yra
išsėjamos ant agarizuotosios terpės, pridėjus ir nepridėjus antibiotikų, kurių atsparumo geną koduoja
ekspresinė plazmidė. Suskaičiavus kolonijas, užaugusias ant abiejų rūšių terpės, randamas bakterijų titras.
Daroma prielaida, kad iš vienos gyvybingos ląstelės išauga viena kolonija ant agarizuotosios terpės.
Mikrobiologiniu titru vadinamas mikroorganizmo gyvybingų ląstelių skaičius tūrio vienete (mL), kuris
nustatomas pagal formulę:


V
A
T
n
10 ⋅
= ,
čia:
T – mikrobiologinis titras (ląst./mL);
A – vidutinis kolonijų skaičius;
10
n
– praskiedimo laipsnis;
V – užsėtos suspensijos tūris (mL).
Norint gauti statistiškai patikimą titrą, būtina suskaičiuoti ne mažiau kaip trijų lėkštelių kolonijas
kiekvienam analizuojamam praskiedimui. Nustatant aritmetinį titro vidurkį, rekomenduojama skaičiuoti tų
lėkštelių kolonijas, kuriose yra nuo 30 iki 300 kolonijų.
212

Darbo tikslas

Patikrinti producento plazmidės stabilumą kultyvavimo metu po transformacijos ar konservavimo.

Prietaisai

1. Laminarinis boksas.
2. Termostatuojama purtyklė.
3. Kriošaldiklis –70 °C ar žemesnės temperatūros.
4. Automatinės mikropipetės su steriliais antgaliais (200 µl ir1000 µl).
5. Sterilios Petri lėkštelės.
6. Sterilios pipetės: 2 mL, 10 mL.
7. Sterilūs mėgintuvėliai, 15 mL.
8. Sterilios stiklinės lazdelės (glaistikliai).

Tirpalai

1. Sterilus fiziologinis tirpalas – 0,15 M (0,87 %) NaCl.
2. Sterili skystoji LB terpė – mielių ekstraktas 5 g/L, triptonas 10 g/L, 10 g/L NaCl.
3. Strerili agarizuotoji LB terpė – agaras 15 g/L skystojoje LB terpėje.
4. Kanamicino sulfato tirpalas steriliame H
2
O 30 mg/mL.
5. Konservuotas (užšaldytas) žmogaus augimo hormono producento preparatas.

Darbo eiga

Konservuota (užšaldyta) žmogaus augimo hormono producento kultūra su rekombinantine ekspresine
plazmide pET28-hGH (mėgintuvėliai po 1 mL) perkeliama į kambario temperatūrą, kur ji per 15–25 min.
atšyla. Naudojant 1 mL konservuotos kultūros laminariniame bokse sterilia pipete inokuliuojama (užsėjama)
kolbutė su 50 mL sterilios LB terpės ir kanamicinu (30 µg/mL). Kultivuojama termostatuojamoje purtyklėje
200 aps./min. greičiu 2 val. 37 °C temperatūroje.
Kol kultūra auga, yra paruošiamos Petri lėkštelės su agarizuotąja LB terpe: po 6 lėkšteles su kanamicinu
(30 µg/mL) ir 6 lėkštelės be antibiotikų. Be to, paruošiami mėgintuvėliai kultūrai skiesti. Mėgintuvėliai
sunumeruojami po šešis ir į kiekvieną iš jų įpilama po 9 mL fiziologinio tirpalo. Visos procedūros atliekamos
laminariniame bokse.
Praėjus dviem kultivavimo valandoms, kai suspensijos optinis tankis, esant 550 nm šviesos bangos
ilgiui, pasiekia vienetą (tai apie 10
8
ląstelių mililitre suspensijos), kultūrinis skystis (1 mL) yra steriliai
perkeliamas į pirmąjį mėgintuvėlį su fiziologiniu tirpalu. Skysčiai gerai išmaišomi mikropipete ir procedūra
kartojama nuosekliai (po 1 mL praskiestos kultūros pernešama vis į kitą mėgintuvėlį) iki šeštojo
mėgintuvėlio imtinai. Tada 0,1 mL ląstelių suspensijos iš penktojo ir šeštojo mėgintuvėlių išsėjama ant
paruoštų Petri lėkštelių, po tris lėkšteles kiekvienam praskiedimui. Glaistikliu atsargiai ir nespaudžiant,
sklaidoma ląstelių suspensija ant agarizuotosios terpės paviršiaus, kol visiškai išdžiūsta. Lėkštelės
inkubuojamos termostate 37 °C temperatūroje 18 val. Rezultatai surašomi į lentelę:












213

Terpė Praskiedimas Mikrobiologinio titro vidurkis
(kolonijos/mL) 10
5
10
6

LB 1. t
1

2. t
2

3. t
3

3
3 2 1
5
t t t
T
+ +
=
1. t
1

2. t
2

3. t
3

3
3 2 1
6
t t t
T
+ +
=

2
6 5
T T
T
vid
+
=
LB + kan 1. t
1

2. t
2

3. t
3

3
3 2 1
5
t t t
T
kan
+ +
=
1. t
1

2. t
2

3. t
3

3
3 2 1
6
t t t
T
kan
+ +
=

2
6 5 kan kan
vidkan
T T
T
+
=

čia: t
1
, t
2
, t
3
– titrai, suskaičiuoti iš trijų skirtingų Petri lėkštelių;
T – titrų vidurkiai.
Ekspresinės plazmidės stabilumas apskaičiuojamas pagal formulę:

100 ⋅ =
vid
vidkan
T
T
Stabilumas %.

Atsiskaitymas

Pateikiamas atlikto darbo aprašymas, kuriame apskaičiuojamas analizuotos ekspresinės plazmidės
stabilumas.

Kontroliniai klausimai

1. Kaip apibūdintumėte producentą?
2. Kokie yra producentų konservavimo būdai?
3. Kas yra mikrobiologinis titras ir kaip jis skaičiuojamas?
4. Kokie yra plazmidės stabilumo kontrolės metodai?

Literatūra

1. Lewin, B. Genes VII. Oxford University Press, 2000.
2. Рыбчин, В. Н.. Основы генетической инжинерии. Санкт-Петербург: Из-во СПбГТУ, 1999.
3. Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold
Spring Harbor Laboratory press, 1989.
4. Льюин, Б.; Гены. Москва: Мир, 1987.
5. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. Москва: Мир, 1976.
6. Sambrook, J.; Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor
Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.
7. Short protocols in molecular biology, ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc.,
1999.

214
6. Polimerazinė grandininė reakcija (PGR)
Valerija Chmieliauskaitė, Gintautas Žvirblis

Teorinis įvadas

Polimerazinė grandininė reakcija (PGR, dažnai vartojamas ir PCR trumpinimas – Polimerase Chain
Reaction) – metodas, naudojamas specifinės DNR sekos amplifikacijai (padauginimui) in vitro. Metodo
esmė: naudojant du specifinius pradmenis, komplementarius pasirinktai matricinės DNR sekai, termostabilią
DNR polimerazę bei DNR matricą, keičiami temperatūrų ciklai nuo DNR denatūracijos iki polimerizacijos
temperatūrų. Šių kintančių temperatūrinių ciklų rezultatas – milijonus kartų amplifikuotas DNR fragmentas,
apribotas dviem pasirinktais pradmenimis ir tiksliai atitinkantis matricinės DNR seką tarp šių pradmenų
(1 pav.).


































1 pav. Polimerazinės grandininės (ciklinės) reakcijos schema

Metodo principus labai išsamiai aprašė Khorana, o 1985 m. Saiki pritaikė praktiškai amplifikacijos
reakcijoje panaudodamas DNR polimerazės Klionovo (Klenow) fragmentą. Kadangi šis fermentas
inaktyvuojasi denatūracijos temperatūroje (94 °C), tai kiekvieno naujo ciklo metu reikėdavo pridėti šviežią
fermento porciją. Geri rezultatai būdavo tik tuomet, kai tekdavo amplifikuoti mažus DNR fragmentus
(< 200bp), o amplifikuojant didelius fragmentus, išeiga smarkiai sumažėdavo, be to, fragmentai būdavo
heterogeniški pagal dydį. Visas problemas pavyko išspręsti, kai 1988 m. Saiki [1] amplifikacijai pritaikė
termostabilią Taq DNR polimerazę, išskirtą iš bakterijų Thermus aquaticus. Fermento aktyvumo pusperiodis
25− −− −40 ciklai
215
yra maždaug 40 min. 95 °C temperatūroje. Taip modernus PGR metodas tapo vienu iš dažniausiai
naudojamų molekulinės biologijos metodų. Tai atsitiko visai pagrįstai, kadangi PGR – greitas, gana
nebrangus būdas gauti mikrograminius kiekius DNR fragmento nuo labai mažo kiekio DNR matricos:
panaudojus 10
-6
µg matricinės DNR ir atlikus 30–35 PGR ciklus, galima tikėtis nuo 0,5 µg iki 1 µg
amplifikacijos produkto, kurio ilgis gali siekti kelis tūkstančius bazių porų.
Polimerazinė grandininė (ciklinė) reakcija yra naudojama genetiniams susirgimams ir vėžiui
diagnozuoti, patogeninių mikroorganizmų ir virusų detekcijai, teisminei ekspertizei ir t. t. Daugelio pasaulio
mokslinių laboratorijų PGR naudojama tokiems rutininiams darbams atlikti, kaip klonų analizavimas,
restrikcinių žemėlapių sudarymas (kartiravimas), subklonavimas, DNR sekos nustatymas (sekvenavimas),
mutagenezė ir t. t. Pastaraisiais metais ši technika dažnai naudojama atliekant molekulinio klonavimo
eksperimentus. Metodo silpnoji vieta – klaidos, pasitaikančios amplifikuotame fragmente. Įrodyta, jog Taq
DNR polimerazės įjungiamo neteisingo nukleotido dažnis – 2x10
-4
nukleotido vienam ciklui. Šis dažnis 4
kartus didesnis nei dirbant su DNR polimerazės Klionovo fragmentu. Atliekant 30 ciklų amplifikaciją,
klaidos dažnis gali sudaryti iki 0,25 %. Kuo didesnė Mg
2+
ir dNTP koncentracija, tuo didesnė klaidų
tikimybė. PGR vykdyti gali būti panaudojamos ir kai kurios kitos termostabilios DNR polimerazės (Tth,
Vent, Pfu, Tfl, Tli), darančios mažiau klaidų negu Taq polimerazė.
Pradedant PGR pirmiausia reikia denatūruoti DNR matricą (1–4 min., 94 °C–95 °C). Vėliau atliekama
25–40 ciklų, kurių kiekvienas susideda iš:
1. Matricinės DNR denatūracijos stadijos (1–2 min., 94 °C–95 °C).
2. Pradmenų specifinio (komplementaraus) prisijungimo (hibridizacijos) su martricos DNR (annealing)
stadijos. Paprastai naudojama temperatūra yra 3–5 laipsniais mažesnė už duplekso (pradmuo –
viengrandė DNR matrica) lydymosi temperatūrą T
m
. Inkubuojama 1–2 min. Jei pradmuo trumpesnis nei
25 nukleotidai, T
m
apskaičiuojama pagal empirinę formulę:

T
m
= 4(G + C) + 2(A + T),

čia G, A, T, C – atitinkamų nukleotidų skaičius pradmenyje. Pvz., pradmens CTG CAT ATG ACA CCT
TTA GG lydymosi temperatūra yra lygi: T
m
= 4(4 + 5) + 2(5 + 6) = 58 °C.
3. Komplementarios matricai DNR sintezės arba polimerizacijos stadijos (72 °C). Sintezės greitis
2–4 kb/min. 1 minutės praktiškai pakanka 2 kb ilgio PGR produktui susintetinti. Jeigu reikia
amplifikuoti didesnius fragmentus, kiekvienam 1000 bp sintezės trukmę pailginame 1 min. Pasibaigus
paskutiniam sintezės ciklui, mėginiai yra papildomai inkubuojami 5–15 min., kad Taq polimerazė
užpildytų pasilikusius viengrandžius amplifikuotojo produkto galus. Šios inkubacijos metu Taq DNR
polimerazė prideda papildomą (nekomplementarų) A nukleotidą produkto 3’-gale, kuris gali būti
panaudojamas tolesniam gautojo fragmento įklonavimui į reikiamą vektorių.
Atliekant PGR labai svarbu teisingai parinkti pradmenų porą:
Turi būti subalansuotas A/T ir G/C kiekis, panašus abiem pradmenims, be to, G/C ne mažiau kaip 40 %.
• Neturi būti stiprios vidinės pradmenų antrinės struktūros (vidinio komplementarumo).
• Tarp abiejų pradmenų neturi būti komplementarumo.
Optimali pradmenų koncentracija: 0,1–1 µM. Optimali Mg
2+
koncentracija parenkama kiekvienam
eksperimentui. Rekomenduojama Mg
2+
koncentracija yra 1–4 mM. Įrodyta, kai dNTP galutinė koncentracija
– 0,2 mM, optimali Mg
2+
jonų koncentracija – 1,5 mM. Paprastai 100 µL reakcijos mišinio imama 0,5–2,5
vieneto Taq DNR polimerazės. Pridėjus daugiau fermento, gaunama nespecifinių reakcijos produktų. Jeigu
būtina (naudojamas termocikleris nekaitina mėgintuvelių viršaus), ant reakcijos mišinio užsluoksniuojama
mineralinė alyva, kad neišgaruotų reakcijos turinys.

Darbo tikslas

Amplifikuoti E. coli chromosominės DNR 250 bazių porų ilgio fragmentą, naudojant polimerazinės
grandininės reakcijos metodą.

Prietaisai

1. Mikrocentrifuga.
2. Maišyklė.
216
3. Termocikleris.
4. Elektroforezės aparatas.
5. Nuolatinės srovės šaltinis.
6. Kaitinimo plytelė.
7. Automatinė pipetė, 20 µL.
8. Antgaliai automatinei pipetei: geltoni.
9. Ependorfiniai mėgintuvėliai, 0,5 mL.
10. Vonelė agarozės geliams dažyti.
11. UV šaltinis.
12. Vaizdo dokumentacijos sistema.
13. Guminės pirštinės.
14. Svarstyklės.

Tirpalai ir reagentai

1. 10xPCR buferis: 100 mM Tris-HCl (pH 8,8, kai 25 °C), 500 mM KCl, 15 mM MgCl
2
, 0,8 % Nonidet
P-40.
2. 4 dNTP (dezoksiribonukleozidtrifosfatų) mišinys: 2 mM kiekvieno.
3. MgCl
2
25 mM.
4. Oligonukleotidinis pradmuo 1, komplementarus E. coli 23S rRNR genui, 2 µM:
5’ CAA-ATC-CGG-AAA-ATC-AAG-GCT-GA 3’.
5. Oligonukleotidinis pradmuo 2, komplementarus E. coli 23S rRNR genui, 2 µM:
5’ TCC-ATC-CGC-GAG-GGA-CCT-CAC-CT 3’.
6. DNR matrica − plazmidinė DNR.
7. Termostabili Taq DNR polimerazė su jaučio serumo albumino priedu: 5 vienetai/µL.
8. Dažas mėginiams, dedamiems į agarozės gelį: 60 % glicerinas, 50 mM EDTA, 0,05 % bromfenolio
mėlis.
9. Etidijaus bromido tirpalas: 0,5 µg/mL.
10. Buferis elektroforezei: 0,04 M Tris-acetatas (pH 7,5), 0,002 M EDTA.
11. 2 % agarozės tirpalas.

Darbo eiga

Į vieną mėgintuvėlį nustatyta tvarka supilstomi komponentai:
dejonizuotasis H
2
O 21 µL,
10xPCR buferis 5 µL,
MgCl
2
3 µL,
dNTP 5 µL,
1 pradmuo 5 µL,
2 pradmuo 5 µL,
plazmidinė DNR 5 µL,
Taq DNR polimerazė 1 µL.
Į kitą mėgintuvėlį supilstomi komponentai tokia pat tvarka, tik vietoje plazmidinės DNR pripilame 5 µL
H
2
O (neigiama kontrolė). Lašus surenkame centrifuguodami mikrocentrifugoje 5–10 sek., mėgintuvėlius
supurtome ir vėl centrifuguojame 5–10 sek. Pradinė denatūracija – 4 min. 94 °C temperatūroje, o toliau – 25
ciklai, kurių kiekvienas susideda iš:
matricinės DNR denatūracijos 1 min., 94 °C,
pradmenų specifinio susirišimo su DNR 1 min., 65 °C,
DNR sintezės (polimerizacijos) 1 min., 72 °C.
Paskutinio ciklo DNR grandinių sintezė vyksta 10 minučių 72 °C.
Agarozės geliui paruošti atsveriame 1 g agarozės, ištirpiname virindami 50 mL elektroforezės buferio.
Kai agarozės tirpalas pasidaro skaidrus, ataušiname iki 50–60 °C ir išpilame į parengtą formą apie 25 mL
agarozės tirpalo.
PGR pasibaigus 10 µL amplifikacijos mišinio sumaišome su 2 µL dažo ir įdedame į agarozės gelį.
Mėginius dedame tokia tvarka:
217
amplifikacijos mišinys (be DNR) 12 µL,
amplifikacijos mišinys (su DNR) 12 µL,
pBR322 DNR/AluI fragmentų DNR dydžio standartai 7 µL.
Elektroforezę atliekame 1–1,5 val., esant 100 V įtampai, kol mėlynas dažas nueina du trečdalius gelio
ilgio. Baigus elektroforezę, pirmiausia išjungiamas srovės šaltinis. Gelis išimamas ir dedamas į vonelę su
etidijaus bromido tirpalu 10–15 min., plaunamas 3 kartus distiliuotu vandeniu. Gelis fotografuojamas UV
šviesoje, naudojant vaizdo dokumentacijos sistemą. Jei PGR įvyko, tai elektroforezės gelyje matysime 250
bp dydžio fragmentą (amplifikacijos mišinys su DNR, 2 pav.).

Kontroliniai klausimai

1. Kodėl PGR metodas naudoja termostabilią polimerazę?
2. Kodėl reikalingas pradinis DNR matricos denatūravimas?
3. Kodėl naudojamas būtent toks PGR ciklų eiliškumas?
4. Kaip apskaičiuojama pradmens lydymosi temperatūra T
m
?
5. Kur naudojamas PGR metodas?


1 2 3

2 pav. Elektroforetinė PGR produktų analizė: 1 – amplifikacijos mišinys be matricinės DNR (neigiama kontrolė);
2 – amplifikacijos mišinys (su DNR); 3 – pBR322 DNA / AluI marker (MBI Fermentas) − DNR standartai (908, 659,
656, 521, 403, 281, 257, 226, 100, 90 bp)

Atsiskaitymas

Atlikto darbo aprašymas, kuriame pateikiamas PGR produktų elekroforezės gelio vaizdas.

Literatūra

1. Saiki, R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S. et al. 1988, Primer-directed enzymatic amplification of DNA
with a thermostable DNA polymerase. Science, 239: 487–491.
2. Sambrook, J.; Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual, third edition. Cold Spring Harbor
Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.
3. Short protocols in molecular biology, ed. F. M. Ausubel et al., 4th edition, John Wiley & Sons, Inc.,
1999.

218
Chromatografijos pagrindai
Laboratoriniai darbai
Vilma Michailovienė

1. Baltymų jonų mainų chromatografija

Darbo tikslas
Atlikti jaučio chimotripsinogeno (pI = 9,5) ir kiaušinio lizocimo (pI = 11,0) mišinio atskyrimą ant
stipraus katijonito − S-sefarozės

Darbo priemonės

Kolonėlė, spektofotometras, grandientatorius, chromatografinė aparatūra, automatinės pipetės.

Paruošiamieji darbai

1. Sorbento S-Sefarozė paruošimas.
Chromatografinė kolonėlė (skersmuo 10 mm, ilgis 10 cm) pripildoma 5,0 mL vandeniu nudekantuoto
sorbento. Per kolonėlę 40 mL/h greičiu praleidžiamas 0,001 N HCl vandeninis tirpalas, pH 3,0 (ne
mažiau kaip 10 tirpalo tūrių sorbento tūriui), nuo rūgšties atplaunama dejonizuotu vandeniu. Kolonėlė
nupusiausvyrinta 50 mL 20 mM Na fosfatiniu buferiu pH 6,0.

2. Buferinių tirpalų ruošimas
2.1. 20 mM Na fosfatas,pH 6,0, − 150 mL, (buferis-1).
2.2. 20 mM Na fosfatas, pH 6,0, turintis 0,8 M natrio chlorido (buferis-2)

3. Baltymų mišinio ruošimas
Po 10,0 mg chimotripsinogeno ir lizocimo atsveriama analitinėmis svarstyklėmis ir tirpinama 10,0 mL
buferiu 1. Matuojama bendroji baltymo koncentracija mišinyje (Bradfordo metodu, 5x skiestam tirpalui)

Darbo eiga

Baltymų mišinio pavyzdys įvedamas į kolonėlę 37,5 mL/h greičiu peristaltiniu siurbliu ir sorbentas
plaunamas buferiu-1 (5 tūriai/sorbento tūriui), renkant eliuato frakcijas (≅ 5 mL) kas 8 min. Sorbuotojo
baltymų mišinio dalis desorbuojama linijiniu NaCl gradientu iki 800 mM, esant bendram gradiento tūriui
50 mL (25 mL buferio 1 ir 25 mL buferio 2). Gradientinės eliucijos frakcijose (tūris 3,5 mL, rinkimo
laikas kas 6 min.)) matuojama baltymo koncentracija Bradfordo metodu. Baltymo koncentracijai matuoti
mėginiai iš gradiento frakcijų skiedžiami buferiniu tirpalu 1: frakcijai Nr. 6 − matuojama neskiedus,
frakcijoms Nr. 7−11 praskiedus mėginį − 5x ir frakcijoje 12 − neskiedus. Apkaičiuojamas bendrasis
desorbuotojo baltymo kiekis. Jo santykis su įvestu į kolonėlę baltymo kiekiu rodo baltymo desorbcijos
išeigą.

Atliktų matavimų lentelė

Fr.nr. Fr. tūris, mL Optinis tankis Konc., mg/mL Praskiedimas Baltymų
kiekis, mg


Atsiskaitymas

1. Chromatograma, detektuojanti eliuato absorbcijos, esant 280 nm, kitimą nuo chromatografijos
pradžios iki gradientinės eliucijos pabaigos.
2. Baltymo koncentracija NaCl gradiento frakcijose ir bendras desorbuoto baltymo kiekis
3. NaCl koncentracija, kuriai esant pasirodo maksimalios chimotripsinogeno ir lizocimo koncentracijos,
detektuojant eliuato absorbciją esant 280 nm.
219

Literatūra

Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Москва: Наука, 1985, c. 249−330.

2. Biomolekulių pasiskirstymas vandeninėse fazinėse sistemose

Darbo tikslas

Atlikti žmogaus serumo albumino (ŽSA) pasiskirstymą dvifazėje sistemoje PEG/dekstranas.
Nustatyti baltymo pasiskirstymo koeficientų pokyčius. Suskaičiuoti baltymo išeigą kiekvienoje dvifazėje
sistemoje.

Darbo priemonės

Spektrofotometras, svarstyklės, pH-metras, pipėtės,automatinės pipėtės,centrifūga.

Tirpalai

40 % (svorio procentai) polietilenglikolio PEG 6000 (molek. masė 6000−7500) tirpalas vandenyje −
50 mL.
20 % (svorio procentai) dekstrano (molek. masė 60 000) tirpalas vandenyje − 50 mL. Paruoštas
tirpalas užvirinamas ir iškarto atšaldžius laikomas +4 °C,
40 % (svorio procentai) PEG-dažas, tirpalai vandenyje po 2 mL tirpalo kiekvienam konjugatui,
0,2 M natrio fosfatinis buferis, pH 7,0−10−20 mL,
20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,0−100 mL,
ŽSA tirpalas 20 mM fosfatiniame buferyje, pH 7,0, baltymo koncentracija 5,5−6,0 mg/mL – 5,0 mL.

Fazinių sistemų ruošimas

Darbui naudojama dvifazės sistemos sudėtis – 6,5 % (svorio procentai) PEG/ 10 % (svorio procentai)
dekstranas. Fazinės sistemos svoris – 4,0 g.

Fazinės sistemos sudėties skaičiavimo pavyzdys

Skaičiuojamas PEG (grynosios medžiagos) kiekis, reikalingas nurodytos sudėties 4,0 g svorio fazinei
sistemai paruošti:
6,5 g  100 g,
X  4 g , X = 0,26 g.

Kadangi PEG tirpalas yra 40 % koncentracijos, perskaičiuojamas jo svoris, reikalingas 4,0 g fazinei
sistemai
−40 g  100 g
0,26 g  X, X = 0,65 g.

Analogiškai skaičiuojamas dekstrano tirpalo kiekis, reikalingas nurodytos sudėties 4,0 g svorio
fazinei sistemai:
10 g  100 g
X  4 g, X = 0,4 g, ir,

20 g  100 g
0,4 g  X, X = 2,0 g.

Taigi fazinei sistemai paruošti reikės atsverti 0,65 g 40 % PEG tirpalo ir 2,0 g 20 % dekstrano tirpalo.
Likusįjį svorį iki 4,0 g sudarys vanduo, buferinis tirpalas ir baltymo mėginys, pvz., 0,4 mL 0,2 M
220
fosfatinio buferio (jo galutinė koncentracija fazinėje sistemoje bus 20 mM), 0,4 mL baltymo tirpalo (2,2 –
2,4 mg) ir 0,55 mL vandens.
Ruošiant fazines sistemas su konjugatais, PEG-dažo kiekis skaičiuojamas procentais nuo bendrojo
PEG kiekio, reikiamo 4,0 g fazinės sistemos paruošti. Pvz., jeigu PEG-dažas koncentracija fazinėje
sistemoje − 5 % nuo PEG, tai sudarys 0,013 g grynojo PEG-dažas konjugato arba 0,0325 g 40 % jo
tirpalo. Šiuo kiekiu atitinkamai turi būti mažinamas PEG tirpalo kiekis, t. y. fazinei sistemai reikės sverti
0,0325 g 40 % PEG-dažas ir 0,6175 g 40 % PEG tirpalų.

Darbo eiga

Fazinės sistemos ruošiamos centrifuginiuose 10 mL talpos mėgintuvėliuose. Kiekvienam bandymui
fazinių sistemų mėginių skaičius dubliuojamas. PEG-dažas konjugatų koncentracijos keičiamos kas 10 %
nuo bendrojo PEG kiekio, imant 10 ir 20 %. Taip ruošiami: trys mėginiai fazinių sistemų PEG/dekstranas
(trečiasis „tuščias“ mėginys, neturintis baltymo, naudojamas kaip palyginamasis atliekant optinio tankio
matavimus) ir po du mėginius PEG-(10 % PEG-dažas)/dekstranas ir PEG-(20 %.PEG-dažas)/dekstranas.
Centrifuginis mėgintuvėlis dedamas į stiklinėlę, atsveriamas, ir į jį iš stiklinės pipetės lašinama sveriant
reikiami PEG ir dekstrano tirpalų kiekiai. Paskui į kiekvieną mėgintuvėlį sulašinama po 0,4 mL 0,2 M
fosfatinio buferio, 0,4 mL ŽSA tirpalo ir 0,55 mL distiliuoto vandens. Mėgintuvėlių viršus uždengiamas
parafilmo plėvele. Kad tirpalai gerai susimaišytų, apie 10−15 kartų pavartoma. Mėgintuvėliai dedami į
centrifugą ir centrifuguojama, kad fazės atsiskirtų 2−3 min. 5000 aps./min. Mėgintuvėliai išimami jų
nesudrumsčiant, fiksuojamas viršutinės ir apatinės fazių tūriai. Iš kiekvienos fazinės sistemos fazės imami
mėginiai baltymo koncentracijai nustatyti Bradfordo metodu (tirpalų optinio tankio sugėrimo, kai 280 nm,
matavimas netinka). Tam tikslui paimti fazių mėginiai skiedžiami (10x ir daugiau) 20 mM fosfatiniu
buferiu ir juose matuojama baltymo koncentracija: fazinėms sistemoms be konjugato PEG-dažas prieš
20 mM natrio fosfatinį buferį, o praskiesti mėginiai iš viršutinės fazės, turinčios konjugatą PEG-dažas
prieš tiek pat kartų praskiestą „tuščią“ PEG fazę.

Skaičiavimai

1. Skaičiuojamas bendrasis baltymo kiekis fazinėje sistemoje:

C
b
= C
b.v.
xV
v
+C
b.a.
xV
a
,

čia C
b.v
, ir C
b.a
− baltymo koncentracija, atitinkamai viršutinėje ir apatinėje fazėse;
V
v
ir V
a
− atitinkamai viršutinės ir apatinės fazių tūriai.
C
b
reikšmės santykis su į sistemą įvestu baltymo kiekiu rodo baltymo pasiskirstymo išeigą sistemoje.
2. Skaičiuojami ŽSA pasiskirstymo tarp fazių koeficientai (K
0
) fazinės sistemos PEG/dekstranas
mėginiuose. Skaičiuojama vidutinė K
0
reikšmė.
3. Skaičiuojamos vidutinės ŽSA pasiskirstymo koeficientų (K) reikšmės fazinėse sistemose, dalyvaujant
10 % ir 20 % PEG-dažas konjugatui.
4. Skaičiuojamas ŽSA pasiskirstymo koeficiento pasikeitimas (∆log K) kiekvienai PEG-dažas konjugato
koncentracijai pagal formulę:
K ∆ =
0
K
K
, tai ∆log K = log K – log K,
čia, K
0
ir K =
a
v
C
C
, ŽSA pasiskirstymo koeficientai atitinkamai fazinėse sistemose be ligando ir esant
ligandui.

Atsiskaitymas

Baltymo išeiga kiekvienoje dvifazėje sistemoje. Skaičiuojami ŽSA pasiskirstymo koeficientai (K
0
)
fazinės sistemos PEG/dekstranas. Skaičiuojamos ŽSA pasiskirstymo koeficientai (K) fazinės sistemos,
dalyvaujant 10 % ir 20 % PEG-dažas konjugatui. Skaičiuojamas ŽSA pasiskirstymo koeficiento
pasikeitimas (log K).

221
Literatūra

Альбертсон, Пер-Оке. Разделение клеточных частиц и макромолекул. Москва: Мир, 1974,
c. 101−124, 283−290.

3. Afininė (biospecifinė) chromatografija

Darbo tikslas

Atlikti žmogaus serumo albumino (ŽSA) chromatografiją ant grupinio specifiškumo sorbento
Sepharose-Cibacron Blue F3GA.

Darbo priemonės
Spektrofotometras, svarstyklės, pH-metras, pipetės, automatinės pipetės

Paruošiamieji darbai
1. Sorbento Sefarozė-Cibacron Blue F3GA paruošimas
Gamintojų tiekiamas sorbentas yra liofilizuotas su stabilizuojančiais priedais, kurie prieš naudojimą
turi būti pašalinti. Tam tikslui atsveriama apie 1 g liofilizuoto sorbento, užpilama vandeniu ir
leidžiama visiškai išbrinkti (išbrinkusio sorbento tūris ≈ 4 mL). Sorbento suspensijai leidžiama
nusėsti, ji nudekantuojama nuo smulkių dalelių, pernešama ant stiklo filtro ir plaunama 50 mL, 1,0 M
NaCl tirpalu (10 tūrių tirpalo sorbento tūriui) stabilizatoriams pašalinti, ir 15−20 tūrių distiliuoto
vandens atplauti nuo NaCl. Chromatografinė kolonėlė (skersmuo 10 mm, ilgis 10 cm) užpildoma 3,0
mL paruošto sorbento, ir jis nupusiausvyrinamas 30 mL pradinio chromatografijos buferio, leidžiant
jį 35 mL/val. greičiu.
2. Buferinių tirpalų ruošimas
2.1. 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,1, buferis 1 (100−150 mL)
2.2. 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,1, turintis 0,5 M KCNS, buferis 2
2.3. (50 mL).
3. ŽSA pavyzdžio ruošimas.
30 mg liofilizuoto ŽSA preparato tirpinama 3,0 mL buferio-1. 0,1 mL baltyminio tirpalo
praskiedžiama 100 kartų baltymo koncentracijai nustatyti Bradfordo metodu (0,1 mL →1 mL, ir 0,1 mL
pastarojo →1 mL). Likę 2,9 mL baltyminio tirpalo nešami ant kolonėlės.

Darbo eiga

Į kolonėlę, nupusiausvyrintą buferiu 1, įnešamas peristaltiniu siurbliu 35 mL/val. greičiu baltymo
tirpalo mėginys (2,9 mL). Sorbentas plaunamas buferiniu tirpalu 1 (∼25 mL), renkant eliuato frakcijas
(tūris ∼ 6 mL) kas 10 min. Sorbuoto baltymo eliucija atliekama leidžiant per kolonėlę tuo pačiu greičiu
buferinį tirpalą 2 (∼50 mL). Frakcijose nuo chromatografijos pradžios iki baltymo desorbcijos buferiu 2
pabaigos analizuojama baltymo koncentracija. Jos matavimui skirti mėginiai iš frakcijų Nr. 1−6
analizuojami be papildomo skiedimo. Mėginiai iš frakcijų Nr. 7 ir 8 skiedžiami atitinkamai 10x ir 40x,
mėginiai iš kitų eliuato frakcijų Nr. 9−11 analizuojami papildomai neskiesti.

Matavimų lentelė

Fr. Nr. Fr. tūris,
mL
Optinis tankis Koncentracija
mg/mL
Praskiedimas Baltymų
kiekis, mg



Atsiskaitymas

1. Chromatograma, parodanti baltymo koncentracijos kitimą nuo chromatografijos pradžios iki eliucijos
buferiu 2 pabaigos.
222
2. Sorbuotojo baltymo kiekis, C
b.s
.
3. Baltymo kiekis, desorbuotas buferiu 2 (C
b.des
).
4. Baltymo desorbcijos išeiga (%) = C
b.des
/C
b.s
x100.

Literatūra

Туркова, Я. Аффинная хроматография. Москва: Мир, 1980.

4. Baltymų afininė chromatografija, naudojant imobilizuotuosius
metalo jonus (Immobilized metal ions affinity chromatography, IMAC)

Darbo tikslas

Atlikti kiaušinio lizocimo (eksponuota His-15 liekana) ir arklio širdies mioglobino (eksponuotos His-
113 ir His-116 liekanos) mišinio frakcionavimą ant sorbento Sefarozė-IDA, įkrauto Cu (II) jonais.

Darbo priemonės

Kolonėlė (10/100 mm),spektofotometras, pH-metras, grandientatorius,pipėtės, automatinės pipėtės,
chromatografinė aparatūra.

Paruošiamieji darbai

1. Sorbento Sefarozė-iminodiacto rūgštis paruošimas ir pakrovimas Cu
2+
jonais.
Chromatografinė kolonėlė (skersmuo 10 mm, ilgis 10 cm) užpildoma 3,0 mL sorbento. Per kolonėlę
praleidžiamas 30 mL/h greičiu 0,001 N HCl vandeninis tirpalas, pH 3,0 (ne mažiau kaip 10 tirpalo
tūrių sorbento tūriui kolonoje), nuo rūgšties atplaunama dejonizuotu vandeniu ir per kolonėlę
leidžiama 30 mL 50 mM Cu(NO
3
)
2
3H
2
O tirpalo dejonizuotame vandenyje. Cu
2+
jonų perteklius ir
silpnai laikomi metalo jonai atplaunami vandeniu, ir sorbentas pusiausvirinamas 10 kolonos tūrių
10 mM Tris-HCl buferio, pH 7,0, turinčio 0,2 M Na
2
SO
4
(buferis 1).
2. Buferinių tirpalų ruošimas
2.1. 10 mM Tris-HCl buferis, pH 7,0, turintis 0,2 M natrio sulfato − 150 mL (buferis 1)
2.2. 10 mM Tris-HCl buferis pH 7,0, turintis 0,2 M natrio sulfato ir 100 mM imidazolo − 17 mL
(buferinio tirpalo pH turi būti ≈ 7,0) (buferis 2)
3. Baltymų mišinio ruošimas.
3,0 mg mioglobino ir 12,0 mg lizocimo atsveriama analitinėmis svarstyklėmis ir tirpinama 15,0 mL
buferinio tirpalo 1. Matuojama bendroji baltymo koncentracija mišinyje (Bradfordo metodu, 10x
skiestam tirpalui).

Darbo eiga

Baltymų mišinio pavyzdys (15 mL) įvedamas į kolonėlę 30 mL/h greičiu su peristaltiniu siurbliu.
Sorbentas plaunamas buferiniu tirpalu 1 (10 tūrių/sorbento tūriui), renkant eliuato frakcijas kas 7 min.
Sorbuotojo baltymų mišinio dalis desorbuojama linijiniu imidazolo gradientu iki 100 mM, esant
bendrajam gradiento tūriui 34 mL (17 mL buferio 1 ir 17 mL buferio 2). Gradientinės eliucijos frakcijose
(tūris 3,5–3,7 mL) matuojama baltymo koncentracija Bradfordo metodu. Baltymo koncentracijai matuoti
mėginiai iš gradiento frakcijų skiedžiami buferiniu tirpalu 1: frakcijai Nr. 1−15x, frakcijoms Nr. 2–4 −
10x ir frakcijai Nr. 5 − 5x. Apskaičiuojamas bendras desorbuoto baltymo kiekis. Jo santykis su įneštu į
kolonėlę baltymo kiekiu rodo baltymo desorbcijos išeigą.

Matavimų lentelė

Fr. Nr. Fr. tūris Optinis tankis Praskiedimas Baltymų
koncentracija, mg/mL
Baltymų
kiekis

223

Atsiskaitymas

1. Chromatograma, rodanti eliuato absorbcijos kitimą, esant 280 nm, nuo chromatografijos pradžios iki
gradientinės eliucijos pabaigos.
2. Baltymo koncentracija imidazolinio gradiento frakcijose ir bendras desorbuoto baltymo kiekis
3. Imidazolo koncentracija, kuriai esant pasirodo didžiausia lizocimo ir mioglobino koncentracija,
detektuojant eliuato absorbciją, kai 280 nm.

Literatūra

1 Frances H. Arnold. Metal-Affinity separations: a new dimension in protein processing.
Biotechnology. 1991, p. 152−155.
2. Porath, J.; Carlsson, J.; Olsson, I. and Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new
approach to protein fractionation. Nature 258, 1975, p. 598−599.

5. Chromatografinės kolonėlės efektyvumo nustatymas

Darbo tikslas

Apskaičiuoti pagrindinius chromatografinės kolonėlės parametrus: teorinių lėkštelių skaičių – N,
ekvivalentinį aukštį vienai teorinei lėkštelei – H, redukuotosios lėkštelės aukštį – h, pikų asimetrijos
veiksnį − A
s

Darbo priemonės

Analitinis chromatografas; atvirkščių fazių kolonėlė – BIO-RAD RP-304 (RP-318), 4,6x250 mm,
švirkštas 20 µL, automatinės pipetės 20 µl, 1000 µL, mikromėgintuvėliai 1,5 mL, filtravimo įranga.

Reagentai

Acetonitrilas, benzenas, toluenas, acetonas, Mill-Q vanduo.
Chromatografijos sąlygos eliuentas: acetonitrilas/vanduo = 50/50(V/V); tekėjimo greitis: 1 mL/min.;
detekcija: 254 nm injekcijos tūris: 10−50 µL.

Darbo eiga

Paruošiamas eliuentas. Į kolbą su 100 mL mill-Q vandens įpilama 100 mL acetonitrilo ir gerai
išmaišoma. Tirpalas prieš naudojimą filtruojamas per 0,45 µm filtrą.
Paruošiami mėginiai. Į mikromėgintuvėlį įpilama 1 mL eliuento ir 10 µL atitinkamo organinio
tirpiklio (benzeno, tolueno arba acetono) ir gerai išmaišoma.
Kolonėlė pusiausvyrinama eliuentu ne trumpiau kaip 15 min 1 mL/min greičiu.
Injekcija įleidžiama 10−50 µL mėginio ir gaunama chromatograma.

Atsiskaitymas

Iš gautos chromatogramos suskaičiuojame piko plotį pusės piko aukštyje W
1/2h
arba ties piko pagrindu
W
b
ir piko laikymo laiką. Skaičiuojame teorinių lėkštelių skaičių, asimetrijos veiksnį pagal atitinkamas
formules.

Literatūra

Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Москва: Наука, 1985, c. 31−40.
224


Aukštis ekvivalentinis vienai teorinei lėkštelei H =
N
L
, čia L − kolonėlės ilgis.
Redukuotasis teorinės lėkštelės aukštis h =
p
d
H
, čia d
p


sorbento dalelių dydis.





6. Baltymų hidrofobinės sąveikos chromatografija (HSCH)

Darbo tikslas

Atlikti žmogaus serumo albumino (ŽSA) hidrofobinės sąveikos chromatografiją ant sorbento Fenil-
Sefarozė (Phenyl-Sepharose).

Darbo priemonės

Kolonėlė, sorbentas fenil-sefarozė, chromatografinė aparatūra, filtras, automatinės pipetės,
spektofotometras.

Paruošiamieji darbai

1. Fenil-Sefarozės paruošimas
7−8 mL sorbento suspensijos pernešama ant stiklinio filtro ir praplaunama ~ 80 mL vandens. 5,0 mL
perplauto ir nuo smulkių dalelių su vandeniu nudekantuoto sorbento pernešama į chromatografinę
10 % piko
aukščio
Asimetrijos veiksnys
Teorinių lėkštelių
skaičius
N = 5,54(t
r
/W
1/2h
)
2


N = 5,54(t
r
/W
b
)
2


225
kolonėlę, ir sorbentas pusiausvyrinamas pradiniu chromatografijos buferiu 1 (10 kolonėlės tūrių) leidžiant
40 mL/val. greičiu.

2. Chromatografijai reikalingų buferinių tirpalų ruošimas.
2.1. 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,1, turintis 1,8 M amonio sulfato, buferis 1 (250−300 mL).
2.2. 20 mM natrio fosfatinis buferis, pH 7,1 buferis 2 (250−300 mL).

3. ŽSA pavyzdžio ruošimas.
75 mg liofilizuoto ŽSA preparato tirpinama 5,0 mL buferio 1. 4,0 mL baltyminio tirpalo paliekama
užnešti ant sorbento, o 1,0 mL baltymo − koncentracijai nustatyti. Tam tikslui imama 0,1 mL ŽSA tirpalo
ir skiedžiama iki 5,0 mL su buferiu 1. Matuojamas tirpalo optinis sugėrimas, kai 280 nm. Tiksli baltymo
koncentracija apskaičiuojama pagal formulę:
mas i praskied
0,53
c
A280
× = , (mg/mL),
čia ŽSA A
280

= 5,3, esant baltymo koncentracijai 1,0 mg/mL, A
280
yra lygus 0,53.

Darbo eiga

Į kolonėlę, nupusiausvyrinta buferiu 1, įnešamas peristaltiniu siurbliu 40 mL/val. greičiu baltymo
tirpalo mėginys (4 mL), ir sorbentas plaunamas buferiniu tirpalu 1, renkant eliuato frakcijas (tūris 7−8
mL) kas 10 min. Matuojamas frakcijų optinis sugėrimas, kai 280 nm, prieš buferį tirpalą 1. Mėginys iš
frakcijos Nr. 1 matuojamas neskiestas, frakcijų Nr. 2−3 mėginiai skiedžiami 2x buferiu tirpalu 1, o kitose
eliuato frakcijose optinis sugėrimas matuojamas papildomai neskiedus, kol optinis tankis pasiekia
pastovią reikšmę < 0,100. Tuomet per kolonėlę tuo pačiu greičiu leidžiamas buferinis tirpalas 2. Baltymo
koncentracijai matuoti mėginiai iš eliuato buferiu 2 frakcijų skiedžiami: frakcijai Nr. 1−3x buferiniu
tirpalu 2, frakcijai Nr. 2−10x. (sugėrimas, kai 280 nm, matuojamas prieš buferį 2). Likusiose buferinio
tirpalo 2 eliuato frakcijose baltymo koncentracija matuojama papildomai neskiedus, iki optinis tankis
pasieks pastovią reikšmę < 0,100.

Matavimų lentelė

Fr.Nr. Fr. tūris, mL Optinis tankis Konc.,
mg/mL
Praskiedimas Kiekis, mg


Atsiskaitymas

1. Chromatograma, rodanti eliuato absorbcijos kitimą, kai 280 nm, nuo chromatografijos pradžios iki
eliucijos buferiu 2 pabaigos.
2. Sorbuoto baltymo kiekis, C
b.s
.
3. Baltymo kiekis, desorbuotas buferiu 2 (C
b.des
).
4. Baltymo desorbcijos išeiga (%) = C
b.des
/C
b.s
.

Literatūra

Туркова, Я. Аффинная хроматография. Москва: Мир, 1982, c. 154−158.
226
B Bi io of fa ar rm ma ac ci ij ja a 1 1
Laboratoriniai darbai
Genovaitė Gedminienė

1. Rekombinantinio baltymo biosintezė E.coli ląstelėse. Pasėjamosios
kultūros paruošimas

Darbo tikslas

Išauginti rekombinantinio baltymo producento biomasę. Paruošti pasėjamąją kultūrą.

Tyrimo objektas

Rekombinantinis kiaulės augimo hormono baltymas.

Darbo priemonės

Autoklavas, termostatuojamieji kratytuvai, sterilaus oro boksas, svarstyklės, analitinės svarstyklės,
centrifuga, spektrofotometras, šaldytuvas/šaldiklis, pH-metras, cilindrai, automatinės pipetės, džiovinimo-
sterilinimo krosnis, kaitinimo (elektrinė) plytelė.

Paruošiamieji darbai

1. Tirpalų, reikalingų rekombinantinės E.coli fermentacijai, paruošimas.
2. Tirpalų sterilinimas autoklavuojant.
3. Fermentatoriaus ir jo priedų sterilinimas.
4. Sterilių kolbų paruošimas iškaitinant jas 2 val. esant 180 °C (0,25 l ir 0,8 l)
5. Sterilių antgalių paruošimas autoklavuojant 20 min. esant 1 atm. (1 mL – mėlyni, 0,2 mL – geltoni).
6. Sterilus vanduo.
7. Mėgintuvėliai tirpalams skiesti.

Tirpalų ruošimas

LB(Luria-Bertani) terpė
Triptonas 10,0 g,
Mielių ekstraktas 5,0 g,
NaCl 10,0 g.
Medžiagos atsveriamos, ištirpinamos 700–800 mL vandens, patikrinama pH. Terpės rūgštingumas turi
būti pH 6,8–7,2 ribose. Jei reikia pakoreguoti pH, tai atliekama su natrio šarmo arba fosforo rūgšties tirpalu.
Vėliau terpės tūris papildomas iki 1 L vandens. Paruošta terpė išpilstoma į kolbas po 80 mL, užkemšama
mikrobiologiniais kamščiais ir sterilinama autoklavuojant 1atm. (121 °C) 20 min.
Sterilus vanduo induktoriaus ir antibiotiko tirpalams ruošti
Į 4 mėgintuvėlius įpilama po 10 mL vandens, užkemšama mikrobiologiniais kamščiais ir sterilinama
esant 1 atm. (121 °C) 20 min.
30 % NaOH (sv/v) – 60 g NaOH ir iki 200 mL H
2
O
60 g NaOH ištirpinama 150 mL vandens, ataušinama iki kambario temperatūros ir tūris papildomas iki
200 mL vandens.
70 % etanolis
70 mL 96 % etanolio skiedžiama cilindre iki 96 mL vandeniu.
Terpių ir jos priedų, reikalingų fermentatoriui užpildyti, paruošimas
Azoto šaltinis
Peptonas 80 g, pH 6,8–7,2,
Mielių ekstraktas 40 g,
227
Amonio chloridas 8g.
Tirpinti šildant iki 5 l. Pakoreguoti pH 6,8–7,2 ir vėliau tūrį papildyti iki 8,0 l. Paruoštą tirpalą supilti į
fermentatorių ir sterilinti 1 atm. (121 °C) 30 min. (žr. instrukciją!).
Fosfatai
Na
2
HPO
4
(bevandenis) 47,2 g,
KH
2
PO
4
(bevandenis) 24,0 g.
Tirpinti šildant iki 0,8 l. Pakoreguoti pH 6,8–7,2 ir vėliau tūrį papildyti iki 1,0 l. Paruoštą tirpalą supilti į
3 kolbas ir sterilinti 1atm. (121 °C) 30 min. (žr. instrukciją!).
Anglies ir energijos šaltinis
Gliukozė 80 g,
MgSO
4
⋅ 7H
2
O 1,8 g,
CaCl
2
0,07 g.
Gliukozė ir magnio sulfato hektahidratas yra ištirpinami 400 mL vandens. Atskirai ištirpinama 70 mg
CaCl
2
100 mL vandens. Kalcio chlorido tirpalas supilamas į gliukozės-magnio sulfato tirpalą ir tūris
papildomas iki 1,0 l vandens. Sterilizuojama 0,5 atm. 20 min.
Prie fermentatoriaus pH palaikyti biosintezės metu reikaligi:
30 % NaOH (sv/v) – 60 g NaOH ir iki 200 mL H
2
O.
35 % fosforo rūgštis – komercinė, 200 mL.
10 % propinolio tirpalas (sterilus) putoms gesinti.
IPTG (induktorius) –izopropil-β-D-tiogalaktozidas.
Ampicilinas.

Darbo eiga

Rekombinantinio producento auginimas kolbose. Pasėjamosios medžiagos paruošimas

Išsterilinus terpes, palaukiama, kol jos atauš iki kambario temperatūros. Steriliai į kiekvieną kolbą su
80 mL terpe įpilama antiobiotiko ampicilino tirpalo iki galutinės koncentracijos 50 µg/mL terpės. Į taip
paruoštą terpę užsėjama rekombinantinio kamieno kultūra E.coli K802recAH. Imama užšaldyta 1,5 mL
talpos mėgintuvėlyje darbinė kultūra, atšildoma iki kambario temperatūros. Mėgintuvėlio paviršius
nuvalomas 70 % etilo alkoholio tirpalu ir aseptiškai užsėjama po 50 µl šios darbinės recAH kultūros į
kiekvieną kolbą (10 kolbų). Kolbos sustatomos į kratytuvą, nustatoma 37 °C temperatūra, apsukų skaičius
200 aps./min. ir auginama per naktį 16–20 val. Kitą dieną darbas tęsiamas.

Literatūra

1. Becker, J. M.; Caldwell, G. A.; Zachgo, E. A. Biotechnology. 2000, p. 9–30.
2. Nicklin, J.; Graeme-Cook, K.; Paget, T. & Killington, R. Instant Notes in Microbiology. 2001,
p. 147–155.
3. Маниятис, Т.; Фрич, Э.; Сэмбрук, Дж. Молекулярное клонирование. 1984, c. 9–25, 34–36.
228

2. Rekombinantinio baltymo biosintezė E.coli ląstelėse. Biomasės
gavimas

Darbo tikslas

Rekombinantinio kiaulės augimo hormono baltymo biosintezė. Biomasės gavimas.

Tyrimo objektas

Kiaulės augimo hormono rekombinantinis baltymas.

Darbo priemonės

Termostatuojamieji kratytuvai, sterilaus oro boksas, svarstyklės, analitinės svarstyklės, centrifuga,
spektrofotometras, šaldytuvas/šaldiklis, pH-metras, džiovinimo-sterilinimo krosnis, kaitinimo (elektrinė)
plytelė, fermentatorius ir jo priedai, automatinės pipetės, stiklinėlės, mėgintuvėliai.

Darbo eiga

Rekombinantinio producento auginimas fermentatoriuje. Biomasės gavimas
Prie fermentatoriaus pajungiamas pH ir pO
2
elektrodai. Į sterilų fermentatorių supilami visiparuoštos ir
sterilios terpės komponentai, įpilama antibiotiko ampicilino tirpalo iki galutinės 50 µL/mL koncentracijos ir
patikrinama pH. Jei reikia, pH koreguojama fosforo rūgšties ar šarmo tirpalu. Supylus į fermentatorių visus
terpės komponentus, paimama ~200 mL terpės skiedimams.
Pasėjamoji (dažnai vadinama naktine) kultūra, auginta 10-yje kolbučių po 80 mL, yra supilama į sterilią
1,0 l ar didesnės talpos kolbą. Aseptiškai paimama ~10 mL ląstelių suspensijos pasėjamosios kultūros
optiniam tankiui įvertinti. Prieš užsėjant kultūrą į fermentatorių, matuojamas optinis tankis prie 540 nm
bangos, 1 cm kiuvetėje. Ląstelių suspensija prieš matavimą 5 ir 10 kartų atskiedžiama. Optiniam tankiui
matuoti kultūrinis skystis skiedžiamas tiek kartų, kad pavyzdžio rodmenys spektrofotometro skalėje,
palyginti su kontrole, būtų 0,1–0,6 O.V. ribose. Skiedimams ir kontrolei imama terpė.

Optinis tankis apskaičiuojamas pagal formulę:

A = DxP,
čia:
A – optinis tankis, O.V.,
D – spektrofotometro rodmenys,
P – praskiedimas.

Pasėjamoji producento kultūra užsėjama į fermentatorių pagal fermentatoriaus instrukcijos reikalavimus.
Užsėjus iš fermentatoriaus paimamas ląstelių suspensijos mėginys pradiniam optiniam tankiui išmatuoti
ir pH patikrinti. Optimalios rekombinantinio producento auginimo sąlygos:
- temperatūra – 37 °C,
- terpės pH – 6,8–7,2
Kai ląstelių suspensijos absorbcija 540 nm bangoje pasiekia 2–3 optinius vienetus (O.V.), imamas
10 mL ląstelių suspensijos mėginys rekombinantinio baltymo sintezei ląstelėse įvertinti. Ląstelės
nucentrifuguojamos staline centrifuga, užšaldomos šaldiklyje ir paliekamos analizei (rekombinantinio
baltymo ekspresija biomasėje prieš induktoriaus IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozidas) įvedimą).
Į fermentatorių aseptiškai supilamas iki 0,2 mM/L koncentracijos induktorius. Auginimas tęsiamas dar
2 val. Praėjus 30, 60 ir 120 min., imami mėginiai rekombinantinio baltymo biosintezei įvertinti. Ląstelių
suspensija nucentrifuguojama kaip ir mėginys prieš induktoriaus įvedimą, ląstelių nuosėdos užšaldomos ir
paliekamos tolesnei analizei.
229
Baigus fermentaciją, vėl imamas 10 mL ląstelių suspensijos mėginys rekombinantinio baltymo
ekspresijai įvertinti. Ląstelių suspensija iš fermentatoriaus supilama į indus, įstatytus ledo vonelėje.
Ataušinama iki 10–15 °C. Kol ląstelių suspensija aušinama, sunumeruojami ir pasveriami centrifugavimo
indai; užrašomi svoriai. Ląstelių suspensija supilama į centrifuginius indus, subalansuojamas svoris ir
centrifuguojama esant +4 °C 5000 aps./min. 15 min. arba 3000 aps./min. 30 min. Kultūrinis skystis po
centrifugavimo surenkamas į atskirą indą, užpilama ~1/10 koncentruoto H
2
O
2
. Gali būti nukenksminama
naudojant ir kitą dezinfektantą. Taip nukenksminus, kultūrinį skystį galima išpilti į kanalizaciją. Biomasė su
centrifuginiais mėgintuvėliais pasveriama, užrašomas indo svoris su biomase. Paskui biomasė su mentele
surenkama iš centrifuginių indų, perkeliama į polietileninį maišelį, užrašoma fermentacijos data ir darbą
atlikusių studentų pavardės. Saugoma buitinio šaldytuvo šaldiklyje (esant –15–18 °C) iki kitų laboratorinių
darbų.
Baigus darbą, sutvarkoma darbo vieta: išplaunamas fermentatorius, jo priedai, išvalomas boksas,
nuvalomai laboratoriniai stalai, nešvarūs indai sumerkiami į indą su dezinfekavimo tirpalu. Švariai
nuplaunamos rankos ir dezinfekuojamos tam skirtu tirpalu.

Atsiskaitymas

Šio darbo metu turi būti:
- kas 0,5 val. registruojama ląstelių suspensijos adsorbcija (O.V.), matuojant spektrofotometru 1 cm
kiuvetėje 540 nm bangoje. Rezultatus patogiausia rašyti lentelėje.


Rekombinantinio producento auginimas LKB fermentatoriuje

Mėginio
Nr.
Mėginio
paėmimo
laikas
Auginimo
trukmė,
min.
O.T.
λ 540 nm
O.T.
λ 540 nm,
ln
O.T.
λ 540 nm,
lg
Auginimo
greitis, µ
Generacijos
laikas, t
d


- šie rezultatai turi atsispindėti grafike, atidedant vertikalioje ašyje O.V., o horizontalioje – kultūros
auginimo trukmę valandomis;
- turi būti apskaičiuotas eksponentinis augimo greitis. Eksponentinis bakterijų augimo greitis
apskaičiuojamas pagal formulę:

µ =
( )
0
0
t t
ln ln
x xt


,
čia:
ln
xt
– ląstelių suspensijos optinio tankio logaritmas po tam tikros auginimo trukmės, min.;
ln
x0
– ląstelių suspensijos optinio tankio logaritmas auginimo pradžioje, t. y. laikas, nuo kurio
norima apskaičiuoti augimo greitį;
t – laikas po tam tikros auginimo trukmės, min.;
t
0
– laikas, nuo kurio norima apskaičiuoti ląstelių kultūros auginimo greitį, min.

Jei ląstelių kultūra yra eksponentinėje augimo fazėje, greitis µ yra pastovus dydis. Nubrėžę laiko ir
optinio tankio, išreikšto natūriniu logaritmu ln, priklausomybės grafiką, gauname tiesę. Šioje augimo
stadijoje E.coli ląstelių skaičius padvigubėja per tam tikrą laiko tarpą. Ląstelių padvigubėjimo laikas
vadinamas generacijos laiku t
d
ir apskaičiuojamas pagal formulę:

t
d
= ln2/µ, ln2 = 0,693.

- apskaičiuotas ląstelių generacijos laikas ir generacijų skaičius. Generacijų skaičius apskaičiuojamas iš
gyvų ląstelių titro arba optinio tankio kultūros auginimo pradžioje ir pabaigoje. Titrui apskaičiuoti
sėjama po 3 arba 5 pakartojimus į Petri lėkšteles su agarizuota mitybine terpe po 50 µl neskiestos ląstelių
suspensijos iš kolbos arba fermentatoriaus auginimo pradžioje ir po 0,1 mL praskiedimų 10
-5
, 10
-6
, 10
-7

auginimo pabaigoje. Titras X vienam mL ląstelių suspensijos apskaičiuojamas pagal formulę:
230

,
V
a
X
n
10 ×
=


čia:
a – vidutinis kolonijų skaičius lėkštelėse;
n – atskiedimo laipsnis;
V – užsėtos suspensijos tūris, mL.;
Generacijų skaičius n apskaičiuojamas pagal formulę:

,
x
x
log , n
0
32 3 =


čia:
x – ląstelių titras arba optinis tankis auginimo pabaigoje;
x
0
– ląstelių titras arba optinis tankis auginimo pradžioje.

Ląstelių dalijimosi greičio konstanta (ląstelių pasidalijimų skaičius per valandą) apskaičiuojamas:

) t t ( lg
N lg N lg
t
n
v
0
0
2 −

= =
.

Laikas, reikalingas vienam pasidalijimo ciklui, arba generacijos laikas, yra lygus:

v n
t
g
1
= =
.

Pvz., jei per 10 val. suspensijoje ląstelių skaičius padidėjo nuo 10
3
iki 10
9
, tai dalijimusi skaičius per
valandą bus:

. v ,
,
lg lg
v 2
10 3010 0
10 10
3 9
=


=


Vadinasi, generacijos laikas bus 30 min.
• Biomasės derlius, t. y. biomasės svoris, g, vienam litrui ląstelių suspensijos.

Literatūra

1. Nicklin, J.; Graeme-Cook, K.; Paget, T. & Killington, R. Instant Notes in Microbiology. 2001,
p. 147–155.
2. Williams, J.; Ceccarelli, A.; Wallace, A. Genetic Engineering. 2001, p. 81–102.
3. Маниятис, Т.; Фрич, Э.; Сэмбрук, Дж. Молекулярное клонирование. 1984, c. 9–25, 34–36.
4. Перт, С. Дж. Основы культивироиания микроорганизмов и клеток. 1978, c. 15–39.
231

3. Rekombinantinio producento ląstelių suardymo laipsnio priklausomybė nuo
ardymo trukmės

Darbo tikslas

Rekombinantinio producento biomasės ardymas.

Tyrimo objektas

Rekombinantinio producento biomasė.

Darbo priemonės

pH metras, maišyklė magnetinė, centrifuga, svarstyklės, termometrai, chronometras, vandens vonelė,
ultragarsinis aparatas, ependorfiniai mėgintuvėliai, įvairaus tūrio cilindrai ir automatinės pipetės.

Tirpalų ruošimas

0,1 M natrio hidroksidas. 2 g natrio hidroksido tirpinama 300–400 mL vandens, ataušinama iki kambario
temperatūros, ir tirpalo tūris papildomas iki 500 mL vandens.
Fosfatinis buferis, × ×× × 10. NaCl – 40,03 g; KCl – 1,08 g; Na
2
HPO
4
x 12H
2
O – 14,5 g; KH
2
PO
4
– 0,73 g. Visos
šios druskos ištirpinamos vandenyje iki 400 mL. Natrio hidroksido tirpalu yra koreguojamas rūgštingumas,
kuris turi būti pH 7,0–7,2 ribose. Vėliau tirpalo tūris papildomas iki 500 mL vandens.

Darbo eiga

Biomasės ardymas ultragarsu
Paruošiama ledo vonelė su šaldomuoju mišiniu. Šaldomajam mišiniui paruošti imama lygiomis dalimis
vandens ir susmulkinto ledo. Atsveriama 5 g rekombinantinio producento užšaldytos biomasės. Užpilama
50 mL fosfatinio buferio. Maišoma magnetine maišykle arba stikline lazdele, kol gaunama homogeninė
suspensija. Stiklinėlė įstatoma į ledo vonelę. Paskui suspensija ardoma ultragarsiniu aparatu 10 kartų po
1 min., kaskart ataušinant mėginį po 30 sek. Po kiekvieno ardymo ciklo imama po 1,5 mL du mėginiai: 1 –
suardymo laipsniui įvertinti, matuojant absorbciją 540 nm bangoje (šiame darbe), ir 2 – baltymų
koncentracijai nustatyti. Baltymų koncentracijai nustatyti, skiriamas atskiras laboratorinis darbas.

Atsiskaitymas

Žinoti ir paaiškinti ląstelių ardymo būdus.

Pagrindiniai ląstelių ardymo metodai

Eil.
Nr.
Ardymo būdas Pavyzdys Principas
1. Ląstelių lizė Eritrocitai, bakterijos Osmotinis ląstelių membranos suardymas
2. Fermentų poveikis Bakterijos paveikiamos
lizocimu
Suardžius ląstelių sienelę lizocimu, dėl osmozės
plyšta ląstelių membranos
3. Cheminė soliubilizacija
ir autolizė
Mielių ekstrakcija
toluolu
Ląstelių sienelę (membraną) iš dalies ištirpdo
chemines medžiagos, o ląstelėje esantys fermentai
užbaigia procesą
4. Užšaldymas,
atšildymas
Bakterijos, E.coli ląstelės Ledo kristalai užima didesnį tūrį nei vanduo.
Ląsteles atšildant, jos suplyšta
232
5. Osmotinis šokas Interferono išskyrimas iš
Pseudomonas sp.
Membranos plyšta koncentruotame druskų arba
cukraus tirpale
6. Homogenizacija
rankiniu būdu ar
naudojant buitinę
maišyklę
Kepenų ląstelės, pelių
audiniai
Ląstelės suardomos mechaniškai, naudojant
homogenizatorius
7. Ardymas stiklo, plieno,
polimeriniais
mikrorutuliukais
Įvairių ląstelių
suspensijos
Ląstelės sutraiškomos tarp dideliu greičiu
maišomų stiklo, plieno arba polimerinių
mikrorutuliukų
8. Gaulino
homogenizatorius,
Frenčo presas
Įvairių ląstelių
suspensijos
Ląsteles ardo aukštas slėgis, leidžiant jas per mažo
skersmens angas, esant 200–600 atm. slėgių
skirtumui
9. Ultragarsas Ląstelių suspensija.
Tinka tik laboratorinėmis
sąlygomis
Ultragarso bangos sudaro slėgio gradientą, dėl to
plyšta ląstelės

- eksperimento metu gauti rezultatai pateikiami lentelėje ir pagal gautus duomenis braižomas grafikas,
atspindintis optinio tankio E
540nm
ir ardymo trukmės priklausomybę.

Pav. Nr. Ardyta ultragarsu
Min. O.T.
1. 0
2. 1
3. 2 ir t. t.

Literatūra

Coligan, J. E. et al. Current protocols in protein science. 1995. 6.1.5–6.1.11.
233

4. Rekombinantinio producento ląstelių suardymo laipsnio
įvertinimas pagal baltymų koncentraciją

Darbo tikslas

Rekombinantinio producento suardymo laipsnio įvertinimas pagal baltymo koncentraciją.

Tyrimo objektas

Rekombinantinio producento biomasės homogenatas.

Darbo priemonės

pH-metras, svarstyklės, analitinės svarstyklės, mėgintuvėliai, matavimo kolbutės, maišyklė, automatinės
pipetės, spektrofotometras, chronometras.

Tirpalų ruošimas

Standartinis albumino tirpalas: Imama 5 mg/mL jaučio albumino serumo (BSA) tirpalo ir atskiedžiama 10
kartų: į mėgintuvėlį įpilama 9 mL distiliuoto vandens ir 1 mL BSA tirpalo. Paruošto tirpalo koncentracija yra
0,5 mg/mL.
Reagentas „A“: 4 g natrio šarmo bei 20 g natrio karbonato tirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 l.
Reagentas „B“: 0,5 g vario sulfato pentahidrato ir 1 g natrio citrato dihidrato tirpinama vandenyje ir
praskiedžiama iki 100 mL.
Reagentas „C“: Sumaišomi tirpalas „A“ ir tirpalas „B“ santykiu 50 : 1. Ruošiamas ir naudojamas darbo
dieną.
Folino reagento tirpalas: Firminis Folino reagentas prieš darbą du kartus atskiedžiamas vandeniu.

Darbo eiga

Baltymų koncentracijos nustatymas
Baltymų koncentracija nustatoma mėginiuose, paruoštuose ardant biomasę ultragarsu. Tiriamieji
mėginiai skiedžiami vandeniu tiek kartų, kad bendrųjų baltymų koncentracija tiriamuose tirpaluose būtų
0,02–0,5 mg/mL ribose.
Kalibracinės kreivės sudarymas.
• Kalibracinei kreivei sudaryti ruošiamos standartinio baltymo tirpalo 6 koncentracijos. Į stovelį
sudedami 7 mėgintuvėliai (10–20 mL tūrio) ir ant jų užrašoma eilės tvarka: 0 (Kontrolė), 1, 2, 3
ir t. t. Lentelėje nurodyti standartinio baltymo tirpalo ir vandens tūriai, kuriuos supylus,
gaunamos atitinkamos baltymo standarto koncentracijos.

Standartininių baltymų koncetracijų tirpalų paruošimas

Mėg.
Nr.
Baltymo standarto
koncentracija, mg/mL
Vanduo,
mL
Baltymo tirpalo, 0,5 mg/mL,
tūris,
mL
0 0 2,0 0
1 0,02 1,92 0,08
2 0,05 1,8 0,2
3 0,1 1,6 0,4
4 0,15 1,4 0,6
5 0,25 1,0 1,0
6 0,5 0 2,0

234
• Spalvinės reakcijos atlikimas. Į stovelį sudedama po 3 mėgintuvėlius kiekvienai baltymo
koncentracijai: 0,02, 0,05 mg/mL ir t. t. bei 1 mėgintuvėlis kontrolei (baltymų standartinių
koncentracijų paruošimo stovelyje pažymėtas „0“.) Į kontrolei skirtą mėgintuvėlį pilama 0,5 mL
vandens vietoj baltymo tirpalo (0 mėgintuvėlis). Į kitus mėgintuvėlius pilama paruošto
atitinkamos baltymo koncentracijos tirpalo po 3 pakartojimus. Į kiekvieną mėgintuvėlį (ir į
kontrolinį) pilama po 2,5 mL reagento „C“, sumaišoma purtykle ir laikoma kambario
temperatūroje 10 min. Paskui į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama po 0,25 mL 2 kartus atskiesto
Folino reagento, sumaišoma, laikoma kambario temperatūroje 30 min. ir spektrofotometru
matuojama absorbcija (λ 750 nm). Lyginama su kontroliniu mėginiu (0,5 mL vandens vietoj
baltymo tirpalo).
Pagal gautus duomenis brėžiama kalibracinė kreivė: absorbcijos priklausomybė nuo baltymo
koncentracijos, mg/mL.
• Tiriamųjų pavyzdžių matavimas ir duomenų apskaičiavimas. Tiriamieji pavyzdžiai skiedžiami
vandeniu taip, kad jų koncentracija būtų 0,2–0,5 mg/mL ribose. Analizės eiga yra tokia pati kaip
ir kalibracinei kreivei. Pirmiausia atskiedžiami tiriamieji baltymų tirpalai, vėliau atliekama
spalvinė reakcija, supilant ta pačia tvarka reagentus kaip nurodyta kalibravimo kreivei.
Pavyzdžiai po tris pakartojimus supilami į mėgintuvėlius po 0,5 mL, įpilama po 2,5 mL reagento
„C“, sumaišoma ir laikoma kambario temperatūroje 10 min. Paskui įpilama po 0,25 mL Folino
reagento, sumaišoma, laikoma kambario temperatūroje 30 min. ir matuojama absorbcija,
palyginti su kontroliniu mėginiu. Tiriamųjų pavyzdžių baltymo koncentracija, mg/mL,
nustatoma pagal kalibracinę kreivę, dauginant iš tiriamojo tirpalo praskiedimo.

Atsiskaitymas

- pagal gautus duomenis brėžiama baltymų koncentracijos kalibracinė kreivė: absorbcijos priklausomybė
nuo baltymo koncentracijos, mg/mL;
- tiriamųjų mėginių baltymo koncentracija nustatoma pagal paruoštą kalibracinę kreivę ir apskaičiuojama
dauginant iš praskiedimo;
- pagal gautus duomenis braižomas grafikas, ardymo trukmės ultragarsu ir baltymų koncentracijos
priklausomybė.

Literatūra

1. Becker, J. M.; Caldwell, G. A.; Zachgo, E. A. Biotechnology. 2000, p. 119–124.
2. Дарбре, А. Практическая химия белка. 1989, c. 290–333.

235
5. Rekombinantinio augimo hormono gryninimas jonų mainų
chromatografijos metodu

Darbo tikslas

Rekombinantinio augimo hormono gryninimas, naudojant jonų mainų chromatografiją.

Tyrimo objektas

Rekombinantinis augimo hormonas.

Darbo priemonės

Peristaltinis siurblys, kolonėlė, densitometras, frakcijų kolektorius, savirašis, pH-metras,
spektrofotometras, cilindrai, automatinės pipetės.

Tirpalų ruošimas

0,5N HCl (komercinė)
1 M Tris-HCl, pH 8,2. 30,3 g Tris-HCl tirpinama 150–180 mL vandens, druskos rūgštimi subalansuojamas
pH, o tirpalo tūris papildomas iki 250 mL vandens.
20 mM Tris-HCl, pH 8,2. 20 mL 1 M Tris-HCl skiedžiama vandeniu iki 800 mL, patikrinama pH ir tūris
papildomas iki 1 l vandens.
1 M NaCl. 29,2 g NaCl ištirpinama 20 mM Tris-HCl, pH 8,2, iki 500 mL.
50 mM NaCl, 250 mL. 12,5 mL 1 M NaCl skiedžiama 20 mM Tris-HCl, pH 8,2, tirpalu iki 250 mL.
150 mM NaCl. 37,5 mL 1 M NaCl skiedžiama iki 20 mM Tris-HCl, pH 8,2 tirpalu iki 250 mL.
0,5 M NaOH. 10 g tirpinama 300–400 mL vandens, o ištirpęs tūris papildomas iki 500 mL.
DEAE – 52 celiuliozė.

Darbo eiga

DEAE – 52 celiuliozės paruošimas
Atsveriama 20 g DEAE-52 celiuliozės ir 200 mL talpos stiklinėje užpilama 2–3 tūriais vandens.
Celiuliozės milteliams leidžiama 1−1,5 val. išbrinkti. Vanduo atsargiai nupilamas nuo celiuliozės paviršiaus,
užpilamas toks pat tūris 0,5 N druskos rūgšties tirpalo, išmaišoma ir paikoma 15 min. Vanduo nupilamas, o
celiuliozė plaunama vandeniu 5–6 kartus, kiekvieną kartą palaukiant, kol celiuliozė visiškai nusės.
Universaliu pH popierėliu tikrinama, kad sorbentas būtų atplautas iki neutralaus pH. Kai pasiekiamas
neutralus pH, celiuliozė užpilama 2–3 tūriais 0,5 M natrio hidroksido tirpalo, išmaišoma ir palaikoma 20–
25 min. Natrio šarmo tirpalas atplaunamas vandeniu iki neutralaus pH. Paskui užpilama 20 mM Tris-HCl
buferiu ir sorbentas plaunamas, kol pH pasiekia 8,1–8,5 ribas.

Kolonėlės paruošimas
1,6 x 5 cm kolonėlė užpildoma 10 mL paruoštos DEAE-52 celiuliozės. Pagrindinės kolonėlės paruošimo
baltymų chromatografijai taisyklės yra šios:
• vertikaliai pritvirtinti kolonėlę;
• uždaryti apatinįjį čiaupą;
• pripilti 1/3 kolonėlės tūrio distiliuoto vandens;
• įsitikinti, ar neliko oro burbulų.
Į taip paruoštą kolonėlę atsargiai supilama paruoštos DEAE-52 celiuliozės. Galima pilti per piltuvėlį
arba atsargiai per stiklo lazdelę, stebint, kad nepakliūtų oro burbulų. Suspensijai leidžiama keletą minučių
nusėsti ir, atsukus apatinįjį čiaupą, kolonėlė pamažu užpildoma. Užpildžius kolonėlę iki reikiamo lygmens
(aukščio), uždaryti apatinįjį čiaupą ir leisti suspensijai nusėsti. Stebėti, kad neapdžiūtų viršutinis sorbento
sluoksnis. Visada virš sorbento turi būti buferio sluoksnis. Viršutinis gelio sluoksnis turėtų būti tolygiai lygus
ir horizontalus. Paskui uždarius ištekėjimo žarnelę, iš viršaus uždedamas adapteris. Pusiausvirinama 20 mM
236
Tris-HCl tirpalu, esant 60 mL/val. tekėjimo greičiui. Kolonėlės pusiausvirinimas vertinamas pagal pH:
įeinančiojo į kolonėlę ir iš jos ištekančiojo buferio pH turi būti tos pačios reikšmės. Prieš pradedant naudoti
kolonėlę reikia nustatyti, kokį tūrį V užima sorbentas. Jis apskaičiuojamas pagal pateiktą formulę:

V = π r
2
⋅ h,
čia:
V – sorbento tūris kolonėlėje, mL;
π – 3,14;
r

– kolonėlės skersmens vidinis spindulys, cm;
h – sorbento aukštis kolonėlėje, cm.

Baltymų tirpalo užpylimas

Baltymų tirpalas, gautas ultragarsu suardžius 1 g rekombinantinio producento biomasę ir atmetus ląstelių
nuolaužas, siurbliu užnešamas ant kolonėlės. Siurblio greitis 60 mL/val. Baltymo tirpalo tūris 20–25 mL,
koncentrcija − 3,5–4,5 mg/mL. Frakcijos renkamos po 10 mL, t. y. po 1 kolonėlės tūrį, atplaunant 20 mM
Tris-HCl buferiu.

Tirpaus rekombinantinio baltymo desorbcija
Tikslinio baltymo desorbcija vykdoma laiptiniu NaCl gradientu: 50 mM – nuimant balastinius baltymus
ir 150 mM – nuimant tirpų rekombinantinį augimo hormoną. Greitis 60 mL/val.

Atsiskaitymas

Surinktos frakcijos analizuojamos, nustatant optinį tankį spektrofotometru 280 nm bangoje. Iš
kiekvienos frakcijos į du ependorfinius mėgintuvėlius paimama po 1,5 mL, užrašomas frakcijos Nr. ir
pavyzdžiai paliekami šaldiklyje baltymų koncentracijai nustatyti Louri metodu bei homogeniškumui įvertinti
PAAG-SDS elektroforezės metodu.
Atlikto darbo išvadose turi būti pateikta:
- užpilto ant kolonėlės baltymo tūris, eliucijos greitis, surinktų frakcijų skaičius, chromatograma ir pan.

Surinktos baltymų frakcijos E 280 nm bangoje ir chromatograma

Mėg. Nr. E
280
Mėg. Nr. E
280
Mėg. Nr. E
280

1 0,080 11 0,462 21 0,215
2 0,280 12 0,407 22 1,338
3 1,479 13 0,364 23 2,030
4 2,674 14 1,362 24 1,990
5 1,833 15 2,308 25 1,610
6 0,905 16 1,309 26 1,170
7 0,680 17 0,86 27 0,808
8 0,616 18 0,559 28 0,589
9 0,554 19 0,359 29 0,449
10 0,514 20 0,238 30 0,446
237
0 5 10 15 20 25 30 35
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Frakc. Nr.
O
.
T
.

2
8
0

n
m

1 pav. Rekombinantinio augimo hormono gryninimo ant DEAE – celiuliozės chromatograma: 1–12 frakcijos – prašokę
baltymai; 13–20 frakcijos – balastinių baltymų desorbcija 50 mM NaCl tirpalu; 21–29 frakcijos – tikslinio-tirpaus
rekombinantinio baltymo desorbcija 150 mM Na Cl tirpalu

Literatūra

1. Preparation of Soluble Proteins from Escherichia coli in J. E. Coligan et al., Current protocols in protein
science. 1995. 6.2.1–6.2.10.
2. Stevenson, C. L.; Hageman, M. J. Estimation of Recombinant Bovine Somatotropin Solubility,
Pharmaceutical Reseach. 1995. 12(11), p. 1671–1676.
238

6. Rekombinantinio baltymo ekspresijos įvertinimas elektroforezės
PAAG-SDS metodu

Darbo tikslas

Įvertinti rekombinantinio baltymo ekspresiją biomasėje prieš ir po indukcijos IPTG.

Tyrimo objektas

Rekombinantinis kiaulės augimo hormonas.

Darbo priemonės

Vertikalusis elektroforezės aparatas, stovas geliui užpilti, pastovios srovės šaltinis, purtyklė, vandens
vonelė, gelių džiovintuvas, automatinės pipetės, mikromėgintuvėliai, stiklinėlės, maišyklė, svarstyklės, pH-
metras, skaitytuvas.

Tirpalų ruošimas

30 % %% % akrilamidas + BIS: 29,2 g akrilamido ir 0,8 g BIS (N,N’-metilen-bis-akrilamidas) ištirpinama
vandenyje ir praskiedžiama matavimo kolboje iki 100 mL.
1,5 M TRIS, pH 8,8: 18,15 g tris (hidroksimetil) aminometano ištirpinama 70 mL vandens. Tirpalo pH
koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rūgštimi iki 8,8. Praskiedžiama matavimo kolboje iki 100 mL.
0,5 M TRIS, pH 6,8: 6,0 g tris (hidroksimetil) aminometano ištirpinami 70 mL vandens. Tirpalo pH
koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rūgštimi iki 6,8. Praskiedžiama matavimo kolboje iki 100 mL.
1,0 M TRIS, pH 6,8: 6,0 g tris (hidroksimetil) aminometano ištirpinami 35 mL vandens. Tirpalo pH
koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rūgštimi iki 6,8. Praskiedžiama matavimo kolboje iki 50 mL.
10 % %% % natrio dodecilsulfatas (SDS): 5,0 g natrio dodecilsulfato ištirpinama, praskiedžiama vandeniu iki
50 mL.
10 % %% % amonio persulfatas: į 1,5–2,0 mL mėgintuvėlį atsveriama 100 mg amonio persulfato, įpilama 1 mL
vandens, ištirpinama. Tinka naudoti tik pagaminimo dieną.
Elektrodinis buferis, 5× ×× × koncentruotas: 30 g tris(hidroksimetil)-aminometano, 144 g glicino, 10 g natrio
dodecilsulfato ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 2 l. Laikoma 4 °C temperatūroje. Tirpalo pH turi
būti 8,3–8,6, tačiau koreguoti negalima Prieš naudojimą tirpalas skiedžiamas (5 kartus) vandeniu.
0,5 % %% % bromfenolio mėlis: 50 mg bromfenolio mėlio ištirpinama 10 mL vandens.
Pavyzdžio buferis: 800 mg natrio dodecilsulfato, 2,5 mL 1,0 M TRIS, pH 6,8, 4,0 mL glicerino, 0,1 mL
0,5 % bromfenolio mėlio skiedžiama vandeniu iki 8,0 mL. Išpilstoma po 0,8 mL į mėgintuvėlius. Laikoma
kambario temperatūroje. - R - redukuotojo pavyzdžio buferiui paruošti į 0,8 mL tirpalo pridedama 0,2 mL
2-merkaptoetanolio.
Coomassie Brilliant Blue R 250 (CBB R-250) dažas: 1,0 g CBB R-250 tirpinamas 400 mL etanolio 3 val.
Tada pridedama 100 mL acto rūgšties ir praskiedžiama vandeniu iki 1 l.
Blukiklis: sumaišoma 300 mL etanolio, 100 mL acto rūgšties. Praskiedžiama vandeniu iki 1 l.
Tirpalas geliui džiovinti: Į 325 mL distiliuoto vandens įpilama 160 mL 96 ° etanolio ir 15 mL glicerolio.
Tirpalas sumaišomas.

Darbo eiga

Užpylimo formos surinkimas
Poliakrilamidinio gelio polimerizacijai naudojama stiklinė forma, kuri surenkama iš 2 stiklų (vidinis
16 × 20 cm ir išorinis 18,3 × 20 cm), tarp jų esančių tarpinių (storis 0,75 mm, aukštis 18,3 cm, plotis
19,0 mm) bei šoninių laikiklių, suspaudžiančių šią konstrukciją. Paruošta forma įstatoma į stovelį geliui
užpilti.

239
Skiriamojo (apatinio) gelio paruošimas
12 % poliakrilamidiniam geliui paruošti stiklinėlėje sumaišoma 12 mL 30 % akrilamido/BIS tirpalo,
7,5 mL 1,5 M TRIS ir 9,1 mL vandens. Pridedama 0,3 mL 10 % natrio dodecilsulfato, 0,2 mL amonio
persulfato ir 0,02 mL TEMED. Gerai išmaišius, tirpalas pilamas į formą iki pažymėtos vietos (4 cm nuo
stiklo viršaus). Paskui atsargiai įpilama 1 mL vandens. Polimerizacija vyksta apie 40 min. kambario
temperatūroje. Jos pabaiga gerai matoma fazių riboje tarp polimero ir vandens. Sustingusio gelio paviršius
praplaunamas vandeniu ir nusausinamas filtriniu popieriumi.
Koncentruojančiojo (viršutinio) gelio paruošimas
4 % poliakrilamidiniam geliui paruošti stiklinėlėje sumaišomi 1,3 mL 30 % akrilamido/BIS tirpalo,
2,5 mL 0,5 M TRIS ir 6,1 mL vandens. Pridedama 0,1 mL 10 % natrio dodecilsulfato tirpalo, 0,05 mL
amonio persulfato ir 0,01 mL TEMED. Gerai išmaišius, tirpalas pilamas ant apatinio gelio iki formos
viršaus. Iš karto įstatomos šukos, formuojančios penkiolika šulinėlių, stebėti, kad neliktų oro burbulų.
Polimerizacija trunka apie 40 min. Jai pasibaigus, šukos ištraukiamos, iškratomas nesusipolimerizavęs
skystis, šulinėliai praplaunami elektrodiniu buferiu ir forma įstatoma į aparatą.
Pavyzdžių paruošimas
Biomasių mėginiai, gauti 2-ame laboratoriniame darbe, nucentrifuguoti prieš induktoriaus IPTG
įvedimą ir praėjus 30, 60 ir 120 min., paruošiami baltymų elektroforezei. Biomasė užpilama 0,2 mL vandens,
gerai homogenizuojama plona stikline lazdele, o paskui atskiedžiama iki 0,4 mL. Gauta suspensija
atskiedžiama vandeniu iki 5 mL. Į ependorfinį mėgintuvėlį imama 120 µl šios suspensijos, užpilama 40 mL
mėginio buferio su 2-merkaptoetanoliu ir virinama 10 min. verdančio vandens vonelėje. Ataušinama iki
kambario temperatūros.

Pavyzdžių supylimo schema
Į pirmąjį gelio šulinėlį supilama 10 µl molekulinės masės standartų, į antrąjį – žAHr baltymo 2–4 µg,
t. y. 8–10 µl. Į kitus šulinėlius supilama po 10 µl paruoštų biomasės mėginių prieš indukciją ir po indukcijos:
30, 60 ir 120 min.
Elektroforezės sąlygos
Viršutinis ir apatinis aparato rezervuarai užpildomi elektrodiniu 5 kartus atskiestu buferiu; apie 250 mL į
viršutinį rezervuarą ir apie 2000 mL į apatinį. Pavyzdžiai pilami į šulinėlius po elektrodinio buferio
sluoksniu. Elektroforezė vykdoma pastoviosios srovės režimu. Kol dažai pereis koncentruojantįjį gelį,
nustatoma srovė 18–20 mA/geliui. Dažui įėjus į skiriamąjį gelį 2–3 mm (po 80–100 min.), srovė padidinama
iki 25 mA/geliui. Dažui iš gelio išėjus, elektroforezė dar tęsiama 20–50 min. Paskui srovės šaltinis
išjungiamas, stiklai išimami iš aparato, nuimami šoniniai laikikliai ir atskiriamas mažasis stiklas.
Nupjaunamas koncentruojantysis gelis, o skiriamasis gelis dedamas į vonelę su CBB R-250 dažu ir
paliekamas per naktį ar ilgiau. Dažą nupylus, užpilamas blukiklis, kuris keletą kartų keičiamas. Nuolat
maišant, procesas pagreitėja. Baigus blukinti, fonas beveik išnyksta ir gelis dedamas į vandenį. Gelį reikia
gerai atplauti nuo blukalo. Tai daroma 5 kartus keičiant vandenį. Kiekvieną kartą užpylus vandenį 20–
30 min. inkubuojama ant purtyklės.
PAAG-SDS gelio džiovinimas
Poliakrilamidiniai geliai džiovinami džiovintuvuose. Jų neturint galima džiovinti rankiniu būdu pagal
toliau aprašytą metodiką. Išblukintas gelis 3 kartus praplaunamas distiliuotu vandeniu, kas dešimt minučių
pakeičiant vandenį. Paskui gelis užpilamas tirpalu džiovinimui. Tirpalo pilama tiek, kad gelis būtų apsemtas.
Gelis inkubuojamas kambario temperatūroje 15–20 min., kartkartėmis pajudinant vonelę, kad tirpalas
tolygiai įsigertų į gelį. Inkubacijos pabaigoje 15–20 sek. į vonelę pamerkiami 2 celofano lakštai. Celofano
matmenys turi būti apie 1 cm didesni už gelį. Paskui imamas vienas celofano lakštas ir paklojamas ant
švaraus stiklo taip, kad tarp stiklo ir celofano neliktų oro tarpų. Ant pakloto lakšto dedamas gelis, kuris iš
viršaus užklojamas antruoju celofano lakštu. Tinkamai džiovinimui paruoštame gelyje neturi būti oro
burbulų. Celofano pakraščiai priklijuojami prie stiklo lipniąja juostele ir vienai–dviem dienoms paliekama
džiūti kambario temperatūroje.

240
94,0
67.0


43.0


30.0


20.1


14.4

kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 pav. Rekombinantinio baltymo biosintezė E.coli ląstelėse: 1 − baltymų molekulinių masių standartai, kDa;
2 − Augimo hormono standartinis baltymas; 3 ir 7 − biomasės lizatas prieš induktoriaus IPTG įvedimą; 4–6 biomasės
lizatai, prėjus 30, 60, 120 min. po induktoriaus įvedimo; 8–11 − biomasės lizatai, paruošti iš nucentrifuguotos biomasės
(keturi pakartojimai)

Literatūra

1. Westermeier, R. Electrophoresis in Practice. A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein
Separations. 1997, p. 165–186.
2. Дарбре, А. Практическая химия белка, 1989, c. 60–63.
241
E En nz zi im mo ol lo og gi ij ja a (pasirinkimas 1)
Laboratoriniai darbai
Jolanta Sereikaitė

1. β ββ β-galaktozidazės iš Kluyveromyces fragilis specifinio aktyvumo
nustatymas

Darbo tikslas

Nustatyti β-galaktozidazės specifinį aktyvumą.

Tyrimo objektas

β-galaktozidazės iš Kluyveromyces fragilis tirpalas „Lactozym 3000L“ (Novo Nordisk).
β-galaktozidazė (E.C. 3.2.1.23, β-D-galaktozid-galaktohidrolazė, laktazė) – fermentas, hidrolizuojantis
laktozę bei kitus galaktozidus ir atskeliantis β-D-galaktozės liekaną:

O
HO
H
H
H
OH H
H
O
H
OH
H
H
OH H
OH
CH
2
OH
H
CH
2
OH
OH
O
HO
H
OH
H
H
OH H
H
O
H
OH
OH
H
H
OH H
OH
CH
2
OH
H
CH
2
OH
OH O H
2
O


Darbo priemonės

Spektrofotometras, termostatas, verdančio vandens vonia, mikropipetės.

Reagentai

1. 208 mM laktozės tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5.
2. 400 kartų skiestas β-galaktozidazės preparato „Lactozym 3000L“ tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame
buferyje pH 6,5.
3. 80000 kartų skiestas β-galaktozidazės preparato „Lactozym 3000L” tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame
buferyje pH 6,5.
4. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas.
5. Bradfordo reagentas.

Darbo eiga

β-galaktozidazės aktyvumo nustatymas.
Į mėgintuvėlį įpilama 2 mL 208 mM laktozės tirpalo, pašildoma 5 min. 37 °C temperatūroje, supilamas
1 mL 80 000 kartų skiestas β-galaktozidazės tirpalas, sumaišoma ir inkubuojama 30 min. 37 °C
temperatūroje. Reakcija sustabdoma įstatant mėgintuvėlį su reakcijos mišiniu į verdančio vandens vonią
5 min. Lygiagrečiai paruošiamas kontrolinis bandymas su neaktyviu fermentu. 1 mL 80 000 kartų skiesto β-
galaktozidazės tirpalo kaitinama verdančio vandens vonioje 5 min. Paskui įpilama 2 mL 208 mM laktozės
tirpalo ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje.
Susidariusi gliukozė matuojama gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu (gliukozooksidazė,
o-dianizidinas, peroksidazė). Imama 0,5 mL reakcijos mišinio, sumaišoma su 3 mL šio reagento ir
inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Kontrolei: 0,5 mL reakcijos mišinio iš kontrolinio bandymo su
neaktyviu fermentu, 3 mL reagento, inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Absorbcija matuojama, esant
bangos ilgiui 460 nm. Perskaičiavimams iš optinių tankių į gliukozės mikromolius analogiškai atliekamas
eksperimentas su žinomos koncentracijos gliukozės tirpalais intervale 0,1–0,6 µmol/mL. Gaunama
242
kalibracinė kreivė, aprašoma lygtimi y = ax + b, kur b šiuo atveju lygus nuliui (kalibracinę kreivę paruošia
laborantas).

Apskaičiuojamas fermentinis aktyvumas – β-galaktozidazės aktyvumo vienetų skaičius, tenkantis 1 mL
fermento tirpalo (µmol x min
-1
x mL
-1
).
Baltymo koncentracijos nustatymas:
0,2 mL 400 kartų skiesto β-galaktozidazės tirpalo sumaišoma su 2,5 mL Bradfordo reagento ir po 5 min.
matuojama absorbcija, esant bangos ilgiui 595 nm. Analogiškai gaunama kalibracinė kreivė su žinomomis
baltymo (albumino) koncentracijomis intervale 0,01–0,15 mg/mL (kalibracinę kreivę paruošia laborantas).
Žinant baltymo koncentraciją ir β-galaktozidazės aktyvumo vienetų skaičių, tenkantį 1 mL fermento
tirpalo, apskaičiuojamas specifinis β-galaktozidazės aktyvumas (µmol x min
-1
x mg
-1
).

Atsiskaitymas

- fermentų klasės, klasifikavimo principai;
- fermentų aktyvumo vienetai;
- fermentų specifinis aktyvumas;
- baltymų koncentracijos nustatymo būdai.

Literatūra

1. Захарова, Й. Я.; Буглова, Т. Т.; Тихомирова, А. С. Ферменты, трансформирующие галактозу.
Киев, 1988.
2. Диксон, М.; Уэбб, Э. Ферменты. 1 т. Москва, 1982.
3. Price, N. C.; L. Stevens. Fundamentals of enzymology. Oxford University Press, 1999.
4. Лебедева, О. В.; Угарова, Н. Н; Березин; И. В. Биохимия, 42, 1977, c. 1372–1376.
243

2. β ββ β-Galaktozidazės kinetinės kreivės gavimas

Darbo tikslas

Nustatyti β-galaktozidazės kinetinius parametrus K
M
, V
maks.
ir k
kat
.

Tyrimo objektas

β-galaktozidazė iš Kluyveromyces fragilis.

Darbo priemonės

Spektrofotometras, termostatas, verdančio vandens vonia, mikropipetės.

Reagentai

1. 208 mM laktozės tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5.
2. β-galaktozidazės preparato „Lactozym 3000L“ tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5
(baltymo koncentracija 2,5 x 10
-4
mg/mL).
3. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas.
4. Bradfordo reagentas.

Darbo eiga

Bazinis 208 mM laktozės tirpalas skiedžiamas 2, 3, 5, 10, 20 ir 40 kartų 0,1 M kalio fosfatiniu buferiu
pH 6,5 (suskaičiuokite gautų laktozės tirpalų molines koncentracijas). Kiekvienai iš gautų laktozės
koncentracijų nustatomas fermentinės reakcijos greitis v. Tam tikslui į mėgintuvėlį įpilama 2 mL atitinkamos
koncentracijos laktozės tirpalo, pašildoma 5 min. 37 °C temperatūroje, paskui įpilama 1 mL β-galaktozidazės
tirpalo, sumaišoma ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Reakcija sustabdoma įstatant mėgintuvėlį
su reakcijos mišiniu į verdančio vandens vonią 5 min. Lygiagrečiai paruošiamas kontrolinis bandymas su
neaktyviu fermentu. 1 mL β-galaktozidazės tirpalo kaitinama verdančio vandens vonioje 5 min., paskui
įpilama 2 mL atitinkamos koncentracijos laktozės tirpalo ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje.
Susidariusi gliukozė matuojama gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu (gliukozooksidazė,
o-dianizidinas, peroksidazė). Imama 0,5 mL reakcijos mišinio, sumaišoma su 3 mL šio reagento ir
inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Kontrolei: 0,5 mL reakcijos mišinio iš kontrolinio bandymo su
neaktyviu fermentu, 3 mL reagento, inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Absorbcija matuojama, esant
bangos ilgiui 460 nm (gliukozės kalibracinę kreivę ruošia laborantas).
Skaičiuojamas fermentinės reakcijos greitis (M x s
-1
), esant skirtingoms laktozės koncentracijoms.
Brėžiama fermentinės reakcijos greičio priklausomybė nuo substrato koncentracijos.
Panaudojus H. Lainuivero ir D. Berko linearizacijos metodą, apskaičiuojama K
M
ir V
maks
. Žinant
fermento koncentraciją reakcijos mišinyje (β-galaktozidazės molekulinė masė 201000), randama fermentinės
reakcijos katalitinė konstanta k
kat
.

Atsiskaitymas
- fermentinės reakcijos greičio priklausomybė nuo substrato koncentracijos;
- Michaelio ir Menten (Michaelio-Menten)lygtis;
- K
M
fizikinė prasmė.

Literatūra

1. Price, N. C.; Stevens, L. Fundamentals of enzymology. Oxford University Press, 1999.
2. Palmer, T. Understanding enzymes. Ellis Horwood Limited, 1985.
3. Glemža, A. Fermentai. Vilnius, 1987.
244

3. β ββ β-galaktozidazės imobilizacija. Baltymo ir aktyvumo nustatymas
liekamajame imobilizacijos tirpale

Darbo tikslas

Imobilizuoti β-galaktozidazę ant aminosilochromo, išmatuoti imobilizuotojo β-galaktozidazės preparato
ir liekamojo tirpalo aktyvumą.

Tyrimo objektas

β-galaktozidazė iš Kluyveromyces fragilis. β-galaktozidazės imobilizaciją ant aminosilochromo galima
užrašyti schematiškai:
C
O
H
O
H
NH
2
CH
2 3
C
N CH
O
H
CH
2 3
C
E
NH
2
N CH CH
2 3
CH N
E


Darbo priemonės

Spektrofotometras, termostatas, verdančio vandens vonia, mikropipetės, purtytuvas mėgintuvėliams,
termostatuojamosios 25 mL kiuvetės.

Reagentai

1. β-galaktozidazės preparatas „Lactozym 3000L“.
2. 12,5 % glutaro aldehido tirpalas 0,05 M boratiniame buferyje pH 9,2.
3. 208 mM laktozės tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5.
4. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas.
5. Bradfordo reagentas.
6. 0,1 M kalio fosfatinis buferis pH 6,5.

Darbo eiga

β-galaktozidazės imobilizacija.
2 g aminosilochromo užpilama 40 mL 12,5 % glutaro aldehido tirpalu 0,05 M boratiniame buferyje
pH 9,2; vakuumuojama ir purtoma 30 min. kambario temperatūroje. Paskui silochromas plaunamas 100 mL
H
2
O ir 100 mL 0,1 M kalio fosfatinio buferio pH 6,5. Imobilizacijai atsveriama 300 mg drėgno aktyvuoto
aminosilochromo, užpilama 0,5 mL β-galaktozidazės preparato „Lactozym 3000L“ (kurio aktyvumas buvo
matuotas pirmame laboratoriniame darbe) ir 0,5 mL 0,1 M kalio fosfatinio buferio pH 6,5. Reakcija
vykdoma 1 val., purtant kambario temperatūroje. Vėliau aminosilochromas nufiltruojamas, naudojant stiklo
filtrą, praplaunamas 100 mL 0,1 M kalio fosfatinio buferio pH 6,5 ir nustatomas imobilizuotojo preparato
aktyvumas. Filtrate matuojamas liekamasis β-galaktozidazės aktyvumas ir nustatoma baltymo koncentracija.

245
Imobilizuotosios β ββ β-galaktozidazės preparato aktyvumo nustatymas

Į termostatuojamą 37 °C temperatūroje kiuvetę įpilama 5 mL 208 mM laktozės tirpalo, pašildoma
5 min., suberiama 50 mg drėgno imobilizuotos β-galaktozidazės preparato ir inkubuojama maišant 30 min.
Paskui reakcijos mišinys filtruojamas ir matuojamas susidariusios gliukozės kiekis. Imama 0,5 mL 400 kartų
skiesto reakcijos mišinio, įpilama 3 mL gliukozooksidazinio-peroksidazinio reagento ir inkubuojama 30 min.
37 °C temperatūroje. Optinis tankis matuojamas, esant 460 nm bangos ilgiui. Kontrolei: 0,5 mL 0,1 M kalio
fosfatinio buferio pH 6,5, 3 mL reagento ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje (gliukozės kalibracinę
kreivę ruošia laborantas). Apskaičiuojamas imobilizuotojo β-galaktozidazės preparato aktyvumas
(µmol x min.
-1
x g
-1
preparato
).

Baltymo ir β ββ β-galaktozidazinio aktyvumo nustatymas liekamajame imobilizacijos tirpale

Baltymui nustatyti liekamasis imobilizacijos tirpalas skiedžiamas 10 kartų 0,1 M kalio fosfatiniu buferiu
pH 6,5. 0,2 mL skiesto tirpalo sumaišoma su 2,5 mL Bradfordo reagento ir po 5 min. matuojamas optinis
tankis, esant bangos ilgiui 595 nm. Apskaičiuojama baltymo koncentracija (baltymo kalibracinę kreivę
ruošia laborantas).
β-galaktozidazinio aktyvumui nustatyti liekamasis imobilizacijos tirpalas skiedžiamas 20 000 kartų
0,1 M kalio fosfatiniu buferiu pH 6,5. Tada į mėgintuvėlį įpilama 2 mL 208 mM lakozės tirpalo, pašildoma
5 min. 37 °C temperatūroje, supilamas 1 mL skiesto liekamojo tirpalo, sumaišoma ir inkubuojama 30 min.
37 °C temperatūroje. Reakcija sustabdoma įstatant mėgintuvėlį su reakcijos mišiniu į verdančio vandens
vonią 5 min. 1 mL 20 000 kartų skiesto liekamojo tirpalo pakaitinama 5 min. verdančio vandens vonioje,
įpilama 208 mM laktozės tirpalo ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje.
Susidariusiai gliukozei pamatuoti imama 0,5 mL reakcijos mišinio, sumaišoma su 3 mL
gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Kontrolei: 0,5 mL
reakcijos mišinio iš kontrolinio bandymo su neaktyviu fermentu, 3 mL reagento inkubuojama 30 min. 37 °C
temperatūroje. Optinis tankis matuojamas, esant bangos ilgiui 460 nm (gliukozės kalibracinę kreivę ruošia
laborantas). Apskaičiuojamas β-galaktozidazės aktyvumas liekamajame tirpale (µmol x min.
-1
x mL
-1
).
Išmatavę imobilizuotos β-galaktozidazės preparato aktyvumą ir β-galaktozidazinį aktyvumą
liekamajame tirpale, sudarykite aktyvumo balansą.

Atsiskaitymas

- fermentų imobilizacija. Imobilizavimo metodai;
- kovalentinei fermentų imobilizacijai naudojami nešikliai; jų aktyvacija.

Literatūra

1. Кулис, Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов. Вильнюс, 1981.
2. Palmer, T. Understanding enzymes. Ellis Horwood Limited, 1985.
246

4. Tirpiosios ir imobilizuotosios β ββ β-galaktozidazės iš Kluyveromyces
fragilis pH optimumo nustatymas

Darbo tikslas

Nustatyti tirpios ir imobilizuotos β-galaktozidazės pH optimumą laktozės hidrolizės reakcijoje.

Tyrimo objektas

Tirpioji ir imobilizuotoji ant aminosilochromo β-galaktozidazė iš Kluyveromyces fragilis.

Darbo priemonės

Spektrofotometras, termostatas, verdančio vandens vonia, mikropipetės, termostatuojamosios 25 mL
kiuvetės.

Reagentai

1. β-galaktozidazės preparatas „Lactozym 3000L“.
2. Imobilizuotosios ant aminosilochromo β-galaktozidazės preparatas.
3. 208 mM laktozės tirpalas 0,1 M acetatiniame buferyje pH 5,5 ir 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje
pH 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 ir 8,0.
4. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas.

Darbo eiga

Tirpiosios β-galaktozidazės pH optimumo nustatymas.
Tirpiosios β-galaktozidazės pH optimumui nustatyti yra išmatuojamas laktozės hidrolizės reakcijos
greitis, esant pH reikšmėms: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 ir 8,0. Tam tikslui į mėgintuvėlį įpilama 2 mL 208 mM
laktozės tirpalo atitinkamos reikšmės pH buferyje, pašildoma 5 min. 37 °C temperatūroje, paskui supilamas 1
mL 80 000 kartų skiesto β-galaktozidazės tirpalo, sumaišoma ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje.
Reakcija sustabdoma įstatant mėgintuvėlį su reakcijos mišiniu į verdančio vandens vonią 5 min. Lygiagrečiai
paruošiamas kontrolinis bandymas su neaktyviu fermentu. 1 mL 80 000 kartų skiesto β-galaktozidazės
tirpalo kaitinama verdančio vandens vonioje 5 min. Paskui įpilama 2 mL 208 mM laktozės tirpalo
atitinkamos pH reikšmės buferyje ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Hidrolizės reakcijos metu
susidariusi gliukozė matuojama gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu. Imama 0,5 mL reakcijos
mišinio, sumaišoma su 3 mL šio reagento ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Kontrolei: 0,5 mL
reakcijos mišinio iš kontrolinio bandymo su neaktyviu fermentu, 3 mL reagento, inkubuojama 30 min. 37 °C
temperatūroje. Optinis tankis matuojamas, esant bangos ilgiui 460 nm. Apskaičiuojamas fermentinės
reakcijos greitis (µM x min.
-1
) (gliukozės kalibracinę kreivę ruošia laborantas). Brėžiamas reakcijos greičio
priklausomybės nuo pH grafikas, ordinačių ašyje atidedant reakcijos greitį, o abscisių – pH.

Imobilizuotosios β ββ β-galaktozidazės pH optimumo nustatymas

Imobilizuotosios β-galaktozidazės pH optimumui nustatyti išmatuojamas laktozės hidrolizės reakcijos
greitis, esant pH reikšmėms: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 ir 8,0. Į termostatuojamą 37 °C temperatūroje kiuvetę
įpilama 5 mL 208 mM laktozės tirpalo atitinkamos pH reikšmės buferyje, pašildoma 5 min, suberiama 50 mg
imobilizuotosios β-galaktozidazės preparato ir inkubuojama maišant 30 min. Paskui reakcijos mišinys
filtruojamas ir matuojamas susidariusios gliukozės kiekis. Imama 0,5 mL 400 kartų skiesto reakcijos mišinio,
įpilama 3 mL gliukozooksidazinio-peroksidazinio reagento ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje.
Kontrolei: 0,5 mL 400 kartų skiesto 208 mM laktozės tirpalo atitinkamos pH reikšmės buferyje, 3 mL
reagento ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Optinis tankis matuojamas, esant 460 nm bangos
247
ilgiui. Apskaičiuojamas fermentinės reakcijos greitis (µM x min.
-1
) ir brėžiamas imobilizuotos
β-galaktozidazės reakcijos greičio priklausomybės nuo pH grafikas.
Palyginami tirpiajai ir imobilizuotajai β-galaktozidazei gauti pH optimumai.

Atsiskaitymas

- pH įtaka fermentinės reakcijos greičiui. pH optimumas;
- imobilizuotųjų fermentų katalitinės reakcijos priklausomybė nuo pH.

Literatūra

1. Price, N. C.; Stevens, L. Fundamentals of enzymology. Oxford University Press, 1999.
2. Glemža, A. Fermentai. Vilnius, 1987.
3. Hartmeier, W. Imobilized biocatalysts. Springer. Berlin, 1986.
248

5. Tirpiosios ir imobilizuotosios β ββ β-galaktozidazės iš Kluyveromyces
fragilis katalitinio aktyvumo priklausomybė nuo temperatūros

Darbo tikslas

Nustatyti tirpiosios ir imobilizuotosios β-galaktozidazės iš Kluyveromyces fragilis katalitinio aktyvumo
priklausomybę nuo temperatūros laktozės hidrolizės reakcijoje.

Tyrimo objektas

Tirpioji ir imobilizuotoji ant aminosilochromo β-galaktozidazė iš Kluyveromyces fragilis.

Darbo priemonės

Spektrofotometras, termostatas, verdančio vandens vonia, mikropipetės, termostatuojamosios 25 mL
kiuvetės.

Reagentai

1. β-galaktozidazės preparatas „Lactozym 3000L“.
2. Imobilizuotosios ant aminosilochromo β-galaktozidazės preparatas.
3. 208 mM laktozės tirpalas 0,1 M kalio fosfatiniame buferyje pH 6,5.
4. Gliukozooksidazinis-peroksidazinis reagentas.

Darbo eiga

Tirpiosios β-galaktozidazės katalitinio aktyvumo priklausomybė nuo temperatūros.
Nustatomas laktozės hidrolizės reakcijos greitis, esant 25 °C, 30 °C, 35 °C; 40 °C, 45 °C ir 50 °C
temperatūroms. Tam tikslui į mėgintuvėlį įpilama 2 mL 208 mM laktozės tirpalo 0,1 M kalio fosfatiniame
buferyje pH 6,5, pašildoma 5 min. atitinkamoje temperatūroje, paskui supilamas 1 mL 80 000 kartų skiesto
β-galaktozidazės tirpalo, sumaišoma ir inkubuojama 30 min. atitinkamoje temperatūroje. Reakcija
sustabdoma įstatant mėgintuvėlį su reakcijos mišiniu į verdančio vandens vonią 5 min. Lygiagrečiai
paruošiamas kontrolinis bandymas su neaktyviu fermentu. 1 mL 80 000 kartų skiesto β-galaktozidazės
tirpalo kaitinama verdančio vandens vonioje 5 min. Paskui įpilama 2 mL 208 mM laktozės tirpalo ir
inkubuojama 30 min. atitinkamoje temperatūroje. Hidrolizės reakcijos metu susidariusi gliukozė matuojama
gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu. Imama 0,5 mL reakcijos mišinio, sumaišoma su 3 mL šio
reagento ir inkubuojama 37 C temperatūroje. Kontrolei: 0,5 mL reakcijos mišinio iš kontrolinio bandymo su
su neaktyviu fermentu, 3 mL reagento, inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Optinis tankis
matuojamas, esant bangos ilgiui 460 nm (gliukozės kalibracinę ruošia laborantas). Apskaičiuojamas
reakcijos greitis (M x s
-1
) atitinkamose temperatūrose ir brėžiamas reakcijos greičio priklausomybės nuo
temperatūros grafikas, ordinačių ašyje atidedant reakcijos greitį, o abscisių – temperatūrą. Aktyvacijos
energijai apskaičiuoti brėžiamas grafikas Arenijuso koordinatėse.

Imobilizuotosios β ββ β-galaktozidazės katalitinio aktyvumo priklausomybė nuo temperatūros

Nustatomas laktozės hidrolizės reakcijos greitis, esant 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C, 45 °C ir 50 °C
temperatūroms. Tam tikslui į atitinkamoje temperatūroje termostatuojamą kiuvetę įpilama 5 mL 208 mM
laktozės tirpalo 0,1 M fosfatiniame buferyje pH 6,5, pašildoma 5 min., suberiama 50 mg imobilizuotos
β-galaktozidazės preparato ir inkubuojama maišant 30 min. Paskui reakcijos mišinys filtruojamas ir
matuojamas susidariusios gliukozės kiekis. Imama 0,5 mL skiesto reakcijos mišinio, įpilama 3 mL
gliukozooksidazinio-peroksidazinio reagento ir inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Kontrolei: 2 mL
laktozės tirpalo, inkubuoto atitinkamoje temperatūroje 30 min., skiedžiama 400 kartų. Paskui 0,5 mL tirpalo
249
sumaišoma su 3 mL gliukozooksidaziniu-peroksidaziniu reagentu ir inkubuojama 30 min. 37 °C
temperatūroje. Optinis tankis matuojamas, esant bangos ilgiui 460 nm. Apskaičiuojamas reakcijos greitis
(M x s
-1
) atitinkamose temperatūrose ir brėžiamas imobilizuotosios β-galaktozidazės reakcijos greičio
priklausomybės nuo temperatūros grafikas, ordinačių ašyje atidedant reakcijos greitį, o abscisių –
temperatūrą. Aktyvacijos energijai apskaičiuoti brėžiamas grafikas Arenijuso koordinatėse.

Atsiskaitymas

- procesai, lemiantys katalitinio aktyvumo priklausomybės nuo temperatūros pobūdį;
- temperatūrinio optimumo sąvoka;
- Arenijuso lygtis.

Literatūra

1. Price, N. C.; Stevens L. Fundamentals of enzymology. Oxford University Press, 1999.
2. Glemža, A. Fermentai. Vilnius, 1987.
3. Hartmeier, W. Imobilized biocatalysts. Springer. Berlin, 1986.

250
B Bi io ot te ec ch hn no ol lo og gi in ni ių ų m ma ai is st to o p pr ro od du uk kt tų ų t te ec ch hn no ol lo og gi ij jo os s p pa ag gr ri in nd da ai i
Pratybos
Rimantas Garuckas

1. Žaliavos, jų technologinis paruošimas, naudojami įrenginiai, jų
veikimo principas

Darbo tikslas

Susipažinti su alaus gamyboje naudojamomis žaliavomis, jų technologiniu paruošimu, naudojamais
įrenginiais bei jų veikimo principu.

Tyrimo objektas

Žaliavų paruošimo skyrius ir salyklo gamybos cechas.
Naudojamos priemonės ir įrenginiai: orinis separatorius, cilindrinis trijeris, kūgio formos mirkymo
įrenginys, salyklidė su judančia lysve, horizantalioji dviaukštė džiovykla, daigelių numušimo mašina.

Darbo eiga

1.1. Žaliavos

Alaus pramonėje naudojamas salyklas gaminamas iš miežių.
Alaus gamybai naudojami dvieiliai miežiai, nes jų grūdai vienodesnio dydžio ir formos.
Sausoji grūdo medžiaga sudaryta iš organinių ir neorganinių junginių. Organiniai junginiai:
angliavandeniai, baltymai, riebalai, polifenoliai, organinės rūgštys ir vitaminai. Neorganinės medžiagos: P,
S, K, Na, Mg, Ca, C, Cl.
Grūduose esantys angliavandeniai: monosacharidai (gliukozė, fruktozė), disacharidai (sacharozė,
maltozė), trisacharidai (kinozė), polisacharidai (krakmolas, celiuliozė ir pektininės medžiagos). Pagrindą
sudaro krakmolas, kuris ir randamas endosperme grūdelių pavidalu. Miežiuose yra amilolitinių, proteolitinių
ir celiulitinių fermentų.
Grūdo sudėtyje yra ir vitaminų: B1, B2, B6, PP, E, H, folinės rūgšties ir karotino.
Salyklo gamybai skirti miežiai turi būti stambūs, turėti daug krakmolo ir mažai baltymų, subrendę, be
priemaišų, šviesiai gelsvos spalvos (1 lent.)

1 lentelė. Miežių charakteristika

Rodikliai I klasės miežiai II klasės miežiai
Spalva Šviesiai geltona, nepatamsėjusi Šviesiai geltona, nepatamsėjusi
Kvapas Be nemalonaus, pašalinio pelėsių
kvapo
Be nemalonaus, pašalinio pelėsių
kvapo
Smulkių grūdų kiekis, % 5 7
Šiukšlinių priemaišų kiekis, % 1 2

Salyklas – nustatytos temperatūros ir drėgnumo dirbtiniu būdu sudaiginti grūdai. Alaus pramonėje tai yra
pagrindinis pusfabrikatis. Salykle susikaupia amilolitinių, proteolitinių ir celiulitinių fermentų. Veikiant
amilolitiniams fermentams, augalinės žaliavos krakmolas hidrolizuojasi ir virsta maltoze.
Salyklas turi būti šviesiai geltonos spalvos, saldaus skonio. Pašalinis kvapas ir skonis neleidžiami.
Salyklas turi būti švarus, be priemaišų, suskaldytų grūdų kiekis – ne didesnis nei 0,5 %.
Cheminė salyklo sudėtis: krakmolas – 57 %, redukuojantieji cukrūs – 4 %, sacharozė – 5,5 %, tirpūs
pentozanai – 1 %, netirpūs pentozanai ir heksozanai– 9 proc., celiuliozė – 5,5 proc., riebalai – 2,5 proc.,
mineralinės medžiagos – 2,5 proc. Salyklas būna dviejų tipų: šviesusis ir tamsusis.

251































1 pav. Principinė salyklo gamybos schema

1.2. Miežių valymas ir rūšiavimas

Į gamyklą atvežami miežiai turi visokių priemaišų ir yra netinkami alaus gamybai, nes priemaišos ne tik
blogina grūdų kokybę, bet ir mažina sandėliavimo laiką. Tokie miežiai prieš sandėliuojant yra valomi
(1 pav.).
Valymo metu pagrindinė kultūra (miežiai) yra išvaloma nuo priemaišų. Valymas atliekamas oriniame
separatoriuje. Elevatoriumi grūdai iš silosų patenka į orinį separatorių, kur sveiki grūdai askiriami nuo
dulkių, lukštų ir lengvų III–IV rūšies grūdų. Orinis separatorius atskiria grūdus ne tik pagal fizinius
duomenis, bet ir aerodinamines savybes (2 pav.).

Grūdai
Principinis grūdų valymas Priemaišos
Grūdų saugojimas
Antrinis grūdų valymas Priemaišos
Grūdų rūšiavimas
I rūšis II rūšis
Plovimas ir dezinfekcija H
2
0
Dezinfekcijos
priemonės
H
2
0
Nuoplovos
H
2
0
Suspaustas oras
H
2
0
Kondicionuotas oras Oras
Žalio salyklo džiovinimas Karštas oras Oras
Daigų atskyrimas Daigai
Sauso salyklo išlaikymas
Salyklas į gamybą
Daiginimas
Mirkymas
252


2 pav. Orinio separatoriaus schema. 1 – stovas; 2 – sietinis korpusas; 3 – priėmimo sietas; 4 – rūšiavimo sietas,
5 – posietinis sietas; 6 – priėmimo dėžutė; 7 – sraigtas; 8 – sklendės grūdų išleidimui reguliuoti; 9 – smagratis;
10, 11 – nusėdinimo kamerų skyriai; 12, 13 – nusėdinimo kamerų vožtuvai; 14 – mentės priemaišoms pašalinti;
15 – ventiliatoriai; 16, 17 – oro kanalai, 18 – perdavimo įrenginys

Grūdai patenka į dėžutę, kur sraigtu paskirstomi po visą plotį. Toliau jie patenka į kanalą, kur veikiant
stipriai oro srovei yra apvalomi nuo lengvų dalelių (dulkių, šiaudų). Grūdų srovė iš kanalo patenka ant
pirmojo viršutinio sieto, kurio skylučių skersmuo 10–12 mm. Čia atskiriamos stambiosios priemaišos
(akmenukai, žemės gabaliukai). Vėliau ant antrojo (pagrindinio) rūšiuojamojo sieto, kurio skylučių skersmuo
4–5 mm. Čia atskiria likusias priemaišas, kurios stambesnės už grūdus. Smulkias priemaišas ir smėlį pašalina
trečiasis sietas, kurio skylučių skersmuo (1,5–2 mm), o švarūs grūdai iš separatoriaus oro kanale antrą kartą
prapučiami stipria oro srove. Taip pašalinamos dulkės bei lengvos priemaišos, susidariusios separatoriaus
viduje jo darbo metu. Lengvos priemaišos, tokio pat dydžio kaip grūdai, ant sietų yra neatskiriamos, o
pašalinamos tik oro srove. Iš separatoriaus grūdai nukreipiami ant magnetinės plokštumos, kur pašalinamos
visos metalinės priemaišos. Separatoriaus veikimo efektyvumą rodo grūdų kiekis (tonomis) per laiko vienetą
(valandą).
Grūdų skirstymas pagal grūdo dydį yra vadinamas rūšiavimu. Tiktai vienodo dydžio miežių grūdai
pasiekia vienodą drėgnumo lygį ir tolygiai vystosi daiginant. Miežių rūšiavimas vyksta trijeryje, kur jie
surūšiuojami į keturias rūšis. I ir II rūšys tinka gamybai, o III ir IV rūšys naudojamos kaip atliekos ūkiams
(3 pav.).

253


3 pav. Cilindrinis trijeris: 1 – latakas grūdams tiekti; 2 – sraigto mentelė; 3 – gramžtukas; 4 – trijerio paviršius;
5 – sraigtas; 6 – rankenėlė; 7 – velenas

Trijeris susideda iš plieninio cilindro su vidiniu akytuoju paviršiumi. Sukantis cilindrui, trumpi grūdai
gerai telpa į akutes, o ilgi netelpa į akutes ir pakyla į žemesnį aukštį, todėl ilgi grūdai slysta vidiniu
paviršiumi ir lėtai juda į cilindro galą, kur ir išeina iš trijerio. Maži grūdai iš akučių iškris tik tuo atveju, jei jų
svoris bus didesnis nei išcentrinės jėgos.
Grūdų tiekimas turi būti nepertraukiamas, tačiau negalimos ir perkrovos, nes bus prastas rūšiavimas.
Šviežiai nuimti grūdai prastai dygsta, o tai labai svarbu salyklo gamybai, todėl jie turi būti išlaikomi 6–8
savaites, nes per tą laiką jie galutinai subręsta.
Švieži miežiai negali būti naudojami gamyboje, nes nėra visai prinokę. Tokie miežiai mažiau daigūs,
todėl grūdai sandėliuojami apie 2 mėnesius silosuose.

1.3. Miežių mirkymas

Pagrindinis mirkymo tikslas yra suaktyvinti grūdų gyvybinius procesus. Prasiskverbus reikiamam
kiekiui vandens į grūdą, suaktyvėja biocheminiai procesai, susiję su gemalo gyvybine veikla, sustiprėja
kvėpavimas ir aktyvuojasi fermentai. Kad miežiai gerai dygtų, tinkamiausias išmirkymo laipsnis yra
42–45 %. drėgnumo. Gyvybingumo procesai grūde atsiranda kai jų drėgnumas pasiekia 30 %. Kai 38 %
drėgnumas, grūdas greitai dygsta, o kai 44–48 %, pradeda kauptis fermentai ir gerai tirpsta endospermas.
Mirkant grūdų tūris padidėja 35–40 %. Keičiasi jų fizinės savybės. Tvirtas ir trapus grūdas po mirkymo
tampa minkštas ir elastingas.
Grūdo išmirkymas vyksta nevienodai: pradžioje palyginti greitai, o vėliau procesas sulėtėja. Mirkymo
trukmė priklauso nuo daugybės veiksnių: vandens temperatūros ir kietumo, grūdų dydžio. Kuo vandens
temperatūra yra aukštesnė, tuo sparčiau vyksta mirkymas.
Optimaliausia mirkymui vandens temperatūra 10–12 °C.
Grūdų aeracija – vienas iš svarbiausių veiksnių, užtikrinančių gerą grūdų dygimą. Trūkstant deguonies,
prasideda spiritinis rūgimas, kurio produktai trukdo grūdų gyvybinei veiklai.
Dažniausiai naudojami kubilo formos mirkymo įrenginiai.
Mirkymo kubilo paruošimas. Kiekvieną katrą prieš užpilant mirkymo kubilą miežiais, jį būtina išvalyti,
išplauti ir išdezinfekuoti (4 pav.).
Prieš kubilo plovimą iš jo pašalinama angliarūgštė (apipurškiant vandeniu iš žarnos). Paskui kubilas
plaunamas šaltu vandeniu ir dezinfekuojamas. Dezinfekcijai naudojamos chlorkalkės.
254
Ištepus kubilą dezinfekciniu tirpalu, palaikoma 1 val. ir skalaujama šaltu vandeniu.
Miežių dezinfekcija ir mirkymas. Mirkymo pradžioje miežiai dezinfekuojami. Dezinfekcijai naudojama:
chlorkalkės – 0,3 kg vienai tonai miežių arba kalio permanganato (KMnO
4
) – 10–15 g vienam m³ vandens.
Dezinfekuojant chlorkalkėmis – 1,5 kg chlorkalkių ištirpinama 10 l vandens. Į mirkymo kubilą
prileidžiama 0,4 jo tūrio vandens, supilamas perkoštas chlorkalkių tirpalas ir pučiant orą 5 min. maišoma.
Tada supilami grūdai. Dezinfekcinis tirpalas turi apsemti grūdus (neapsemiant pridedama vandens),
intensyviai išmaišoma oru ir paliekama 1,5–2 val. ramybėje. Nuleidus nešvarų vandenį, kubilas iš apačios
pripildomas šviežio vandens, išmaišoma, nuimamos nuoplovos. Miežiai mirkomi nepertraukiamoje vandens
ir oro srovėje (kubilo viršuje nuolat teka vanduo, oro aeratoriais tolygiai per visą kubilo paviršių tiekiamas
oras). Mirkymo trukmė 32 val. Vandens temperatūra 9–10 °C.
Visiško išmirkymo laipsniui (43–45 %) pasiekti grūdai dar drėkinami daiginimo lysvėse.





4 pav. Mirkymo įrenginys: 1 – centrinis vamzdis; 2 – Segnerio ratas; 3 – vamzdelis suspausto oro; 4 – aeratorius,
5 – grotelės; 6 – nuleidžiamasis vamzdis



1.4. Salyklo daiginimas

Daiginimo metu vyksta sudėtingi morfologiniai ir biocheminiai pokyčiai.
Grūdo dygimo metu pasirodo gemalinė šaknelė, kuriai susprogus atsiranda keli daigeliai.
Daiginimo intensyvumui didelę įtaką turi aeracija. Esant nepakankamai aeracijai, grūdai lėčiau dygsta,
bet, esant per dideliam deguonies kiekiui, sparčiai vyksta kvėpavimas ir sunaudojama daug maistinių
medžiagų.
Fermentų aktyvacija. Sausame grūde didžioji dalis fermentų yra neaktyvūs. Daiginant grūdus,
proteolitiniai fermentai suskaldo baltymus ir fermentai pereina į laisvą aktyvią formą. Fermentų aktyvumas
džiovinant salyklą yra išsaugomas.
255
Grūdų kvėpavimas. Dygstančiame grūde, veikiant fermentams, vyksta didelės molekulinės masės
junginių skaldymas. Dygimą lydi intensyvus kvėpavimas. Pagrindinė kvėpavimo medžiaga yra
angliavandeniai, nors kvėpavimo procese gali dalyvauti rūgštys, riebalai ir azotinės medžiagos. Aerobinėmis
sąlygomis maltozė virsta gliukoze, o anaerobinėmis – etilo spiritu.
Angliavandenių skilimas. Nesudygusiame grūde pagrindinė dalis angliavandenių yra netirpūs. Nedidelis
kiekis tirpių cukrų sunaudojamas dygimo pradžioje, o vėliau maistinės medžiagos gaunamos skaldant didelės
molekulinės masės junginius. α-amilazė skaldo krakmolą į dekstrinus, kurios toliau veikia β-amilazės. Taip
krakmolas tampa oligosacharidų, dekstrinų ir monosacharidų mišiniu. Šviežiai sudygusių miežių cukrų
koncentracija yra 3,5 karto didesnė.
pH kitimas. Miežių pH yra apie 6, o salyklo apie 6,25. Tačiau šie rodikliai keičiasi skaidant
angliavandenius, baltymines medžiagas ir organines rūgštis.
Alaus darykloje „Tauras“ salyklo daiginimas vykdo salyklidėse su judančiąja lysve (5 pav.).



5 pav. Salyklidė su judančiąją lysve: 1 – miežių daiginimo dėžė; 2 – sietas; 3 – miežiai; 4 – posietinės zonos;
5 – vartytuvas; 6 – sietų valymo zona; 7 – drėkinimo kubilas; 8 – iškrovimo sraigtas; 9 – kondicionuojamas oras;
10 – orinis kanalas

Iš mirkymo kubilų miežiai hidrauliniu siurbliu išpumpuojami į daiginimo lysvę. Šviežiai išpumpuoti
grūdai 1,5–2 paras apipurškiami iš žarnos vandeniu (visą laiką turi būti drėgni). Dygimo metu temperatūra
palaikoma 12–16 °C.
Judančiojoje lysvėje miežiai kaušiniu vartytuvu vartomi 2 kartus per parą (kas 12 val.). Dygimo metu
temperatūrą palaiko kondicionuojamas oras. Į kondicionavimo kamerą ventiliatoriais tiekiamas lauko arba
patalpos oras, taip pat šaltas ar šiltas vanduo. Daiginimo patalpoje palaikoma oro drėgmė. Miežių dygimo
trukmė – 7 paros.

1.5. Žalio salyklo džiovinimas

Žalias salyklas yra lengvai pažeidžiamas, todėl prieš laikymą jį reikia džiovinti. Turi būti sustabdytos
grūde vykstančios cheminės-biologinės reakcijos. Be to, džiovinimo užduotis yra žalio salyklo kvapo
pašalinimas ir suteikimas aromato, būdingo kiekvienos rūšies salyklui. Džiovinimo metu įvyksta fizikiniai ir
cheminiai pokyčiai. Tamsiojo ir šviesiojo salyklo skirtumas atsiranda keičiant drėgmės pašalinimo greitį,
laiką ir džiovinimo temperatūrą. Fizikiniai pokyčiai lemia grūdo drėgnumą, tūrį, masę ir spalvą.
Dehidratavimo proceso metu išskiriamos dvi stadijos: vytinimo ir visiško išdžiovinimo.
Mirkymo ir daiginimo metu miežio grūdas padidėja ir pasidaro stangrus. Dėl tirpumo grūdo viduje
susidaro mažos tuštumos, kurios teisingai atliekant džiovinimą turi išlikti. Dėl šios priežasties salyklo tūris
16–24 % didesnis nei miežio grūdo.
Ką tik sudygęs ir išlaikytas salyklas nenaudojamas alui gaminti, nes neturi aromato, dažančių medžiagų
ir yra drėgnas. Tam salyklas yra džiovinamas. Džiovinimo temperatūra keliama nuo 20–25 °C iki 80–85 °C.
Tuo metu salyklo daigeliai tampa trapūs ir lengvai pašalinami. Džiovinimas susideda iš 2 dalių: H
2
O
šalinimo (I stadija) ir sausojo salyklo kaitinimo (II stadija). I stadijoje dar vyksta fermentiniai procesai. Šios
256
stadijos metu grūdų drėgmė nukrenta iki 8 %, o II stadijoje – iki 1,5–2 %. Džiovinimo metu salyklas įgauna
spalvą, kvapą ir aromatą. I stadijoje susikaupia cukrūs, amino rūgštys, tirpūs baltymai. II stadijoje, padidėjus
temperatūrai, gemalas žūsta ir fermentų aktyvumas sumažėja. Džiovinimo metu skiriami 3 procesai:
fiziologinis, cheminis, fermentinis.
Fiziologinio proceso metu salyklas įkaista nuo 20 ° iki 45 °C. Gemalas ir daigeliai auga toliau, vyksta
fermentiniai procesai, salyklo drėgnumas sumažėja iki 30 %.
Fermentinio proceso metu temperatūra nuo 45 °C pakeliama iki 70 °C ir gemalo augimas bei
kvėpavimas sustoja, o fermentinai procesai stiprėja, nes hidrolitinių fermentų optimali veikimo temperatūra
45–60 °C.
Cheminio proceso metu temperatūra didinama iki 105 °C. 75 °C temperatūroje fermentinės reakcijos
baigiasi. Šio proceso metu susiformuoja aromatas, suyra fermentai. Amino ir cukrų reakcijos metu susidaro
aldehidai (acetoaldehidas, metilglioksalis), kurie suteikia salyklui malonų skonį ir aromatą. Galutiniai šios
reakcijos produktai suteikia salyklui spalvą.
Drėgmė 3,8–5,8 %, spalva (mL 0,1 N jodo tirpalo) 0,16–0,3, pH 5,6–5,8.
Džiovinimas vyksta horizontalioje dviaukštėje džiovykloje (6 pav.).
Aukštame pastate yra 2 horizontalios grotelės (4, 6). Šviežias salyklas lygiu sluoksniu paskleidžiamas
ant viršutinių grotelių ir čia pašalinama didžiausia vandens dalis. Tada salyklas perkeliamas ant apatinių
grotelių, kur galutinai išdžiovinamas ir susiformuoja spalva, aromatas, skonis. Apatiniame džiovyklos aukšte
yra pečius (9). Karštos dujos iš pečiaus tiekiamos į kaloriferį, kur oras įkaitinamas ir iš čia leidžiamas per
salyklo sluoksnius apatiniame ir viršutiniame aukšte.
Karšto oro srautą reguliuoja vožtuvai. Ant grotelių salyklas periodiškai vartomas. Iš viršutinių grotelių į
apatines salyklas pernešamas per viršutinėse grotelėse esančias angas. Iš apatinių grotelių salyklas
iškraunamas kastuvu. Karšto oro judėjimas iš apačios į viršų vyksta dėl traukos, todėl salyklo sluoksnis
viršutinėse grotelėse neturi viršyti 25 cm. Tam, kad padidintų trauką (ir viršutinių grotelių salyklo storį),
traukos vamzdyje montuojami siurbiamieji ventiliatoriai.

257


6 pav. Horizontalioji dviaukštė džiovykla: 1 – išmetimo vamzdis; 2 – ventiliatorius; 3 – iškrovimo vamzdis;
4, 6 – horizontaliosios grotelės; 5,7 – vertikalieji kanalai; 8 – vožtuvai; 9 – pečius; 10, 11, 12, 13 − kaloriferiai

1.6. Sausojo salyklo apdorojimas ir laikymas

Salyklo daigeliai turi kartų skonį, todėl alaus gamybai naudoti netinka. Daigeliai šalinami iš karto po
džiovinimo. Daigelių numušimo mašina yra būgnas, kurio viduje yra sietai ir besisukančios mentės (7 pav.).

258


7 pav. Daigelių numušimo mašina: 1 – pakraunamasis sraigtas; 2 – mentės; 3 – sraigtas; 4 – ventiliatorius; 5 – sietinis
būgnas

Salyklas su daigeliais tiekiamas į būgno vidų, kur mentės suteikia salyklui sukamąjį judesį. Salyklo
daigeliai įlenda į sieto akutes ir, besisukant būgnui daigeliai nulūžta. Dulkės išsiurbiamos ventiliatoriumi, o
daigeliai pašalinami sraigtu.
Išvalytas salyklas sveriamas ir vežamas į sandėlius. Salyklo laikymo temperatūra neturi viršyti 20 °C.
Prieš tiekiant į gamybą salyklas išlaikomas 30 parų. Tuo metu pasibaigia visi procesai. Neišlaikytas salyklas
yra trapus ir malant susidaro daug smulkių kruopelių bei mažai miltų. Per 4–5 išlaikymo savaites salyklo
drėgnumas padidėja nuo 3–4 % iki 5–6 %. Šviežiai išdžiovintas salyklas saugomas 3–4 m storio sluoksniu.
Į gamybą tiekiamas salyklas turi būti švarus, be daigelių, priemaišų ir pelėsių. Spalva vyrauja nuo
šviesiai geltonos iki geltonos. Salyklo kvapas turi būti švarus ir aromatingas, o skonis saldokas.

Atsiskaitymas

1. Žaliavos parinkimas.
1 Miežių klasifikavimas.
2 Miežių išmirkymas.
3 Salyklo daiginimas.
4 Žalio salyklo džiovinimas.
5 Sausojo salyklo apdorojimas ir laikymas.

Literatūra

1. Колчева, Р. А. Производство пива и безалкогольных напитков. Mocква: Агропромиздат, 1985.
146 c.
2. Мальцев, П. М. Технология солода и пива. Mocква: Агропромиздат, 1964. 516 c.
3. Главинский, Д. Г. Современная техника пивоваренного производства. Mocква: Агропромиздат,
1974. 620 c.
4. LST 44:1993. Alus. Bendrosios techninės sąlygos. Lietuvos standartizacijos tarnyba. 1997. 5 p.
5. Puslapis alaus mėgėjams-Internet: http://www.alutis.lt

259
2. Alaus misos paruošimo technologija

Darbo tikslas

Susipažinti su alaus misos paruošimo įranga, gamybos technologijomis ir režimais.

Tyrimo objektas

Alaus virimo skyrius.

Naudojamos priemonės ir įrenginiai

Miežių malimo malūnas, alaus virimo katilas, mentalo užmaišymo katilas, filtravimo katilas,
šilumokaitis.

Darbo eigos technologijos aprašymas

Svarbiausias procesas alaus gamyboje yra cukraus, esančio misoje fermentacija tam, kad susidarytų
alkoholis ir anglies dioksidas. Pradiniai netirpūs komponentai salykle turi būti paverčiami į tirpius produktus
ir turi būti gaunami ypač tirpūs fermentuojamieji cukrūs. Šių junginių susidarymas ir tirpimas yra misos
gamybos tikslas. Alaus misos paruošimo technologinis procesas apima šias operacijas: salyklo smulkinimą,
mentalo paruošimą, mentalo filtravimą, misos virimą ir misos aušinimą (1 pav.).




1 pav. Alaus misos gamybos technologinė schema

Salyklas iš salyklo laikymo bunkerio (1) perduodamas į grūdų malūną (2), kuriame jis sumalamas iki
tinkamo dydžio. Salyklo grūdai sumaišomi su vandeniu ( mentalo gavimas) ir paskirstomi į du mentalo indus
(3), mentalo perdirbimo indus (arba mentalo kubilus) ir į mentalo virimo katilą tam, kad būtų gauta kuo
daugiau tirpaus ekstrakto. Dažnai naudojamas ir kitas indas, papildomas virimo katilas. Skaidrinimo inde
(mentalo atskyrimo inde) (4) tirpusis ekstraktas misoje yra atskiriamas nuo netirpiųjų medžiagų, nuo
saladino. Tada misa verdama su apyniais misos virimo katile (5). Šioje stadijoje išgaunamas kartus alaus
260
skonis. Misos virimo katile virimo pabaigoje nustatyta ekstrakto išeiga padeda kontroliuoti ekstrakto virimo
procesą. Karšta misa yra atskiriama nuo nusodintų dalelių whirpool′y (specialiame sūkuriniame kubile) (6) ar
centrifugoje ir ataušinama lėkšteliniame šilumokaityje (7), nes toliau fermentacija turi būti vykdoma
žemesnėje temperatūroje. [1]
Salyklo smulkinimas. Tam, kad salykle esantys fermentai pereitų į misą, salyklas turi būti susmulkintas.
Susmulkinus grūdus, ekstraktyviosios medžiagos tampa prieinamos vandeniui, taip pat pagreitėja tirpumas ir
kiti cheminiai bei fizikiniai procesai.
Prieš ekstrahuojant salyklas smulkinamas valcais. Gaunami tokie malimo produktai: lukštai, stambios ir
smulkios kruopos, miltai, pudra. Malimo kokybė labai priklauso nuo filtravimo būdo. Salyklas malamas
smulkiam filtravimui filtravimo presuose ir rupiam filtravimui filtravimo bosuose. Lukštai filtravimo
bosuose sudaro purų natūralų filtrą, ir misa geriau filtruojasi. Gerai sumaltame salykle yra 12–15 % lukštų,
45–50 % kruopų ir 35 % miltų. Salyklas malamas dviejų, keturių, penkių ir šešių velenų valcais. Šešių
velenų valcus sudaro lygių velenų poros ir rantytų velenų pora. Pradžioje salyklas rupiai smulkinamas
pirmąja lygių velenų pora ir malinys sijojamas sijotuvėje. Sietus praeina kruopelės ir miltai, o lukštai ir
stambios kruopos malamos antrąja lygių velenų pora. Paskui malinys vėl sijojamas sijotuvėje, kur išskiriami
lukštai, miltai ir kruopos, kurios dar malamos rantytų velenų pora. Tokiu būdu gaunama daug smulkių
kruopelių su lukštu. Likę lukštai naudojami filtravimui. Lukštai filtruojant katiluose sudaro purų natūralų
filtrą, todėl misa geriau filtruojasi. Gerai sumaltame salykle yra apie 15–20 % lukštų, 30 % miltų ir 45–50 %
kruopų.
Mentalo paruošimas. Sumaišius smulkintą salyklą su vandeniu, gaunama vienalytė tešlos pavidalo
masė, vadinama mentalu. Iš mentalo atskyrus netirpias dalis, gautas tirpalas vadinamas misa, o misos
tirpiosios dalys – ekstraktu.
Ruošiant mentalą, iš salyklo siekiama gauti kuo daugiau tam tikros sudėties, atitinkančios alaus rūšį,
ekstrakto. Salykle yra nedaug (10–15 %) vandenyje tirpių medžiagų: cukrų, dalis baltymų ir jų skilimo
produktų, šiek tiek pentozanų, pentozių, pektino, tanino ir karčiųjų rūgščių. Didžioji ekstrakto dalis susidaro
mentale, veikiant fermentams. Amilazė skaldo krakmolą iki dekstrinų ir maltozės, proteolitiniai fermentai
baltymus verčia tirpiomis azotinėmis medžiagomis, fitazė skaldo fitiną į inozitą ir fosfatus. Šie
fermentaciniai procesai prasideda daiginant salyklą ir daug greičiau vyksta mentale, esant palankiai
temperatūrai ir pakankamam vandens kiekiui. Mentale fermentaciniai procesai reguliuojami keičiant
aplinkos temperatūrą, pH ir virimo metu inaktyvuojant fermentus. 45–50 °C temperatūroje geriausiai
skaldomos azotinės medžiagos. 50 °C temperatūra yra palankiausia aminorūgštims kauptis, o 70–75 °C
temperatūroje greičiau skyla krakmolas, bet daugiau susidaro dekstrinų negu 60–65 °C temperatūroje. Taigi
ilgiau ar trumpiau išlaikant minėtąją temperatūrą, reguliuojama baltyminių medžiagų ir krakmolo hidrolizė.
Mentale svarbiausias fermentacinis procesas yra krakmolo hidrolizė, veikiant amilazei. Amilolitiniai
fermentai greitai veikia krakmolo kleisterį, kuris pradžioje skystėja, o paskui susicukrina į dekstrinus ir
maltozę. Miežių krakmolas kleisterizuojasi 60–80 °C temperatūroje, o skystėja, veikiant fermentams ir esant
optimaliam režimui – 65–70 °C temperatūrai ir pH 4,6. Sucukrinant krakmolą, jo skilimas turi būti gilus, kad
misoje nebūtų amilo- ir eritrodekstrinų. Misoje turi būti ne tik maltozės, bet ir tam tikras kiekis achro-,
maltodekstrinų, nuo kurių alus yra klampesnis ir geresnio skonio. Santykis tarp maltozės ir dekstrinų
priklauso nuo α- ir β-amilazės veikimo. Optimalios sąlygos α-amilazei veikti mentale yra 70 °C temperatūra
ir pH 5,8, o β-amilazei – 60–65 °C temperatūra ir pH 5,4. α-amilazė inaktyvuojama 80 °C temperatūroje, o
β-amilazė – 70–75 °C temperatūroje. Misos ekstrakte nustatomas cukrų ir necukrų santykis. Cukrų kiekį
sudaro maltozė, gliukozė ir kiti redukuojantieji cukrūs, vadinami žalia maltoze. Necukrums priskiriami
dekstrinai ir visos organinės bei neorganinės medžiagos, nepasižyminčios redukuojančiomis savybėmis.
Mentale labai svarbus procesas yra baltyminių medžiagų hidrolizė. Baltymų skylimo produktai turi
įtakos alaus skoniui, putojimui ir laikymui. Jie taip pat reikalingi mielėms maitinti. Mentale daugiausia
veikia proteinazės, kurios baltymus verčia albumozėmis, pentonais ir polipeptidais. Peptidazės yra jautrios
aukštesnei temperatūrai ir inaktyvuojamos džiovinant salyklą.
Albumozės, peptonai, polipeptonai ir aminorūgštys sudaro grupę tirpių baltymų, kurie verdant
nekoaguliuoja. Mentale šiek tiek tirpsta organiniai fosfatai. Veikiant fitazei jie iš dalies skaldomi į inozitą ir
neorganinius fosfatus. Nuo inozito mielės labiau auga, dauginasi, o neorganiniai fosfatai reikalingi mielėms
maitinti. Be to, fosforas (fosforo rūgšties pavidalu) dalyvauja alkoholinio rūgimo reakcijose.
Ruošiant mentalą, susidaro melanoidinai, o dalį jo virinant, susidaro karamelė. Tada mentalo spalva
sodrėja. Rauginės medžiagos oksiduojasi į flobafenus, turinčius įtakos mentalo spalvai. Nuo į tirpalą
261
perėjusių lukštų rauginių ir karčiųjų medžiagų blogėja jo skonis. Šių medžiagų tirpumas esti didesnis, kai pH
aukštesnis. Dėl to, parūgštinus vandenį iki pH 5,2 pieno rūgštimi, gaunama šviesesnė, švelnesnio skonio
misa ir padidėja ekstrakto išeiga, aktyviau veikiant amilolitiniams ir proteolitiniams fermentams.
Mentalui ruošti yra daugelis būdų. Jie visi skirstomi į dvi grupes: užpylimo (infuzinius) būdus ir virimo
(dekokcinius) būdus.
Ruošiant užpylimo (infuziniais) būdais, visas mentalas šildomas lėtai iki 75 °C temperatūros
(nevirinant). Tai pagrindiniai būdai aukštutinio rūgimo alaus misai gaminti. Mentalas šildomas iki 45–50 °C
temperatūros, joje išlaikomas 1 h, pašildomas iki 62–63 °C ir išlaikomas 30–40 min., paskui pašildomas iki
75 °C temperatūros, joje išlaikomas 10–15 min. ir varomas į filtravimo bosus. Mentalo paruošimo bosuose
temperatūra keliama 1–2 °/min. greičiu.
Ruošiant virimo (dekokciniais) būdais, dalis mentalo virinama, o paskui sumaišoma su nevirintomis
mentalo dalimis ir mentalo temperatūra pakeliama iki 75 °C. Gaminant mentalą šiais būdais, jį veikia ne tik
fermentai, bet ir aukšta temperatūra (virinant). Tai klasikiniai būdai žemutinio rūgimo alaus misai gauti.
Mentalui virti naudojamas mentalo bosas, virimo katilas, filtravimo bosas arba filtravimo presas ir misos
virimo katilas.
Yra trijų, dviejų ir vieno virimo būdas. Klasikinis mentalo paruošimo būdas yra trijų virimų. Mentalas
pradedamas ruošti 35 °C temperatūroje. Viena trečioji tiršto mentalo dalis leidžiama į virimo katilą, iš lėto
šildoma iki virimo ir išlaikoma, esant optimaliai baltymo skilimo ir sucukrinimo temperatūrai. Gaminant
šviesų alų, virinama 10–15 min., o garinant tamsų – 20–30 min. Grąžinus į mentalo bosą virintą mentalo
dalį, viso mentalo temperatūra pakyla iki 50–55 °C. Tada vėl 1/3 tiršto mentalo leidžiama į virimo katilą ir
užvirinama. Grąžinus antrą kartą virintą dalį, mentalo masės temperatūra pakyla iki 62–65 °C. Pagaliau,
grąžinus trečią kartą pavirintą mentalo dalį, temperatūra pakyla iki 75 °C ir mentalas varomas į filtravimo
bosus. Pasiekus visos masės 70 °C temperatūrą, suardomi fermentai. Šis būdas trunka ilgiausiai, bet
daugiausia taikomas tamsiam alui gaminti ir blogiau daigintam salyklui perdirbti.
Dviem būdais virtas mentalas pradedamas ruošti 50 °C temperatūroje. Po pirmojo virimo jo temperatūra
pakyla iki 62–63 °C, o po antrojo − iki 75 °C.
Vieno virimo mentalo paruošimo būdas yra labai panašus į užpylimo būdą. 35 °C mentalas yra po truputį
kaitinamas iki 50°C temperatūros ir palaikomas, paskui visas mentalas pakaitinamas iki 64 °C temperatūros.
Tada imama dalis mentalo ir varoma į virimo katilą. Grąžinus mentalą, jo temperatūra siekia 75 °C. Šis
metodas labiausiai tinka gaminant šviesų alų.
Bet kuriuo būdu ruošiant mentalą, turi būti gaunama misa, kurioje būtų pakankamas rauginamų cukrų
kiekis [3].
Skaidrinimas. Saladinas susideda daugiausia iš lukštų, daigų ir kitų medžiagų. Misa yra naudojama
tikalaus gamyboje, todėl turi būti kaip galima geriau atskirta nuo saladino. Šis atskyrimo procesas vadinamas
skaidrinimu (mentalo filtravimu). Skaidrinimo metu turi būti išgauta kaip galima daugiau ekstrakto.
Skaidrinimas yra filtracijos procesas, kurio metu saladinas vaidina filtro vaidmenį. Skaidrinimas vyksta
dviem stadijomis:
♦ pirminės misos ištekėjimas,
♦ saladino apipurškimas – ekstrakto išplovimas (antrinė misa).
Misos išsunkimas iš saladino vadinamas pirmine misa. Kai misa išsunkiama iš saladino, pastarasis dar
turi ekstrakto. Dėl ekonominių sumetimų šis ekstraktas turi būti išgautas. Todėl, ištekejus pirminei misai,
saladinas yra apipurškiamas. Apipurškimas pamažu praskiedžia misą.
Saladino sulaikytas ekstraktas išplaunamas karštu vandeniu. Šis procesas vadinamas apipurškimu.
Mažesnis ištekančios misos kiekis po apipurškimo vadinamas antrine misa.
Apipurškimui naudojamas vandens kiekis priklauso nuo pirminės misos kiekio, jos koncentracijos ir nuo
norimos gauti koncentracijos virimo katile.
Kuo didesnis apipurškimui naudojamo vandens kiekis praeina pro saladiną, tuo didesnis vandens kiekis
turi būti vėl išgarintas.
Skaidrinimo temperatūra yra labai svarbi. Filtruojamo mentalo temperatūra turi būti 75–77 °C.
Temperatūrai didėjant, mažėja skysčio klampa. Vadinasi, skaidrinimas greičiausiai vyks 100 °C
temperatūroje. Nors ištirpęs likęs krakmolas kiekvienu atveju išplaunamas iš saladino apipurškimo metu,
vėlyvasis cukrinimas α-amilaze gali vykti su sąlyga, kad nebuvo inaktyvuota didesne nei 78 °C temperatūra.
262
Kadangi α-amilazė sunaikinama 80 °C temperatūroje, skaidrinimo metu būtina palaikyti žemesnę
temperatūrą.
Apipurškimas vykdomas tol, kol pasiekiama norima koncentracija virimo katile.
Mažaprocentinė misa, kuri išteka vėliausiai, vadinama paskutine frakcija arba paskutine misa. Stipraus
alaus atveju paskutinė frakcija vis dar turi ekstrakto kiekį apie 0,5–0,6 %. Ši paskutinė frakcija kartais
naudojama kaip vanduo mentalui sudaryti kitame alaus gamybos procese. Artėjant prie paskutinių frakcijų
išgavimų, didėja pereinančių į tirpalą nepageidaujamų medžiagų (polifenolių ir karčiųjų medžiagų iš lukštų,
silikato rūgšties ir t. t.) kiekiai.
Norint gauti geros kokybės alų, nereikėtų daug kartų kartoti apipurškimo procedūros: nors tai ir pagerina
išeigą, bet pablogina kokybę.
Kai paskutinės frakcijos vis dėlto panaudojamos, jos turėtų būti apdorotos aktyviąja anglimi tam, kad
būtų pašalinti nepageidautini skonio komponentai. Ar bus naudojamos paskutinės frakcijos, lemia ir
ekonominiai rodikliai.
Mentalas atskiriamas arba skaidrinimo (filtravimo) kubile, arba mentalo filtre (2 pav.).
Skaidrinimo aparatas pagamintas iš chromo nikelio plieno ir yra termiškai izoliuotas. Jį sudaro
cilindrinės formos indas, kurio viduje yra dar vienas indas su sietiniu dugnu. Mentalas yra tiekiamas iš
apačios tam, kad būtų palaikomas deguonies pasisavinimas. Apačioje yra 2–6 uždaromi įleidimo vožtuvai,
kurie turi užtikrinti ne didesnį kaip 10 min. ištekėjimo laiką.



2 pav. Filtravimo kubilas:
1 – Vožtuvo vamzdis; 9 – Saladino plokštė; 17 – Pagrindas;
2 – CIP- ryšys; 10 – Saladino vožtuvas; 18 – Mentalo įleidimas;
3 – Hidraulinės sistemos ryšys;
11 – Mentalo įleidimo
vožtuvas;
19 – Filtravimo sistema;
4 – Tiekimo anga; 12 – Pavara; 20 – Filtravimo sistema;
5 – Hermetiškas dangtis;
13 – Dvigubo dugno
skalavimas;
21 – Drumstos ir skaidrios misos siurblys;
6 – Apipurškimo vandeniu ryšys; 14 – Filtravimo vamzdžiai; 22 – Hidraulinis kėlimo ir nuleidimo įrenginys;
7 – Hidraulinis cilindras; 15 – Žiediniai vamzdžiai; 23 – Mentalo siurblys;
8 – Peilių juostos; 16 − Grotelės; 24 − Saladino konvejeris
263

Veiksmų seka skaidrinimo kubile apima kelias stadijas:
1. Oro išvarymas.
2. Mentalo įpumpavimas.
3. Mentalo stingimas.
4. Drumstos misos išpumpavimas atgal.
5. Pirmosios misos ištekėjimas.
6. Apipurškimas.
7. Saladino pašalinimas.
Kad būtų staigiai nuskaidrinama, dvigubas dugnas turi būti išvalytas nuo nešvarumų ir oro burbulų, kurie
trukdo filtruoti. Taigi karštas vanduo yra tiekiamas per dvigubą dugną iš apačios ir tuo pat metu jį
kaitindamas.
Mentalas kaip galima greičiau tiekiamas į skaidrinimo kubilą ir ten paskirstomas. Nuo nevienodo
saladino pasiskirstymo priklauso netolygi ekstrakcijos ir redukcijos išeiga. Todėl pumpavimo metu turi būti
palaikomas kaip galima mažesnis greitis, tam, kad būtų išvengta netolygaus išsimaišymo. Pageidautina, kad
mentalas būtų pumpuojamas iš apačios. Mentalo laikymo inde pumpavimo metu veikia maišytuvai, taigi
mentalas yra išmaišytas.
Įpumpavus mentalą, saladinas stingsta iki 30–40 cm aukščio (iki 60–70 cm, esant drėgnam malimui), ir
pirmoji misa susirenka virš jo. Taigi saladinas panaudojamas kaip natūralus filtro sluoksnis. Šis procesas
trunka 5–30 min. Stingstant saladinui, jo dalelės pasiskirsto 3 sluoksniais – nuo sunkiausių apačioje iki
lengviausių viršuje. Pirmiausia iš filtro teka drumsta misa, todėl ji varoma atgal į filtravimo kamerą.
Kuo didesnė galutinė mentalo temperatūra, tuo laisvesnės saladino dalelės ir tuo greitesnis skaidrinimas.
Dėl šios priežasties skaidrinimo metu turi būti vengiama vėsinimo. Nuleidus misą, iš apačios leidžiamas
80 °C vanduo, kuris išplauna ekstraktą iš netirpios dalies. Tokiu būdu gaunama antroji misa. Masė plaunama
tol, kol joje lieka ne daugiau kaip 0,5 % ekstrakto.
Pirmosios misos koncentracija yra visur vienoda. Pirmoji misa praeina pro saladiną ir šitaip
išfiltruojama.
Skaidrinimo pabaiga nustatoma matuojant misos koncentraciją misos katile. Skaidri nufiltruota misa
siunčiama į virimo katilus. [1]
Misos virimas. Misa virinama 1–2 val. tam, kad stabilizuotųsi jos sudėtis. Virimo metu pridedama
apynių.



Verdama dėl kelių priežasčių:
misa turi pasiekti reikiamą koncentraciją (išgaruoja vanduo);
misa sterilizuojama ir dezaktyvuojami enzimai;
pašalinami nestabilūs baltymai;
išlaisvinamos karčiosios apynių skoninės medžiagos;
pašalinamos nereikalingos aromatinės medžiagos. [5]
Misos virimo metu kartumas ir aromatiniai apynių komponentai yra perduodami į misą ir tuo pat metu
nusodinami baltymai. Apyniai turi įtakos putoms susidaryti ir veikia kaip antiseptikas. Misa verdama misos
virimo katile, kuris įrengtas taip, kad virimas vyktų sklandžiai. Galutinis misos virimo produktas yra karšta
galutinė misa. Misos virimo metu vyksta keletas svarbių procesų:
264
1. Ekstrakcija ir apynių komponentų perdavimas.
2. Baltymų polifenolių kompleksų formavimas ir nusodinimas.
3. Vandens išgarinimas.
4. Misos sterilizavimas.
5. Fermentų sunaikinimas.
6. Misos spalvos intensyvėjimas.
7. Misos rūgštinimas.
8. Redukcinių medžiagų formavimasis.
9. Dimetilsulfido kiekio misoje poveikis.
Alaus gamybai svarbūs apynių komponentai yra šie:
♦ apynių dervos ar apynių karčiosios medžiagos;
♦ apynių eterinis aliejus;
♦ apynių polifenoliai.
Apynių dervos arba karčiosios medžiagos yra svarbiausi apynių komponentai alaus gamyboje, nes jie
suteikia alui būdingą kartumo skonį.
α-rūgštys yra visiškai netirpios šaltoje misoje. Verdančioje misoje pasireiškia pokyčiai α-rūgščių
struktūroje, kurie remiasi izomerizacija. Izo- junginiai yra tirpesni nei α-rūgštys. α-rūgščių izomerizacija
virimo metu nebaigta. Vidutiniškai 1/3 pridėtų α-rūgščių regeneruojama verdančioje misoje izo- junginių
forma. Izohumulono išeiga verdant ir alaus kartumas priklauso nuo:
♦ Izohumulono rūšies. Skirtingi α-rūgščių komponentai izomerizuojami iki skirtingų dydžių. Naudojamos
įvairios apynių rūšys, turinčios daugiau humulono, kad būtų gauta daugiau karčiojo alaus.
♦ Virimo trukmės. Ilgėjant virimo laikui, izohumulono išeiga didėja. Dauguma α-rūgščių izomerizuojasi
virimo pradžioje ir virimo metu izomerizacijos greitis mažėja.
♦ pH. Kuo didesnis pH, tuo geresnė izomerizacija, bet kartumas, gautas esant žemam pH, yra labiau
subalansuotas.
♦ Humulono koncentracijos. Izohumulono išeiga mažėja, kai didėja pridedamų apynių kiekis, tačiau
mažėjimas yra nedidelis (iki 10 %).
♦ Apynių malimas padidina ekstrakcijos greitį ir karčiųjų medžiagų išeigą.
Apynių polifenoliai yra tirpūs vandenyje ir ištirpsta iškart. Polifenolių tarpe yra antocianogenų, taninų ir
katechinų.
Polifenoliai iš apynių ir salyklo visiškai ištirpsta misoje ir susiformuoja junginiai su baltymais. Salyklo
polifenoliai yra chemiškai aktyvesni.
Yra daug bakterijų, kurios, jei nesunaikintos, gali alų parūgštinti ir pereiti į mentalą su salyklo dulkėmis.
Virimo metu misoje dar tebesantys keli fermentai visiškai sunaikinami, todėl vėliau nebeatsiranda
nekontroliuojamų misos turinio pasikeitimų. Esant tam tikroms sąlygoms, turi būti pridedama salyklo
ekstrakto ar pirmosios misos tam, kad visiškai suskiltų krakmolas.
Misa patamsėja. Virimas lemia melanoidinų formavimąsi ir polifenolių oksidaciją. Dėl to virimo
pabaigoje spalva patamsėja. Spalva šiek tiek pašviesėja fermentacijos metu.
Misa parūgštėja dėl to, kad virimo metu susiformuoja melanoidinai, o ir apynių poveikis yra šiek tiek
rūgštinantis.
Nevirintos misos pH yra apie 5,8–5,9. Virtos misos pH yra apie 5,5–5,6. Dauguma svarbių procesų
geriau vyksta esant žemesniam pH. Tai tokie procesai, kaip:
♦ geras baltymų–polifenolių kompleksų nusėdimas, misai verdant, kai pH 5,2;
♦ mažesnis spalvos patamsėjimas, esant žemesniam pH;
♦ geresnis, skanesnis apynių kartumas, esant žemesniam pH;
♦ mažesnis mikroorganizmų atsparumas, esant žemesniam pH.
Tačiau, naudojant žemesnį pH, blogesnis apynių karčiųjų medžiagų panaudojimas, dėl to reikia imti
daugiau apynių. Taip pat pageidautina parūgštinti nevirintą misą.
Misos virimo metu susiformuoja medžiagos, kurios gali reaguoti su misa ir šitaip lemti redukcinį
poveikį. Šios medžiagos vadinamos reduktonais. Tai, pavyzdžiui, melanoidinai.
Dimetilsulfidas (DMS) yra labai lakus sieros junginys, kurį aluje galima aptikti pagal jo nemalonų kvapą
ir skonį. Todėl pageidautina, kad aluje jo būtų kaip galima mažiau (50–60 µg DMS/l).
265
Cinko kiekis misoje. Cinko misoje turėtų būti bent jau 0,1–0,15 mg/l. Cinkas dalyvauja baltymų
sintezėje mielių ląstelėse ir kontroliuoja jų nukleorūgščių ir angliavandenių metabolizmą. Trūkstant cinko,
blogėja putų stabilumas aluje.
Virimas trunka 60–100 minučių. Pageidaujama virti ilgą laiką ir stipriai, nes
♦ daugiau karčiųjų medžiagų pereina į tirpalą;
♦ koaguliuojantys baltymai geriau nusėda;
♦ daugiau DMS pašalinama.
Tačiau ilgiau verdant sunaudojama daugiau energijos, todėl verdama kiek galima trumpiau.
Prieš pradedant virti svarbu patikrinti, ar cukrinimas pasibaigęs. Gali būti, kad mentalo gavimo ir
skaidrinimo metu daugiau krakmolo junginių pereina į tirpalą ir jie nesucukrinami, nes aukšta temperatūra
aktyvina amilazes. Kad būtų išvengta krakmolo drumstumo aluje, vykdomas papildomas cukrinimas,
pridedant pirminės misos ar salyklo ekstrakto (vėliau to pataisyti jau neįmanoma).
Labai svarbus procesas yra baltymų koaguliavimas (nes tirpūs baltymai drumsčia misą). Šis procesas
vyksta dviem etapais. Iš pradžių baltymai denatūruoja ir praranda dalį vandens, paskui koaguliuoja jungiantis
micelėms. Iš pradžių baltymai iškrenta mažomis dalelėmis, bet paskui juos verdant susidaro dideli dribsniai.
Geriausias koaguliantas susidaro, esant pH 5,2. Filtruota karšta misa teka į virimo katilus ir į ją pridedama
apynių. Dedama ne tik natūralius apynius, bet ir apynių ekstraktus. Apynių kiekis priklauso nuo gaminamos
alaus rūšies ir gali svyruoti nuo 100 iki 500 g į 1 hl. Apyniai racionaliau suvartojami veikiant juos ultragarsu,
t. y. 20–30 % daugiau karčiųjų medžiagų iš to paties kiekio apynių, taip pat gerėja alaus kokybė, geriau
denatūruojami prastesni baltymai.
Misa verdama sandariuose katiluose, esant aukštam slėgiui. Taip verdant misą, labiau koaguliuojami
baltymai, geriau nuskaidrėja alus, tampa biologiškai patvaresnis. Pagrindiniai rodikliai, rodantys virimo
pabaigą, yra misos koncentracija ir susidarę dribsniai. Baigus virimą, apynių liekanos ir kitos netirpios
dalelės atskiriamos specialiame nusodintuve (whirpool) (4 pav.).
Tada tikrinami tokie parametrai:
♦ misos skaidrumas;
♦ vėlusis cukrinimas;
♦ išvirtos misos kiekis;
♦ išvirtos misos ekstrakto turinys.
Dribsniai iš išvirtos misos vadinami šiurkščiaisiais arba karštaisiais dribsniais. Tai didelės (30–80 µm
dydžio) dalelės, kurios yra sunkesnės už misą ir gerai nusėda, suformuodamos kompaktišką masę, jei
suteikiama pakankamai laiko. Šie dribsniai turi būti pašalinami. Tai daroma nusodintuve.
Nusodintuvas yra vertikalus cilindrinis indas be vidinės įrangos, į kurį pumpuojama misa. Tai sukelia
inde sukamąją tėkmę. Ji lemia karštų dribsnių nusėdimą kūgio formos indo viduryje.
Whirpool yra uždaras cilindrinis indas plokščiu dugnu, su 2 % palinkimu išėjimo angos link.
Nusodintuvas izoliuojamas, kad būtų išvengta vėsinimo iš išorės. Yra tokių whirpool nusodintuvų, kurie
vietoj plokščio dugno turi kūgišką įdubimą pagrindo viduryje.
Misa įleidžiama dažniausiai per du kartus:
♦ vienas įleidimas dugne, kad būtų išvengta deguonies pasisavinimo,
♦ įleidimas apatiniame trečdalyje, kad būtų sukeliama rotacija. Išėjimas visada yra žemiausio whirpool
taško pusėje.

266


4 pav. Nusodintuvas Whirpool: 1 – garų pašalinimo dūmtraukis; 2 – viršutinis dangtis; 3 – kondensuotojo vandens
pašalinimas; 4 – CIP valymas; 5 – apšvietimas; 6 – šoninis langas ir angos dangtis; 7 – šoninė siena; 8 – izoliavimas;
9 – pagrindas su 1 % šlaitu; 10 – CIP dugno purkštuvas; 11 – tangentinis įleidimas; 12 – išėjimas

Svarbu, kokiu būdu misa įpumpuojama į whirpool. Misos įtekėjimo greitis neturėtų viršyti 5 m/s. Dažnai
pakanka daug mažesnių greičių, kad būtų sukelta misos rotacija ir išgaunamas sūkurio efektas. Misa
whirpool nusodintuve būna 20–40 min. [1]

Fermentų naudojimas

Amilosubtilinas G20x – hidrolitinių fermentų kompleksas, turintis šiuos aktyvumus: α-amilazinį
~ 600 vnt/g, proteolitinį ~ 50 vnt/g ir β-gliukanazinį, ne mažesnį nei 400 vnt/g. Tai šviesiai rudi milteliai,
kuriuose paprastai esti ir amilosubtilino G20x, ir protosubtilino G20x. Šie komponentai gaminami iš
skirtingų Bacillus subtilis kamienų, auginamų giluminiuose fermentatoriuose, filtruojant kultūrinį skystį ir
koncentruojant filtratą ultrafiltracijos būdu, paskui džiovinant jį purkštuvinėje džiovykloje. Fermentiniai
preparatai fasuojami po 10 kg polietileniniuose maišuose, kurie pakuojami į 3–4 sluoksnių popierinius
maišus. Pagrindiniai naudojami preparatai: amilosubtilinas, protosubtilinas, multienziminės kompozicijos
(MEK), citorozeminas (Px). Amilosubtilinas imamas norint pakeisti 20–30 % blogo ištirpimo salyklo
nesalyklinėmis medžiagomis, tai ~ 0,5–1 kg fermentų mišinio / 1 t nesalyklinių medžiagų (pvz.: kukurūzai,
ryžiai ir kt.). Prieš vartojimą preparatai paprastai išmaišomi nedideliame kiekyje šalto vandens ir, ruošiant
mentalą nusistovėjimo būdu, visas preparatas supilamas žaliavų užmaišymo metu, kai temperatūra 40–45 °C;
o pavirinimo būdu 1/2–2/3 preparato dozuojama į mentalo dalį su nesalyklinėmis medžiagomis, esant 40–
45 °C, o likusioji dalis – į mentalą su salyklu.
Misos aušinimas. Kadangi mielės veikia žemoje temperatūroje, misa turi būti atšaldoma kaip galima
greičiau iki 5–6°C arba iki 7–10°C.
Misa vėsinama iki rauginimo temperatūros. Ją aušinant, išgarinama dalis vandens. Dėl to padidėja misos
koncentracija, misa sugeria deguonį, kuris chemiškai veikia sudėtines jos dalis, ir nusėda iškritusios
medžiagos. Deguonį misa sugeria fiziniu ir cheminiu būdu. Aukštesnėje temperatūroje deguonis naudojamas
organinėms medžiagoms oksiduoti: cukrums (fruktozei), apynių dervoms, azotinėms ir rauginėms
medžiagoms. Žemesnėje temperatūroje deguonis tirpsta misoje, visiškai ją prisotindamas. Viename litre
ataušintos misos yra 7 mg deguonies.
Misos aušinimo būdai skirstomi į:
1. Ant šaldomų lėkščių bei drėkinamuose vamzdeliniuose šaldytuvuose. Šio proceso metu misa labai
užkrečiama oro mikroorganizmais, kas labai sumažina alaus biostabilumą ir gadina skonį.
2. Uždaros nusistovėjimo šaldymo talpos (virpuliai) padeda išvengti užkrėtimo.
267
3. Plokšteliniai šaldytuvai (šilumokaičiai) – čia misa aušinama šaltu vandeniu. Šilumos perdavimas vyksta
per plonas chromo bei nikelio plieno plokšteles, kurios gali būti įvairių dydžių ir formų.



5 pav. Plokštelinio šilumokaičio plokštelės: 1 – misos įtekėjimas; 2 – misos ištekėjimas; 3 – aušinančiojo vandens
įtekėjimas; 4 – aušinančiojo vandens ištekėjimas; 5 – guminis sandarinimas

Plokšteliniame šilumokaityje misa aušinama šaltu vandeniu. Šilumos perdavimas vyksta per plonas
chromo bei nikelio plieno plokšteles, kurios gali būti įvairių dydžių ir formų (5 pav.).
Plokštelinis šilumokaitis sudarytas iš daugelio plonų metalinių plokštelių, išsidėsčiusių viena po kitos,
tarp kurių paeiliui teka misa ir šaltas vanduo. Šaldomasis agentas bei šąlanti misa plonu sluoksniu patenka į
priešingas kiekvienos plokštės puses ir juda vienas prieš kitą.
Kad būtų gerai perduodama šiluma, reikia:
• panaudoti labai plonas metalines plokšteles;
• plokštelės turi būti tokios formos, kad sukeltų turbulentiškumą;
• kad tarp plokštelių būtų labai mažas tarpas;
• panaudoti priešsrovinę misos ir šalto vandens tėkmę;
• kad tėkmės kryptis būtų dažnai keičiama.
Plokštelės sukabinamos rėmelyje ant lygiagrečių strypų, kurie pritvirtinti prie atramos, ir sandariai
suspaudžiamos tarpusavyje.
Plokštelinis šilumokaitis sudarytas iš:
• rėmelio su suspausta įranga;
• sujungtų plokštelių;
• šilumos perdavimo plokštelių.
Ypač svarbu, kad plokštelės būtų tankiai suspaustos tarpusavyje ir būtų užtikrinamas šilumokaičių
sandarumas.
Plokšteliniame šilumokaityje karšta misa atšaldoma šaltu vandeniu nuo maždaug 98–95 °C iki 6–8 °C
raugimo temperatūros. Vanduo, kuriuo vėsinama misa, įkaista. Tokiu būdu šiluma perduodama iš karštesnės
misos šaltesniam vandeniui. Šis šilumos perdavimas priklauso nuo kelių veiksnių.
Karštesnis skystis atiduoda šilumą per sienelę šaltesniam skysčiui.
Svarbūs šie temperatūros pokyčio veiksniai:
• sienelės storumas;
• medžiaga, iš kurios padaryta sienelė;
• šilumos laidumo koeficientas (λ).
Šilumai perduoti per sienelę yra svarbūs šie veiksniai:
• šilumos perdavimo iš skysčio sienelei koeficientas;
268
• šilumos laidumo koeficientas;
• šilumos perdavimo iš sienelės skysčiui koeficientas.
Taigi:
• šiluma besikeičiantys skysčiai turi tekėti priešingomis kryptimis;
• skysčiai judėti turi greitai;
• turi būti išlaikomas švarus medžiagos paviršius;
• turi būti naudojamos didelį šilumos laidumo koeficientą turinčios šilumokaičio plokštelės.
Aušinimas gali būti vykdomas viena arba dviem pakopomis.
Dviejų pakopų vėsinimas. Parengiamojo aušinimo skyriuje misa perduoda šilumą procese naudojamam
šaltam vandeniui. Kol misa aušinama iki 16–18 °C temperatūros, aušinimo vanduo įkaista iki 80–88 °C
temperatūros. Kitame žemesnės temperatūros aušinimo skyriuje misa vėsinama lediniu 1–2 °C vandeniu iki
norimos raugimo temperatūros. Ledinis vanduo įšyla (bet išlieka žemesnės nei proceso vanduo temperatūros)
ir grąžinamas atgal į ledinio vandens šaldytuvą.
Vienos pakopos vėsinimas. Šio proceso metu iki 1–2 °C atšalęs ledinis vanduo įšyla plokšteliniame
šilumokaityje iki 80–88 °C, kol karšta 95–98 °C misa aušinama iki raugimo temperatūros.
Plokštelinio šilumokaičio privalumai:
• plokštelinis šilumokaitis neužima itin daug vietos;
• vyksta geras šilumos perdavimas, esant nedideliam slėgio mažėjimui;
• lengvai išvalomas;
• misa šaldytuve išbūna labai trumpą laiką;
• nepasireiškia užteršimo rizika, užtikrinamas misos sterilumas, nes šis šilumokaitis nekontaktuoja su
atmosferos oru. [1]
Separavimas. Tai pagreitintas nusodinimas, kurio metu, veikiant išcentrinėms jėgoms, svorio jėga
padidėja iki 5000 kartų (Leval firmos Švedijoje aparatai). Jie būna periodinio veikimo ir su automatiniu
susikaupusių atliekų šalinimu, nepertraukiant separatoriaus darbo. Separatoriuje būna 3 cilindrinės kameros,
sudarytos iš nerūdijančio plieno įdėklų. Separatoriaus būgnas tvirtinamas prie vertikaliojo veleno, kurį suka
apie 6000 aps/min. greičiu galingas variklis sliekine pavara. Per separatoriaus viršutinės dalies atvamzdį
misa savitaka patenka į vidinę cilindrinę kamerą, iš kur nuosekliai pereina iš vienos kameros į kitą, atsimuša
į būgno sienelę ir, jau nuskaidrėjusi, per nuvedimo vamzdį spaudimu išmetama į separatoriaus viršutinę dalį.
Išcentrinės jėgos misos nuosėdas su didesniu lyginamuoju svoriu atmeta prie kameros ir būgno sienelių, kur
jos ir nusėda. Tokių separatorių našumas 5–10 m
3
/val.
Misą galima separuoti prieš ar po šaldymo. Labiau paplitęs karštas separavimas, nors vėliau, išsiskyrus
šaltoms baltyminėms dalelėms, misa gali kiek padrumslėti. Separuojant atšaldytą misą, separatoriaus
našumas sumažėja perpus dėl padidėjusio klampumo, todėl geriausia derinti abu metodus.
Filtravimo separatoriais pranašumai: pagerėja higieninės proceso sąlygos ir misos sterilumas, sutrumpėja
nuskaidrinimo ciklas, gerokai sumažėja gamybinis plotas ir eksploatavimo išlaidos, sumažėja ekstrakto
nuostoliai.

Atsiskaitymas

1. Alaus misos ruošimas, salyklo smulkinimas, mentalo paruošimo operacijos.
2. Mentalo filtravimo, misos virimo su apyniais technologinės operacijos.
3. Mentalo virimo būdai ir jų metu vykstantys procesai.

Literatūra

1. Kunze international edition Technology brewing and malting. Germany, Berlin: WLB, 1996. 726 p.
2. Главачек, Ф.; Алхотский, А. Пивоварение. Mocква: Агропромиздат, 1977. 294 c.
3. Venskevičius, J.; Bernatonis, J. Bendroji maisto produktų technologija. Vilnius: Mokslas, 1977. 248 p.
4. UAB „Utenos alus“, Internetas: http://www.utenosalus.lt
5. AB „Utenos gėrimai“, Internetas: http://www.utenosgerimai.htm
6. LST 44 : Alus. Bendrosios techninės sąlygos. Vilnius, 1993. 41 p.
7. AB „Kalnapilis“, Internetas: http://www.kalnapilis.lt
269

3. Alaus fermentavimo ir išlaikymo technologija

Darbo tikslas

Susipažinti su alaus gamyboje vykstančiais fermentacijos ir išlaikymo procesais.

Tyrimo objektas

Fermentacijos ir išlaikymo technologiniai procesai.

Naudojamos priemonės ir įrenginiai

Fermentavimo talpos, aušinimo įrenginys (vamzdis vamzdyje), išlaikymo talpos.

Darbo eiga

Pagrindinis rūgimas vyksta atviruose arba uždaruose rauginimo įrenginiuose. Šoninėje įrenginio sienoje
10–15 cm aukščiau dugno yra čiaupas nuleisti jaunam alui, o dugne – čiaupas nusėdusioms mielėms
pašalinti, viduje yra gyvatukas skysčiui aušinti.
Pagrindinis rūgimo biocheminis procesas yra cukrų virtimas į etilo alkoholį ir anglies dioksidą:

C
6
H
12
O
6
→ 2C
2
H
5
OH + 2CO
2
.

Vykstant šiai reakcijai, išsiskiria šiluma.
Didžioji dalis misos susideda iš angliavandenių. Apytiksliai apie 75 % %% % jų dalyvauja reakcijoje. Kitą
dalį sudaro dekstrinai, baltymai, mineralinės medžiagos ir kt.
Prasidėjus reakcijai, pirmiausia suskaldoma fruktozė ir gliukozė. Sacharozė skyla iki fruktozės ir
gliukozės veikiant mielėse esančius fermentus β-fruktafuranozidaze. Po fruktozės ir gliukozės mielės vartoja
maltozę, kuri veikiant fermentui α-glikozidazei virsta į gliukozę.
Šios reakcijos metu maltozė skaldoma lėtai ir nevisiškai.
Etilo alkoholis ir anglies dioksidas yra pagrindiniai spiritinio rūgimo produktai. Be jų, misoje susidaro
glicerinas, acto aldehidas, acto, gintarinė, citrinų ir pieno rūgštys. Iš amino rūgščių susidaro aukštesnieji
alkoholiai, būtent jie turi įtakos alaus aromatui ir skoniui.
Rūgstant misai aerobinėmis sąlygomis, ji tampa jaunu alumi. Visi susidarę produktai taip pat turi įtakos
alaus aromatui ir skoniui.
Prieš supilant mieles į rauginimo įrenginį, jos tam skirtame inde sumaišomos su šalta misa (2–6 l misos
ir 1 l mielių). Maišoma steriliu suspaustu oru arba maišytuvu ir paliekama 2–3 val., kad prasidėtų rūgimas.
Temperatūra turi būti 6 °C.
Šiltos misos (5–7° C) į rauginimo aparatą pilama tiek, kad apsemtų jo dugną. Paskui dedamos mielės,
išmaišoma ir supilama visa likusi misa.
Pirmojoje rūgimo stadijoje, vadinamoje pabalimu, misos paviršiuje pasirodo švelniai baltos putos. Ši
stadija trunka 1–1,5 paras ir apibūdinama kaip intensyvus mielių pumpuravimas.
Antrąją rūgimo stadiją – žemųjų „garbanų“ periodą apibūdina didesnis CO
2
išskyrimas, tankios
kylančios putos susidarymu, kuri panaši į garbanas. Putos iš pradžių būna baltos, vėliau tamsėja, nes apynių
smalos oksiduojasi. Ši stadija trunka 2–3 paras.
Trečioji rūgimo stadija – aukštųjų „garbanų“ periodas. Tai didžiausias rūgimo intensyvumas, maksimali
viso proceso temperatūra. Puta pasidaro puri, silpnai kyla į viršų, „garbanos“ pasidaro didžiausios, viršutinės
„garbanos“ įgauna rudą spalvą, o apatinės – baltą. Ši stadija trunka 3–4 paras.
Ketvirtojoje rūgimo stadijoje, vadinamoje „garbanų“ kritimu, „garbanos“ nyksta, putos nusėda. Dėl to
misos paviršius pasidengia plonu sluoksniu. „Garbanų“ nykimas vyksta dvi paras.
Krintant misos pH, mielių ląstelės pasidengia slidžia plėvele, turinčia klijuojamųjų savybių. Lipdamos
vienos su kitomis, jos nusėda į dugną.
270
Mielėms nusėdus, rūgimas nutraukiamas, ir jaunas alus nuskaidrinamas šildant. Tuo baigiamas
pagrindinis rūgimas. Gautas produktas vadinamas jaunu alumi.
Išlaikant alų, vyksta tie patys procesai, kaip ir pagrindiniame rūgime, bet lėčiau, nes jaunas alus
laikomas mažesnėje temperatūroje (0–2 °C).
Išlaikant alų, vyksta šie procesai: karbonizacija, nuskaidrinimas, subrandinimas.
Karbonizacija. Jaunas alus turi apie 0,2 % CO
2
. Jį išlaikant reikia padaryti taip, kad po filtravimo liktų ne
mažiau kaip 0,3 % CO
2
. Rauginant jauname aluje esantį ekstraktą, jis ir yra CO
2
šaltinis.
Anglies dvideginis yra aluje ir ištirpsta ir susiriša su ekstrakto komponentėmis. Taip pat dalis CO
2
yra
angliarūgštės pavidalu.
CO
2
↔ CO
2
↔ CO
2

surištas ištirpęs dujinis

Nuskaidrinimas. Į išlaikymą patenkantis alus turi tam tikrą kiekį mielių ląstelių. Atšaldant alų iki
0–2°C, atsiskiria medžiagos, kurios vykstant pagrindiniam rūgimui buvo surištos su tirpalu. Alus pamažu
skaidrėja. Nuskaidrinimo stadijoje nepasiekiamas visiškas alaus skaidrumas, bet tai pasiekiama filtruojant
alų.
Brandinimas. Brandinant jauną alų, jam būdingas mielių ir apynių skonis išnyksta. Veikiant deguoniui,
jauname aluje diacetilo koncentracija sumažėja iki 40–50 %. Vertinant alų, į vertinimo sistemą įeina
diacetilo ir organinių sieros junginių koncentracijos. Alaus branda vertinama organoleptiškai.
Alaus nokinimas
Po fermentavimo alus noksta, stabilizuojasi ir yra prisotinamas angliarūgštės. Nokinimas trunka įvairiai,
jis priklauso nuo alaus rūšies ir technologinio proceso (nuo 8–12 parų (Utenos alui) iki 21 paros
„Žiguliniam“ alui), po kurių alus įgyja visas norimas skonio ir kvapo savybes.
Nokinimas vyksta, esant temperatūrai nuo 0 iki +4 °C vertikaliuose arba horizontaliuose tankuose esant
CO
2
slėgiui nuo 0,03 iki 0,06 MPa („Žiguliniam“ alui).
Tankai, kuriuose vyksta šis procesas, paprastai pagaminti iš aliuminio arba plieno. Vertikalūs ir
horizontalūs tankai skiriasi tik atramų buvimo vietomis ir čiaupų išdėstymu. Vertikalūs geriau panaudoja
gamybinių patalpų erdvę. (1−4 pav.)

Alaus skirstymas pagal fermentacijos tipą

Žemutinio rūgimo fermentacjos alus (angliškai vadinamas lager) paprastai yra šviesios spalvos ir
lengvo, ryškesnio skonio dėl trumpesnės ir „šaltesnės“ (2–10 °C) fermentacijos bei ilgesnio nokinimo laiko.
Bene populiariausios šios grupės alaus rūšys yra Pilsener, Münchener Helles, Bock, Doppelbock, Marzen ir
amerikietiškasis Lager alus.
Pilsener
Yra dvi šio alaus rūšys: vokiškasis Pilsener ir Bohemijos Pilsener. Vokiškoji rūšis yra laikoma šviesaus
apatinio rūgimo fermentacijos alaus pasauliniu standartu. Tuo tarpu Bohemijos rūšis, atsiradusi Čekijos
mieste Pilzene, XIX a. labiausiai padėjo Lager tipo alui išplisti visame pasaulyje. Abi šios Pilsener rūšys yra
labai panašios, tačiau klasikinis vokiškasis alus paprastai yra šiek tiek šviesesnis už čekiškąjį ir yra kiek
silpnesnio apynių aromato.
Münchener Helles
Ši alaus rūšis itin populiari pietinėse Vokietijos srityse. Münchener Helles yra švelniai kartus ir nelabai
stiprus alus, jį geriant gerai jaučiamas salyklo skonis. Tačiau kai kurios šio alaus atmainos gaminamos labiau
išryškinant apynių aromatą. Münchener Helles visuomet yra labai šviesios spalvos.
Bock
Šis stiprus alus, turintis maždaug 6,5 % alkoholio tūrio, dėl savo „šildomųjų“ savybių nuo seno
gaminamas Vokietijoje žiemos laikotarpiu. Bock rūšis kilusi iš Žemutinės Saksonijos, tačiau dabar šis alus
dažniau siejamas su Bavarija. Šios rūšies alaus spalva gali kisti nuo gana šviesios iki tamsiai rudos. Bock
paprastai yra vidutinio kartumo, jį geriant gerai juntamas salyklo skonis.
Doppelbock
Doppelbock išsiskiria stiprumu (nuo 7 iki 12 % alkoholio tūrio). Doppelbock yra intensyvios gintaro
spalvos ir dažnai būna gerai juntamo vaisių aromato. Toks alus paprastai nėra labai kartus.

271
Marzen
Šis vario spalvos alus kilęs iš Vienos, tačiau vėliau jo gamybos procesas buvo patobulintas Miunchene
(Vokietija). Vokietijoje Marzen alus būdavo pradedamas nokinti kovo mėnesį ir laikomas iki pat Oktoberfest
šventės, kuri tradiciškai rengiama rudenį, po derliaus nuėmimo. Pastaruoju metu Marzen alų visoje
Vokietijoje išstūmė vadinamasis festbiere, kuris yra kiek stipresnis ir populiaresnis per Oktoberfest šventę.
Amerikietiškasis Lager
Šios rūšies alus dažniausiai yra švelnaus skonio ir turi daugiau angliarūgštės nei gaminamas Europoje.
Gamindami Lager alų, amerikiečiai gana dažnai naudoja kukurūzų arba ryžių priedų. Pastaruoju metu taip
pat itin išplito vadinamasis light alus, kuris yra ypač švelnus, šviesus ir smarkiai prisotintas angliarūgštės.

Viršutinio rūgimo fermentacijos alus (angliškai vadinamas ale) paprastai išsiskiria tamsesne spalva.
Šios grupės alus fermentuojamas 10–20 °C temperatūroje ir gana trumpai nokinamas. Ale tipo alaus skonis
paprastai apibūdinamas kaip ryškus ir ilgai išliekantis burnoje. Šiai grupei priklauso tokios populiarios alaus
rūšys kaip altbier, bitter, stouts, porter, weissbier, pale.
Altbier
Šis alus gaminamas Diuseldorfe ir kai kuriuose kituose šiaurinės Vokietijos regionuose pagal senovinę
viršutinio rūgimo fermentacijos technologiją, naudojama daug apynių. Kartais šis alus daromas iš kviečių
salyklo. Altbier alus yra vario spalvos, aromatingas, išsiskiria kartoku skoniu.
Bitter
Ši rūšis yra bene labiausiai paplitusi Anglijoje ir Velse. Bitter alus dažniausiai būna rausvos spalvos,
tačiau gaminama ir šviesesnių šios rūšies atmainų, kurios pradėjo ypač populiarėti pastaruoju metu. Bitter
yra „sauso“ skonio su gerai juntamu apynių kartumu. Šis alus dažniausiai turi apie 3,5 % alkoholio tūrio,
nors gaminamos ir stipresnės rūšys (English special bitter, English extra-special bitter).
Stouts
Stout yra tradicinis airiškas alus, į kurį dedama stipriai degintų miežių. Kartais šiam alui naudojami
avižų priedai. Stout alus yra tirštas, labai tamsios spalvos, neskaidrus ir išsiskiria itin standžia puta. Skonis
paprastai yra švelnus ir ilgai išliekantis.
Porter
Porter tipo alus yra gana tirštas, tamsiai rudos spalvos, kiek primenančios stout alų. Tačiau tamsi porter
spalva gaunama dėl ypatingai paruošiamo tamsaus salyklo, o ne dėl degintų miežių priedo, kuris naudojamas
stout alui gaminti. Porter skonis būna labai įvairus ir svyruoja nuo saldaus iki kartaus.
Weissbier
Išskirtinė šio alaus savybė yra ta, kad jam naudojamas miežinio ir kvietinio salyklo mišinys. Weissbier
brandinamas buteliuose arba statinaitėse. Taip pat įprasta, kad šiame aluje būtų mielių nuosėdų. Toks alus
nėra kartus, dažnai juntamas vaisių, vanilės ar gvazdikėlių prieskonis. Spalva gali kisti nuo šviesiai iki
tamsiai rudos.
Pale
Šio blyškaus alaus spalva gali kisti nuo visai šviesios iki vario rausvumo. Geriant Pale tipo alų, gerai
juntamas apynių kartumas ir vaisių prieskonis. India Pale Ale rūšis buvo specialiai sukurta XIX a. tam, kad
alus nesugestų jį plukdant laivais iš Anglijos į Indiją.

Savaiminio rūgimo fermentacijos alus (angliškai lambic) yra gaminamas beveik vien Belgijoje.
Verdant šio tipo alų, dažnai pridedama vaisių, uogų ir cukraus, todėl jo skonis smarkiai skiriasi nuo įprasto
alaus.
Kriek
Šis tamsios spalvos alus gaminamas pridedant kriek rūšies vyšnių, kurios sukelia antrinę fermentaciją ir
suteikia gėrimui papildomą vaisių bei migdolų skonį. Tokia alaus gamybos technologija Belgijoje egzistuoja
jau keletą amžių.
Geuze
Ši rūšis gaminama maišant „jauną“ ir „seną“ lambic tipo alų. Taip maišant sukeliama antrinė
fermentacija, dėl kurios alus būna savotiškas, gausiai putoja. Toks alus tradiciškai nėra filtruojamas,
pasterizuojamas ar šaldomas. Geuze alus, kaip ir šampanas, parduodamas kamščiu uždarytais buteliais.
Faro
Anksčiau tai buvo bene labiausiai paplitęs lambic tipo alus. Faro alus yra silpnas ir dažniausiai saldomas
cukrumi. Šiais laikais šios rūšies alus beveik nebegaminamas.
272
Atsiskaitymas

1. Alaus fermentavimo technologinis režimas.
2. Alaus išlaikymo technologinis režimas.

Literatūra

1. Dagys, V. Darau savo alų. Ūkininko patarėjas, 2000. 8 c.
2. Колнева, Р. А.; Ермолаева, А. Производство пива и безалкогольных напитков. Москва, 1985.
468 c.
3. Главачек, Ф.; Алхотский, А. Пивоварение. Москва, 1977. 448 c.
4. Alus, Internetas: http://www.utenosalus.lt
5. Alaus gamyba, Internetas: http://www.alutis.lt

273


1 pav. Cilindrinis − kūginis tankas: 1 – produkto įėjimas ir išėjimas; 2, 3 – šaldymo agento įėjimas ir išėjimas;
4 – termometras; 5 – plovimo galvutė; 6 – mėginių paėmimas; 7 – vandens ir dezinfekcinio skysčio čiaupas;
8 – įlaidas; 9 – sklendė; 10 – CO
2
išėjimas
274



2 pav. Cilindrinė fermentacijos talpa: 1 – alaus čiaupas; 2 – liukas; 3 – mėginių paėmimas; 4 – įlaidas; 5 – slėgmačio
sriegė; 6 – suspaustojo oro čiaupas; 7 – stovai; 8 – mechaninio plovimo įrenginys



3 pav. Principinė technologinė nepertraukiamos fermentacijos ir išlaikymo schema: 1 – fermentacijos talpa;
2 – matuoklis; 3 – nusėsdintuvas; 4 – šaldytuvas; 5 – dekantatorius; 6 – separatorius; 7, 8, − rauginimo talpos;
9 – siurblys; 10 – separatorius; 11 – lėkštė; 2 – jauno alaus talpa; 13 – karbonizatorius; 14 – brandinimo talpa;
15 – saikininkas










275




























4 pav. Principinė technologinė nepertraukiamos fermentacijos ir išlaikymo schema (APV): 1 – misos talpa; 2 – misos
su mielėmis talpa; 3 – fermentacijos talpos; 4 – brandinimo talpos; 5, 7, 9, 11 – tarpinės talpos; 6 – CO
2
surinktuvai;
8 – saikininkas; 10, 12 brandinimo talpos; 13 – alaus surinkimo talpos

4. Alaus mielių gamybos technologija

Darbo tikslas

Susipažinti su alaus gamyboje naudojamomis mielėmis, jų paruošimo technologija, naudojamais
įrenginiais bei jų veikimo principu.

Tyrimo objektas

Alaus mielių gamybos cechas.

Naudojamos priemonės ir įrenginiai:

1. Ganzeno aparatas.
2. Greinerio aparatas.
3. Praplovimo ir laikymo vonelė.
4. Apdorojimo, paruošimo ir perpumpavimo aparatas.

Darbo eiga

1. Bendroji mielių charakteristika

Mielių charakteristika
276

Mielės – tai didžiausias žemesniųjų augalų skyrius. Jį sudaro apie 100 000 grybų rūšių. Grybai –
aerobiniai, heterotrofiniai, saprofitiniai, kai kurie parazitiniai, neturintys chlorofilo augalai, paplitę dirvoje ir
vandenyje. Vieni jų yra makrofitai, sudarantys didelius vaisiakūnius. Jiems priklauso kepurėtieji, tarp jų
valgomieji, grybai. Dauguma jų yra mikrofitai, matomi pro mikroskopą, dažnai vadinami pelėsiais.
Grybai būna vienaląsčiai ir daugialąsčiai. Jų ląstelių citoplazmą supa tvirta sienelė. Citoplazmoje yra
mitochondrijų, lizosomų, voliutino, lipidais užpildytų vakuolių, vienas ar keli branduoliai. Grybuose yra
kaupiamas ne krakmolas, kurį kaupia aukštesniųjų augalų ląstelės, o glikogenas. Ląstelių sienelėse yra
chitino, o vienas iš medžiagų apykaitos produktų yra šlapalas. Todėl pagal šiuos, skirtingus nuo augalų,
požymius grybai artimi gyvūnams, o pagal absorbcinį mitybos būdą ir neribotą ląstelių dauginimąsi –
augalams.
Dauguma grybų intensyviai gamina įvairias biologiškai aktyvias medžiagas: fermentus (amilazes,
proteazes, pektinazes), augimo stimuliatorius (giberelinus), antibiotikus (peniciliną ir kt.). Todėl tikrų grybų
grynos kultūros auginamos pramoniniu būdu ir gaminamos minėtos biologiškai aktyvios medžiagos. Mielės
naudojamos etilo alkoholio, alaus, vyno, giros, duonos bei pyrago gaminių gaminiams. Nefermentuojančiųjų
mielių rasės auginamos nemaistiniuose substratuose (sulfitiniuose popieriaus ir celiuliozės žlaugtuose,
augaliniuose hidrolizatuose, naftos angliavandeniliuose) ir naudojamos kaip baltyminis ir vitamininis pašaras
gyvuliams šerti.
Pagal grybienos sandarą grybai yra skirstomi į žemesniuosius ir aukštesniuosius. Žemesnieji grybai yra
vienaląsčiai. Šiems grybams priskiriamos trys klasės: chitridiomicetų (Chytridiomycetes), oomicetų
(Oomycetes), zigomicetų (Zygomycetes). Aukštesniųjų grybų grybiena gerai išsivysčiusi. Micelis yra gerai
išsivystęs, sudarytas iš vienabranduolių ir daugiabranduolių ląstelių (daugialąstis). Šiems grybams
priskiriamos trys klasės: aukšliagrybiai (Ascomycetes), papėdgrybiai (Basidiomycetes), grybšiai
(Deuteromycetes).
Aukšliagrybių klasėje yra apie 30 000 rūšių. Jai priklauso mielės ir daugialąsčiai grybai. Mielės
dauginasi dažniausiai pumpuravimu ir konidijomis. Lytinio dauginimosi metu susiformuoja maišeliai –
askai, kuriuose paprastai esti aštuonios askosporos. Grybai turi nariuotą micelį, yra heterotrofai, saprofitai,
gadina maisto produktus ir pašarus. Tarp jų yra ir daug kultūrinių augalų parazitų. Daugelis šios klasės grybų
turi svarbią pramoninę reikšmę.
Aukšliagrybių klasė skirstoma į du poklasius: plikaaukšlių (Protoascomycetidae) ir tikraaukšlių
(Euascomycetidae). Plikaaukšlių poklasio grybai nesudaro vaisiakūnių. Poklasyje yra dvi eilės: mieliečių
(Endomycetales) ir ragangrybiečių (Taphrinales). Mieliečių eilei priklauso dvi labai svarbios šeimos:
Saccharomycetaceae ir Endomycetaceae. Saccharomycetaceae šeimos svarbiausia gentis – mieliagrybis
(Saccharomyces). Paprastai šios genties grybai vadinami mielėmis. Jos yra apvalios, ovalios arba elipsės
formos ląstelės (1 pav.). Jų dydis – apie 10×15 µm. Mielės – fakultatyviniai anaerobai, nesudaro micelio,
tačiau, daugindamosi pumpuravimu ir išskirdamos gleives, gali laikinai sulipti nepatvariomis grandinėlėmis
arba kuokšteliais. Šios šeimos mielės specialiuose maišeliuose arba aukšliuose (askuose) gali suformuoti
askosporas, kuriomis dauginasi. Jų sporos daugiausia apvalios arba ovalios, tačiau pasitaiko ir kitokios
formos (2 pav.). Kultūrinių mielių sugebėjimas sudaryti sporas yra susilpnėjęs, o kai kurios gentys jų
nesudaro. Mielių ląsteles supa stora sienelė. Kai kurių rūšių ląstelės išskiria gleives, kurios suklijuoja ląsteles
į dribsnius, skystose terpėse nusėdančius ant dugno. Tai labai svarbi savybė alaus gamyboje. Ląstelių
citoplazmą dengia membrana. Citoplazmoje yra ribosomų, mitochondrijų ir branduolys, diferencijuotas
dviguba membrana. Be šių organoidų, citoplazmoje randama atsarginių medžiagų: glikogeno, voliutino,
riebalų. Senstančiose ląstelėse atsiranda vakuolių, pilnų sulčių. Mielių ląstelės judėjimo organoidų neturi,
todėl yra nejudrios. Mielės turi svarbią pramoninę reikšmę, naudojamos etilo alkoholio, alaus, vyno, giros,
duonos gamyboje. Kai kurių genčių (Pichia, Hansenula, Debaryomyces) mielės, patekusios į kepimo ar
pašarinių mielių, spirito, alaus vyno fermentatorius, sutrikdo gamybos procesą, mažina pagrindinės
produkcijos išeigą ir blogina kokybę. Jos gali daugintis ir įvairiuose cukringuose produktuose (uogienėse,
sultyse, vaisiuose, uogose). Todėl tokios mielės gadina maisto produktus bei gėrimus. [4]

277


1 pav. Saccharomycetaceae šeimos mielių ląstelių formos: 1 – kiaušiniškos (Sacch. Cerevisiae); 2 – pailgos (Pichia);
3 – elipsinės (Sacch. Ellipsodeus); 4 – citriniškos (Pseudosacch. Apiculatus); 5 – lazdelinės (Sacch. Pasteurianus)


2 pav. Saccharomycetaceae šeimos kai kurių genčių mieliagrybių sporos: 1 – Saccharomyces, 2 – Fabospora;
3 – Zygopichia, 4 – Hansenula, 5 – Williopsis, 6 – Debaromyces, 7 – Schwanniomyces, 8 – Metschnikowia





278
1.2. Alaus mielių charakteristika

Alui gaminti naudojamos specialių rasių mielės. Mikroorganizmai jį gadina. Alus yra silpnai alkoholinis
gėrimas, pagamintas iš miežių salyklo, apynių ekstrakto ir mielių. Jame yra apie 90 % vandens, 1,5–7,5 %
alkoholio, 0,3 % anglies dioksido, 5,5–10 % ekstraktinių medžiagų. Alaus gamyboje naudojamos mielės
skirstomos: į aukštutinio rūgimo (top) ir žemutinio rūgimo (lager). Alaus mielėms keliami šie reikalavimai:
1) greitai ir visiškai surauginti cukrų;
2) sudaryti dribsnius ir greitai nusėsti ant rauginimo kubilo dugno (lager), kad gėrimas būtų skaidrus;
3) sudaryti būdingas skonines ir aromatines medžiagas.
Aukštutinio (top) rūgimo mielės priklauso Saccharomyces cerevisiae rūšiai, naudojamos alaus gamybai
aukštesnėje temperatūroje (+12 iki +20 °C). Jos išsiskiria ląstelių mažumu bei silpnu sugebėjimu flokuliuoti.
Dėl savo mažumo šios mielės kartu su anglies dioksidu iškeliamos ir auginamos misos viršuje. Tai iš dalies
apsunkina jų pakartotiną panaudojimą. Likusios po fermentacijos mielės suteikia alui matinę gelsvą spalvą.
Žemutinio (lager) rūgimo mielės alaus pramonėje naudojamos dažniausiai. Šios mielės priklauso
Saccharomyces carlsbergensis rūšiai. Jos skiriasi nuo aukštutinio rūgimo mielių daug didesniu dydžiu ir
geromis flokuliacinėmis savybėmis. Tokios mielės priklauso šalto rūgimo mielėms ir aktyviai dauginasi
+5–+10°C temperatūroje. Daugumos žemutinio rūgimo mielių ląstelių ilgis yra 9–11 mikrono, o plotis 4–7
mikronai. Jaunų mielių ląstelių plona sienelė ir smulkiagrūdė citoplazma. Senstančiose ląstelėse atsiranda
daugiau stambių intarpų, vakuolių. Senos, badaujančios ląstelės paprastai esti nusėdusios, jų citoplazma
stambiagrūdė, o negyvos įgauna netaisyklingą formą ir greitai nusidažo silpnais mėlynojo metileno ar kitų
dažų tirpalais.
Apatinio rūgimo mielės trisacharidą rafinozę suskaido į fruktozę ir melibiozę, o ši, veikiama fermento
melibiazės, suskyla į gliukozę ir galaktozę. Todėl apatinio rūgimo mielės rafinozę visiškai suraugina, o
viršutinio – suraugina tik vieną trečdalį, nes neturi fermento melibiazės.
Mielės ima daugintis anksčiau nei prasideda jų sukeliamas rūgimas. Tačiau dauginimasis užsibaigia per
2–3 paras, o rūgimas trunka 7–10 parų. Pridėjus mažai mielių, alkoholinis rūgimas vyksta lėčiau. Iš karto
pridėjus jų daug, rūgimas prasideda greičiau, bet ir lėčiau jų daugėja. Mielių dauginimąsi skatina ir terpėje
esantis deguonis. Tačiau tokiomis aerobinėmis sąlygomis sparčiai besidauginančios mielės naudoja maisto
medžiagas, ir terpėje susikaupia jų medžiagų apykaitos produktai, prailginantys alaus brendimo laiką. Mielės
sparčiausiai dauginasi iki tam tikros temperatūros. Apatinio rūgimo mielės geriausiai dauginasi 25–27 °C,
bet gali daugintis ir 2–3 °C temperatūroje, 60–65 °C temperatūroje mielės žūva.
Daugelis medžiagų slopina mielių dauginimąsi. Jau 1,5 % etilo alkoholio slopina jų dauginimąsi, o kai
alkoholio esti daugiau kaip 3 %, sulėtėja cukraus rūgimas. 0,5 % sieros rūgštis arba 1 % acto rūgštis per
1–2 val. užmuša mielių ląsteles, o 1 % pieno rūgštis joms neturi įtakos. Anglies dioksidas iki 0,2 % lėtina
ląstelių pumpuravimąsi, o 1,5 % – sustabdo alkoholinį rūgimą.
Alaus gamyboje svarbiausia, kad mielės sukeltų alkoholinį rūgimą. Mielių dauginimosi greitis ir
alkoholinio rūgimo intensyvumas priklauso nuo deguonies kiekio terpėje ir temperatūros. Gaminant alų,
mielių dauginimąsi slopina žema rauginimo temperatūra, o alkoholinį rūgimą aktyvina anaerobinių sąlygų
sudarymas. Gamybai vertingiausiomis laikomos aktyviai rauginančios mielės, sugebančios gerai nuskaidrinti
alų ir suteikti jam malonų skonį bei aromatą.
Mielių sugebėjimas skaidrinti alų vadinamas flokuliacija, arba dribsnių susidarymu. Dribsnius sudaro
stambialąstės apatinio rūgimo ir viršutinio rūgimo mielės. Apatinio rūgimo dribsniai nusėda ant indo dugno,
o viršutinio rūgimo – iškyla į paviršių. Dribsnių nesudaro smulkialąstės mielės. Jos iki rūgimo pabaigos lieka
pasklidusios rauginamoje misoje.
Dribsnius sudarančios mielės misos cukrus suraugina greičiau, tačiau nevisiškai. Jos dribsnius sudaro
surauginusios apie du trečdalius misoje esančių sausųjų medžiagų, lėtai baigia rauginti cukrus. Tuo tarpu
smulkialąstės mielės cukrus raugina lėčiau, tačiau pilniau ir, pasklidusios misoje, išlieka ilgiau, greičiau
užbaigia fermentaciją.
Dauguma alaus kultūrų sudarytos iš stambialąsčių ir smulkialąsčių mielių mišinio. Gerai rauginančiose
mielėse gali būti daugiau kaip 90 % smulkialąsčių ir 5–10 % stambialąsčių mielių rasių, o silpnai
rauginančiose – 4–50 % dribsnius sudarančių mielių. [4]



279
1.3. Alaus mielių cheminė sudėtis

Mielių cheminė sudėtis labai kinta. Ji priklauso nuo mielių rasės, maitinimosi sąlygų ir fiziologinės
mielių sudėties. Mielės sudarytos iš 75 % vandens ir 25 % sausųjų medžiagų. Sausųjų medžiagų procentinė
sudėtis: 35–65 % azotinės medžiagos, 20–63 % neazotinės ekstraktinės medžiagos, 2–5 % riebalai (lipidai ir
lipoidai), 5–11 % mineralinės medžiagos. Pagrindinės mielių medžiagos yra: glikogenas, mielių sakai,
azotinės medžiagos, riebalai, mineralai.
Glikogenas (C
6
H
10
O
5
)
n
– atsarginė mielių maistinė medžiaga. Mielėse glikogeno kiekis labai svyruoja
(nuo 0 iki 40 %). Tai priklauso nuo mielių maitinimosi. Patekusios į rauginimo terpę, kurioje didelė
gliukozės koncentracija, mielės pradeda gaminti glikogeną (glikogenezė), o mieles laikant po vandeniu
vyksta atvirkštinis procesas (glikogenolizė) (3 pav.). [12]



3 pav. Glikogeno molekulės sandara

Glikogeno gliukozės molekulės sujungtos α-1→4 ir α-1→6-glikozidinėmis jungtimis. Šakotos
glikogeno molekulės susidarymą katalizuoja amilo-1,4→1,6-glikoziltransferazė. Šis fermentas katalizuoja ne
atskirų glikolizės vienetų, bet atskirų glikogeno molekulės dalių, sujungtų α-1→4-glikozidinėmis jungtimis,
pernešimą. Perneštos glikogeno molekulės dalys α-1→6-glikozidinėmis jungtimis prijungiamos prie tos
pačios ar jai analogiškos grandinės. Tiriant glikogeno sintezę radioaktyviu gliukozės-1-fosfatu nustatyta, kad
iš pradžių vyksta linijinis šoninių glikogeno molekulės grandinių ilgėjimas, susidarant α-1→4-
glikozidinėms jungtims. Kai šoninės glikogeno molekulės grandinėse susijungia vienuolika gliukozės
vienetų, pradeda veikti atsišakojimo fermentas ir susidaro naujos šoninės grandinės. Glikogeno sintezei
energija naudojama iš ATF. [5]
Mielėse daug baltymų, vidutiniškai 45 % nuo sausosios masės. 90 % azoto yra baltymuose. Mielių
baltymai turi apie 64 % tikrųjų baltymų, apie 10 % amino rūgščių ir peptidų, apie 26 % fosforo turinčių
baltymų. Pagrindiniai du baltymai – tai cerevizinas ir zimokozeinas. Baltymuose yra žymi dalis gliutationo,
kuris svarbus oksidacijos-redukcijos procesuose. Riebalų kiekis mielėse kinta ir priklauso nuo amžiaus ir
mitybos. Senose mielėse riebalų daugėja ir gali siekti 10–20 %. [12]
Iš neorganinių medžiagų pusę sudaro fosforo rūgštis ir trečdalį – kalis. 30−50 % fosforo rūgšties mielėse
yra sujungta su organinėmis medžiagomis, įeina į tokių junginių sudėtį kaip lecitinas, nukleoproteidai,
nukleotidai, ribonukleininės rūgštys. Mielių pelenų cheminė ir procentinė sudėtis nurodyta 1 lentelėje.

1 lentelė. Mielių cheminė sudėtis

P
2
O
5
47–73 % SiO
2
0,28–0,73 %
MgO 3,0–7,4 % Cl 0,1–0,65 %
K
2
O 2,8–4,0 % SO
3 0,09–0,74 %
CaO 0,4–11,3 %

Pelenuose yra nedideli kiekiai tokių elementų: geležies, vario, mangano, cinko, sieros. Siera į mielių
baltymų sudėtį įeina kaip disulfidinė –S-S grupė, taip pat ir sulfhidridinė –S-H grupė. Geležies ir kitų
280
neorganinių elementų buvimą lemia katalitinių oksiduojančiųjų fermentų (oksidazės, peroksidazės,
katalazės) būtinybė. [20]

1.4. Alaus mielių pigmentai, vitaminai ir fermentai

Mielėse yra daug medžiagų, turinčių didelę fiziologinę reikšmę. Iš šių medžiagų reikėtų išskirti
pigmentus: citochromą ir geltonąjį pigmentą. Mielių ląstelės turi visus tris skirtingų spektrų citochromo
komponentus, kurie vadinami a, b ir c. Citochromo veikla mielių ląstelėse labai panaši į hemoglobino veiklą
kraujyje. Citochromų hemo struktūros geležies atomas, atlikdamas biologinį vaidmenį, keičia valentingumą
(nuo Fe
++
iki Fe
+++
, ir atvirkščiai). Kvėpavimo grandinėje citochromai yra tarp dehidrogenazių ir galinio
elektronų akceptoriaus.
Geltonasis fermentas susideda iš bespalvio baltymo (apofermento) ir geltonojo fermento, vadinamo
flavonu. Flavono pagrindą sudaro riboflavinas (vitaminas B
2
), surištas su fosforo rūgštimi ir
adenozinnukleotidu. Jungdamasis su baltymine medžiaga, flavonas sudaro fermentinę sistemą, kuri
vadinama geltonuoju fermentu. Flavoproteinas sutinkamas oksiduotos formos, geltonos spalvos ir
neoksiduotos formos–bespalvis. Flavoproteinų funkcijos –o ksidaciniai ir redukciniai procesai.
Flavoproteinas dalyvauja vykstant ne tik kvėpavimo, bet ir rūgimo procesams.
Taip pat fiziologiškai svarbūs cisteinas ir glutationas. Glutationas yra tripeptidas,
γ-gliutaminilciseinilglicinas, dalyvauja oksidacinėse–redukcinėse reakcijose. Cisteinas – baltymų amino
rūgštis, α-amino-β-tiopropiono rūgštis. Nuo sulfhidrilinių grupių priklauso kai kurių baltymų, hormonų ir
fermentų biologinis aktyvumas. [12]
Žemutinio rūgimo mielėms normaliai augti ir daugintis reikalingi vitaminai. Mielės labai blogai auga
mineralinėse, sintetinėse terpėse, neturinčiose vitamino B
6
. Mielėse yra vitamino B kompleksas, nikotino
rūgšties, pantoteninės rūgšties, inozito, biotino, vitamino E ir kitų.
Alaus mielėse vitamino B yra dešimt kartų daugiau nei kepimo mielėse. Kai kurie vitaminai įeina į
fermentinių sistemų sudėtį ir dalyvauja vykstant rūgimo bei kvėpavimo procesams. Vitaminas B
1
yra
fermento piruvatdekarboksilazės sudėtinė dalis, ardantis pirovynuoginę rūgštį vykstant alkoholiniam
rūgimui, o vitaminas B
2
– vianas iš kvėpavimo fermentų. Mielėse taip pat yra vitamino B
6
, kuris labai
svarbus biokatalizatorius. Vitaminas C dalyvauja oksidaciniuose procesuose. [20]
Mielės turi įvairiausių fermentų, kurie priskiriami dviem edofermentų grupėms: hidrolazėms ir
desmolazėms. Hidrolazės katalizuoja substrato molekulės skaldymą dalyvaujant vandeniui. Veikiant
desmolazėms, gaunama laisvoji energija. Hidrolitiniams fermentams priskiriami:
• karbohidrolazės (skaldo angliavandenius): amilazės, invertazės, gliukogenazės, melibiazės ir kiti;
• amidazės (skaldo asparaginą ir gliutaminą): asparaginazė ir gliutaminazė;
• proteazės (skaldo arba sintetina baltymus): peptidazės ir proteinazės;
• lipazės (katalizuoja riebalų skaldymo ir sintezės reakcijas).
Vienas iš svarbiausių fermentų yra maltozidazė (α-gliukozidazė). Ji skaldo disacharidą maltozę ir
susidaro dvi gliukozės molekulės: C
12
H
22
O
11
+ H
2
O = 2C
6
H
12
O
6
. Šio fermento mielėse esti labai daug, bet
kiekis priklauso nuo mielių rasės.
Fermentas invertazė (sacharozidazė) suskaldo sacharozę ir susidaro gliukozė bei fruktozė:
C
12
H
22
O
11
+ H
2
O = C
6
H
12
O
6
+ C
6
H
12
O
6
. Šio fermento mielėse taip pat yra daug, jis stabilesnis nei
maltozidazė.
Melibizidazė (α-galaktozidazė) disacharidą melibiozę skaldo į gliukozę ir galaktozę. Melibizidazė
randama žemutinio rūgimo mielėse. Aukštutinio rūgimo mielės dažnai jos neturi. Mielėse taip pat randama
daug kitokių fermentų, kurie disacharidus dažniausiai skaldo į monosacharidus.
Asparaginas suskaldomas vykstant asparaginazei. Gaunamas amoniakas ir asparagino rūgštis:
NH
2
⋅ CO ⋅ CH
2
⋅ CHNH
2
⋅ COOH + HOH ⇔ NH
3
+ HOOC ⋅ CH
2
⋅ CHNH
2
⋅ COOH.
Gliutaminas suskaldomas veikiant gliutaminazei. Gaunamas amoniakas ir gliutamino rūgštis:
NH
2
⋅ CO ⋅ CH
2
⋅ CH
2
⋅ CHNH
2
⋅ COOH + HOH ⇔ NH
3
+ HOOC ⋅ CH
2
⋅ CH
2
⋅ CHNH
2
⋅ COOH.
Desmolazės – grupė fermentų, dalyvaujančių kvėpavimo ir rūgimo procesuose. Šie fermentai vykdo
organinių junginių skaldymo procesą (desmolizę). Desmolizės procesas suprantamas kaip angliavandenių
skilimas. Veikiant desmolazėms, vyksta jungčių tarp dviejų anglies atomų skilimas arba organinės molekulės
struktūros pakitimas. Desmolazės desmolizės metu paruošia, vykdo ir užbaigia anglies atomų grandinės
skilimą. [12]
281
1.5. Mielių kokybės įvertinimas

Svarbiausi mielių kokybės rodikliai yra jų biologinis grynumas, morfologinės (ląstelių forma, dydis) ir
fiziologinės (sugebėjimas rauginti, sudaryti dribsnius, daugintis ir t. t.) savybės.
Mielių grynumas nustatomas stebint mikroskopu ir sėjant mitybines terpes, o ląstelių forma bei dydis –
stebint mikroskopu. Jeigu randama daug morfologiškai pakitusių ląstelių ir kartu susilpnėjęs jų fermentinis
aktyvumas, mielės yra degeneruotos. Tokios mielės alaus gamybai netinka. Senas mieles reikėtų atjauninti
4–6 val. paauginant šviežioje misoje.
Gerose sėjamosiose mielėse gali būti ne daugiau kaip 10 % negyvų ląstelių. Mielių kultūroje esant daug
negyvų ląstelių, gali lėtai vykti alkoholinis rūgimas, daugintis pašaliniai mikrobai, o negyvosios ląstelės gali
autolizuotis ir suteikti alui specifinį prieskonį. Negyvosios ląstelės pašalinamos gerai praplaunant šaltu
tekančiu vandeniu, nes jos lengvesnės už gyvas.
Apie mielių gebėjimą gerai rauginti cukrų sprendžiama iš glikogeno buvimo jų ląstelėse. Apie 70–75 %
ląstelių turėtų būti glikogeno. Jeigu tokių ląstelių kultūroje yra mažiau, tai rodo, kad jos yra senos arba blogai
maitinosi. Glikogeno mažėja mielėse, laikomose po vandeniu aukštesnėje kaip 0°C temperatūroje. Misą
pradėjus rauginti mielėmis, turinčiomis mažai glikogeno, pagrindinis rūgimas būna ilgesnis. Todėl tokias
mieles reikia atjauninti.
Mielių fiziologinis aktyvumas nustatomas iš cukraus surauginimo laipsnio, rūgimo energijos, gebėjimo
daugintis, sudaryti dribsnius ir nusėsti. Cukraus surauginimo laipsnis nustatomas iš sausųjų medžiagų likučio
po dviejų parų rauginimo 20–25 °C temperatūroje. Mielių rūgimo energija apskaičiuojama pagal susidariusio
anglies dioksido arba alkoholio kiekio ir misos tūrio santykį. Gebėjimas daugintis nustatomas pagal ląstelių
pumpuravimą, dauginimosi greitį ir koeficientą. Jaunose mielėse turi būti 40–70 % pumpuruojančių ląstelių.
Mielių dauginimosi greitis ir koeficientas nustatomas skaičiuojant ląsteles per tam tikrą laiko tarpą
standartinėje terpėje. Mielių dauginimosi greitis matuojamas pasėjus jas į misą su apynių ekstraktu (11 %
sausųjų medžiagų) ir tris paras auginant 6–8 °C temperatūroje. Ląstelių dauginimosi koeficientas – tai kiekio
santykis su pradiniu kiekiu. Jis apskaičiuojamas po septynių augimo parų. Mielių sugebėjimas sudaryti
dribsnius ir nusėsti dažniausiai nustatomas vizualiai. Tam tikslui mielių suspensija supilama į graduotą
mėgintuvėlį ir stebima, per kiek laiko mielės nusėda ant dugno. Dribsnius sudarančios mielės paprastai
nusėda per 10 min., o smulkialąstelinės – per 30 min. [4]

2. Alaus mielių gamybos technologija

2.1. Mielių dauginimas laboratorinėmis sąlygomis

2.1.1. Grynosios mielių kultūros dauginimas

Alaus gamybai naudojamos grynosios alaus mielių kultūros. Mikrobiologiškai gryna alaus mielių kultūrą
įmonės gauna iš centrinės grynųjų kultūrų kolekcijos mokslinių tyrimų institutų, mikrobiologinių laboratorijų
ar kitų įmonių grynosios kultūros skyrių, paprastai mėgintuvėlyje.
Žemutinio rūgimo mielės skiriasi dauginimosi greičiu, rauginimo energija, diacetilo kaupimo ir jo
redukavimo aktyvumu, flokuliaciniais sugebėjimais, galutiniu surauginimo laipsniu, taip pat sugebėjimu
formuoti tam tikrą alaus skonį. Alaus rasės pasirinkimas priklauso nuo daugelio veksnių:
1) pasirinktos alaus gamybos technologijos specifikos;
2) alaus gamybai naudojamų įrenginių;
3) gamybinio pajėgumo, našumo;
4) subalansavimo tarp alaus virimo, rauginimo ir išlaikymo skyrių.
Dažniausiai naudojamos šios mielių rasės Saccharomyces carlsbergensis 11, 36, 41, greitai rauginantis
štamas 8A(M) arba f-2.
Alaus darykloje išvedant grynąją kultūrą, reikia laikytis tokių sąlygų: naudoti sterilią misą ir indus,
pamažu prijaukinti mieles prie žemos temperatūros. Išvedimas – tai mielių dauginimas nuo mėgintuvėlio,
gaunamo iš muziejaus kolekcijos, iki rauginimo talpoms reikalingo kiekio. Visas procesas susideda iš dviejų
stadijų: laboratorinės ir cechinės. Laboratorijoje, bokse iš mėgintuvėlio (1) nuo misos agaro terpės mielės
steriliai perkeliamos į kolbą (2), kurios talpa 300 mL. Sėjimai laikomi esant 18–25 °C temperatūrai apie 24–
36 val. iki energingo rūgimo momento. Vėliau ši rūgstanti misa perpilama į kolbą (3), kurios talpa 3–5 l. Joje
282
yra apie 2–3 l sterilios misos su apyniais, temperatūra 15–18 °C, paliekama 24–36 valandoms. Vėliau
rūgstanti misa perkeliama į butelį (4), kurio talpa 30 l. Jame yra apie 20–25 litrus misos, paimtos iš virimo
katilo, rauginama 12–15 °C temperatūroje 48 valandas. Paruošiama 4000 litrų talpa (5), į kurią supilama apie
1000 litrų gerai apcukrintos misos su apyniais, temperatūra 12 °C, dedamos mielės iš butelio (4), kad jų
koncentracija susidarytų apie 10 %. Garbanų stadijoje talpa pripildoma misos. Pirminė rūgimo stadija
vykdoma 12 °C temperatūroje, toliau 6–8 °C temperatūroje. Visas procesas pavaizduotas 4 pav.



4 pav. Alaus mielių dauginimas laboratorinėmis sąlygomis. 1 – mėgintuvėlis, 2 – 300 mL kolba, 3 – butelis su 2–3 l
misos, 4 – butelis su 20–25 l misos, 5 – kubilas su 500–1000 l misos ir apyniais

2.2. Alaus mielių dauginimas pusiau gamybinėmis ir gamybinėmis sąlygomis

2.2.1. Mielių dauginimas Genzeno sistemos aparatuose

Ganzeno sistemos aparatas sudarytas iš rauginimo cilindro ir sterilizatoriaus. Abu indai yra cilindrinės
formos, pagaminti iš raudonojo vario, jų vidus padengtas alavu. Kiekvienas cilindras turi dangtį, kurie
prisukami varžtais, o kad būtų sandarūs – turi gumines žiedines tarpines.
Rauginimo cilindre yra maišyklė, kurios ašis nuleista per dangčio vidurį, maišyklės mentės išdėstytos
prie pat dugno. Maišoma rankiniu būdu. Ant rauginimo cilindro dangčio pritvirtintas lenktas vamzdis (skirtas
angliarūgštės dujoms ir orui nuleisti), kurio kitas galas nuleistas į indą (1) su vandeniu, taip sukuriamas
hidraulinis užtvaras. Rauginimo cilindro šone pritvirtintas vandens lygio matavimo stiklas, kurio viršutinė
dalis sujungta su vatiniu filtru (2). Oras į vatinį filtrą patenka iš oro komunikacijų. Rauginimo cilindro dugne
yra vamzdis (geležinis arba guminis), kuris sujungia su sterilizatoriumi. Grynai mielių kultūrai įpilti yra
speciali anga. Alaus mielėms ir alui išpilti padarytas specialios konstrukcijos išleidimo kranas (4). Krano
vamzdelis cilindro viduje yra lenktas žemyn ir yra 3,5 centimetro nuo dugno. Tai padaryta tam, kad
nuleidžiant alų (misą) ir mieles nepatektų užkratas iš išorės.
Sterilizatorius skirtas steriliai misai ruošti. Jis turi gyvatuką, orą tiekia per sterilų filtrą. Priklausomai nuo
to, ko reikia, gyvatuku leidžiamas vanduo arba garai: jei reikia pašildyti – garai, jei atšaldyti – vanduo.
Sterilus oras pučiamas, kad misa pakankamai įsisavintų deguonies ir misos, reikalingos perpumpuojant.
Sterilizatorius yra didesnės talpos nei rauginimo cilindras. Misa perpumpuojama iš sterilizatoriaus geležiniu
vamzdžiu arba gumine žarna.
Rauginimo cilindras prieš pirmą pakrovimą, o sterilizatorius prieš kiekvieną pakrovimą sterilizuojami
aštriais garais. Oro vatinis filtras sterilizuojamas sausais garais. Visi aparatai prieš paleidžiant tikrinami, ar
yra hermetiški.
Iš pradžių rauginimo cilindras užpildomas misa iki 1/10 arba 1/20 jo tūrio ir leidžiama mielėms rūgti. Po
vienos, dviejų parų pripilama misos iki 1/3 cilindro tūrio ir paliekama rūgti. Vėliau aparatas pripildomas iki
darbinio tūrio. Baigiantis rūgimui (7–10 parų, priklausomai, kokia temperatūra buvo palaikoma, dažniausiai
nuo 6 ° iki 12 °C) panaudota misa (alus) pašalinama, o mielės, kurios tankiu sluoksniu nusėdusios rauginimo
cilindro viduje, vėl užpilamos sterilia misa, maišomos steriliu oru. Didžioji dalis (0,8–0,9) misos ir mielių
siunčiamos į rauginimo skyrių. Likęs nedidelis kiekis naudojamas tolesniam dauginimui. Taip procesas
kartojamas nepertraukiamai. Pasėtų maistingojoje terpėje mielių kokybė tikrinama per mikroskopą. Aptikus
infekciją arba mielių išsigimimą, procesas stabdomas ir imama šviežia mielių kultūra [12].
283


5 pav. Ganzeno aparatas: rauginimo cilindras (kairėje) ir sterilizatorius (dešinėje). 1 – indas su vandeniu, 2 – vatinis oro
filtras, 3, 4 – kranas

2.2.2 Mielių dauginimas Greinerio sistemos aparatuose

Didelio kiekio mielėms pagaminti ir dauginti naudojamas Greinerio sistemos aparatas. Greinerio
sistemos aparatas susideda (6 pav.) iš: dviejų sterilizatorių (1) ir (3), dviejų rauginimo cilindrų (2),
naudojamų rauginimo pradžioje, ir talpos (4), kurioje laikoma pasėta kultūra tolesniam naudojimui.
Sterilizatoriai ir rauginimo cilindrai gaminami iš vario, o vidus padengiamas alavu arba nerūdijančiu plienu.
Sterilizatoriuose įrengti apsauginiai vožtuvai, manometrai, du gyvatukai (vienas ant kito), naudojami kaitinti
arba šaldyti (apatinis – naudojamas šildyti ir šaldyti, viršutinis – šaldyti), dvigubi sterilaus oro filtrai ir
kontrolės matavimo prietaisai. Rauginimo aparatuose (2) įrengti nedideli indai (4) grynai kultūrai palaikyti
aparato darbo metu. Pučiamas oras yra sterilus, jis komunikacijomis patenka į sterilizatorių. Mažo
sterilizatoriaus talpa yra 650 litrų, didelio – 4000 litrų, rauginimo cilindrų – 360 litrų.
Laboratorijoje iš mėgintuvėlių atliekami keli persėjimai, kurie užbaigiami Kalsbergo kolbos užsėjimu.
Misa Kalsbergo kolboje rauginima 5–6 paras, 7–8 °C temperatūroje, paskui kolbos patenka į I cechą.
Aparatai prieš paleidžiant sterilizuojami garais, paskui į sterilizatorių (1) dedama gatava misa su apyniais,
kuri sterilizuojama suspaustais garais, naudojant gyvatuką ir atšaldoma. Misa dedama į rauginimo aparatą
(2), kuriame per fakelą užsėjama gryna kultūra iš Kalsbergo kolbos, tris paras rauginima, šiuo metu vyksta ir
mielių dauginimasis, temperatūra − 8 °C, tuo metu paruošiamas sterilizatorius (3), užpildomas misa,
sterilizuojama ir atšaldoma iki 8 °C. Tada į sterilizatorių (3) pilama iš talpos (2) išrauginta mielių biomasė
(500 litrų). Dalis raugintos misos (po 10 litrų iš kiekvieno aparato (2)) nupilama į indus (4), kuriuose laikoma
kaip sėjamoji kultūra tolesniam rauginimui. Sterilizatoriuje (3) tris paras raugiama, todėl sterilizatorius (3)
atlieka dvi funkcijas: kaip sterilizavimo talpa ir kaip parengiamojo rauginimo rezervuaras. Rauginimo
aparatas (2), ištuštintas po rauginimo, vėl užpildomas sterilia misa iš sterilizatoriaus (1) ir užsėjamas
mielėmis, laikomomis induose (4). Mielių auginimo procesas Greinerio sistemos aparatuose vyksta
nepertraukiamai, kol aptinkamas kultūros užterštumas. Rauginta misa su mielėmis iš didžiojo sterilizatoriaus
perduodama į rauginimo talpą (10 000 litrų), užpilama apie 3 000 litrų gamybinės alaus misos, o po 12
valandų dar įpilama 4 000 litrų, po 36 valandų rauginta misa su mielėmis naudojama sėjimui pagrindinio
rauginimo talpoje. Darbinė talpa užpildoma misa iki 50 % ir procesas tęsiamas iki normalaus surūgimo ir
pašviesėjimo, toliau šviežias alus perpumpuojamas į laikymo (brandinimo) rūsį. Jei naudojamos pirmos
generacijos mielės, jas galima naudoti 10–12 generacijų [12].
Misai rauginti naudojami mielių kiekiai:
1. Atvirose rauginimo talpose − 0,5 litro mielių /100 litrų misos.
2. Uždarose rauginimo talpose − 1 litras mielių /100 litrų misos.


284


6 pav. Greinerio aparatas. 1 – mažasis sterilizatorius, 2 – rūgimo cilindrai, 3 – didysis sterilizatorius, 4 – indai grynai
kultūrai palaikyti

2.2.3. Mielių paėmimas, laikymas ir regeneracija

Mielių paėmimas. Nupylus jauną alų brandinimo skyriuje nuimamos mielės. Jos yra tankiu sluoksniu
nusėdusios ant rauginimo tanko dugno sienų. Mielių nuosėdos susideda iš trijų sluoksnių. Apatiniame
sluoksnyje, susidariusiame ant dugno, yra mirusios mielės ir nuosėdų dalelės. Sluoksnis − tamsios spalvos.
Viduriniame, šviesesnės spalvos, yra gyvybingos mielės, pamažu nusėdusios rūgimo metu. Šio sluoksnio
mielės turi geras rauginimo savybes ir naudojamos kitam rauginimui. Viršutinis rudas sluoksnis susideda iš
lengvų, nesubrendusių mielių ląstelių, nusėdusių pagrindinio rūgimo gale. Jame yra daug mirusių mielių,
pašalinių mikroorganizmų, nuosėdų, alaus ir apynių dervų.
Viršutinis ir apatinis sluoksniai – gamybinės atliekos. Atsargiai atskirtos viduriniojo sluoksnio mielės
nuo viršutinio ir apatinio sluoksnių surenkamos į vonelę. Vonelė naudojama mieliems praplauti ir laikyti. Ji
pavaizduota 7 pav. Vonelės gaminamos iš aliuminio. Jomis patogu naudotis, nes turi dvigubą dugną (šaltam
vandeniui laikyti), specialų mechanizmą, naudojamą išpilant (vonelė palenkiama) [12].

285


7 pav. Praplovimo ir laikymo vonelė. 1 – nupylimo noselė, 2 – ašis, 3 – stovas, 4 – dvigubas dugnas, 5 – vandens
išleidimas, 6 – šaldymo vanduo, 7 – vandens įpylimo čiaupas

Pagrindinis mielių apdirbimo, paruošimo ir perpumpavimo aparatas pavaizduotas 8 pav. Viršutinis
liukas naudojamas vidinei ertmei praplauti ir dezinfekuoti. Aparatas gaminamas iš aliuminio.



8 pav. Apdirbimo, paruošimo ir perpumpavimo aparatas. 1 – manometras, 2 – dangčio žiedas, 3 – nupylimo čiaupas,
4 – barboteris, 5 – padėklas, 6 – liuko dangtis, 7 – uždarymo mechanizmas, 8 – fiksatorius

Praplautos mielės atsilaisvina nuo nereikalingo ekstrakto, baigia rūgti ir gerai nusėda. Mielės labai
jautrios išoriniams poveikiams, todėl jos plaunamos atsargiai, tam tikros temperatūros ir sudėties vandeniu.
Jei praplovimo vanduo nėra biologiškai švarus, jis valomas dezinfekuojamomis medžiagomis. Mielės
praplaunamos šaltu vandeniu (1–2 °C). Jas kiekvieną dieną užpilamos šaltu vandeniu (1–2 °C), praplauti
naudojami vibraciniai sietai (nuo baltyminių dribsnių ir apynių. Tokios praplautos mielės naudojamos 10–12
generacijų, kol mirusių ląstelių kiekis neviršija 5 % ir jo neužteršia mikrobais.
Mielių apdorojimas rūgštimi. Pastebėjus darbinėse mielėse bakterijas (koncentracija didesnė kaip 1 %) ir
pilant mieles iš tanko į tanką rekomenduojama mieles apdoroti rūgštimi ne rečiau kaip kas 3–4 mielių
generacijas. Darbinės mielės apdorojamos 8,5 % ortofosforo rūgšties tirpalu. Jų temperatūra turi būti ne
aukštesnė kaip 2 °C, esant šiai temperatūrai lėtai pridedama rūgšties nuolat maišant 2 °C temperatūroje iki
pH 2,2. Rūgšties koncentracija masėje neturi viršyti 0,2 %. Tuo atveju, kai pH yra mažiau kaip 2,2,
rekomenduojama pridėti papildomą kiekį mielių. Apdorotos rūgštimi mielės paliekamos apie dvi valandas,
periodiškai maišant ir stebint temperatūrą, kuri neturi būti aukštesnė kaip 2 °C. Apdorotas mieles reikia iš
karto pilti į misą. Apdorojimas rūgštimi nerekomenduojamas mielėms, kuriose bakterijų koncentracija
286
didesnė kaip 10 % ir kurios yra nusilpusios po ilgo rauginimo ir laikymo. Tokios mielės apdorojamos esant
didesnėms pH reikšmėms (daugiau kaip 2,5 pH), apdorojimo laikas sutrumpinamas iki 40–60 minučių.
Mieles galima regeneruoti 10 % sieros rūgštimi, sulfidine rūgštimi, arba 0,35 %, 3,5, amonio disulfatu
(pH 3,5). Tuo atveju mielių santykis su vandeniu − 1 : 3 [10].
Mielių aktyvacijai rekomenduojama naudoti preparatą „Alkoten“, praskiestą nedideliame (0,5–1 litre)
misos kiekiu. Reguliariai naudojant šį preparatą naudojimo dozė yra 0,9 gramai 100 litrų misos, naudojamos
rauginti. Gerokai pablogėjus mielių būklei rekomenduojama naudoti 3,5 gramo 100 litrų. Naudoti šį
preparatą rekomenduojama ir apdorojus mieles rūgštimi (3–5 g/100 l).

2.3. Gamybos kontrolės objektai ir metodai

Grūdai turi būti apžiūrimi. Ant jų pastebėjus pelėsių žymių tiriama mikroskopu. Jei grūdai ir salyklas
smarkiai užkrėsti pelėsiniais grybais, jie brokuojami.
Alaus salyklo misoje nustatomas bendras mikroorganizmų skaičius, pelėsinių grybų, rūgštis gaminančių
bakterijų ir žarnyno lazdelių buvimas bei jų stabilumas. Bendras mikroorganizmų skaičius nustatomas
giluminiu metodu − į MPA pasėjus 1 cm
3
misos. Grybai ir rūgštis gaminančios bakterijos nustatomos po 0,1–
0,5 cm
3
misos užsėjant paviršiniu metodu ant SMA su kreida. Pasėliai inkubuojami 69–75 valandas, esant
29–31 °C temperatūrai. Žarnyno lazdelių titras nustatomas rūgimo metodu. Misoje neturi būti pelėsinių
grybų ir rūgštis gaminančių bakterijų.
Stabilumas nustatomas salyklo misą supylus į kelias sterilias kolbas ir jas laikant 25 °C temperatūroje.
Kasdien kolbos tikrinamos ir registruojamas nuosėdų iškritimo, plėvelės susidarymo ir drumstimosi pradžios
laikas. Tiriant mikroskopu skysčio, nuosėdų, plėvelės, drumzlių mėginius, nustatomas mikroorganizmų
buvimas. Jeigu salyklo misa daugiau nei keturias paras lieka nepakitusi, vadinasi, ji yra biologiškai švari.
Mielių grynoje kultūroje nustatomas pašalinių mikroorganizmų (bakterijų, laukinių mielių) buvimas.
Nesacharomicetinės laukinės mielės nustatomos misos mėginius sėjant ant sietinės terpės su lizinu, o
sacharomicetinės – ant specialių terpių su vyno rūgštimi. Grynos kultūros mielės brokuojamos, jei randama
šiek tiek bakterijų arba pašalinių mielių ląstelių.
Sėjamų mielių kokybė tikrinama vieną kartą per parą mikroskopu − ar yra bakterijų, laukinių mielių, o
rauginimo metodu – tiriamas žarnyno lazdelių titras. Leidžiamas bakterijų kiekis – ne daugiau kaip 0,5 %
bendro kultūrinių mielių skaičiaus, o laukinių mielių neturi būti iš viso.
Be to, kultūrinių mielių ląstelėse nustatomas glikogeno buvimas, taip pat negyvų ląstelių skaičius.
Glikogeno turinčių ląstelių turi būti ne mažiau kaip 70 %, o negyvų – ne daugiau kaip 5 % bendro sėjamų
mielių skaičiaus.
Alus tiriamas rūgimo pradžioje, pabaigoje, išrūgęs ir supilstytas į butelius. Rūgimo pradžioje alus
vadinamas jaunu. Mėginiai imami iš pagrindinio rūgimo fermentatoriaus 2–3 dieną sutrikus fermentacijos
procesui: susilpnėjus arba sustiprėjus rūgimui, kurį rodo kylantys burbuliukai, ir t. t. Mikroskopu nustatomas
pašalinės mikrofloros buvimas. Esant reikalui mėginiai sėjami į terpes laukinėms mielėms, lazdelinėms
bakterijoms, kokams, pediokokams ištirti.
Likus septynioms paroms iki rauginimo pabaigos, kai į fermentoriaus dugną nusėda visos mielės, alus
supilamas į sterilius butelius, kurie laikomi 25 °C temperatūroje. Kai mikroorganizmų yra per daug, po
dviejų, trijų parų alaus paviršiuje atsiranda plėvelė, skystyje matomi dribsniai, jaučiamas puvimo arba
rūgštus kvapas. Galima įtarti, kad blogai buvo išplauti ir dezinfekuoti fermentatoriai arba misa buvo labai
užteršta mikroorganizmais.
Nustatomas stabilumas, bendras mikroorganizmų ir žarnyno lazdelių skaičius. Kiekvienos rūšies alaus
stabilumui nustatyti kasdien atsitiktinai atrenkama po du butelius, kurie laikomi ir stebimi 20 °C
temperatūroje septynias ar dešimt parų. Bendras mikroorganizmų skaičius nustatomas paviršiniu metodu
užsėjant po 0,2–0,5 cm
3
alaus ant SMA su nistatinu. Žarnyno lazdelės aluje nustatomos panašiai kaip ir
geriamajame vandenyje. Pagal sanitarines normas specialių rūšių aluje žarnyno lazdelių negali būti – 10 cm
3

alaus, 3 cm
3
– masinio vartojimo ir 1 cm
3
− iš statinių pilstomo alaus.[3]

3. Optimali alaus mielių gamybos technologija ir jų naudojimas alaus gamyboje

Alaus gamyboje optimaliausia naudoti žemutinio (lager) rūgimo mieles. Šios mielės priklauso
Saccharomyces carlsbergensis rūšiai. Jos skiriasi nuo aukštutinio rūgimo mielių geromis flokuliacinėmis
savybėmis. Tai šaltojo rūgimo mielės, kurias dauginasi +5 – +10 °C temperatūroje. Daugumos žemutinio
287
rūgimo mielių ilgis yra 9–11 mikrono, o plotis − 4–7 mikronų. Apatinio rūgimo mielės trisacharidą rafinozę
suskaido į fruktozę ir melibiozę, o ši, veikiama fermento melibiazės, suskyla į gliukozę ir galaktozę. Todėl
apatinio rūgimo mielės rafinozę visiškai suraugina, o viršutinio – tiktai vieną trečdalį, nes neturi fermento
melibiazės.
Alaus darykloje norint gauti gryną kultūrą reikia laikytis tokių sąlygų: naudoti sterilią misą ir indus,
pamažu pripratinti mieles prie žemos temperatūros. Grynoji kultūra − tai mielių, esančių mėgintuvėlyje,
gaunamame iš muziejaus kolekcijos, dauginimas iki kiekio, reikalingo rauginimo talpoms. Visas procesas
susideda iš dviejų stadijų: laboratorinės ir cechinės.
Laboratorijoje, bokse iš mėgintuvėlio nuo misos agaro terpės mielės steriliai perkeliamos į kolbą, kurios
talpa − 300 mL. Sėjimui jos laikomos esant 18–25 °C temperatūrai apie 24–36 valandas iki greito rūgimo
momento. Vėliau ši rūgstanti misa perpilama į kolbą, kurios talpa 3–5 ir joje yra apie 2–3 litrus sterilios
misos su apyniais; temperatūra − 15–18 °C, paliekama 24–36 valandoms. Paskui rūgstanti misa perpilama į
talpos 30 litrų butelį, kuriame yra apie 20–25 litrus misos, paimtos iš virimo katilo; rauginama 12–15 °C
temperatūroje 48 valandas. Ceche paruošiama 4000 litrų talpa, į kurią supilama apie 1000 litrų gerai
paruoštos misos su apyniais, temperatūra − 12 °C, supilamos mielės iš butelio, kad koncentracija susidarytų
apie 10 % mielių (į 500 litrų misos pilama 50 litrų). Garbanų stadijoje talpa pripildoma misos, pirminė
rūgimo stadija vyksta 12 °C temperatūroje, toliau − 6–8 °C temperatūroje.
Didelio kiekio mielėms pagaminti ir dauginti naudojamas Greinerio sistemos aparatas. Greinerio
sistemos aparatas (9 pav.) susideda iš: dviejų sterilizatorių (1) ir (3), rauginimo cilindrų (2), naudojamų
rauginimo pradžioje, ir talpų (4), kuriose laikoma sėjimo kultūra tolesniam naudojimui. Sterilizatoriai ir
rauginimo cilindrai gaminami iš vario, o vidus padengiamas alavu arba nerūdijančiu plienu. Sterilizatoriuose
įrengti apsauginiai vožtuvai, manometrai, du gyvatukai (vienas ant kito) naudojami kaitinti arba šaldyti
(apatinis naudojamas – šildyti ir šaldyti, viršutinis – šaldyti), dvigubi sterilaus oro filtrai ir kontrolės
matavimo prietaisai. Rauginimo aparatuose (2) įrengti nedideli indai (4) grynai kultūrai palaikyti aparato
darbo metu. Pučiamas oras yra sterilus, jis komunikacijomis sujungtas su sterilizatoriumi. Mažo
sterilizatoriaus talpa − 650 litrų, didelio − 4000 litrų, rauginimo cilindrų – 360 litrų.
Laboratorijoje iš mėgintuvėlių atliekami keli persėjimai, kurie užbaigiami Kalsbergo kolbos užsėjimu.
Misa Kalsbergo kolboje rauginama 5–6 paras, 7–8 °C temperatūroje, paskui kolbos perkeliamas į cechą.
Aparatai prieš paleidžiant sterilizuojami garais, paskui į sterilizatorių (1) dedama gatava misa su apyniais,
kuri sterilizuojama suspaustais garais naudojant gyvatuką ir atšaldoma. Misa supilama į rauginimo aparatą
(2), kuriame per fakelą užsėjama gryna kultūra iš Kalsbergo kolbos. Misa rauginama tris paras, kartu vyksta
ir mielių dauginimasis, temperatūra − 8 °C. Tuo metu paruošiamas sterilizatorius (3), užpildomas misa,
viskas sterilizuojama ir atšaldoma iki 8 °C. Paskui į sterilizatorių (3) perpumpuojama iš talpos (2) išrauginta
mielių biomasė (500 litrų). Dalis raugintos misos (po 10 litrų iš kiekvieno aparato (2)) nupilama į indus (4),
kuriuose laikoma kaip sėjamoji kultūra tolesniam rauginimui. Sterilizatoriuje (3) tris paras rauginama, todėl
sterilizatorius (3) atlieka dvi funkcijas: kaip sterilizacijos talpa ir parengiamojo rauginimo rezervuaras. (2)
Ištuštintas po rauginimo rauginimo aparatas vėl užpildomas sterilia misa iš sterilizatoriaus (1) ir užsėjamas
laikomomis induose (4) mielėmis.
Mielių auginimo procesas Greinerio sistemos aparatuose vyksta nepertraukiamai, kol aptinkamas
kultūros užterštumas. Rauginta misa su mielėmis iš didžiojo sterilizatoriaus nukreipiama į rauginimo talpą
(10 000 litrų), užpilama apie 3 000 litrų gamybinės alaus misos, o po 12 valandų dar pilama 4 000 litrų, po
36 valandų rauginta misa su mielėmis naudojama užsėti pagrindinio rauginimo talpoje. Darbinė talpa
užpildoma misa iki 50 % ir procesas tęsiamas iki normalaus surūgimo ir šviesėjimo, o jaunas alus
perpumpuojamas į laikymo (brandinimo) rūsį, mielės naudojamos kaip pirmos generacijos, mieles galima
naudoti 10–12 generacijų.
Skaidri atšaldyta misa patenka į rauginimo talpą, kurioje mielės logaritminėje fazėje gali būti laikomos
nuo penkių iki septynių savaičių. Šiuo metu turi būti palaikoma pastovi mielių koncentracija, kad nesikeistų
mielių kiekis rauginimo metu. Terpė nuolat maišoma. Mielių norma yra 0,5 1/hl. Misa rauginama septynias
paras rauginimo talpose. Pagrindinis rauginimas vyksta rauginimo talpose arba rezervuaruose. Rauginimo
patalpoje palaikoma 6–8° C temperatūra. Pagrindinis rūgimas skirstomas į kelias stadijas, kurios skiriasi
rauginamos misos paviršiaus kitimu ir ekstraktų mažėjimo lygiu. Pagrindinė rūgimo stadija trunka 1–1,5
paros. Šiuo metu dauginasi mielės ir misos paviršiumi susidaro lengvos putos. O misos koncentracija per
parą sumažėja 0,1–0,2 %. Antroji rūgimo stadija trunka 2–3 paras ir vadinama apatinių garbanų stadija. Šioje
stadijoje susidaro tirštos kompaktiškos garbanotos putos. Misoje per parą sumažėja 0,5–0,8 % ekstrakto.
288
Trečioji stadija trunka 3–4 paras. Ji vadinama aukštųjų garbanų stadija. Šiuo metu misa rauginama
intensyviausiai. Ekstraktų nuostolių per parą esti 0,8–1,5 %. Ketvirtojoje stadijoje pamažu nusėda putos,
susidaro mielių dribsniai, alus nuskaidrėja. Šioje stadijoje per parą ekstraktų sumažėja 0,5–0,2 %, tai trunka
dvi paras. Kai ekstraktų per parą sumažėja 0,1–0,2 %, pagrindinis rūgimas baigiasi. Pagrindinis raugimas
vyksta rauginimo tankuose, talpose. Rauginimo talpoje palaikoma 6–8° C temperatūra. Atšaldyta misa
pilama į rezervuarus iki 1/3 tūrio. Vienam dekalitrui pridedama 0,5 litro misos. Priklausomai nuo pradinės
misos, patenkančios į rauginimo aparatus koncentracijos, rūgimas trunka 7–10 parų. 11–13 % misos
rauginama 7 paras, 14–18 % misos − 8–10 parų.
Pasiekus nustatytą rauginimo laipsnį (šviesiajam alui 58–60 %; tamsiajam alui 50–55 %) pagrindinio
rūgimo procesas baigiasi ir gaunamas 5–6 °C temperatūros jaunas alus. Siurbliu jaunas alus varomas į
pirminio filtravimo įrenginį, o separatoriuje iš jauno alaus atskiriamos mielės. Prirauginimui pridedama
šviežių arba surinktų ir perplautų mielių. Prirauginimo (išlaikymo) skyrius įrengiamas žemiau rauginimo
skyriaus, kad galima būtų naudotis savitaka. Prirauginimo patalpoje palaikoma 1–2 °C temperatūra.
Plokšteliniame šaldytuve alus atšaldomas ir varomas į karbonizavimo talpas, kuriose yra prisotinamas
anglies dioksido dujomis (0,2 %). Susidariusios anglies dioksido dujos ištirpsta aluje, esant rezervuaruose
0,13–0,15 MPa slėgiui. Toliau alus perpompuojamas į laikymo tankus, kuriuose laikomas 15 parų iki
surauginimo 76–78 %, laipsnio esant 1 °C temperatūrai. Gatavo alaus kokybės analizė atliekama cheminėse
laboratorijose, kuriose nustatomas alkoholio, angliarūgštes kiekis aluje, rūgštingumas, spalva ir stabilumas.



9 pav. Greinerio aparatas: 1 – mažasis sterilizatorius, 2 – rūgimo cilindrai, 3 – didysis sterilizatorius, 4 – indai grynai
kultūrai palaikyti

Atsiskaitymas

1. Mielių charakteristika.
2. Alaus mielių charakteristika.
3. Alaus mielių cheminė sudėtis.
4. Alaus mielių pigmentai, vitaminai ir fermentai.
5. Mielių dauginimas laboratorinėmis sąlygomis.
6. Alaus mielių dauginimas pusiau gamybinėmis ir gamybinėmis sąlygomis.
7. Gamybos kontrolės objektai ir metodai.
8. Optimali alaus mielių gamybos technologija ir jos panaudojimas alaus gamyboje.

Literatūra

1. Grinienė, E. Biochemija. Kaunas: Technologija, 1998. 181 p.
2. Gailiūnienė, A. Biochemija. Kaunas: KMU. 1999
289
3. Pečiulis, J. Mikrobiologiniai maisto produktų kokybės tyrimo metodai. Vilnius: Leidybos centras. 1995,
p. 57–63.
4. Pečiulis, J. Mikrobiologija. Vilnius: Mokslas. 1983, p. 14–21; 40–43; 147 p.
5. Holum, J. R. Fundamentals of general, organic and biological chemistry. USA, 1997. 745 p.
6. Devlin, T. M. Biochemistry, New York, 1997.
7. Banevičius, J. Alus ir stiprūs gėrimai. Kaunas: Aušra. 2000. 41 p.
8. Вахербауер, К.; Эберс, Х.; Кунерт, С. Пропагациа дрожжей и активностъ чистой културы
дрожжей // Вrauwelt, Мир пива. 1999. Nr. 11. c. 24–29.
9. Мангер, Х. Й. Проблемы определения количества дрожжевых клеток на пивоварунном
производстве // Вrauwelt, Мир пива. 1999. Nr. 11. C. 22–23.
10. AB „Vilniaus Tauras“ technologinės instrukcijos.
11. Колгева, Р. А.;. Ермолова, А. Г. Производство пиво и безалкоголъных напитков. Москва, 1985.
12. Малъцев, П. М.. Техналогия солода и пиваю. Москва. 1964. 571 c.
13. Bernatonis, J.; Venskavičius, J. Bendroji maisto produktų technologija. Vilnius: Mokslas, 1977.
14. Kundre, W. Technology Brewing and Malting. T: Wainwright, 1996.
15. Lietuvos standartas LST 44: -1993. Alus. Bendrosios sąlygos.
16. Dagys, V. Darau savo alų. Ūkininko patarėjas. 2000.
17. Velička, A. Kaip kartumas virsta saldumu. http://www.alutis.lt

5. Alaus filtravimo ir išpilstymo technologija

Darbo tikslas

Susipažinti ir įsisavinti alaus filtravimo, separavimo bei išpilstymo technologijas.

Tyrimo objektas

Alaus separavimo, filtravimo bei išpilstymo cechai.

Naudojamos priemonės ir įrenginiai

Separatorius, kizelgūrinis filtrpresas, butelių plovimo bei išpilstymo įrenginiai.

Darbo eiga

Alaus filtravimas

Mielių liekanoms atskirti nuo alaus, prekinei išvaizdai suteikti ir stabilumui išlaikyti alus filtruojamas
(skaidrinamas). Šiandien alaus filtravimas neatsiejamas nuo alaus pramonės, tačiau plačiau filtravimas buvo
pradėtas naudoti tik XX a. pradžioje. Alaus filtravimas sukėlė šios pramonės šakos atstovų diskusijas. Buvo
tvirtinama, kad filtruojant kartu su mielėmis iš alaus yra pašalimos medžiagos, kurios yra svarbios jo skoniui
bei kitoms savybėms. Dar buvo tvirtinama, kad nuolatinis filtrų naudojimas sudaro galimybes slėpti
technologines problemas, o tai sudaro sąlygas mažėti viso personalo darbo atlikimo kruopštumui. Nepaisant
visų šių prieštaravimų, filtruotas alus dėl išskirtinių savo savybių pelnė daugelio vartotojų pripažinimą ir
filtras tapo neatskiriama alaus pramonės dalimi [1].
Filtravimas vyksta kizelgūriniuose filtruose, separatoriuose, rėminiuose filtruose su filtravimo mase.
Dažniausiai dėl gero efektyvumo bei rezultatų yra naudojami kizelguriniai filtrai. Juos naudojant
pasiekiamas didesnis skaidrumo laipsnis, išlaikoma spalva, skonis ir putojimas [1, 3].
Prieš filtruojant alų, rezervuaras sujungiamas su suspausto oro ar angliarūgštės linija, kad sudarytų
reikiamą slėgį, o prie rezervuaro nuleidžiamojo čiaupo prijungiama alaus žarna, kuria alus tiekiamas į filtrą.
Paskui atidaromas rezervuaro čiaupas ir oro linijos ventilis ir tik tada paleidžiamas siurblys, kuriuo atiteka
alus.
Filtravimo metu rezervuaruose palaikomas slėgis ne mažesnis nei išlaikymo metu. Taip pat būtina
palaikyti viršslėgį induose – saikikliuose, į kuriuos filtruojamas alus, norint išsaugoti jame ištirpusią
290
angliarūgštę. Visose gamybos stadijose turi būti vengiama putojimo, susijusio su angliarūgštės praradimu [1,
4].
Alaus žarnos ir vamzdžiai turi būti vienodo skersmens ir su lygiu vidiniu paviršiumi.
Alus vamzdžiais tiekiamas tolygiai; viršslėgio negalima keisti staigiai nutraukiant orą ar angliarūgštę.
Maišomas skirtingo tankio alus tiekiamas filtracijai iš dviejų ar trijų rezervuarų vienu metu per maišytuvą.
Prieš filtrus rekomenduojama įrengti saugiklius ir atšaldyti alų iki 0,5–1 °C temperatūros.
Prieš prijungiant žarną prie filtro, pirma alaus porcija renkama į nedidelį indą ir perduodama perdirbti.
Tik paskui, kai iš žarnos pradės tekėti alus be mielių, žarna prijungiama prie filtro. Vanduo, išstumtas iš
filtro, pašalinamas į kanalizaciją. Pirmos porcijos atskiesto alaus, ištekančio iš filtro, surenkamos į atskirą
indą ir nukreipiamos perdirbti. Tik paskui, kai iš filtro pradeda tekėti pilnavertis alus (tikrinama
organoleptiškai), jis yra nukreipiamas į filtruoto alaus rinktuvą. Filtruoto alaus rezervuarus būtina įrengti
šaldomoje patalpoje, kad alus būtų žemos temperatūros. Šiuose rezervuaruose iki pilstymo pabaigos turi būti
palaikomas 0,4–0,5 atm slėgis, kuris dažniausiai sudaromas naudojant angliarūgštę [2].
Alaus filtravimo metu visą laiką turi būti griežtai palaikomas viršslėgis. Alus į filtrą turi būti tiekiamas
tolygiai ir nenutrūkstamai. Filtravimo metu stebimas perfiltruoto alaus skaidrumas. Jis stebimas per filtro
stebėjimo langelį arba tiesiog stebimas alaus pavyzdys stiklinėje.

Alaus separavimas

Alui nuskaidrinti separuojant plačiai naudojamas hermetiškas lėkštelinis išcentrinis separatorius, iš kurio
periodiškai iškraunamos nuosėdos. Tokio separatoriaus schema pateikta (1, 2 pav.).


Judančiame tarp lėkštelių aluje pakibusios nuosėdų dalelės, veikiamos išcentrinės jėgos, išmetamos ant
žemutinių lėkščių paviršiaus ir juo nučiuožia į erdvę 6, sudarydamos tankų sluoksnį prie vertikalaus būgno
paviršiaus. Šviesesnis alus pašalinamas iš būgno per išleidžiamąją įrangą, o nuosėdos – periodiškai
praplaunant būgną [2].
Prieš paleidžiant separatorių, reikia apžiūrėti ir patikrinti įrangą, tepalus vonioje, stabdžių išjungimą.
Separatorius užpildomas vandeniu ir tik paskui įjungiamas. Prieš įjungiant nustatomas 0,1–0,15 MPa slėgis,
toliau jis po truputį didinamas iki 0,5 MPa. Vanduo iš separatoriaus išteka į kanalizaciją. Kai separatoriaus
1 pav. Išcentrinis separatorius su nuosėdų iškrovimo įrenginiu: 1 −
perdavimo mechanizmas; 2 – korpusas; 3 – rotorius; 4 – droselis;
5 – lėkščių paketas; 6 – dangtis; 7 – velenas; 8 – paskirstymo
2 pav. 1 – lėkštės; 2 – lėkščių paketas;
3 – būgnas; 4 – misos anga; 5 – žiedas; 6 −
nuosėdos
291
būgnas įgauna reikiamą apsisukimų dažnį, vandens tiekimas išjungiamas ir įjungiamas alaus. Pasirodžius
alui kontroliniame lange, tiekiamąją ir išleidžiamąją separatoriaus įrangą sujungiame su alaus vamzdžiu.
Darbo metu palaikomas normalus slėgis: įeinant − 0,07 MPa, o išeinant − 0,5 MPa. Darbinis rotoriaus
apsisukimų dažnis yra apie 5000 aps/min.
Darbo pradžioje separatoriaus našumas yra apie 20 h/l per valandą. Jeigu alus išeina gerai nušviesintas,
separatoriaus našumas padidinamas iki maksimalaus (45 h/l) ir palaikomas viso darbo metu. Separatoriaus
našumo sumažinti nerekomenduojama, nes nuo to alus nepašviesėja. Kadangi procesas yra nepertraukiamas,
nutraukti alaus tiekimo srovės, pavyzdžiui, per perėjimą nuo vieno tanko prie kito, negalima. Prieš
separatorių turi stovėti maišiklis, o naujas tankas įjungiamas tada, kai alus dar yra pradiniame tanke.
Prieš sustabdant separatorių vietoje alaus į jį tiekiamas vanduo, kuris nuteka į kanalizaciją ir tik paskui
separatorius išjungiamas nenutraukiant vandens tiekimo.
Kai separatoriaus nuosėdų erdvė užpildoma nuosėdomis, jis sustabdomas ir būgnas perplaunamas karštu
vandeniu (ne daugiau kaip 70 °C) bei dezinfikuojančiu tirpalu.
Vandens cirkuliacijos metu separatorius trumpam įjungiamas. Plovimo pabaigoje jis perplaunamas šaltu
vandeniu, kol vanduo tampa visiškai skaidrus. Valdant būgną draudžiama naudoti šarminius tirpalus [1].

Alaus filtravimas kizelgūriniuose filtruose

Aukšto skaidrumo laipsnio alui gaminti separuotas alus dar ir filtruojamas. Alus filtruojamas per
filtruojamųjų miltelių sąnašų sluoksnį.
Tokių filtrų ypatumas yra tas, kad ant kartono plokštelės sukuriamas sluoksnis iš medžiagos (diatomito),
išplautos ant tų plokštelių. Diatomitas, dar vadinamas kizelgūru, yra lengvas, šviesiai pilkos, geltonos ar
baltos spalvos, dažniausiai iš vienaląsčių dumblių sudaryta medžiaga.
Filtravimo milteliai gaunami šiuo būdu: grubiai suskaldytas diatomitas apdeginamas esant 800–1100 °C
temperatūrai, paskui sumalamas ir frakcionuojamas pagal dalelių dydį. Miltelių tankis − 0,45–0,37 kg/l.
Milteliai labai porėti, dėl to dalelių paviršiaus plotas siekia net iki 20 m
2
vienam kilogramui miltelių masės.
Dalelių dydis svyruoja nuo 2 iki 100 µm.
Prieš filtravimą reikia paruošti filtrą darbui. Jei filtras paleidžiamas pirmą kartą, visa sistema užpildoma
2 % 60 °C temperatūros sodos tirpalu. Įjungiant siurblį, tirpalas cirkuliuoja ne mažiau kaip 15 min, paskui jis
pašalinamas, o filtras plaunamas karštu vandeniu (60–70 °C) tol, kol išleidžiamos praplovimo vanduo taps
neutralus.
Filtras užpildomas milteliais taip: ant filtro plokštelių uždedamas atraminis kartonas, prieš tai 20–
30 min. išmirkytas karštame vandenyje. Paskui filtras surenkamas ir užpildomas vandeniu. Kai vanduo
pradės tekėti per oro čiaupus, įjungiamas siurblys ir stebima, kad slėgis būtų 4 atm. Tai atliekama siekiant
patikrinti hermetiškumą. Į maišytuvą iki pusės pripilama vandens ir nepertraukiamai maišant pilamas
kizelgūras. Pirmojo sluoksnio pabaiga nustatoma, kai kizelgūro nerandama vandenyje, einančiame pro
stebėjimo langelį. Po pirmojo sluoksnio sudaromas antrasis. Sudarant filtravimo sluoksnius, būtina stebėti
oro pašalinimą iš filtro, dėl to reikia kiek atidaryti oro kranus.
Prieš tiekiant alų į filtrą, būtina įsitikinti, kad dozavimo siurblys veikia normaliai ir siunčia suspensiją į
magistralinį vamzdyną. Normaliai dirbant stebėjimo langelyje aiškiai matoma įpurškiamo kizelgūro porcija.
Išstūmus vandenį alumi filtre, alus nukreipiamas į filtruoto alaus rezervuarą, kurį rekomenduojama statyti
vienu lygiu su filtru.
Filtruojama tol, kol slėgis į filtro plokšteles pasiekia 5 atm, paskui įjungiamas siurblys – dozatorius ir
alus iš filtro išstumiamas vandeniu.
Filtras atidaromas, nuosėdos nuplaunamos šalto vandens srove. Filtras vėl surenkamas ir per jį priešinga
alaus tekėjimo kryptimi (filtravimo metu) paleidžiamas vanduo.
Siekiant išvengti sluoksnio pažeidimo filtravimo procese negalima stabdyti siurblio, tiekiančio alų į
filtrą. Darbo pabaigoje filtras, maišytuvas, dozatorius ir vamzdžiai praplaunami šaltu vandeniu. Ne rečiau
kaip 2 kartus per mėnesį filtras dezinfekuojamas 20 % karštu sodos tirpalu [4].
Po filtravimo alus pilstomas.




292
Butelių plovimo technologinė instrukcija

Alus būtinai turi būti pilstomas tik į švarią tarą, kuri gaminama iš tvirto, permatomo stiklo,
nepraleidžiančio alui kenksmingų saulės spindulių. Šie spinduliai gali sukelti chemines reakcijas, kurių
pasekmė − produktai, skleidžiantys nemalonų kvapą.
Atrenkant butelius iš taros cecho į pilstymo cechą plovimui, nauji ir naudoti buteliai yra tikrinami prieš
šviesinį ekraną. Atmetami nestandartiniai, defektiniai ar stipriai užteršti buteliai. Tie buteliai, kurie atitinka
kontrolės keliamus reikalavimus, toliau keliauja į automatinę butelių plovyklą [1].
Butelių plovimo aparato AMM – 6 schema (3 pav.):



3 pav. 1, 2, 3, 4 – butelių plovimo įrenginiai, 5 – sukimo grandinės, 6 – korpusas, 8, 13 – šildytuvai, 9, 14 – vonios, 11,
12 – vonios skysčiui po plovimo, 16 – įkrovimo mechanizmas, 21 – iškrovimo mechanizmas

Butelių kasetės, pritvirtintos ant dviejų grandinių (5), sudaro nesibaigiantį konvejerį. Šios konvejerio
grandinės sukamos 5 žvaigždučių porų.
Apatinėje automato korpuso dalyje yra 2 vonios (9) ir (14). Šiose voniose buteliai mirkomi. Viršutinėje
korpuso dalyje yra išdėstyti butelių apiplovimo įrenginiai (1), (2), (3) ir (4), skirti buteliams apdoroti
šarminiu tirpalu, šiltu ir šaltu vandeniu, taip pat (11) ir (12) vonios, į kurias įteka plovimo skystis po
apiplovimo.
Apatinėse voniose su šarmu įtaisyti šildytuvai (8) ir (13). Taip pat yra tinklinis būgnas, iš tirpalo
surenkantis nuplautas etiketes. Vanduo, esantis viršutinėje vonioje, yra šildomas garais.
Įkrovimo mechanizmas susideda iš eilės volelių (16), kurie sukasi viena kryptimi. Į kasetę telpa 16
butelių.
Švarūs buteliai iškraunami į iškrovimo mechanizmą (21). Šiuo mechanizmu buteliai yra pastatomi į
vertikalią padėtį ir stumiami į plastikinį transporterį (20).
Butelių plovimo aparate yra automatiškai reguliuojamas temperatūros režimas palaikant nedidelį
plaunamų skysčių temperatūros svyravimą. Nuo didelių temperatūros svyravimų padidėja sudužusių ar
suskilusių butelių. Buteliai plovimo automate plaunami taip: ant pakrovimo stalo jie skalaujami šiltu 25–
30 °C vandeniu, kuris teka iš vonios (12) į apšlakstymo vamzdį (18); buteliai yra pašildomi ir dalis
nešvarumų nusiplauna; prieš pirmąją plovimo vonią buteliai apipilami silpnu šarminiu vandeniu iš vamzdžio
(22), kuris į jį patenka iš vonios (11). Vanduo, naudojamas pakrovimo stale, prieš pirmąją vonią yra labai
nešvarus, todėl jis patenka į kanalizaciją; vonioje (14) vyksta nešvarumų mirkymas. Mirkoma 1–2 %
šarminiame tirpale (NaOH su NaCo priedu) esant 60–65 °C temperatūrai, išėjusios iš vonios kasetės rieda
būgnu. Čia vyksta butelių apiplovimas šarminiu 60–65 °C temperatūros tirpalu, tam kad nusiklijuotų
etiketės.
293
Vonioje (9) nešvarūs buteliai yra mirkomi 1–2 % šarminiame tirpale esant 75–80 °C temperatūrai;
viršutinėje horizontaliojoje dalyje buteliai daug kartų apiplaunami iš vidaus ir išorės karštu šarminiu tirpalu
(60–65 °C), paskui − šiltu ir šaltu vandeniu.
Išplauti ir atvėsinti buteliai dar pereina kelis etapus, kad vanduo nutekėtų. Vėliau buteliai iš kasetės yra
perduodami į pakrovimo stalą [2].
Butelių plovimo automatai AMM – 6 yra skirti 0,5 l ir 0,33 l talpos buteliams.

Alaus išpilstymas į butelius

Alus išpilstomas į taras izobarinėmis sąlygomis, t. y. kai jo slėgis yra pastovusis ir perteklinis. Pilstomas
nesuslėgtas alus putotų ir taip būtų prarandama angliarūgštė bei nesandariai užpildoma tara. Pilstyti
naudojamos izobarinės pilstymo mašinos.
Prieš užpildant, butelis hermetiškai uždaromas. Taigi talpos susisiekia tik su pilstymo aparato alaus
rezervuaro dujų erdve, taigi nustatomas slėgis, lygus slėgiui alaus rezervuare ir tik paskui į talpą pradeda
tekėti alus. Taip pat alaus išstumiamos CO
2
dujos vėl nukreipiamos į rezervuarą. Izobariškai pilstomas alus
beveik neputoja. Angliarūgštės praradimas yra minimalus.
Alus pilstomas į butelius automatinėse linijose automatiškai, sujungtais tarpusavyje plokšteliniais
transporteriais. Linijoje vyksta butelių plovimo, alaus pilstymo, užkimšimo, brokavimo ir etiketavimo
procesai. Alaus temperatūra pilstant palaikoma ne aukštesnė kaip 3 °C. Alaus vamzdžiai iki pilstymo mašinų
turi būti su šilumos izoliacija.
Buteliai užkemšami metaliniais kamšteliais, kuriuose yra hermetiškumą užtikrinanti tarpinė. Tarpinė turi
būti švari, o kamštelio lako danga nepažeista. Prieš užkemšant kamšteliai garinami arba dezinfekuojami 2 %
formalino tirpalu, o vėliau gerai praplaunami vandeniu.
Brokuoti buteliai nustatomi šviesos ekranu. Nepilni, blogai uždaryti ar su mechaninėmis priemaišomis
buteliai atrenkami, atkemšami ir taip alus grąžinamas atgal į gamyklą. Patikrinus broką tolesnis automatas
užklijuoja etiketę, ant kurios nurodyta alaus rūšis, išpilstymo data, gamyklos pavadinimas, alaus stiprumas.
Etiketėms klijuoti naudojami klijai, pasižymintys geru gebėjimu klijuoti ir greitu atmirkimu šiltame
vandenyje.
Alus gali būti pilstomas ne tik į butelius, bet ir į statines bei cisternas. Pilstyti naudojamos statinės
gaminamos iš aliuminio bei kitų medžiagų, kurios atitiktų reikalavimus, keliamus pilstymo, transportavimo
bei pardavimo metu. Gražinamos iš prekybos statinės turi būti kruopščiai patikrinamos, ar nėra mechaninių
pažeidimų, pašalinių kvapų, likusių daiktų ir pan. Statinės gali būti plaunamos plovimo mašinose naudojant
švirkštus. Aliumininių statinių karšto vandens temperatūra turi būti 65–70 °C, jei neatliekama dezinfekcija.
Išplautos statinės perduodamos pilstyti. Pilnas, alaus pripildytas statines draudžiama stumdyti ir ridinėti
grindimis. Užpildytos statinės užsukamos metaliniais kamščiais, dezinfekuotais 3 % formalino tirpalu [5, 3].

Atsiskaitymas

1. Alaus filtravimo technologija.
2. Alaus separavimo technologija.
3. Alaus filtaravimas kizelgūriniuose filtruose.
4. Butelių plovimo technologija.
5. Alaus išpilstymo technologija.

Literatūra

1. Колнева, Р. А.; Ермолаева; А. Производство пива и безалкогольных напитков. Москва:
Агропромиздат, 1985. 146 c.
2. Главачек, Ф.; Алхотский, А. Пивоварение, Moквa, 1977. 468 c.
3. Puslapis alaus megėjams – internet: www.alutis.lt
4. Maлъцев, П. M. Тeхнология солода и пива. Москва. 1984. 516 c.
5. Pečiulis, J. Mikrobiologiniai maisto produktų kokybės tyrimo metodai. Vilnius, 1995. 254 p.

294
6. Alaus gamyba cilindriniuose kūginiuose tankuose (CKT)

Darbo tikslas

Įsisavinti alaus gamybą cilindriniuose konusiniuose tankuose.

Tyrimo objektas

Cilindrinių konusinių tankų alaus gamybos baras.

Naudojamos priemonės ir įrenginiai:

Cilindriniai konusiniai tankai.

Darbo eiga

Pradėjus naudoti dirbtinį šaltį alaus virimo įmonėse atsirado galimybė reguliuoti numatytą temperatūrinį
režimą atskiruose rauginimo aparatuose, kartu betarpiškai atšaldant alų. Tai sudaro galimybę rauginti ir
nokinti viename vertikaliame cilindrokonusinės formos aparate. Tokių aparatų talpa yra nuo 50 (aukštis 8 m)
iki 400 m
3
(aukštis 15 m). Esant tokiam dideliam aukščiui cilindrokonusiniame rauginimo aparate vyksta
stipri misos konvekcija (persimaišymas iš apačios į viršų, ir atvirkščiai), sukelta anglies dioksido burbuliukų
išsiskyrimo ir jų judėjimo į viršų; taip pat dėl šiluminių skysčio srovių, kurių stiprumas priklauso nuo rūgimo
intensyvumo, reguliuojamo tam tikros temperatūros palaikymu šaldant.
Kartu su misa į aparatą sudedamos mielės ir rauginama 8–10 parų. Pasiekus reikiamą rūgimo lygį
konusinė dalis stipriai atšaldoma ir mielės nusėda. Intensyviai aeruojant misą pagrindinis rūgimas 12–14 °C
temperatūroje vyksta 7–12 parų. Po pagrindinio rūgimo alus nokinamas. Jaunas alus atšaldomas aparate iki
1–2 °C ir leidžiamas švarus anglies dioksidas. Paskui alus karbonizuojamas. Jis atliekamas esant 0 °C ir
padidintam slėgiui. Karbonizuotas alus naudojamas likusioms mielėms nusėsti. Visas rauginimo ir nokinimo
procesas tęsiasi 10–14 parų.
Cilindrinis kūginis rauginimo aparatas gaminamas iš korozijai atsparaus plieno su poliruotu vidiniu
paviršiumi (žr. 1 pav.). Aparatas turi keturis šaldančius „marškinius“: tris ant cilindrinės dalies ir vieną ant
kūginės dalies. Apatinė kūginio dugno dalis nuimama (valant ir plaunant, taip pat vizualiai apžiūrint po
dezinfekcijos). Per liuką viršutiniame dangtyje į aparato vidų įeina vamzdis su plovimo galvute, vamzdynų
sistema sujungta su dezinfekcinių tirpalų siurbliais ir talpykloms. Apatinė cilindrinio korpuso dalis baigiasi
atraminiu žiedu. Ivolės aparatas apskaičiuotas 0,07 MPa slėgiui, vakuumo pertraukiklis − iki 0,4 MPa.
Pastarasis hidrauliniu užraktu jungiasi su antvamzdžiu. Aparate yra įrenginys su armatūra, naudojama misai,
mielėms, anglies dioksidui, plovimo skysčiams, šalčio agentui tiekti, taip pat yra įrengti temperatūros,
apytikrio viršutinio lygio kontrolės ir reguliavimo davikliai, apsauginis vožtuvas. Išimamų mielių kontrolei
konusinės aparato dalies išėjime yra įtaisytas stiklinis langelis. Alaus lygis aparate, slėgis ir temperatūra
reguliuojami atomatiškai.
Vertikalūs cilindriniai konusiniai rauginimo aparatai gaminami 100 m
3
talpos (darbinis tūris 80 m
3
).
Šaldomo paviršiaus plotas 44,3 m
2
, maksimalus slėgis aparate − 0,07 MPa, o šaldančiuosiuose
„marškiniuose“ – 0,4 MPa. Neužpildytas aparatas be šiluminės izoliacijos sveria apie 12 tonų.
Cilindriniai konusiniai rauginimo aparatai turi šilumos izoliacinį apvalkalą, kuris leidžia juos įrengti ne
tik pastate, bet ir lauke.
Alaus paruošimo cilindriniame konusiniame aparate technologija yra tokia: nuskaidrinta misa, atšaldyta
iki 6 °C temperatūros, nukreipiama į konusinę aparato dalį per atidarytą ventilį, sujungiantį aparatą su
atmosfera. Aparatas pildomas kelias paras vienu ar dviem etapais, priklausomai nuo misos atėjimo iš virimo
cecho. Pirmieji 50 % misos aeruojami steriliu oru. Intensyvi aeracija dar prieš rūgimą leidžia gauti misoje
4–6 mg/mL ištirpusio deguonies.
Iš pradžių, kai misa užpildyta tik 2–3 % darbinio tūrio, į aparatą naudojant siurblį dedamos stipriai
rauginančios mielės. Tuo pačiu metu dedami ir fermentai. Po to aparatas užpildomas misa 85 % jo tūrio.
Rūgimo proceso trukmė pradedama skaičiuoti nuo misos nukreipimo į aparatą momento.
295
Per pirmąsias dvi paras misos temperatūra dėl spiritinio rūgimo pakyla nuo 6 °C iki 12–14 °C ir tokia
palaikoma (dėl šaldymo agento naudojimo viršutinėje šaldančiojoje dalyje) iki galutinės rūgimo stadijos.
Atšaldyta per paviršinius „marškinius“ rauginama misa leidžiasi žemyn, o šiltesnė − kyla į viršų – taip
užtikrinamas geras natūralus rauginamos misos susimaišymas.
Kai ekstraktinių medžiagų kiekis sumažėja iki 3,5–3,2 %, aparatas špuntuojamas ir toliau procesas
vyksta esant 0,04–0,06 MPa slėgiui. Taip alus geriau prisisotina anglies dvideginio ir pagreitinamas mielių
nusodinimas.
Kad rauginama misa neprišaltų prie aparato sienelių, šaldymo agento temperatūra turi būti ne žemesnė
kaip +6 °C. Kaip šaldymo agentas naudojimas rasalas (pavirintas druskos tirpalas).
Baigiantis intensyviam raugimui, kai ekstraktinių medžiagų koncentracija aluje sumažėja iki 2,6–2,2 %,
konusinė aparato dalis atšaldoma iki 0,5–1,5 °C temperatūros. Pasiekus tokią temperatūrą šaldymo agento
tiekimas į šaldančius „marškinius“ nutraukiamas. Cilindrinėje aparato dalyje 12–14 °C temperatūrą
palaikoma dar 1,5–2 paras, kad pagreitėtų rūgimo procesas.
Kūginėje aparato dalyje esant žemai temperatūrai vyksta mielių nusėdimas ir tankių nuosėdų
susidarymas. Tuo baigiasi pagrindinis rūgimas, kuris vyko 7–12 parų. Paskui į visus šaldančiuosius
„marškinius“ (išskyrus kūginės dalies) nukreipiamas šaldymo agentas ir alus atšaldomas iki 0,5–1,5 °C
temperatūros. Prasiseda nokinimo stadija. Po 10–11 parų nuo rauginimo pradžios iš kūginės aparato dalies
lėtai pirmą kartą nuimamos mielės. Prieš nuskaidrinant alų vyksta antrasis mielių nuėmimo į specialias talpas
etapas. Mielių nuėmimo pabaiga nustatoma vizualiai per langelį stebint alaus be mielių atsiradimą.
Į 0,06 MPa slėgio erdvę, esančią virš skysčio, alus nukreipiamas nuskaidrinti separavimo ir filtravimo
būdu.
Tuščias aparatas plaunamas taip:
1 etapas: plaunama 2 % NaOH ir HNO
3
tirpalu, kurio temperatūra − 40 °C. Plovimo trukmė − 45 min.
2 etapas: perplauname kambario temperatūros vandeniu. Plauname 10 min.
3 etapas: plauname 1 % HNO
3
tirpalu. Temperatūra − 12–15 °C, trukmė − 45 min.
4 etapas: perplauname kambario temperatūros vandeniu. Plauname 10 min.
5 etapas: plauname dezinfekatu, kurio pagrindas yra acto rūgštis ir peroksidas, trukmė 30 min.
6 etapas: perplauname kambario temperatūros vandeniu. Plauname 10 min.
Lyginant su klasikine alaus gamyba, CKT metodas turi privalumų:
1. Rūgimo ir nokinimo procedūra sutrumpėja du kartus.
2. Geresnė aparato priežiūra.
3. Alus rūgsta ir noksta vienoje patalpoje (nereikia jo perpumpuoti).
Karšta misa iš hidrociklono yra nukreipiama į plokštelinį šaldytuvą, kuriame atšaldoma iki 9–10 °C
temperatūros. Misos tiekimo vamzdynas sujungiamas cilindrine kūgine talpa, kurioje ir prasideda misos
šaldymas.
Šaldant misa aeruojama suspaustu oru iki 0,3–0,4 g O
2
/l misos. Paskui į aeruotą misą yra dozuojamos
mielės, 0,5–1 l/hl misos.
Misa pradedama rauginti 9–10 °C temperatūroje, paskui ji pakeliama iki 14 °C. Rūgimas vyksta 5–8
paras 14 °C temperatūroje. Temperatūra yra palaikoma automatiškai.
5–8 parą nuo rauginimo pradžios yra palaikomas 0,04–0,05 MPa slėgis. Rauginimo proceso pabaigoje
tanko konusinė dalis yra atšaldoma iki 1,5 °C temperatūros. Per 2 paras 1,5 °C temperatūroje yra
nusodinamos mielės. Mielės yra surenkamos ir rauginamos, jas kiekvieną dieną prižiūrint mikrobiologui.
Mielės naudojamos 5–8 operacij, t. y. tol, kol mirusių ląstelių kiekis neviršija 8–10 %, ir jei jos neužkrėstos
pašaliniais mikroorganizmais.
Nusodinant ir pašalinant mieles viršutinėje cilindro dalyje palaikoma 13–14 °C temperatūra.
Kada mielės pašalinamos, pradedamas nokinti alus. Tam visas tūris per 2 paras atšaldomas iki 1,5 °C
temperatūros. Šioje temperatūroje alus išlaikomas 10–14 parų. Likus 1–2 paroms iki alaus nokinimo
pabaigos paimamos alaus pavyzdys. Jis yra patikrinamas nustatant juslinius ir fizikocheminius rodiklius,
kurie turi atitikti nurodytus receptūrose.
Išnokintas ir laboratorijoje patikrintas alus yra siunčiamas į alaus nuskaidrinimo barą.



296
Atsiskaitymas

1. Alaus gamybos technologija cilindriniuose kūginiuose tankuose.
Literatūra

1. Колнева, P. A.; Ермолаева, А. Производство пива и безалкоголньных напитков. Москва, 1985. 468
c.
2. Γлавинский, Д. Γ. Современая техника пивоваренного праизводства. Mосква. 1974, 620 c.
3. Alaus rauginimo ir nokinimo cilindrinėse konusinėse talpose technologinė instrukcija. (Vilniaus
„Tauras“)
4. Alus, internetas: http: //www. utenosalus.lt
5. Alaus gamyba, internetas: http: //www. alutis.lt


297

1 pav. Cilindrinis kūginis tankas: 1. Produkto įėjimas ir išėjimas; 2 − 3 šaldymo agento įėjimas ir išėjimas; 4 –
termometras; 5 − Plovimo galvutė; 6 − mėginių paėmimas; 7 − vandens ir dezinfekcinio skysčio čiaupas; 8 – špuntas;
9 – sklendė; 10 − CO
2
išėjimas.


298
7. Alaus gamybos technologinė kontrolė

Darbo tikslas

Atlikti alaus gamybos technologinę kontrolę.

Tyrimo objektas

Salyklo ir alaus gamybos cechai.

Darbo eiga

1. Cheminė laboratorija

Cheminė laboratorija yra skirta alaus, žaliavų, nutekamųjų vandenų analizei. Į gamyklą atvežtos žaliavos
(miežiai, ryžiai) tiriamos cheminėje laboratorijoje.
Laboratorijoje nustatomas grūdų drėgnumas, natūrinis svoris, ekstraktingumas ir svarbiausia – grūdų
gyvybingumas. Visa tai nustatoma grūdus gavus iš ūkininkų ir žemės ūkio bendrovių.
Išdaiginus miežius gautas salyklas taip pat tiriamas cheminėje laboratorijoje. Čia nustatomas
ekstraktingumas, drėgnumas, baltymų kiekis. Taip pat čia nustatomas ir apcukrinimo laikas.
Toliau sumalus salyklą, nustatomas gautos misos rūgštingumas.
Cheminėje laboratorijoje nustatoma ir nutekamųjų vandenų kokybė. Remiamasi šiais rodikliais:
nutekamųjų vandenų kvapas, skaidrumas, įvairios priemaišos.
Laboratorijoje atliekami ir vandentiekio tyrimai: nustatomas geležies kiekis vandenyje, vandens
kietumas. Kietas vanduo minkštinamas leidžiant jį per katijonų kolonėlę, taip pat filtruojant bei virinant.
Prieš parduodant tikrinamas alaus rūgštingumas, sausųjų medžiagų kiekis bei alkoholis (%) ir įvertinama
alaus spalva. Visi šie rodikliai turi griežtai atitikti įmonės nustatytus standartus.

2. Alaus gamyklos kontrolės schema

2.1. Žaliavos

Kontrolės objektas Kontrolės rodiklis Tikrinimo periodiškumas
Miežiai
Miežių priėmimas
Organoleptinis įvertinimas
Miežių temperatūra vagone
Drėgmės kiekis
Kenkėjų pažeisti grūdai
Natūrinis svoris ir 1000 grūdų svoris
Homogeniškumas
Užterštumas piktžolėmis ir grūdais
Miežių priėmimo diena
kiekviename vagone.
Miežių priėmimo į gamyklą metu
ir nustatant saugojimo vietą
Miežių prabos, paimtos
priėmimo metu


Ekstraktingumas
Baltymo kiekis
Grūdo apvalkalo kiekis
Vidutinėse kiekvienos miežių
partijos, paimtos į gamyklą,
prabose iš vienos iškrovimo vietos
per nustatytą laiką
Kontrolės objektas Kontrolės rodiklis Tikrinimo periodiškumas
Salyklo pakaitalai Organoleptinių savybių įvertinimas
Drėgmės kiekis
Ekstraktingumas
Riebalų kiekis (kukurūzų miltuose)
Tikrinama kiekviena priimta
partija
Miežių saugojimas Grūdų temperatūra
Kenkėjų pažeisti grūdai
Dygimo rodikliai
Drėgmės kiekis
Kiekvienoje grūdų saugojimo
vietoje ne mažiau, kaip vieną kartą
per mėnesį; defektų atradimo
atvejais – dažniau
Miežiai papildomo apdorojimo Grūdų temperatūra Po papildomo apdorojimo
299
metu, saugojimo metu
(maišymas, transportavimas iš
vienos saugojimo vietos į kitą)
Natūrinis svoris
Drėgnumas
Grūdų užterštumas piktžolėmis
Grūdų užteršimas kenkėjais
Miežiai prieš perduodant į
gamybą
Natūrinis svoris
Drėgmės kiekis
Grūdų užterštumas piktžolėmis
Grūdų užterštumas vabalais ir
kenkėjais
Ne rečiau kaip vieną kartą
perdavimo metu
Apyniai Organoleptinis įvertinimas
Lupulino būklė
Sėklų kiekis
Priemaišos
Bendras karčiųjų medžiagų kiekis
Peleningumas
Minkštos dervos
Alfa-rūgštys
Kiekviena priimta į gamyklą
partija. Esant specialiai aparatūrai
Vanduo, skirtas
technologiniams tikslams
Organoleptinis įvertinimas
Amoniako, azoto rūgščių ir laisvojo
chloro kokybinės prabos
Oksidacijos laipsnis
Kietumas
Liekamasis šarmingumas
vieną kartą per ketvirtį.
Periodiškai yra nustatomas
„pagaminto“ vandens kietumas ir
chloro kiekis. Galima atlikti
tyrimus specialiose laboratorijose

2.2. Technologinio proceso ir pusfabrikačio kontrolė

Kontrolės objektas Kontrolės rodiklis Tikrinimo periodiškumas
Salyklo gamyba. Miežių
valymas ir rūšiavimas prieš
mirkymą
Grūdų rūšiavimas Fogelio sietuose Kasdien vidutiniuose mėginiuose
Mirkomi miežiai Vandens temperatūra
Mirkymo laipsnis
Praktiškai nustatytas mirkymo
laipsnis
Periodiškai visuose mirkymo
kubiluose
Daiginami miežiai Salyklo temperatūra.
Oro, įeinančio į dygimo talpas, ir
salyklo temperatūra. Oro, išeinančio
iš salyklo dygimo būgno,
temperatūra. Daigų kiekis
procentais. Augančio lapelio ilgis.
Praktiškai nustatomas žalio salyklo
tirpumo laipsnis. Drėgmės kiekis
Periodiškai kiekviena dygstančių
miežių partija
Džiovinamas salyklas Salyklo ir oro temperatūra. Salyklo
drėgmės kiekis, nuo viršutinio groto
pereinant į apatinį
Kiekviena džiovinamo salyklo
partija
Periodiškai visos džiovinimo
vietos, nustatant džiovinimo
režimą
Gatavas salyklas






1000 grūdų svoris
Drėgmės kiekis
Ekstraktingumas
Apcukrinimo laikas
Laboratorinės misos kokybė:
skaidrumas, spalva, rūgštingumas
Grūdo pjūvis arba peršvietimas
Po kiekvienos salyklo laikymo
talpos užpildymo
300






diafanoskopu
Purumo laipsnis
Smulkaus ir stambaus malimo
skirtumas ekstrakte
Galutinis laboratorinės misos
rūgimo laipsnis
Kontrolės objektas Kontrolės rodiklis Tikrinimo periodiškumas
Karamelinis salyklas Organoleptinis įvertinimas. Drėgmės
kiekis
Ekstraktingumas
Spalvos rodikliai
Kiekviena gaunama arba
gaminama partija
Misos paruošimas. Poliravimo
mašinos darbas
Salyklo grūdų būvimas atliekose Periodiškai
Salyklas, ne salyklo medžiagos
ir pakaitalai
Drėgmės kiekis
Ekstraktingumas
Salyklo apcukrinimo laikas
Vidutiniuose mėginiuose, kurie
apima visas naudojamas
medžiagas (per keletą dienų,
savaičių, dekadų)
Salyklo malimas Išsisklaidymo praba: miltai,
kruopos, lukštas
Įrengiant salyklo smulkintuvų
valcus ir toliau periodiškai
Trynimas Pertrūkio ir vandens temperatūra
Apcukrinimo laipsni.
Pertrūkio parūgštinimo pH
Per kiekvieną pertrūkį
Filtravimas Organoleptinis misos įvertinimas
Misos koncentracija atskirose
filtracinės sistemos sekcijose
Vandens temperatūra
Per kiekvieną pertrūkį
veikiant šarmu
Pirminės misos ir praplovimo
vandenyje koncentracija

Paruošta misa Koncentracija
Apcukrinimas
Spalva
Rūgštingumas (pH)
Galutinio surūgimo laipsnis
Karčiųjų medžiagų kiekis
Periodiškai, kiek įmanoma
dažniau
Periodiškai (turint
spektrofotometrą)
Susmulkinto salyklo frakcija Bendras, išplaunamas ir likęs
ekstraktas
vieną kartą per savaitę
kiekviename agregate
Susmulkintų apynių frakcija Išplaunamas ekstraktas vieną kartą per savaitę
kiekviename agregate
Rūgimas
Atšaldyta misa
Koncentracija pagal sacharometrą
Temperatūra
Kiekviename pertrūkyje
Kontrolės objektas Kontrolės rodiklis Tikrinimo periodiškumas
Žalias alus Sacharometro rodmenys Menamas
surūgimo laipsnis
Skaidrinimas bandymo stiklinėje.
Temperatūra transportuojant į rūsį
Kiekvienas rūgimo kubilas
Sėjamos mielės Vandens temperatūra vonelėse
Mikroskopavimas
Kiekviena mielių vonelė
Papildomas rūgimas alaus
talpose
Slėgis
Patalpos temperatūra
Alaus skaidrinimas
Kiekviena talpa
Alus, skirtas išleisti (duomenys
pasui išrašyti)
Išlaikymo dienų skaičius
Organoleptiniai rodikliai
Tikras ekstrakto kiekis
Kiekvieną dieną vidutinė
kiekvienos pilstomos partijos
praba
301
Pradinės misos koncentracija
Tikras surūgimo laipsnis
Rūgštingumas
Spalva
Alaus išpilstymas
Alus filtruoto alaus rinktuvuose
Užpylimo slėgis
Temperatūra
Kiekvienas surinktuvas
Filtravimo masė Vandens temperatūra masės plovimo
mašinoje

Kiekviena mašina
Butelių plovimas Šarminio tirpalo temperatūra.
Tirpalo temperatūra
Plovimo mašinų bakai
Statinių plovimas Vandens temperatūra Kiekvienoje plovimo mašinoje
Alaus išpilstymas ir butelių bei
statinių uždarymas
Įpylimo pilnumas
Butelių bei statinių uždarymo
hermetiškumas. Alaus temperatūra
buteliuose. Butelio su alumi išvaizda
Aluje, paimtame iš kiekvienos
mašinos
Alaus pasterizavimas Temperatūra atskiruose etapuose ir
etapų trukmė
Pasterizuojant kiekvieną partiją

2.3. Gatavas alus

Kontrolės objektas Kontrolės rodiklis Periodiškumas
Išpilstyto alaus kontrolė Išvaizda
Aromatas ir skonis
Putojimas ir putų stabilumas
Spirito kiekis
Tikro ekstrakto kiekis
Pradinės misos koncentracija
Rūgštingumas (pH)
Spalva
Angliarūgštės kiekis
Stabilumas
Oro nustatymas buteliniame aluje
Izohumulono nustatymas
Kiekviena rūšis tris kartus per
savaitę
Visos išpilstyto alaus partijų
prabos
Periodiškai, turint atitinkamą
aparatūrą
Filtravimo masė Brinkimas
Filtravimo savybės
Pašalinių prieskonių bei kvapų
buvimas
Kiekviena gaunama partija
Filtravimo milteliai Brinkimas
Filtravimo savybės
Pašalinių prieskonių bei kvapų
buvimas
Kiekviena gaunama partija
Alaus derva Išvaizda. Elastingumas
Lydymosi temperatūra
Prieskonių bei kvapų buvimas
Kiekviena gaunama partija
Pieno rūgštis
Dezinfekcijos priemonės
Bendras rūgštingumas
Tirpumas
Aktyviosios dalies kiekis
Kiekviena gaunama partija
Buteliai LST rodikliai Kiekviena gaunama partija
Alaus statinės LST rodikliai Kiekviena gaunama partija

Gatavo alaus kokybė yra vertinama organoleptiniais arba jusliniais ir fizikiniais-cheminiais parametrais.
Organoleptiniai (jusliniai):
– skonis,
– aromatas,
302
– spalva,
– skaidrumas.
putos fizikiniai-cheminiai parametrai:
– alkoholio kiekis (svorio ar tūrio %),
– sausos medžiagos (svorio %),
– rūgštingumas arba pH,
– CO
2
kiekis aluje, O
2
kiekis aluje,
– spalva.
Pagrindiniai šie kokybės įvertinimo parametrai yra aprašyti pagrindiniame Lietuvos standarte LST 44
„Alus. Bendrosios techninės sąlygos“.
Pagrindiniai privalomi parametrai kokybę reglamentuojančiuose dokumentuose yra šie:
1. Sausos medžiagos (svorio % – balingai).
2. Alkoholis (tūrio %).
3. Spalva.
4. Juslinės savybės (skonis, kvapas, puta).
5. Alus turi atitikti HN 26 (didžiausias leistinas mikrobiologinis užterštumas) ir HN 54 (apie kenksmingų
medžiagų naudojimą: metalai, radioaktyvieji elementai) higienos normas.

Fizikinė-cheminė alaus analizė

Fizikinių-cheminių parametrų analizė atliekama gamybinėje laboratorijoje, gamyboje (saikininkuose).

1.1. Alkoholio kiekio aluje nustatymas

Klasikinis metodas alkoholiui aluje nustatyti yra distiliacijos metodas.


1 pav. Distiliavimo įrenginys alkoholio kiekiui aluje nustatyti

Įrenginys sudarytas iš kolbos 4, šaldytuvo 2, lašų surinktuvo 3 ir kolbos 1, naudojamas distiliatui
surinkti. Prieš analizę kolba 1 pasveriama 0,1 g tikslumu ir sujungiama su šaldytuvu. Į kolbą 4 įpilama 200 g
alaus be CO
2
. CO
2
dujos pašalinamos purtant kambario temperatūroje. Į kolbą 1 įpilama 10 mL distiliuoto
H
2
O. Alus lėtai kaitinamas iki virimo, o spiritas garuodamas eina per šaldytuvą, aušta, kondensuojasi ir
nuteka į priimtuvą 1. Kai tik prilaša 2/3–3/4 skysčio nuo paimto alaus, distiliacija baigiama. Kolba 1 su
turiniu atšaldoma, atjungiama nuo šaldytuvo, statoma ant svarstyklių ir pripilama distiliuoto H
2
O iki 200 g
skysčio masės. Paskui kolbos turinys išmaišomas ir piktnometru nustatomas santykinis tankis, o pagal
lentelę, kuri nurodyta Lietuvos standarte LST 1572 : 1999, randamas atitinkamas alkoholio kiekis aluje.
Dabar alkoholio kiekį aluje galima nustatyti daug greičiau ir paprasčiau – naudojant alaus analizatorių
„A PAAR“. Duomenys apdoruojami kompiuteriu.


1
2
3
4
303

1. 2. CO
2
kiekio aluje nustatymas

CO
2
kiekis aluje nustatomas pagal šią schemą:


1 pav. Įrenginys CO
2
kiekiui aluje nustatyti

Viršutinėje prietaiso plokštelėje yra pritvirtinta plieninė adata 1, sujungta vidiniu kanalu su manometru
M. Adatos galas eina per guminį sandarinimo žiedą 2.
Prieš nustatant CO
2
, butelis su alumi termostatuojamas vandens vonioje vieną valandą 25 °C
temperatūroje, paskui išimamas iš vonios, sausai nušluostomas, pažymimas alaus lygis ir butelis statomas ant
prietaiso apatinės judančios plokštelės 3 taip, kad kamštelio centras būtų po adatos smaigaliu 1. Pasukant
varžtą 4 butelis pakeliamas į viršų, sandariai prispaudžiant jį kamšteliu prie sandarumo žiedo 2 ir adatos 1.
Butelio kamštelis praduriamas adata ir butelio ertmė per adatos kanalą susisiekia su monometro kamera.
Butelis supurtomas rankomis iki pastovios manometro rodyklės padėties ir pažymimi prietaiso rodmenys.
Butelis išimamas, alus išpilamas, praplaunamas vandeniu ir iki tos pačios žymės pilamas nustatytas
kiekis vandens. Paskui iš sugraduoto cilindro į butelį pilamas vanduo iki viršaus.
Žinodami iš cilindro (mL) įpilto vandens tūrį, gausime dujų erdvės tūrį butelyje:

) A 122 , 0 )( 1 P ( C + + = ,

C – CO
2
kiekis aluje, %,
P – manometro rodmenys,
A – koeficientas, kurio dydis priklauso nuo dujų erdvės tūrio, nustatomas iš lentelės.
Taip pat yra specialus CO
2
matuoklis „Haffmans“, naudojamas CO
2
koncentracijai saikikliuose nustatyti.

1.3. Rūgštingumo nustatymas

Prieš analizę CO
2
pašalinti 50 mL filtruoto alaus išlaikoma 30 min. konusinėje siaurakaklėje kolboje
esant 40 °C temperatūrai, periodiškai supurtant. Paskui atšaldoma ir titruojama 0,1 N natrio hidroksido
(NaOH) tirpalu. Sunaudotas šarmo kiekis dauginamas iš 0,2 ir gaunamas alaus rūgštingumas mL šarmo 100
mL alaus.

1.4. Spalvos nustatymas

Anksčiau spalvai nustatyti buvo naudojamas toks įrenginys:
304

1 pav. Įrenginys alaus spalvai nustatyti

1 – plastmasinė, laidi šviesai pertvara, 2 – stiklinė su alumi (100 mL), 3 – stiklinė su vandeniu (100 mL), 4 – stebėjimo
langeliai

Į stiklinę su vandeniu po truputį lašinama 0,1 N jodo tirpalo, kol spalva šioje stiklinėje susivienodins su
spalva stiklinėje su alumi. Sunaudotas jodo tirpalo kiekis (mL) ir būtų spalvos parametras.
Dabar spalva nustatoma spektrofotometru „SPECTRONIC
®
GENESYS™ 5“: bangos ilgis yra
dauginamas iš tam tikro koeficiento, pvz., 430 × 0,026 = 11,18.

1.5. Stabilumo nustatymas

Stabilumui nustatyti 2 buteliai alaus laikomi tamsoje, 20 °C temperatūros patalpoje (termostate) ir
stebimas drumstumas. Kiekvieną dieną buteliai apverčiami ir stebimi prieš šviesą. Pagal drumstumo
atsiradimo laiką, išreikštą paromis nuo išpilstymo momento, nustatomas alaus stabilumas.
Pagrindiniame Lietuvos standarte LST 44 „Alus. Bendrosios techninės sąlygos“ yra nurodyta alaus
laikymo trukmė.
Pagrindiniai higienos reikalavimai, keliami alaus gamybai, yra įvardyti Higienos normose.

1.6. Sausųjų medžiagų nustatymas

Sausosios medžiagos aluje nustatomos naudojant sacharometrą esant 20 °C temperatūrai.

LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

Maisto žaliavos ir produktai. Didžiausias leidžiamas mikrobinio užterštumo lygis.

1. Taikymo sritis

1.1. Ši higienos norma skirta reglamentuoti teikiamų rinkai maisto žaliavų ir produktų nekenksmingumą
žmonių sveikatai.
1.2. Ši higienos norma netaikoma apdorojant maisto žaliavas ir produktus asmeniniams ar namų ūkio
poreikiams bei per Lietuvos Respubliką tranzitu gabenant maisto žaliavas ar produktus, jeigu jie nekelia
grėsmės žmonių ar gyvūnų sveikatai bei aplinkai.
1.3. Jeigu Lietuvos Respublikos tarptautinėse sutartyse nustatyti kitokie reikalavimai, negu šioje higienos
normoje, taikomi tarptautinių sutarčių reikalavimai.
1.4. Šioje normoje nurodyti didžiausi leidžiami maisto mikrobinio užterštumo lygiai ir mikrobiologinei
analizei naudojamų bandinių kiekiai, taikomi įmonių išleidžiamos produkcijos ir importuojamo maisto
užterštumui vertinti. Prekybos tinkle ir kitose vartojimo srityse naudojamų maisto produktų mikrobiniam
užterštumui vertinti gali būti tiriami kitokie maisto produkto bandinių kiekiai, pagrįsti bandinių atrinkimo
metodų statistikos reikalavimais, tačiau jų mikrobinis užterštumas bet kuriuo atveju neturi būti didesnis negu
didžiausias leidžiamas lygis (M).

2. Nuorodos

Šioje higienos normoje yra nuorodos į tokius dokumentus:
305
2.1. LST ISO 4831 : 1998. Mikrobiologija. Koliforminių bakterijų skaičiavimas. Labiausiai tikėtino
skaičiaus nustatymas.
2.2. LST ISO 4832 : 1998. Mikrobiologija. Koliforminių bakterijų skaičiavimas. Kolonijų skaičiaus
nustatymas.
2.3. LST ISO 4833 : 1998. Mikrobiologija. Mikroorganizmų skaičiaus nustatymas. Kolonijų skaičiavimas
30°C temperatūroje.
2.4. LST ISO 6888 : 1998. Mikrobiologija. Auksinių stafilokokų (Staphylococcus aureus) ir jų kolonijų
skaičiaus nustatymas.

LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

2.5. LST ISO 6610 : 1996. Pienas ir pieno produktai. Mikroorganizmų kolonijas sudarančių vienetų
skaičiavimas. Kolonijų skaičiaus nustatymas 30 °C temperatūroje.
2.6. LST ISO 6611 : 1996. Pienas ir pieno produktai. Mielių ir/ar pelėsinių grybų kolonijas sudarančių
vienetų skaičiavimas. Kolonijų skaičiaus nustatymas 25 °C temperatūroje.
2.7. LST ISO 6887 : 1998. Mikrobiologija. Skiedinių mikrobiologiniams tyrimams ruošimas. Bendrieji
nurodymai.
2.8. LST ISO 7218 : 1996. Mikrobiologija. Mikrobiologiniai tyrimai.
2.9. LST ISO 7932 : 1998. Mikrobiologija. Vaškinių bacilų (Bacillus cereus) ir jų kolonijų skaičiaus
nustatymas.
2.10. LST ISO 7937 : 1998. Maisto ir pašarų mikrobiologija. Lūžinių klostridijų (Clostridium perfringens) ir
jų kolonijų skaičiaus nustatymas.
2.11. LST ISO 7954 : 1998. Mikrobiologija. Mielių ir/ar pelėsinių grybų skaičiavimas 25 °C temperatūroje.
Bendrieji nurodymai.
2.12. LST ISO 8261 : 1996. Pienas ir pieno produktai. Bandinių ir skiedinių laboratoriniams tyrimams
paruošimas.
2.13. LST ISO 10560 : 1998. Pienas ir pieno produktai. Monocitogeninių listerijų (Listeria monocytogenes)
nustatymas.
2.14. LST ISO 7251 : 1996. Mikrobiologija. Ešerichių (Escherichia coli) skaičiavimas. Bendrieji
nurodymai. Labiausiai tikėtino skaičiaus nustatymas.
2.15. LST ISO 6222 : 1998. Vandens kokybė. Gyvybingųjų mikroorganizmų skaičiaus nustatymas.
Kolonijų standžioje mitybinėje terpėje skaičiavimas.
2.16. LST ISO 6461 – 1 : 1998. Vandens kokybė. Sulfitus redukuojančių sporinių anaerobų skaičiaus
nustatymas – 1 dalis: Pagausinimo skystoje terpėje metodas.
2.17. LST ISO 6461 – 2 : 1998. Vandens kokybė. Sulfitus redukuojančių sporinių anaerobų (klostridijų)
skaičiaus nustatymas – 2 dalis: Membraninio filtravimo metodas.
2.18. LST ISO 7899 – 1 : 1998. Vandens kokybė. Fekalinių streptokokų nustatymas. 1 dalis: Pagausinimo
skystoje terpėje metodas.
2.19. LST ISO 7899 – 2 : 1998. Vandens kokybė. Fekalinių streptokokų nustatymas ir skaičiavimas. 2 dalis:
Membraninio filtravimo metodas.
2.20. LST ISO 8360 – 1 : 1998. Vandens kokybė. Žaliamėlių pseudomonų (Pseudomonas aeruginosa)
nustatymas ir skaičiavimas – 1 dalis: Pagausinimo skystoje terpėje metodas.
2.21. LST ISO 8360 – 2 : 1998. Vandens kokybė. Žaliamėlių pseudomonų (Pseudomonas aeruginosa)
nustatymas ir skaičiavimas – 2 dalis: Membraninio filtravimo metodas.

LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

2.22. LST ISO 9308 – 1 : 1998. Vandens kokybė. Koliforminių bakterijų, atsparių šilumai koliforminių
bakterijų ir žarnyno lazdelių (E. coli) kiekio nustatymas ir skaičiavimas. 1 dalis: Membraninio filtravimo
metodas.
2.23. LST ISO 9308 – 2 : 1998. Vandens kokybė. Koliforminių bakterijų, atsparių šilumai koliforminių
bakterijų ir žarnyno lazdelių (E. coli) kiekio nustatymas ir skaičiavimas. 2 dalis: Mėgintuvėlių (labiausiai
tikėtino skaičiaus) metodas.
306
2.24. LST ISO 1429 : 1996. Auksinių stafilokokų (Staphylococcus aureus) ir jų kolonijų skaičiaus
nustatymas.
2.25. LST ISO 1432 : 1996. Bendrieji salmonelių (Salmonella) išskyrimo metodai.

3. Terminai ir apibrėžimai

Šioje higienos normoje pavartoti terminai ir apibrėžimai:
3.1. maisto žaliava ir produktas.
Maisto medžiaga ar produktas, apdorotas, pusiau apdorotas ar neapdorotas, skirtas žmonių mitybai. Šiai
sąvokai taip pat priklauso geriamasis vanduo, gėrimai ir kitos medžiagos bei gaminiai, skirti žmogui praryti
ar kramtyti, išskyrus medicinos ir tabako gaminius.
3.2. bendras mikroorganizmų skaičius.
Bakterijų, mielių ir pelėsių, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis galinčių daugintis ir sudaryti kolonijas,
skaičius viename grame (viename cm
3
) produkto.
3.3. koliforminės bakterijos.
Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis, esant (30–37) °C temperatūrai skaidančios laktozę į dujas
ar mitybinėje terpėje sudarančios būdingas kolonijas.
3.4. žarnyno lazdelė (Escherichia coli).
Bakterijos, esant 45 °C temperatūrai, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis skaldančios laktozę į dujas ir
sintezuojančios indolą iš triptofano.
3.5. auksinis stafilokokas (Staphylococcus aureus).
Mikroorganizmai, kurie tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis formuoja tipiškas ir (arba) netipiškas
kolonijas ant selektyvios mitybinės terpės paviršiaus ir rodo stipriai teigiamą koaguliazės reakciją.
3.6. lūžinė klostridija (Clostridium perfringens).
Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis sudarančios būdingas kolonijas ir pasižyminčios būdingu
biocheminiu aktyvumu.

LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

3.7. vaškinė bacila (Bacillus cereus).
Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis sudarančios būdingas kolonijas ir pasižyminčios būdingu
biocheminiu aktyvumu.
3.8. sulfitus redukuojančios bakterijos.
Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis selektyvioje terpėje sudarančios tipiškas kolonijas.
3.9. pelėsiniai grybai.
Mikroorganizmai, esant 25 °C temperatūrai tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis selektyvioje terpėje
formuojantys tipiškas kolonijas.
3.10. mielės.
Mikroorganizmai, esant 25°C temperatūrai, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis selektyvioje terpėje
formuojantys tipiškas kolonijas.
3.11. žaliamėlių pseudomona (Pseudomonas aeruginosa).
Aerobinės bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis formuojantys tipiškas kolonijas.
3.12. monocitogeninė listerija (Listeria monocytogenes).
Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis selektyvioje terpėje formuojančios tipiškas kolonijas ir
pasižyminčios būdingomis morfologinėmis, fiziologinėmis ir biocheminėmis savybėmis.
3.13. salmonelės (Salmonella).
Bakterijos, tyrimo metodu nustatytomis sąlygomis selektyvioje terpėje formuojančios tipiškas kolonijas ir
pasižyminčios būdingomis biocheminėmis ir serologinėmis savybėmis.

4. Bendrosios nuostatos

4.1. Didžiausi leidžiami mikrobinio užterštumo lygiai nustatyti vadovaujantis šiais principais:
4.1.1. galutinis, vartotojui teikiamas produktas turi būti nekenksmingas žmogaus sveikatai: produktai,
kuriuose yra patogeninių mikroorganizmų, neturi patekti į rinką;
307
4.1.2. vartoti skirtame produkte neturi būti tokių mikrobinės kilmės toksinų ar metabolitų kiekių, kurie gali
kelti pavojų vartotojo sveikatai.
4.2. Maisto mikrobinės taršos lygiai šioje higienos normoje nurodyti valgomojoje maisto dalyje,
fasuotuose produktuose – visame tūryje.
4.3. Visais atvejais, oficialiai įvertinant maisto produktų užterštumą, bandiniai turi būti atrinkti įgaliotų
asmenų, įforminti bandinių atrinkimo akte ir nurodyti visos siuntos, iš kurios jie paimti, užterštumą.

LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

4.4. Mikrobinio maisto žaliavos ar maisto produktų, skirtų žmonėms vartoti, užterštumo lygiai nustatomi
Lietuvoje nustatyta tvarka įteisintais laboratoriniais tyrimo metodais [2.1–2.25].
4.5. Šioje higienos normoje nenurodytais atvejais galutinis sprendimas dėl leidžiamo maisto produkto
mikrobinio užterštumo priimtas Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministerijos nustatyta tvarka.

5. Didžiausi leidžiami mikrobinio užterštumo lygiai maisto produktuose

1 lentelė. Nealkoholinių gėrimų ir alaus didžiausias leidžiamas mikrobinis užterštumas

Produkto
pavadinimas
Analitės
pavadinimas
Mikroorganiz-
mo tipas
Analizės metodas n c m M
1. Centralizuotai
tiekiamas vanduo
E. coli h LST ISO 9308 – 1,
LST ISO 9308 – 2
5 0 0
c
0
c

Bendras
mikroorganizmų
skaičius 22 °C
i LST ISO 6222 5 0 100 100
Bendras
mikroorganizmų
skaičius 37 °C
i LST ISO 6222 5 0 20 20
Fekaliniai
streptokokai
h LST ISO 7899 – 1,
LST ISO 7899 – 2
5 1 0
c
1
c

2. Mineralinis vanduo E. coli h LST ISO 9308 – 1,
LST ISO 9308 – 2
5 0 0
a
0
a

Fekaliniai
streptokokai
h LST ISO 7899 – 1,
LST ISO 7899 – 2
5 1 0
a
1
a

P. aeruginosa i LST ISO 8360 – 1,
LST ISO 8360 – 2
5 1 0
a
1
a


LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

1 lentelės tęsinys

Produkto
pavadinimas
Analitės
pavadinimas
Mikroorganiz-
mo tipas
Analizės metodas n c m M
3. Fasuotas
geriamasis vanduo
E. coli h LST ISO 9308 – 1,
LST ISO 9308 – 2
5 0 0
a
0
a

Fekaliniai
streptokokai
h LST ISO 7899 – 1,
LST ISO 7899 – 2
5 1 0
a
1
a

Sulfitus
redukuojančios
klostridijos
i LST ISO 6461 – 1,
LST ISO 6461 – 2
5 1 0
b
1
b

P. aeruginosa i LST ISO 8360 – 1,
LST ISO 8360 – 2
5 1 0
a
1
a

4. Vaisvandeniai Koliforminės
bakterijos
i LST ISO 9308 – 1,
LST ISO 9308 – 2
5 2 1
c
10
c

308
E. coli h LST ISO 9308 – 1,
LST ISO 9308 – 2
5 0 0
c
0
c

5. Gazuoti gėrimai Bendras
mikroorganizmų
skaičius
LST ISO 6222 5 0 100 100
Koliforminės
bakterijos
i LST ISO 9308 – 1,
LST ISO 9308 – 2
5 2 1
c
10
c

E. coli h LST ISO 9308 – 1,
LST ISO 9308 – 2
5 0 0
c
0
c

6. Nepasterizuotas
alus
Koliforminės
bakterijos
i LST ISO 9308 – 1,
LST ISO 9308 – 2
5 2 1 10
Salmonella p LST 1432 5 0 0 0
a
250 mL tūrio
b
50 mL tūrio
c
100 mL tūrio

LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 26 : 1998

6. Sutrumpinimai

6.1. n – bandinių, reikalingų mikrobiologinei analizei atlikti, skaičius.
6.2. c – bandinių, kuriuose mikrobinis užterštumas gali būti didesnis kaip m, skaičius.
6.3. m – didžiausias leidžiamas mikrobinis užterštumas visuose tyrimui paimtuose bandiniuose,
išreiškiamas indikuojamų mikroorganizmų kiekiu konkrečiame tiriamo maisto produkto kiekyje (L.
monocytogenes ir Salmonella – 25 gramuose, visi kiti mikroorganizmai – 1 grame ar 1 m
3
(jei nenurodytas
kitoks kiekis)), kai c = 0.
6.4. M – didžiausias leidžiamas mikrobinis užterštumas visuose tyrimui paimtuose bandiniuose,
išreiškiamas indikuojamų mikroorganizmų kiekiu konkrečiame tiriamo maisto produkto kiekyje (L.
monocytogenes ir Salmonella – 25 gramuose, visi kiti mikroorganizmai – 1 grame ar 1 m
3
(jei nenurodytas
kitoks kiekis)). M vertė negali būti viršijama nei viename bandinyje.
6.5. p – patogeniniai mikroorganizmai.
6.6. h – mikroorganizmai, rodantys netinkamas higienines produkto gamybos sąlygas.
6.7. i – mikroorganizmai, kurių šioje higienos normoje ribojami kiekiai gali būti panaudojami kaip
orientaciniai, įdiegiant maisto gamybos proceso vidinės kontrolės sistemas.

LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 54 : 1998

Maisto žaliavos ir maisto produktai

Didžiausias leidžiamas cheminių teršalų koncentracijos ir didžiausi leidžiami užterštumo
radioaktyviaisiais izotopais lygiai.

1. Taikymo sritis

1.1. Ši higienos norma skirta reglamentuoti tiekiamų rinkai maisto žaliavų ir produktų nekenksmingumą
žmonių sveikatai.
1.2. Ši higienos norma netaikoma apdorojant maisto žaliavas ir produktus asmeniniams ar namų ūkio
poreikiams bei per Lietuvos Respubliką tranzitu gabenant maisto žaliavas ar produktus, jeigu šie nekelia
grėsmės žmonių ar gyvūnų sveikatai bei aplinkai.
1.3. Jeigu Lietuvos Respublikos tarptautinėmis sutartimis nustatyti kitokie reikalavimai, negu čia išdėstyti,
taikomi tarptautinių sutarčių reikalavimai.



309
2. Bendrosios nuostatos

2.1. Maisto žaliavos ir maisto produktai, kuriuose teršalų kiekis visuomenės sveikatos požiūriu ir ypač
toksikologiniu požiūriu viršija leidžiamas ribas, neturi patekti į rinką.
2.2. Teršalų koncentracijos ir užterštumo radioaktyviaisiais izotopais lygiai šioje higienos normoje
nurodyti valgomojoje maisto dalyje, konservuose – visame tūryje, įskaitant bet kokį skystį, sirupą, riebalus ir
pan. Koncentruotuose ir sausuose produktuose, kūdikių bei vaikų maiste, jeigu atskirai nenurodyta,
didžiausios leidžiamos koncentracijos ir didžiausi leidžiami užterštumo radioaktyviais izotopais lygiai
nustatomi paruoštame vartoti produkte.
2.3. Visais atvejais, oficialiai įvertinant maisto žaliavų ar maisto produktų taršą, bandiniai turi būti atrinkti
teisės norminių aktų nustatyta tvarka, įgaliotų asmenų ir įforminti bandinių atrinkimo aktu.
2.4. Teršalų analizės rezultatai įgyja teisinę galią tik tada, kai tyrimai atlikti akredituotoje arba arbitražinėje
laboratorijoje.

LIETUVOS HIGIENOS NORMA HN 54 : 1998

3. Didžiausios leidžiamos cheminių teršalų koncentracijos ir didžiausi leidžiami užterštumo
radioaktyviais izotopais lygiai maisto žaliavose ir maisto produktuose

1 lentelė

Produkto pavadinimas Teršalo pavadinimas DLK,
mg/kg
Pastaba
Grūdų produktai (grūdai,
kruopos, miltai, ankštinių
daržovių sėklos, riešutai ir
kt.); salyklas, miežiai, ryžiai
Švinas 0,1 Išskyrus riešutus
Kadmis 0,1 Išskyrus riešutus, sėlenas ir
grūdų gemalus
Alfatoksinas B
1
0,002 Išskyrus ankštinių daržovių
sėklas Alfatoksinų B
1,2
, G
1,2
suma 0,004
Ochratoksinas A 0,005

LIETUVOS STANDARTAS LST 44 : 1993

Šis standartas nustato bendruosius techninius reikalavimus, keliamus alui, jo pakavimui, ženklinimui,
priėmimui, tyrimo būdams, gabenimui, laikymui.

Alus

Bendrosios techninės sąlygos

1. Taikymo sritis

1.1. Šis standartas taikomas alui, kuris yra silpnas alkoholinis gėrimas, prisodrintas angliarūgšte, gaunamas
fermentuojant alaus misą mielėmis.

2. Nuorodos

2.1. Šiame standarte duotos nuorodos į LST 1416 – 95, HN 26 – 94, HN 54 – 95, GOST 10846 – 74,
GOST 10967 – 90, GOST 12786 – 80, GOST 12787 – 81, GOST 12788 – 87, GOST 12789 – 87, GOST
21948 – 76, GOST 26928 – 86, GOST 26929 – 86, GOST 29272 – 92.

3. Techniniai reikalavimai

3.1. Alus turi atitikti šio standarto reikalavimus ir turi būti gaminamas pagal įmonių patvirtintas receptūras
ir technologijos instrukcijas.
310
3.2. Charakteristika.
3.2.1. Pagal spalvą alus skirstomas į:
– šviesųjį;
– pusšviesį;
– tamsųjį.
3.2.2. Sausųjų medžiagų kiekis pradinėje misoje gali būti nuo 10 % iki 21 % masės.
3.2.3. Alus gaminamas:
– pasterizuotas;
– nepasterizuotas;
– specialiai arba steriliai filtruotas;
– padidinto stabilumo.
3.3. Reikalavimai, keliami žaliavoms, medžiagoms.
3.3.1. Alui gaminti naudojamos šios žaliavos:
– miežinis salyklas;
– žirniai;
– miežiai;

LIETUVOS STANDARTAS LST 44 : 1993
– ryžiai;
– kukurūzai;
– grūdų ekstraktai ir kitos nesalyklinės medžiagos;
– apyniai ir jų produktai;
– geriamasis vanduo;
– cukrus;
– alaus mielės.
Visos žaliavos, naudojamos alaus gamybai, turi atitikti galiojančius normatyvinius dokumentus.
3.4. Alaus gamybai gali būti naudojami fermentiniai preparatai, stabilizatoriai ir kitos pagalbinės
medžiagos, kurias leidžia Sveikatos apsaugos ministerija ir kitos numatytos technologijos instrukcijose.
3.5. Alaus jusliniai rodikliai turi atitikti reikalavimus ir normas, pateiktas 1 lentelėje.

1 lentelė

Rodiklio pavadinimas Charakteristika ir norma
Išvaizda
Puta
Skaidrus, blizgantis skystis, be nuosėdų ir priemaišų
Alus, įpiltas iš 25 mm aukščio (atstumas nuo butelio kaklelio iki viršutinio indo
krašto) į cilindrinį švarų 110 mm aukščio stiklinį indą, kurio išorinis skersmuo
70 ÷ 75 mm, esant (12 ± 2) °C temperatūrai, turi išlaikyti kompaktinę putą, išskirti
angliarūgštės burbuliukus ir atitikti šiuos reikalavimus:
Putos aukštis, mm, ne mažesnis kaip:
Alaus buteliuose 30
Pilstomojo alaus 15
Putos stabilumas, min., ne mažesnis kaip:
Alaus buteliuose 3,0
Pilstomojo alaus 1,5

3.6. Alaus fizikiniai ir cheminiai rodikliai turi atitikti nurodytus 2 lentelėje.
3.7. Jusliniai, fizikiniai ir cheminiai rodikliai, alfa rūgšties kiekis karštoje misoje turi būti nurodyti
kiekvienos alaus rūšies receptūroje.
3.8. Alaus bakterinio užterštumo lygis turi atitikti Lietuvos higienos normą HN 26.

LIETUVOS STANDARTAS LST 44 : 1993

3.9. Didžiausias leidžiamas teršalų koncentracijos lygis aluje neturi viršyti Lietuvos higienos normos HN 54.
3.10. Alus pakuojamas ir ženklinamas pagal LST 1416.
311

4. Priėmimas

4.1. Alaus priėmimo taisyklės pateiktos GOST 12786.
4.2. Toksiškosios medžiagos ir patogeniniai mikroorganizmai tikrinami Sveikatos apsaugos ministerijos
nustatyta tvarka.

5. Tyrimo būdai

5.1. Mėginiai atrenkami ir paruošiami pagal GOST 12786, GOST 26929 reikalavimus.
5.2. Arbitažiniai alaus fizikiniai ir cheminiai tyrimai atliekami:
– Etilo alkoholio ir sausųjų medžiagų kiekis pradinėje misoje nustatomas pagal GOST 12787 arba
EBC Analytica 9.1.1 p.;
– Rūgštingumas – pagal GOST 12788;
– Spalva – pagal GOST 12789 arba EBC Analytica 9.4 p.;
– Angliarūgštės kiekis – pagal GOST 12790 arba EBC Analytica 9.15 p.
5.3. Mėginiai toksiškiems elementams nustatyti ruošiami pagal GOST 26929, nustatoma pagal GOST
26932.
5.4. Mikrobiologiniai tyrimai (bendras mikroorganizmų skaičius, žarninių lazdelių grupės bakterijų,
patogeninių mikroorganizmų kiekiai) atliekami Sveikatos apsaugos ministerijos patvirtintais būdais.

6. Gabenimas ir laikymas

6.1. Alus gabenamas ir laikomas pagal LST 1416.

7. Gamintojo garantijos

7.1. Gamintojas garantuoja, kad alus atitinka šio standarto reikalavimus, jeigu laikomasi gabenimo ir
laikymo taisyklių.
7.2. Alaus laikymo trukmė nuo jo pagaminimo datos pažymima nustatyta tvarka patvirtintoje kiekvienos
alaus rūšies receptūroje ir neturi viršyti nurodytos 3 lentelėje.

LIETUVOS STANDARTAS LST 44 : 1993

3 lentelė

Sausųjų medžiagų kiekis
pirminėje misoje, %
Nepasterizuoto alaus laikymo trukmė, paros
Šviesusis alus Pusšviesis alus Tamsusis alus
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
15
15
15
15









15
15
15
15
20
20
20
20
20
20
20

15
15
15
15
20
20
20
20
20
20
20

Specialiai arba steriliai filtruoto alaus laikymo trukmė ne didesnė kaip 45 paros.
Pasterizuoto alaus laikymo trukmė ne didesnė kaip 180 parų.
Padidinto stabilumo alaus laikymo trukmė ne didesnė kaip 360 parų.
312

Atsiskaitymas

1. Sausųjų medžiagų nustatymas.
2. Alkoholio nustatymas.
3. Spalvos nustatymas.
4. CO
2
kiekio nustatymas.
5. Rūgštingumo nustatymas.
6. Stabilumo nustatymas.

Literatūra

1. Колнева, Р. А.; Ермолаева, А. Производство пива и безалкогольных напитков. Москва:
Агропромиздат, 1985. 146 c.
2. Bernatonis, J.; Venskevičius, J. Bendroji maisto produktų technologija. Vilnius: Mokslas. 1977. 118 p.
3. LST 44 : 1993. Alus. Bendrosios techninės sąlygos. Lietuvos standartizacijos tarnyba. 1993. 13 p.
4. LST 1490 : 1997. Alus. Spalvos nustatymas. Lietuvos standartizacijos tarnyba. 1997. 5 p.
5. HN 26 : 1998. Maisto žaliavos ir produktai. Didžiausias leidžiamas mikrobinio užterštumo lygis.
Lietuvos standartizacijos tarnyba. 1998. 12 p.
6. HN 54 : 1998. Maisto žaliavos ir maisto produktai. Didžiausios leidžiamos cheminių teršalų
koncentracijos ir didžiausi leidžiami užterštumo radioaktyviaisiais izotopais lygiai. Lietuvos
standartizacijos tarnyba. 1998. 57 p.
7. Puslapis alaus mėgėjams – internetas: http://www.alutis.lt.



313
B Bi io of fa ar rm ma ac ci ij ja a 2 2
Laboratoriniai darbai
Genovaitė Gedminienė

1. Rekombinantinio kiaulės augimo hormono agreguotų formų
atskyrimas naudojant Q-sefarozę

Darbo tikslas

Atskirti agreguotas kiaulės augimo hormono formas nuo monomerinės.

Tyrimo objektas

Agreguotos rekombinantinio baltymo formos.

Matavimų priemonės

Kolonėlė, gradientatorius, savirašis, frakcijų kolektorius, densitometras, peristaltinis siurblys,
spektrofotometras, pH-metras, centrifuga „Beckman“, automatinės pipetės.

Tirpalų ruošimas

1 M Tris-HCl, pH 9,0: 30,3 g Tris-HCl tirpinama 150–180 mL vandens, druskos rūgštimi
sureguliuojamas pH, o tūris papildomas vandeniu iki 250 mL.
20 mM Tris-HCl, pH 9,0: 20 mL 1 M Tris-HCl skiedžiama vandeniu iki 800 mL, patikrinama pH ir
tūris papildomas vandeniu iki 1 litro.
0,1 M NaCl: 2,92 g NaCl ištirpinama 300 mL vandens ir tūris papildomas iki 500 mL.
0,35 M NaCl: 10,2 g NaCl ištirpinama 400 mL 20 mM Tris-HCl tirpalo ir tūris papildomas tuo pačiu
buferiu iki 500 mL.
6 M guanidin-hidrochloridas, pH7,5–8,0: 229,3 g guanidin-hidrochlorido užpilama 100 mL karšto
vandens, ištirpinama, įpilama 8 mL 1 M Tris tirpalo ir tūris papildomas vandeniu iki 400 mL.
0,5 M NaOH: 10 g NaOH ištirpinama 300 mL vandens ir tūris papildomas vandeniu iki 500 mL.
20 % C
2
H
5
OH: 20 mL 96 % C
2
H
5
OH skiedžiama vandeniu iki 96 mL.

Darbo eiga

Sorbento paruošimas
Firminė Q- sefarozė yra išbrinkinta 20 % etanolio tirpale. Reikia atsargiai dekantuoti etanolio tirpalą ir
užpilti 20 mM Tris-HCl, pH 9,0 buferiu. Sefarozės ir buferio santykis 3 : 1, t. y. 12 mL išbrinkintos sefarozės
reikia užpilti 4 mL buferio.
Kolonėlės paruošimas
Naudojama 1,6 x 5 cm kolonėlė. Patikrinami priešfiltriai, filtrai, adapteriai. Kolonėlė stove tvirtinama
vertikaliai, įjungiamas siurblys, pripilama apie 10 mL vandens ir atsargiai supilamas visas Q- sefarozės tūris.
Sefarozė pilama per piltuvėlį ar per stiklinę lazdelę, ją laikant prie kolonėlės sienelės. Taip išvengiama oro
burbulų. Jei kolonėlėje nesimato oro burbulų, kolonėlė greitai užpildoma buferiu, uždaroma adapteriu ir
sujungiama su siurbliu. Vėliau ji sujungiama su kolektoriumi. Kolonėlė pusiausvirinama 20 mM Tris-HCl,
pH 9,0 buferiu. Į kolonėlę įtekančio ir ištekančio buferio pH dydis turi sutapti.
Intarpinių kūnelių baltymų tirpalo paruošimas
Intarpiniai kūneliai, turintys rekombinantinio kiaulės augimo hormono baltymo, ištirpinami tokios
sudėties tirpale:
50 mM Tris-HCl, pH 8,7–9,0,
8,0 M karbamidas,
5,0 mM EDTA,
2,0 mM PMSF,
314
2,0 mM 2-ME
Intarpinių kūnelių tirpalas prieš chromatografiją skiedžiamas vandeniu du kartus, kad karbamido
koncentracija ne būtų didesnė nei 4 M. Tirpalas nuskaidrinamas centrifuguojant „Beckman“ centrifuga esant
20000 aps/min., 20 min.
Plovimas
Po sorbcijos likę baltymai plaunami 20 mM Tris-HCl, pH 9,0 tirpalu.
Desorbcija linijiniu NaCl gradientu
Įjungiamas gradientatorius, formuojantis 0–0,35 M NaCl tirpalo koncentracijas. Į vieną gradientatoriaus
indą pilama 100 mL buferio 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, o į kitą – tiek pat 0,35 M NaCl trisiniame buferyje.
Desorbcija atliekama 60 mL/h greičiu, renkant frakcijas po 10 mL, t. y. po vieną kolonėlės tūrį.
Baltymo koncentracijos surinktose frakcijose įvertinimas
Matuojama absorbcija surinktose tirpalų frakcijose esant E
280
bangai. Metodas pagrįstas aromatinių
aminorūgščių (triptofano, tirozino ir iš dalies fenilalanino) savybe maksimaliai absorbuoti ultravioletinius
spindulius esant 280 nm bangai. Kadangi baltymai skiriasi pagal aromatinių aminorūgščių sudėtį,
suprantama, kad absorbcijos dydis varijuoja lyginant skirtingus baltymus. Sąlygiškai laikoma, kad esant
suvidurkinto baltymo koncentracijai, 1 mg/mL optinis tankis esant 280 nm bangai yra lygus 1,0, kai
matuojama 1 cm pločio kiuvetėje. Šiuo metodu nustatant baltymų koncentraciją tirpaluose reikia įvertinti
nukleino rūgščių ar nukleotidų buvimą juose. Tai daroma matuojant optinį tankį esant 260 nm bangai, kuri
atitinka nukleotidų ir NR absorbcijos maksimumą.
Baltymo koncentracija apskaičiuojama taikant Kalkaro formulę:

C = 1,45 ⋅ A
280
– 0,74 ⋅ A
260
,

C – baltymo koncentracija, mg/mL.

Q- sefarozės regeneravimas
Baigus chromatografiją, Q- sefarozė regeneruojama. Per kolonėlę leidžiamas vienas tūris 1 M NaCl
tirpalo, paskui 3–4 tūriai 6 M guanidin-hidrochlorido, pH7,5–8,0, 4–6 tūriai vandens, 3–4 tūriai 0,5 M NaOH
ir galiausiai praplaunama vandeniu iki neutralaus pH. Q-sefarozė užpilama 20 % C
2
H
5
OH ir saugoma
šaldytuve +4 °C temperatūroje.

Atsiskaitymo forma

Pagal gautus E
280
duomenis ir baltymo koncentracijos rezultatus brėžiamos chromatogramos profilis.
Tipinė chromatograma pateikiama 1 pav. Tolesnei analizei paliekamos frakcijos, rodančios chromatogramos
profilyje smailes. Paimama po du ependorfinius mėgintuvėlius tų frakcijų, kurios sudaro smailes.

Surinktos baltymų frakcijos. Absorbcija E
280nm
ir chromatograma

Mėg. Nr. E
280
Mėg. Nr. E
280
Mėg. Nr. E
280

15. 0,002 21 0,215 27 0,041
16. 0,080 22 0,093 28 0,040
17. 0,021 23 0,043 29 0,038
18. 0,050 24 0,032 30 0,03
19. 0,127 25 0,081 – –
20. 0,277 26 0,040 – –
315
0 5 10 15 20 25 30 35
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Frakc. Nr.
O
.
T
.

2
8
0
n
m


Chromatograma. 2–12 frakcijos – prašokimas, 15–17 frakcijos – neidentifikuoti baltymai, 19–22 frakcijos –
rekombinantinio baltymo monomerinė forma, 24–26 frakcijos – rekombinantinio baltymo oligomerinės formos, 28–30
frakcijos – neidentifikuoti baltymai

Literatūra

1. Cunningham, B. C.; Mulkerrin, M. G.; Wells J. A. Dimerization of Human Growth Hormone, Science,
v. 253, 1991, p. 545–548.
2. Anderrson, C.; Edlund, P. O. et al. Isolation and characterization of trisulfide variant of recombinant
human growth hormone formed during expression in Escherichia coli, Int. J. Peptide Protein Res, 47.
1996, p. 311–321.
316

2. Monomerinės ir oligomerinės rekombinantinio baltymo formų
įvertinimas

Darbo tikslas

Surinktose baltymų frakcijose (pirmame laboratoriniame darbe) PAAG-SDS metodu vizualiai įvertinti
monomerines ir agreguotas rekombinantinio baltymo formas.

Tyrimo objektas

Monomerinės ir oligomerinės rekombinantinio baltymo formos.

Matavimų priemonės

Vertikalus elektroforezės aparatas, stovas geliams pilti, nuolatinės srovės šaltinis, purtyklė, vandens
vonelė, gelių džiovintuvas, automatinės pipetės, mikromėgintuvėliai, stiklinėlės, maišyklė, svarstyklės, pH-
metras, skaitytuvas.

Tirpalų ruošimas

30 % %% % akrilamidas+BIS: 29,2 g akrilamido ir 0,8 g BIS (N,N’-metilen-bis-akrilamidas) ištirpinama
vandenyje ir praskiedžiama matavimo kolboje iki 100 mL.
1,5 M TRIS, pH 8,8: 18,15 g tris(hidroksimetil)aminometano ištirpinama 70 mL vandens. Tirpalo pH
koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rūgštimi iki 8,8. Praskiedžiama matavimo kolboje iki 100 mL.
0,5 M TRIS, pH 6,8: 6,0 g tris(hidroksimetil)aminometano ištirpinami 70 mL vandens. Tirpalo pH
koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rūgštimi iki 6,8. Praskiedžiama matavimo kolboje iki 100 mL.
1,0 M TRIS, pH 6,8: 6,0 g tris(hidroksimetil)aminometano ištirpinami 35 mL vandens. Tirpalo pH
koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rūgštimi iki 6,8. Praskiedžiama matavimo kolboje iki 50 mL.
10 % %% % natrio dodecilsulfatas (SDS): 5,0 g natrio dodecilsulfato ištirpinami, praskiedžiama vandeniu iki
50 mL.
10 % %% % amonio persulfatas: į 1,5–2,0 mL mėgintuvėlį atsveriama 100 mg amonio persulfato, įpilama
1 mL vandens, ištirpinama. Tinka naudoti tik pagaminimo dieną.
Elektrodinis buferis, 5× ×× ×koncentruotas: 30 g tris (hidroksimetil)-aminometano, 144 g glicino, 10 g
natrio dodecilsulfato ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 2 L. Laikoma 4 °C temperatūroje. Tirpalo
pH turi būti 8,3–8,6, tačiau koreguoti negalima. Prieš naudojimą tirpalas skiedžiamas 5 kartus vandeniu.
0,5 % %% % bromfenolio mėlis: 50 mg bromfenolio mėlio ištirpinama 10 mL vandens.
Pavyzdžio buferis: 800 mg natrio dodecilsulfato, 2,5 mL 1,0 M TRIS, pH 6,8, 4,0 mL glicerino, 0,1 mL
0,5 % bromfenolio mėlio skiedžiamas vandeniu iki 8,0 mL. Išpilstoma po 0,8 mL į mėgintuvėlius. Laikoma
kambario temperatūroje. Esant neredukuotoms elektroforezės sąlygoms į pavyzdžio buferį įpilama 0,2 mL
vandens.
Coomassie Brilliant Blue R 250 (CBB R-250) dažas: 1,0 g CBB R-250 tirpinamas 400 mL etanolio
3 val. Paskui pridedama 100 mL acto rūgšties ir praskiedžiama vandeniu iki 1 L.
Blukiklis: sumaišoma 300 mL etanolio, 100 mL acto rūgšties. Praskiedžiama vandeniu iki 1 L.
Tirpalas geliams džiovinti: Į 325 mL dist. vandens įpilama 160 mL 96 ° etanolio ir 15 mL glicerino.
Tirpalas sumaišomas.

Darbo eiga

Užpylimo formos surinkimas
Poliakrilamidinio gelio polimerizacijai naudojama stiklinė forma, kurią sudaro 2 stiklai (vidinis
16 × 20 cm ir išorinis 18,3 × 20 cm), tarp jų esančių tarpinių (storis 0,75 mm, aukštis 18,3 cm, plotis
19,0 mm) bei šoniniai laikikliai, suspaudžiantys šią konstrukciją. Paruošta forma įstatoma į stovą.
Skiriamojo (apatinio) gelio paruošimas
317
12 % poliakrilamidiniam geliui paruošti stiklinėlėje sumaišoma 12 mL 30 % akrilamido/BIS tirpalo,
7,5 mL 1,5 M TRIS ir 9,1 mL vandens. Pridedama 0,3 mL 10 % natrio dodecilsulfato, 0,2 mL amonio
persulfato ir 0,02 mL TEMED. Gerai išmaišius, tirpalas pilamas į formą iki pažymėtos vietos (4 cm nuo
stiklo viršaus). Paskui atsargiai įpilama 1 mL vandens. Polimerizacija vyksta apie 40 min. kambario
temperatūroje. Jos pabaiga gerai matoma ties polimero ir vandens fazių riba. Sustingusio gelio paviršius
praplaunamas vandeniu ir nusausinamas filtriniu popieriumi.
Koncentruojančiojo (viršutinio) gelio paruošimas
4 % poliakrilamidiniam geliui paruošti stiklinėlėje sumaišomi 1,3 mL 30 % akrilamido/BIS tirpalo,
2,5 mL 0,5 M TRIS ir 6,1 mL vandens. Pridedama 0,1 mL 10 % natrio dodecilsulfato tirpalo, 0,05 mL
amonio persulfato ir 0,01 mL TEMED. Gerai išmaišius, tirpalas pilamas ant apatinio gelio iki formos
viršaus. Iš karto įstatomos šakutės su penkiolika dantų taip, kad po dantimis neliktų oro burbulų.
Polimerizacija trunka apie 40 min. Jai pasibaigus, šukos ištraukiamos, iškratomas po polimerizacijos likęs
skystis, šulinėliai praplaunami elektrodiniu buferiu ir forma įstatoma į aparatą.
Pavyzdžių paruošimas
Pagal chromatogramą atrenkamos frakcijos monomerinei (19–21) ir oligomerinėms (24–26)
rekombinantinio baltymo formoms įvertinti ir paruošiamos baltymų elektroforezei. Imama po 20–25 µg
baltymo iš kiekvienos frakcijos, sudarančios pagrindines smailes, sumaišoma su pavyzdžio buferiu (be 2-
ME) santykiu 3 : 1 (3 dalys baltymo tirpalo ir 1 dalis mėginio dažo) ir kaitinama verdančio vandens vonelėje
5–8 min. Atšaldoma iki kambario temperatūros.
Pavyzdžių įpylimo schema
Į gelio šulinėlius įpilama po 20 µL paruoštų frakcijų: 19, 20, 21, 24,25, 26.
Elektroforezės sąlygos
Viršutinis ir apatinis aparato rezervuarai užpildomi elektrodiniu atskiestu buferiu apie 300 mL į viršutinį
rezervuarą ir apie 2000 mL į apatinį. Pavyzdžiai dedami į šulinelius po elektrodinio buferio sluoksniu.
Elektroforezė atliekama esant nuolatinės srovės režimui. Kol dažas pereis koncentruojantį gelį, nustatoma
srovė 18–20 mA/geliui. Dažui įėjus į skiriamąjį gelį 2–3 mm (po 80–100 min.), srovė padidinama iki
25 mA/geliui. Dažo srovei išėjus, nuolatinė srovė dar palaikoma apie 40–50 min. Paskui srovės šaltinis
išjungiamas, stiklai išimami iš aparato, nuimami šoniniai laikikliai ir atskiriamas mažasis stiklas.
Nupjaunamas koncentruojantis gelis. Skiriamasis gelis dedamas į vonelę su CBB R-250 dažu ir paliekamas
per naktį ar ilgiau. Dažą nupylus, įpilamas blukiklis, kuris keletą kartų keičiamas. Nuolat maišant, procesas
pagreitėja. Baigus blukinti, fonas beveik išnyksta ir gelis patalpinamas į vandenį. Gelį reikia gerai nuplauti
nuo blukiklio. Tai daroma 5 kartus keičiant vandenį. Kiekvieną kartą įpylus vandens 20–30 min.
inkubuojama ant purtyklės.
PAAG-SDS gelio džiovinimas
Poliakrilamidiniai geliai džiovinami džiovintuvuose. Jų neturint, galima džiovinti rankiniu būdu pagal
toliau aprašytą metodiką. Išblukintas gelis 3 kartus praplaunamas distiliuotu vandeniu kas dešimt minučių jį
pakeičiant. Paskui gelis užpilamas tirpalu ir džiovinamas. Tirpalo pilama tiek, kad būtų apsemtas gelis. Gelis
inkubuojamas kambario temperatūroje 15–20 minučių, kas tam tikrą laiką pajudinant vonelę, kad į gelį
tolygiai įsigertų tirpalas. Inkubacijos pabaigoje į vonelę 15–20 sekundžių pamerkiami 2 celofano lakštai.
Celofano matmenys turi būti apie 1 cm didesni už gelį. Paskui imamas vienas celofano lakštas ir paklojamas
ant švaraus stiklo taip, kad neliktų oro tarpų tarp stiklo ir celofano. Ant pakloto lakšto dedamas gelis, kuris iš
viršaus užklojamas antru celofano lakštu. Tinkamai paruoštas džiovinti gelis laikomas tuo atveju, jei
nesimato oro burbulų. Celofano pakraščiai priklijuojami prie stiklo lipnia juostele ir paliekama džiūti
kambario temperatūroje vienai – dviems dienoms.

Atsiskaitymas
Pateikiama rekombinatinio baltymo oligomerinių formų atskyrimo chromatograma ir elektroforegrama.
318
0 5 10 15 20 25 30 35
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Frakc. Nr.
O
.
T
.

2
8
0
n
m


A. Monomerinių ir oligomerinių formų atskyrimo chromatograma B. 19. 20. 21. 24. 25. 26.
Baltymų frakcijos Nr.

A. Monomerinių ir oligomerinių formų atskyrimo chromatograma. B. Frakcijų 19–21 ir 24–26 PAAG-SDS analizė
neredukavimo sąlygomis

Literatūra

1. Дарбре, А. Практическая химия белка. 1989, c 64–65.
2. Westermeier, R. Electrphoresis in Practice. A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein
Separations, 1997, p. 263–273.
319

3. Disulfidinių jungčių nustatymas elektroforetiniais metodais
rekombinantiniuose baltymuose

Darbo tikslas

Naudojant reduktorių 2-merkaptoetanolį įvertinti disulfidinių jungčių buvimą rekombinantinio
interferono frakcijose.

Tyrimo objektas

Rekombinantinio interferono oligomerinės formos, surinktos po gryninimo ant karboksiceliuliozės CM-
52.

Matavimų priemonės

Vertikalus elektroforezės aparatas, stovas geliams pilti, nuolatinės srovės šaltinis, purtyklė, vandens
vonelė, gelių džiovintuvas, automatinės pipetės, liniuotė, mikromėgintuvėliai, stiklinėlės, maišyklė,
svarstyklės, pH-metras, skeneris.

Tirpalų ruošimas

30 % %% % akrilamidas+BIS: 29,2 g akrilamido ir 0,8 g BIS (N,N’-metilen-bis-akrilamidas) ištirpinama
vandenyje ir praskiedžiama matavimo kolboje iki 100 mL.
1,5 M TRIS, pH 8,8: 18,15 g tris(hidroksimetil)aminometano ištirpinama 70 mL vandens. Tirpalo pH
koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rūgštimi iki 8,8. Praskiedžiama matavimo kolboje iki 100 mL.
0,5 M TRIS, pH 6,8: 6,0 g tris(hidroksimetil)aminometano ištirpinami 70 mL vandens. Tirpalo pH
koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rūgštimi iki 6,8. Praskiedžiama matavimo kolboje iki 100 mL.
1,0 M TRIS, pH 6,8: 6,0 g tris(hidroksimetil)aminometano ištirpinami 35 mL vandens. Tirpalo pH
koreguojamas praskiesta (3 kartus) druskos rūgštimi iki 6,8. Praskiedžiama matavimo kolboje iki 50 mL.
10 % %% % natrio dodecilsulfatas (SDS): 5,0 g natrio dodecilsulfato ištirpinami, praskiedžiama vandeniu iki
50 mL.
10 % %% % amonio persulfatas: į 1,5–2,0 mL mėgintuvėlį atsveriama 100 mg amonio persulfato, įpilama
1 mL vandens, ištirpinama. Tinka naudoti tik pagaminimo dieną.
Elektrodinis buferis, 5× ×× ×koncentruotas: 30 g tris (hidroksimetil)-aminometano, 144 g glicino, 10 g
natrio dodecilsulfato ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 2 L. Laikoma 4 °C temperatūroje. Tirpalo
pH turi būti 8,3–8,6, tačiau koreguoti negalima. Prieš naudojimą tirpalas skiedžiamas 5 kartus vandeniu.
0,5 % %% % bromfenolio mėlis: 50 mg bromfenolio mėlio ištirpinama 10 mL vandens.
Mėginio buferis: 800 mg natrio dodecilsulfato, 2,5 mL 1,0 M TRIS, pH 6,8, 4,0 mL glicerino, 0,1 mL
0,5 % bromfenolio mėlio skiedžiamas vandeniu iki 8,0 mL. Išpilstoma po 0,8 mL į mėgintuvėlius. Laikoma
kambario temperatūroje. – R – redukuoto pavyzdžio buferiui paruošti į 0,8 mL tirpalo pridedama 0,2 mL β-
merkaptoetanolio, N – esant netinkamoms redukcijai sąlygoms – 0,2 mL vandens.
Coomassie Brilliant Blue R 250 (CBB R-250) dažas: 1,0 g CBB R-250 tirpinamas 400 mL etanolio
3 val. Po to pridedama 100 mL acto rūgšties ir praskiedžiama vandeniu iki 1 L.
Blukiklis: sumaišoma 300 mL etanolio, 100 mL acto rūgšties. Praskiedžiama vandeniu iki 1 L.
Tirpalas geliams džiovinti: Į 325 mL distiliuoto vandens įpilama 160 mL 96 ° etanolio ir 15 mL
glicerino. Tirpalas sumaišomas.

Darbo eiga

Užpylimo formos surinkimas
Poliakrilamidinio gelio polimerizacijai naudojama stiklinė forma, kuri sudaroma iš 2 stiklų (vidinis
16 × 20 cm ir išorinis 18,3 × 20 cm), tarp jų esančių tarpinių (storis 0,75 mm, aukštis 18,3 cm, plotis
320
19,0 mm) bei šoninių laikiklių, suspaudžiančių šią konstrukciją. Paruošta forma įstatoma į stovelį gelio
užpilti.
Skiriamojo (apatinio) gelio paruošimas
12 % poliakrilamidiniam geliui paruošti stiklinėlėje sumaišoma 12 mL 30 % akrilamido/BIS tirpalo,
7,5 mL 1,5 M TRIS ir 9,1 mL vandens. Pridedama 0,3 mL 10 % natrio dodecilsulfato, 0,2 mL amonio
persulfato ir 0,02 mL TEMED. Gerai išmaišius, tirpalas pilamas į formą iki pažymėtos vietos (4 cm nuo
stiklo viršaus). Paskui atsargiai užpilama 1 mL vandens. Polimerizacija vyksta apie 40 min. kambario
temperatūroje. Jos pabaiga gerai matoma ties polimero ir vandens riba. Sustingusio gelio paviršius
praplaunamas vandeniu ir nusausinamas filtriniu popieriumi.
Koncentruojančiojo (viršutinio) gelio paruošimas
4 % poliakrilamidiniam geliui paruošti stiklinėlėje sumaišomi 1,3 mL 30 % akrilamido/BIS tirpalo,
2,5 mL 0,5M TRIS ir 6,1 mL vandens. Pridedama 0,1 mL 10 % natrio dodecilsulfato tirpalo, 0,05 mL
amonio persulfato ir 0,01 mL TEMED. Gerai išmaišius, tirpalas pilamas ant apatinio gelio iki formos
viršaus. Iš karto įstatomos šakutės su penkiolika dantų taip, kad po dantimis neliktų oro burbulų.
Polimerizacija trunka apie 40 min. Jai pasibaigus, šukos ištraukiamos, iškratomas po polimerizacijos likęs
skystis, šulinėliai praplaunami elektrodiniu buferiu ir forma įstatoma į aparatą.
Pavyzdžių paruošimas
Darbui naudojama rekombinantinio interferono oligomerinės formos, surinktos po chromatografijos ant
karboksiceliuliozės CM-52. Šiuos baltymus paruošiame PAAG-SDS elektroforezei, redukcijai tinkančiomis
(naudojant pavyzdžio dažą su reduktoriumi β- merkaptoetanoliu) ir neredukuojančiomis sąlygomis
(pavyzdžio daže – vanduo vietoj reduktoriaus.) Imama po 20–25 µg baltymo iš kiekvieno pateikto
pavyzdžio(1–4).
Pavyzdžių supylimo schema
Į gelio šulinėlius įdedama po 15 µL paruoštų elektroforezei baltymų; redukcijos sąlygomis –1R, 2R, 3R,
4R, molekulinių masių markerius (M.M.M.) ir oligomerines formas redukcijai tinkančiomis sąlygomis: 1, 2,
3, 4.
Elektroforezės sąlygos
Viršutinis ir apatinis aparato rezervuarai užpildomi elektrodiniu (penkis kartus atskiestu ) buferiu apie
250 mL į viršutinį rezervuarą ir apie 2000 mL į apatinį. Pavyzdžiai įdedami į šulinėlius po elektrodinio
buferio sluoksniu. Elektroforezė atliekama esant nuolatinės srovės režimui. Kol dažo srovė pereis
koncentruojantįjį gelį, geliui nustatoma srovė 18–20 mA. Dažui įėjus į skiriamąjį gelį 2–3 mm (po 80–
100 min.), srovė padidinama iki 25 mA/geliui. Dažui išėjus, elektroforezė dar tęsiama apie 40–50 min.,
paskui srovės šaltinis išjungiamas, stiklai išimami iš aparato, nuimami šoniniai laikikliai ir atskiriamas
mažasis stiklas. Nupjaunamas koncentruojantysis gelis ir skiriamasis gelis dedamas į vonelę su CBB R-250
dažu ir paliekamas per naktį ar ilgiau. Dažą nupylus, užpilamas blukiklis, kuris keletą kartų keičiamas.
Nuolat maišant, procesas greitėja. Baigus blukinti, fonas beveik išnyksta ir gelis patalpinamas į vandenį. Gelį
reikia gerai atplauti nuo blukalo. Tai daroma 5 kartus keičiant vandenį. Kiekvieną kartą užpylus vandenį 20–
30 min. inkubuojama ant purtyklės.
PAAG-SDS gelio džiovinimas
Poliakrilamidiniai geliai džiovinami džiovintuvuose. Jų neturint galima džiovinti rankiniu būdu pagal
toliau aprašytąją metodiką. Išblukintas gelis 3 kartus praplaunamas distiliuotu vandeniu kas dešimt minučių
pakeičiant vandenį. Po to gelis užpilamas tirpalu, skirtu džiovinti. Tirpalo pilama tiek, kad būtų apsemtas
gelis. Gelis inkubuojamas kambario temperatūroje 15–20 minučių, kas tam tikrą laiką pajudinant vonelę, kad
į gelį tolygiai įsigertų tirpalas. Inkubacijos pabaigoje į vonelę 15–20 sekundžių pamerkiami 2 celofano
lakštai. Celofano matmenys turi būti apie 1 cm didesni už gelį. Paskui imamas vienas celofano lakštas ir
paklojamas ant švaraus stiklo taip, kad neliktų oro tarpų tarp stiklo ir celofano. Ant pakloto lakšto dedamas
gelis, kuris iš viršaus užklojamas antru celofano lakštu. Tinkamai paruoštas džiovinti gelis laikomas tuo
atveju, jei nesimato oro burbulų. Celofano pakraščiai priklijuojami prie stiklo lipnia juostele ir paliekama
džiūti kambario temperatūroje vienai, dviems dienoms.

Atsiskaitymas

Pateikiama elektroforegrama.

321

1R. 2R 3R 4R MMM 1. 2. 3. 4.
Rekombinantinio baltymo oligomerinių formų ir monomerinės formos PAAG-SDS elektroforegrama. 1R, 2R, 3R, 4R –
monomerinė forma po baltymų sąveikos su redukuojančiuoju agentu -2-merkaptoetanoliu, 1–4 rekombinantinio
baltymo oligomerinės formos redukcijai netinkančiomis sąlygomis. MMM – baltymų molekulinių masių standartai,
kDa, nuo gelio viršaus į apačią: 94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1; 14,4

Nustatoma analizuotų baltymų molekulinė masė, redukcijos ir redukcijai netinkančiomis sąlygomis.
1. Išmatuojamas atstumas R (cm) nuo skiriamojo gelio pradžios iki bromfenolio mėlio juostos gelio
apačioje. Taip pat išmatuojami atstumai r
1
, r
2
..... r
n
cm nuo skiriamojo gelio pradžios iki standartinių
baltymų ir tiriamų baltymų nudažytų juostelių.
Apskaičiuojamas santykinis kiekvieno baltymo (standartinių ir nežinomų) nueitas kelias R
f
pagal
formulę:

R
f
= r/R.

2. Braižomas grafikas: ordinačių ašyje atidedami standartinių baltymų molekulinių masių dešimtainiai
logaritmai, o abscisių – R
f
.
3. Iš gautos priklausomybės pagal nežinomo baltymo R
f
apskaičiuojama jo molekulinė masė.
4. Paaiškinama, kokio dydžio oligomerinės formos yra nustatytos.

Literatūra

1. Дарбре, А. Практическая химия белка. 1989, c. 64–65.
2. Westermeier, R. Electrophoresis in Practice. A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein
Separations. 1997, p. 263–273.

322
4. Rekombinantinių baltymų peptidinio žemėlapio sudarymas

Darbo tikslas

Susipažinti su baltymų peptidinio žemėlapio sudarymu.

Tyrimo objektas

Granuliocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus ir neupogeno (palyginamasis standartas) baltymų
peptidiniai žemėlapiai.

Matavimų priemonės

Analitinė gradientinė HPLC chromatografinė sistema, detektorius, gradientatorius, integratorius,
maišytuvas, kolonėlė, mikromėgintuvėliai, analitinės svarstyklės, vakuuminis siurblys, švirkštas injekcijoms,
filtravimo švirkštas, termostatas, ultragarsinė vonia.

Tirpalų ruošimas

1 % amonio bikarbonato tirpalas: 10,0 g amonio bikarbonato ištirpinama 900–950 mL ypač švariame
vandenyje. Tirpalas perpilamas į matavimo kolbą (1000 mL) ir iki žymės pripilama ypač švaraus vandens.
Tirpalas filtruojamas per 0,45 um membraną.
0,1 % tripsino tirpalas: Į mėgintuvėlį mikromėginiams suberiama 1,0 mg tripsino ir ištirpinama 1,0 mL
1 % amonio bikarbonato tirpalo. Tirpalas filtruojamas per 0,45 um membraną arba centrifuguojamas 5min.
0,02 % tripsino tirpalas: 20 µL 0,1 % tripsino tirpalo praskiedžiama 1 % amonio bikarbonato tirpalu
iki 100 µL. Tirpalas ruošiamas prieš pat naudojimą.
0,2 % tripsino inhibitoriaus tirpalas: Į mėgintuvėlį mikromėginiams suberiama 1,0 mg tripsino
inhibitoriaus ir ištirpiname 0,5 mL 1 % amonio bikarbonato tirpalo. Tirpalas filtruojamas per 0,45 um
membraną arba centrifuguojamas 5min.
0,04 % tripsino inhibitoriaus tirpalas: Į 20 µL 0,2 % tripsino inhibitoriaus tirpalas praskiedžiamas 1 %
amonio bikarbonato tirpalu iki 100 µL. Tirpalas ruošiamas prieš pat naudojimą.
Eliuentas A: Į matavimo kolbą (1000 mL) su 200–300 mL ypač švariu vandeniu įpilama 1,0 mL
trifluoracto rūgšties, ir iki žymės pripilama ypač švaraus vandens. Tirpalas gerai išmaišomas ir filtruojamas
per 0,45 um membraną.
Eliuentas B: Į matavimo kolbą (1000ml) su 100 mL ypač švariu vandeniu įpilama 1,0 mL trifluoracto
rūgšties ir iki žymės pripilama acetonitrilo. Tirpalas gerai išmaišomas ir filtruojamas per 0,45 um membraną.

Darbo eiga

Standarto paruošimas
Palyginamasis tirpalas. Neupogeno laboratorinio standarto (palyginamasis standartas) tikslus tūris
skiedžiamas 1 % amonio bikarbonato tirpalu iki baltymo koncentracijos 1,0 mg/mL. Tirpalas filtruojamas
per 0,45 um membraną arba centrifuguojamas 5 min. 0,5–1,0 mL tirpalo pernešama į mėgintuvėlį dializei su
nitroceliuliozine membrana ir dializuojama prieš 1 % amonio bikarbonato tirpalą – 18 val. 4 °C
temperatūroje. Tirpalas laikomas –20 °C temperatūroje.
Pavyzdžio paruošimas
Tiriamasis tirpalas. Granuliocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus (G-CSF) tikslus tūris skiedžiamas
1 % amonio bikarbonato tirpalu iki baltymo koncentracijos 1,0 mg/mL. Tirpalas filtruojamas per 0,45 um
membraną arba centrifuguojamas 5 min. 0,5–1,0 mL tirpalo įpilama į mėgintuvėlį su nitroceliuliozine
membrana dializei ir dializuojama naudojant 1 % amonio bikarbonato tirpalą 18 val. 4 °C temperatūroje.
Tirpalas laikomas –20 °C temperatūroje.
Hidrolizė. Į 200 µL palyginamojo ir 200 µL tiriamojo tirpalo, esančio atskiruose mėgintuvėliuose,
įpilama po 20 µL 0,02 % tripsino tirpalo. Tirpalai gerai išmaišomi ir patalpinami į termostatą. Inkubuojama
37 °C temperatūroje 4 val.
323
Reakcijos sustabdymas. Mėgintuvėliai su palyginamuoju tirpalu ir tiriamuoju tirpalu išimami iš
termostato. Reakcija sustabdoma pridedant po 20 µL su 0,04 % tripsino inhibitoriaus tirpalo.
Chromatografija
Kolonėlė pusiausvirinama eliuentu A 15–20 min. Paleidžiama gradiento, kolonėlės atplovimo ir
pusiausvirinimo programa be pavyzdžio:

Laikas, min. Eliuentas A, % Eliuentas B, %
0 100 0
15 80 20
25 75 25
50 40 60
55 20 80
56 100 0
70 100 0

Įleidžiama 20 µL tiriamojo tirpalo pagal nurodytą programą. Gaunama palyginamoji chromatograma.



Rekombinantinio baltymo GCSF peptidinio žemėlapio (apačioje) palyginimas su standartiniu neupogeno
palyginamuoju (viršuje) baltymu. Tiriamo rekombinantinio baltymo chromatogramos profilis kokybiškai atitinka
palyginamojo neupogeno chromatogramos profilį

Atsiskaitymas

- žinoti pepetidinių žemėlapių sudarymo principus, mokėti analizuoti baltymų peptidinius žemėlapius.
324

Literatūra

Дарбре, А.. Практическая химия белка. 1989, c. 223–242.
325

5. Baltymo molekulinės masės nustatymas masių spektrometru

Darbo tikslas

Susipažinti su baltymų molekulinės masės nustatymu masių spektrometru.

Tyrimo objektas

Rekombinantinis baltymas interleukinas-2; tikslus molekulinės masės nustatymas.

Matavimų priemonės

Masių spektrometras, HP 1100 MSD, didelio efektyvumo chromatografas, HP 1100 HPLC, du suslėgto
azoto balionai.

Tirpalai

1. Izopropanolis/ vanduo/ actorūgštis – 49,5/49,5/1–500 mL.
2. Izopropanolis/ vanduo – 50/50 – 500 mL.
3. Prietaiso kalibravimo standartai.

Darbo eiga

Analizuojamojo pavyzdžio paruošimas
Analizuojamasis pavyzdys turi būti visiškai grynas. Kadangi daugelis baltymų saugomi pridėjus
stabilizatorių, prieš analizę juos būtina pašalinti. Geriausias būdas atsikratyti šių priedų naudoti atvirkščių
fazių chromatografiją, kurios metu visiškai suyra daugelis stabilių baltymo ir stabilizatoriaus komponentų
kompleksų.
Po chromatografijos gautas baltymas džiovinamas liofilinant ir istirpinamas tirpale Nr. 1. Gauto baltymo
tirpalo koncentracija − 3,33 pmol/ µL.
Tirpalų paruošimas
Visi tirpalai ruošiami ir saugomi polipropileniniuose induose. Visi indai prieš naudojant ir po darbo
praplaunami šviežiu dejonizuotu vandeniu (18 Ω). Patariama indų, skirtų masės spectrometrijai, nenaudoti
kitiems tikslams. Visi tirpikliai turi būti „HPLC gradient grade“ arba geresnės kokybės bei perfiltruoti per
0,2 µm filtrą.
Masės spektrometro paruošimas darbui
Dieną prieš darbą atliekami šie paruošimo darbai:
a) paruošiami visi tirpalai;
b) išvaloma įpurškimo kamera ir, jeigu reikia, kapiliaras ir nugriebtuvai;
c) patikrinamas purkštuvo veikimas;
d) kiekvienas chromatografe esantis tirpalo tekėjimo kanalas išvalomas leidžiant per jį apie 10 min.
5 mL/min. greičiu tirpalą Nr. 2, kur įmanoma, metaliniai kapiliarai pakeičiami kapiliarais,
pagamintais iš PEEK;
e) įjungiamas masių spektrometras ir nustatomas prapūtimo režimas (inertinių-džiovinančių dujų
srautas 3 L/min. (N
2
), purkštuvo dujų slėgis 20 psi džiovinančių dujų temperatūra 300 °C, kvadrupolio
temperatūra 100 °C).
Analizės dieną:
a) prietaisas yra kalibruojamas;
b) praleidžiamas inertinių dujų srautas 10 L/min. (N
2
) esant purkštuvo dujų slėgiui 40 psi, džiovinimo
dujų temperatūrai 350 °C, kvadrupolio temperatūrai 100 °C. Tirpalo Nr. 2 tekėjimo greitis iš
chromatografo į masės spectrometrą 0,5 mL/min.) apytikriai yra 1–2 val.;
c) masių spektrometras paruoštas darbui.

326
Analizės atlikimas
Programoje HP Chemstation sukuriamas metodas „PROTEIN.M“, kuriame įrašomi visi prietaisų
valdymo parametrai:
1) Pompos: tirpalo Nr. 1 tekėjimo greitis – 0,4 mL/min.,
2) Injektoriaus: injekcijos tūris – 15 µL,
3) Masių spektrometro: analizuojamų jonų krūvis – teigiamas,
džiovinančių dujų srautas – 10–13 L/min.,
džiovinančių dujų temp. – 350 °C,
purkštuvo dujų slėgis – 40 psi,
kapiliaro įtampa – 4500 V,
fragmentavimo įtampa – 120 V,
4) Spektro užrašymo parametrai: m/z skalė – 500–3000.
Įjungiama chromatografo pompa ir užpildomi visi tirpalo kanalai į masės spectrometrą tirpalu Nr. 1.
Tada spaudžiame klavišą „Start“, kuris pradeda procesą.

Atsiskaitymas

- paaiškinti masių spektrometro veikimo principą;
- žinoti analizuojamo pavyzdžio paruošimą masės spektrometrinei analizei;
- paaiškinti rekombinantinių baltymų molekulinės masės nustatymą masių spektrometru.














A.



1 pav. HP 1100 MSD Atmosferos slėgio įpurškimo sistema ir masių analizatorius













B.


1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
A : 1 8
A : 1 7
A : 1 6
A : 1 5
A : 1 4
A : 1 3
A : 1 2
A : 1 1
A : 1 0
A : 9
A : 8
A : 7
A : 6
B : 1 6
B : 1 5
B : 1 4
B : 1 3
B : 1 2
B : 1 1
B : 1 0
B : 9
B : 8
B : 7
K o m p i u t e r i o n u s t a t y t a s k r ū v i ų
p a s i s k y r s t y m a s IL - 2 m ė g i n y j e

327








C.
A : 1 5 5 4 6
B : 1 5 4 1 6
K o m p i u t e r i o a p s k a i č i u o t a I L - 2
m o l e k u l i n ė m a s ė










D.



m/z
1000 2000
0
20
40
60
80
100
Max: 25299
1111.4
1296.4
972.6
1414.1
1102.1
915.5
1555.5
1285.6
1728.3
1944.2
1120.7
2221.4 1416.0
2592.1
998.8
562.7 869.0
701.4
Tikrasis IL-2 mėginio masės spektras
2203.4
1927.9
1713.6
1542.3
1402.2


2 pav. A. Slėgio elektroįpurškimo schema ir masių analizatorius. B. Kompiuterio nustatytas krūvių pasiskirstymas IL-2
analizuojamame mėginyje. C. Kompiuterio programa apskaičiuota rekombinantinio baltymo IL-2 molekulinė
masė. D. Tikrasis IL-2 mėginio masės spektras

Iš gautų rezultatų matoma, kad naudojant masių spektrometriją galima labai tiksliai nustatyti baltymo
molekulinę masę. Nustatyta IL-2 molekulinė masė visiškai atitinka teorinę šio baltymo molekulinę masę
MM
IL-2(Met)
= 15547,24; MM
IL-2
= 15416,04.

Literatūra

1. Mickevičius, D. Cheminės analizės metodai. 1998, p. 215–267.
2. Дарбре, А. Практическая химия белка. 1989. 515–529.

328
E Ek ks sp pe er ri im me en nt ti in ni ių ų t ty yr ri im mų ų p pa ag gr ri in nd da ai i
Pratybos
Aurelija Žvirblienė

1. Biologinių duomenų bazės internete. NCBI duomenų bazės. Entrez
paieškos sistema

Šiose pratybose studentai supažindinami su Europos bioinformatikos instituto (EBI), Nacionalinio
biotechnologinės informacijos centro (NCBI) ir kitomis biologinių duomenų bazėmis, Entrez paieškos
sistemos galimybėmis. Studentai gauna užduotį surasti informaciją apie savo eksperimentinių tyrimų objektą
šiose duomenų bazėse, pavyzdžiui, mokslinės literatūros šaltinius, duomenis apie tiriamojo baltymo
struktūrą, jį koduojančio geno seką ir pan.
Nuorodos:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.embl.org/
http://www.ebi.ac.uk/
http://www.isb-sib.ch/
http://mcb.harvard.edu/BioLinks.html

2. Literatūros duomenų paieška PubMed duomenų bazėje. Metodų
aprašymų paieška internete

Šių pratybų metu studentai detaliau supažindinami su mokslinės literatūros ir metodų duomenų bazėmis.
Jie gauna užduotį surasti mokslinius straipsnius arba patentus iš savo eksperimentinio darbo temos bei darbui
reikalingų metodų aprašymus.
Literatūros šaltinių paieškos nuorodos:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi
http://www.biomedcentral.com
http://cellbiol.com/journals.htm
http://www.bmn.com/
http://ep.espacenet.com/

Metodų aprašymų paieškos nuorodos:
http://www.protocol-online.net/
http://www.cellbio.com/
http://wheat.pw.usda.gov/homepage/lazo/methods/
http://www.highveld.com/protocols.html
http://research.nwfsc.noaa.gov/protocols.html

3. DNR sekų paieška genų banke. DNR sekų palyginimas bei
koduojamų baltymų sekos nustatymas, naudojant BLAST
kompiuterinę programą

Šiose pratybose studentai gauna užduotį surasti tam tikrą DNR seką genų banke ir ją apibūdinti: rasti
panašumų su kitomis sekomis, nurodyti promotoriaus ir terminatoriaus vietas, jeigu jos yra duomenų bazėje,
rasti nuorodas į nurodytą baltymą ir jo seką. Taikomi įvairūs paieškos būdai: pagal geno pavadinimą, pagal
autorius, citavimo šaltinį, priėjimo numerį .
DNR sekų paieškos nuorodos:
http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html
http://golgi.harvard.edu/sequences.html
http://nrcbsa.bio.nrc.ca/~nash/genbank.html
http://www.tigr.org/tdb/
329

Analizuojama seka lyginama su kitomis DNR sekomis, naudojant BLAST kompiuterinę programą.
Pagal jos variantą Parwise BLAST, lyginamos dvi norimos sekos, įrašius pačias sekas arba jų priėjimo
numerį.
Nuoroda DNR sekoms lyginti:
http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/

4. Baltymų sekos ir struktūros paieška duomenų bazėse. Baltymų
sekų palyginimas. Baltymų struktūros modeliavimas, naudojant
RasMol kompiuterinę programą

Studentai supažindinami su baltymų struktūros ir proteomikos duomenų bazėmis bei molekulinio
modeliavimo įrankiais. Praktinė užduotis: pagal pateiktą amino rūgščių seką surasti baltymo tretinės
struktūros modelį, nustatyti baltymo funkciją, analogus eukariotuose ir prokariotuose, galimas glikozilinimo
ir fosforilinimo vietas, galimus transmembraninius domenus, lokalizaciją ląstelėje ir pan.
Nuorodos baltymų struktūros ir funkcijos paieškai:
http://www.rcsb.org/pdb/
http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html
http://mips.gsf.de/
http://smart.embl-heidelberg.de/
http://protomap.cornell.edu/

Nuorodos baltymų sekoms lyginti:
http://www.sanger.ac.uk/Pfam/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
http://www.ch.embnet.org/software/bBLAST.html
http://www.cbs.dtu.dk/

Studentai supažindinami su RasMol programa, skirta baltymams ir kitoms molekulėms vizualizuoti. Šios
programos galimybės rodomos, pasirinkus tam tikro baltymo, pavyzdžiui, žmogaus augimo hormono,
struktūros modelį iš baltymų banko. Baltymo molekulė vaizduojama įvairiais grafiniais pavidalais:
sukiojama apie pasirinktą ašį, išskiriamas norimas struktūros fragmentas, išmatuojami atstumai tarp
pasirinktų atomų ir pan.
Nuorodas RasMol programai (versijos 2.6) siųsti:
http://www.rayslearning.com/rasmol.htm
http://science.glaxowellcome.com/science/rasmol/down.htm

5. Geros laboratorinės praktikos taisyklės

Šių pratybų tikslas yra supažindinti studentus su Geros laboratorinės praktikos (GLP) reikalavimais,
kurie garantuoja eksperimentinių laboratorinių tyrimų kokybę ir leidžia juos unifikuoti tarptautiniu mastu.
Pratybos organizuojamos seminaro forma. Remiantis Sveikatos apsaugos ministerijos leidiniu „Geros
laboratorinės praktikos taisyklės“ (Vilnius, 1999), išdėstomi pagrindiniai GLP reikalavimai: tiriamojo darbo
organizavimas, tyrimų darbo sąlygos, reikalavimai, keliami aparatūrai, pavyzdžių atrinkimas ir saugojimas,
tyrimo atlikimas ir rezultatų apibendrinimas, darbo protokolų rengimas ir saugojimas.
Esant galimybei, organizuojama ekskursija į laboratoriją, turinčią GLP sertifikatą.

6. Darbas steriliame bokse. Audinių kultūros

Pratybos vyksta Biotechnologijos instituto Imunologijos laboratorijoje. Studentai supažindinami su
įranga, reikalinga dirbant su aukštesniųjų eukariotų ląstelėmis, sterilumo reikalavimais, ląstelių kultivavimo
ir saugojimo sąlygomis.
330
Demonstruojamas darbas steriliame bokse su ląstelių kultūromis: ląstelių atgaivinimas, persėjimas,
skaičiavimas. Naudojant šviesinę mikroskopiją, parodomi skirtumai tarp įvairių tipų žinduolių ląstelių,
žinduolių ląstelės lyginamos su mielių ląstelėmis. Demonstruojant naudojamas mikroskopas Olympus IX70 ir
vaizdų analizės programa Image Pro-Plus.
Lyginama, kuo skiriasi aukštesniųjų eukariotų ląstelių ir mikroorganizmų kultivavimo sąlygos:
mitybinės terpės, sterilumo reikalavimai, ląstelių užšaldymas ir saugojimas.

7. Eksperimentinių duomenų statistinis apdorojimas

Šiose pratybose studentai įtvirtina žinias apie statistinių metodų taikymą eksperimentiniuose tyrimuose.
Praktinė užduotis: atlikti savo turimų eksperimentinių duomenų statistinę analizę ir įvertinti jų patikimumą.
Skaičiavimams rekomenduojama naudotis GraphPad, Origin, Excel programomis.

8. Eksperimento rezultatų grafinis pateikimas. Duomenų
apibendrinimas. Demonstruojamosios medžiagos paruošimas

Šiose pratybose studentai supažindinami su reikalavimais, kaip paruošti parodomąją medžiagą pristatant
savo eksperimento rezultatus, pavyzdžiui, moksliniam seminarui, pranešimui konferencijoje ar baigiamajam
darbui ginti. Praktinė užduotis: parengti demonstruojamąją medžiagą iš turimų eksperimentinių duomenų.
Darbui rekomenduojama naudotis PowerPoint, Excel, Origin programomis.

9. Eksperimentinio darbo rezultatų pristatymas

Šios pratybos organizuojamos mokslinio seminaro forma. Pratybų tikslas: išmokti apibendrinti
eksperimentinio darbo rezultatus, pristatyti juos auditorijai, dalyvauti mokslinėje diskusijoje. Praktinė
užduotis: parengti mokslinį pranešimą ir pristatyti jį kolegoms. Pranešimas gali būti rengiamas iš turimų
eksperimentinių duomenų arba pagal mokslinę publikaciją.

331
I Im mu un no ol lo og gi ij ja a
Laboratoriniai darbai
Aurelija Žvirblienė

1. Gama-interferono nustatymas žmogaus limfocitų kultūrose
imunofermentiniu metodu

Darbo tikslas

Imunofermentiniu metodu nustatyti gama-interferono koncentraciją ir įvertinti T limfocitų aktyvacijos
laipsnį nestimuliuotų ir mitogenu stimuliuotų žmogaus periferinio kraujo limfocitų kultūrose.

Gama-interferonas (IFNγ) yra svarbus ląstelinio imuninio atsako reguliatorius. Jo pagrindinė funkcija
yra makrofagų aktyvacija. Šį citokiną daugiausia sekretuoja Th1 limfocitai, kurie gali būti aktyvuojami
imuninio atsako metu arba paveikus specifiniais T ląstelių aktyvatoriais, pavyzdžiui, T ląstelių mitogenu
fitohemagliutininu (PHA). Padidėjusi IFNγ sekrecija rodo Th1 limfocitų aktyvacijos laipsnį. Atliekant
klinikinius imunologinius tyrimus, Th1 limfocitų aktyvumas gali būti įvertinamas pagal jų gebėjimą
sekretuoti IFNγ in vitro. Tam naudojami limfocitai, išskirti iš tiriamųjų ligonių periferinio kraujo.
Spontaninės ir mitogenu indukuotos IFNγ sekrecijos lygis nustatomas limfocitų auginimo terpėje po 1 ar 2
parų inkubacijos. Sveikų žmonių limfocitų kultūrose po stimuliacijos mitogenu IFNγ sekrecija paprastai
padidėja. Jeigu nustatoma aukšta spontaninė IFNγ sekrecija nestimuliuotose kultūrose, tai gali reikšti, kad
tiriamojo ligonio Th1 limfocitai jau buvo aktyvuoti in vivo, pavyzdžiui, esant infekcijai ar uždegimui.
IFNγ nustatyti limfocitų kultūrose taikomas dviepitopinės imunofermentinės analizės metodas.
Monokloniniai antikūnai prieš IFNγ (klonas GIF10) imobilizuojami plokštelėje. Po to plokštelė inkubuojama
su IFNγ standartu ir tiriamaisiais pavyzdžiais – limfocitų auginimo terpe. IFNγ specifiškai prisijungia prie
imobilizuotų antikūnų. Prisijungęs IFNγ išryškinamas, inkubuojant su kitais monokloniniais antikūnais
(klonas GIF3), konjuguotais su peroksidaze. Po to pridedamas peroksidazės substrato tirpalas ir išryškinama
fermentinė reakcija. Spalvos intensyvumas (optinis tankis) išmatuojamas spektrofotometru. Jis yra tiesiogiai
proporcingas IFNγ koncentracijai. IFNγ koncentracija tiriamuosiuose pavyzdžiuose nustatoma pagal
kalibracinę kreivę. Palyginama, kaip skiriasi IFNγ koncentracija nestimuliuotose ir PHA stimuliuotose
limfocitų kultūrose.

Tiriamieji pavyzdžiai

Darbui naudojami anksčiau paruošti ir užšaldyti limfocitų kultūrų pavyzdžiai. Ruošiant šiuos
pavyzdžius, limfocitai buvo išskirti iš skirtingų donorų periferinio kraujo ir inkubuoti augimo terpėje RPMI
su 10 % fetalinio serumo be stimuliacijos arba su 5 µg PHA. Ląstelių tankis buvo 10 mln/mL. Po 48 valandų
inkubacijos ląstelių augimo terpė buvo surinkta ir užšaldyta. Limfocitų kultūrų pavyzdžiai pažymėti: 1, 2, 3,
4 ir 1s, 2s, 3s, 4s (čia „s“ − PHA stimuliuotų limfocitų kultūrų pavyzdžiai).

Medžiagos ir reagentai

1. Plokštelė, naudojama imunofermentinei analizei.
2. IFNγ standartas (0,2 mg/mL).
3. Monokloniniai antikūnai GIF10 prieš žmogaus IFNγ.
4. Monokloniniai antikūnai GIF3, konjuguoti su peroksidaze (konjugatas).
5. Imobilizacijos buferis (0,05 M Na-karbonatinis buferis, pH 9,5).
6. Buferis PBS (0,05 M K/Na-fosfatinis buferis su 0,15 M NaCl, pH 7,2−7,4).
7. Buferis PBS-T (PBS su 0,1 % detergento Tween-20).
8. Blokavimo buferis (PBS su 1 % albumino).
9. Peroksidazės substratas 3, 3’, 5, 5’ − tetrametilbenzidinas (TMB).
10. 10 % sieros rūgšties tirpalas.
11. Spektrofotometras DigiScan 400 (Assys Hitech).
332

Darbo eiga

1. Monokloninių antikūnų GIF10 imobilizacija: Paruošiamas antikūnų GIF10 tirpalas: 10 µL
antikūnų suspensijos ištirpinama 10 mL imobilizacijos buferio. Į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilama po
100 µL antikūnų tirpalo. Plokštelė inkubuojama 16 valandų +4–8 °C temperatūroje.
2. Blokavimas. Laisvas plokštelės paviršius blokuojamas albuminu. Į plokštelę išpilstoma po 150 µL
blokavimo buferio, inkubuojama 30 min. 37 °C temperatūroje. Po to šulinėlių turinys išpilamas ir plokštelė
tris kartus praplaunama PBS-T buferiu.
3. Standartinių tirpalų paruošimas. Iš IFNγ standarto (0,2 mg/mL), skiedžiant PBS-T buferiu,
paruošiama po 0,5 mL standartinių tirpalų, kuriuose IFNγ koncentracija būtų: 4000, 2000, 1000, 500, 250,
125 ir 62,5 pg/mL.
4. Inkubacija, naudojant standartinius ir tiriamuosius pavyzdžius. Į tris plokštelės eilutes įpilama po
100 µL IFNγ standartinių tirpalų. Į kitus plokštelės šulinėlius įpilama po 100 µL tiriamųjų pavyzdžių.
Kiekvienas pavyzdys mažiausiai dar du kartus įpilamas. Tiriamieji pavyzdžiai neskiedžiami. Plokštelė
inkubuojama 1 valandą kambario temperatūroje. Paskui šulinėlių turinys išpilamas, plokštelė 5 kartus
praplaunama PBS-T buferiu.
5. Inkubacija, naudojant konjugatą. Konjugatas GIF3 atskiedžiamas 1000 kartų PBS-T buferiu. Į
visus plokštelės šulinėlius įpilama po 100 µL konjugato tirpalo. Plokštelė inkubuojama 1 val. kambario
temperatūroje. Po to šulinėlių turinys išpilamas, plokštelė 10 kartų plaunama PBS-T buferiu ir 2 kartus
distiliuotu vandeniu.
6. Fermentinės reakcijos išryškinimas. Į plokštelės šulinėlius išpilstoma po 100 µL substrato TMB
tirpalo. Plokštelė inkubuojama tamsoje 5–10 min., kol išryškėja spalva. Tada fermentinė reakcija
sustabdoma, pridedant po 50 µL sieros rūgšties tirpalo. Sugertis išmatuojama spektrofotometru DigiScan
400, esant šviesos bangos ilgiui 450 nm.
7. IFNγ γγ γ koncentracijos nustatymas ir gautų rezultatų analizė. Išmatavus sugertį spektrofotometru
DigiScan 400, IFNγ koncentracija tiriamuosiuose pavyzdžiuose apskaičiuojama pagal KIM kompiuterinę
programą. Kalibracinė kreivė nubraižoma, ordinačių ašyje atidedant gautas optinio tankio reikšmes, abscisių
ašyje – IFNγ standarto koncentraciją (pg/mL).
Palyginami analizės rezultatai nestimuliuotose ir stimuliuotose limfocitų kultūrose.

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
O
p
t
i
n
i
s

t
a
n
k
i
s
,

4
5
0

n
m
IFNg koncentracija, pg/ml.

0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
O
p
t
i
n
i
s

t
a
n
k
i
s
,

4
5
0

n
m
1 1s 2 2s


IFNγ nustatymas limfocitų kultūrose imunofermentiniu metodu: a) kalibracinė kreivė (pavyzdys), b) imunofermentinės
analizės rezultatai: 1, 2 – nestimuliuotų limfocitų kultūros; 1s, 2s – PHA stimuliuotų limfocitų kultūros (pavyzdys)

Kontroliniai klausimai

- T limfocitai, jų funkcijos, Th1 ir Th2 subpopuliacijų skirtumai;
- citokinai, jų funkcijos, nustatymo metodai.
2.5
4000
333

Literatūra

1. Abbas, A. K.; Lichtman, A. H. Basic immunology. London, W. B. Saunders Co. 2001. 43–47, 87–108.
2. Roitt, I.; Brostoff, J.; Male, D. Immunology. 5th ed. Philadelphia, USA, Mosby. 2000. 14–22, 121–135.

2. Žmogaus alfa-intereferono nustatymas imunoblotingo metodu

Darbo tikslas

Imunoblotingo metodu nustatyti rekombinantinį alfa-interferoną (IFN-α) ląstelių Ps.putida lizate.

Imunoblotingas (dar vadinamas Western blotingu) yra vienas iš imunocheminės analizės metodų.
Naudojant specifinius antikūnus, šiuo metodu galima identifikuoti tiriamąjį baltymą kitų baltymų mišinyje,
pavyzdžiui, ląstelių lizate, kraujo serume ir pan. Todėl imunoblotingas plačiai taikomas medicinoje,
biotechnologijoje ir moksliniuose tyrimuose. Pavyzdžiui, šiuo metodu galima nustatyti virusų, tokių kaip
ŽIV, tymų, hepatito B, C ir kt., baltymus žmogaus kraujo serume ir patvirtinti diagnozę. Be to, šiuo metodu
galima tirti įvairių baltymų, net ir netirpių, ekspresiją ląstelėse – pavyzdžiui, membranoje esančių receptorių
ir pan. Biotechnologijoje šis metodas gali būti taikomas rekombinantinių baltymų ekspresijai tirti.
Baltymai poliakrilamidiniame gelyje atskiriami elektroforezės būdu ir pernešami ant specialios
membranos. Po to membrana inkubuojama su specifiniais antikūnais prieš tiriamąjį baltymą, šiuo atveju
pelės monokloniniais antikūnais prieš IFN-α. Prisijungę antikūnai išryškinami, inkubuojant su antriniais
antikūnais prieš pelės imunoglobulinus, konjuguotais su peroksidaze. Po to pridedamas peroksidazės
substrato tirpalas ir išryškinama fermentinė reakcija. Nusidažiusios baltymo juostelės padėtis turi atitikti
tiriamojo baltymo, šiuo atveju IFN-α, molekulinę masę.

Tiriamieji pavyzdžiai

Darbui naudojami anksčiau paruošti ir užšaldyti ląstelių Ps.putida lizato pavyzdžiai: 1 ir 2. Vienas jų yra
paruoštas iš netransformuotų Ps.putida ląstelių, o kitas – iš ląstelių, transformuotų rekombinantine plazmide,
turinčia IFN-α geną. Pastarajame pavyzdyje yra apie 0,05 mg/mL rekombinantinio IFN-α.

Medžiagos ir reagentai

1. IFN-α standartas (0,1 mg/mL).
2. Monokloniniai antikūnai 9D3 prieš žmogaus IFN-α.
3. Antriniai antikūnai prieš pelės imunoglobulinus, konjuguoti su peroksidaze (NXA 931, Amersham).
4. Polivinildifluorido (PVDF) membrana (Millipore).
5. Standartinės molekulinės masės baltymų rinkinys blotingui (Fermentas).
6. Buferis PBS: 0,05 M K/Na-fosfatinis buferis su 0,15 M NaCl, pH 7,2–7,4.
7. Buferis PBS-T: PBS su 0,1 % detergento Tween-20.
8. Blokavimo buferis: PBS su 1 % želatinos.
9. Peroksidazės substratas 3, 3’, 5, 5’