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METABOLISMO DE AMINOCIDOS: TRANSAMINACIN Departamento de Qumica, facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Nario, sede Torobajo, Cra.

18 calle 50, Pasto- Colombia Realizado el 10 de Noviembre de 2009; entregado el 27 de Noviembre de 2009. RESUMEN

Se realiz la transaminacin del glutamato al piruvato catalizada por la GPT (Transaminasa Glutmico Pirvica), obtenida del hgado de un cuy. El activador de la enzima usado, fue arsenito de sodio y la reaccin se llevo a cabo a 37 C, temperatura a la cual la enzima presenta actividad. Finalmente mediante cromatografa de capa fina se encontr que el anlisis de aminocidos indico la presencia de alanina con lo que se concluy que la transaminacin si se llevo a cabo.

PALABRAS CLAVES: Metabolismo de aminocidos, transaminacin, glutamatopiruvato aminotransferasa. INTRODUCCIN Todos los tejidos tienen cierta capacidad para la sntesis de los aminocidos no esenciales, remodelacin de aminocidos, y conversin de los esqueletos de carbono que no son de aminocidos en aminocidos y en otros derivados que contienen nitrgeno. Sin embargo, el hgado es el sitio principal de metabolismo del nitrgeno en el cuerpo. En etapas de exceso diettico, el nitrgeno potencialmente txico de los aminocidos es eliminado va transaminacin, deaminacin, y formacin de urea; los esqueletos de carbono se conservan generalmente como carbohidratos, va gluconeognesis, o como cidos grasos va sntesis del cido graso. A este respecto los aminocidos caen en tres categoras: glucognicos, cetognicos, o glucognicos y cetognicos. Los aminocidos glucognicos son los que dan lugar a una produccin neta de piruvato o intermediarios del Ciclo del TCA, tales como -cetoglutarato u oxaloacetato, que son precursores de la glucosa va gluconeognesis. Todos los aminocidos excepto la lisina y la leucina son al menos en parte glucognicos. La lisina y la leucina son los nicos aminocidos que son solamente cetognicos, dando lugar solamente a acetil-CoA o a acetoacetil-CoA, ninguno de los cuales puede traer la produccin neta de la glucosa.

Un grupo pequeo de aminocidos comprendidos por isoleucina, fenilalanina, treonina, triptfano, y tirosina dan lugar a precursores de la glucosa y de cidos grasos y as son caracterizados como glucognicos y cetognicos. Finalmente, debe ser reconocido que los aminocidos tienen un tercer posible destino. Durante etapas de hambruna los esqueletos de carbono reducidos se utilizan para la produccin energtica, con el resultado que se oxida a CO2 y H2O. El glutamato es sintetizado a partir de su distribuido ampliamente -ceto cido precursor por una simple 1-paso transamination reaccin catalizada por el glutamato deshidrogenasa. Como se seala en el metabolismo de nitrgeno, el glutamato dehidrogenasa reaccin desempea un papel central en la homeostasis global de nitrgeno Todas las transaminasas utilizan el mismo grupo prosttico, el piridoxal fosfato (una forma

coenzimtica de la vitamina B6), que es transportador temporal del grupo amino. El piridoxal fosfato se enlaza covalentemente con el grupo amino de un residuo de lisina, en ausencia de sustrato (el aminocido). Cuando llega el aminocido, su grupo amino es sustituido por el grupo amino de la

lisina. La nueva base de Schiff que se ha creado queda soldada al sitio activo de la enzima mediante la formacin de uniones mltiples no covalentes. La enzima pierde un protn del carbono , formando un intermediario quinonoide, cuya reprotonacin determina la produccin de una cenitina que presenta una doble unin entre el carbono y el nitrgeno del sustrato enlazado. Una reaccin sucesiva de hidrlisis determina la separacin de un -cetocido y la formacin de piridoxamina fosfato[1]. PROCEDIMIENTO Se extrajo el hgado de un cuy. Se lo coloc en una cpsula de vidrio con 50 mL de solucin buffer fosfato 0,05 M de pH 7,4, en frio. Se pesaron 2 g de hgado y se los coloc en un mortero con 10 mL de buffer fosfato frio, triturando con arena lavada hasta obtener una pasta fina. Una vez mezclado, se centrifug a 7000 r.p.m. durante 10 min. Se tom el sobrenadante (Extracto N 1) y se guardo en un tubo de ensayo sumergido en un bao de hielo. Se tom 2 mL del extracto N 1 y se aadieron 2 mL de cido tricloroactico al 10 %. Se filtr y se tomo el filtrado (Extracto N 2). Luego se tomaron dos tubos de ensayo y se deposit en cada uno de ellos y en orden estricto los siguientes reactivos: Tabla 1. Incubacin reaccin enzimtica Reactivos Tubos 1 (mL) 2 (mL) Arsenito de sodio 0,4 0,4 L- glutamato 0,3 0,3 Piruvato 0,3 0,3 Extracto de hgado 0,1(N 1) 0,1 (N 2) Colocar los tubos en bao mara durante 30 minutos a 38 C. Etanol absoluto 6,0 6,0 Se filtr el contenido de ambos tubos y se realiz el anlisis cromatogrfico de los aminocidos. ANLISIS Y RESULTADOS

La GPT es una enzima con gran concentracin en el en el hgado y en menor medida en los riones, corazn los msculos. Cuando hay una lesin de estos rganos la enzima es liberada a la sangre y aparece elevada en los anlisis [2]. La transaminasa

Glutmico Pirvica (GPT) o Alanina Aminotranferasa (ALT), cataliza la transferencia reversible del grupo amino del glutamato al piruvato. La reaccin que se da es la siguiente:
Glutamato + Piruvato GPT Alanina + 2- oxoglutarato [3]

Como la reaccin es reversible es de esperar que al final del proceso se obtenga los cuatro compuestos, es decir los dos aminocidos y los dos cetocidos. Luego del proceso de extraccin, se tomaron dos tubos en los cuales se coloc el extracto con la enzima puro (Tubo 1) y otro con la enzima pero se agreg adems cido tricloroactico (tubo 2) con el fin de denaturalizar la enzima, ya que la conversin del L- glutamato a alanina se impidi en el sistema 2, mientras que en el otro si sucedi la reaccin, por tanto, en cada sistema hubo un aminoacido distinto el l-glutamato y alanina. En la prctica el arsenito de sodio se empleo para evitar la descarboxilacin oxidativa del piruvato, mientras que el etanol al igual que el acido tricloaroacetico actu como agente desnaturalizante, siendo por tanto el inhibidor de la accin enzimtica en ambos sistemas (la enzima se desnaturalizo ya que es una protena con actividad especfica). Para el proceso de incubacin fue necesario agregar un activador de la enzima, el cual fue el arsenito de sodio. La temperatura a la cual se realiz la incubacin fue 37 C que es la temperatura corporal y a la que la enzima presenta actividad. Finalmente terminado el tiempo de incubacin, se agreg etanol absoluto para detener la reaccin y hacer el posterior anlisis. Para comprobar la presencia de cada uno de los productos de la reaccin, se realiz cromatografa de capa fina. En la cromatografa de capa fina para los aminocidos se obtuvo la siguiente placa

Se determin por cromatografa de capa fina la presencia de aminocidos tras el proceso de transaminacin catalizado por la GPT (Transaminasa Glutmico Pirvica).

cromatogrfica cuando se hizo el revelado con ninhidrina:

estos ltimos estaban muy cercanos y no permitieron la identificacin. Se debe tener en cuenta las condiciones a las que se mantiene la enzima GPT, ya que esta es muy sensible a cambios que pueden haber en el medio. Por esta razn fue necesario mantenerla en fro para evitar la desnaturalizacin de la misma y solo calentar en el momento de realizar la reaccin, sin superar los 37 C que es la temperatura corporal. BIBLIOGRAFA
[1]http://themedicalbiochemistrypage.org/spanish/a mino-acid-metabolism-sp.html [2]http://www.tuotromedico.com/temas/transaminas a_gpt.htm [3]http://www.idcca.com/images/enzimas/gptalt2.pd f

Figura 1 Placa aminocidos.

cromatogrfica

anlisis

Los aminocidos con la ninhidrina formaron un complejo coloreado violeta que se form rpidamente, por ello fue necesario realizar el revelado con esta sustancia para obtener resultados eficientes. Se calcul los Rf de cada una de las muestras sembradas. Los resultados se muestran en la tabla 3. Tabla 3 Rf para las muestras cromatogrfico aminocidos MUESTRA 1 2 3 4 Rf 0,29 0,27 0,29 0,28 anlisis

Las muestras 1 y 2 corresponden a los tubos 1 y 2 a los que se realiz la transaminacin, mientras que las muestras 3 y 4 a los patrones de alanina y glutamato respectivamente. Como se puede mirar en la tabla 3 los valores de Rf de los patrones son bastantes cercanos por lo tanto seria inconveniente diferenciar o asignar a las muestras la presencia de alguno de los dos aminocidos, es decir, puede haber una mezcla de los dos o la presencia de uno de los dos. CONCLUSIONES Con los valores de los Rf en el anlisis de aminocidos no fue posible comparar los valores de los Rf de las muestras con los de los patrones ya que los valores de