FICHES TECHNIQUES TP L3

COLORATION DE GRAM : partir dune colonie dissocie dans une trs petite goutte deau COLORATION DE GRAM : partir dun bouillon : Dposer 1 goutte de bouillon non dilu Raliser un frottis sur une lame : Scher lentement. Flamber lalcool 100 (1 ou 2 gouttes). Recouvrir la lame de violet de gentiane (1 min.). Vider. Recouvrir la lame de lugol (1 min.). Vider. Rincer leau. Dcolorer lalcool 100 : recouvrir la lame 15 s. dalcool 100. Rincer immdiatement leau. Recommencer cette dcoloration si la lame nest pas transparente. Recouvrir la lame deau. Ajouter 4 gouttes de fuchsine (1 min.). Rincer leau. Scher en tamponnant dlicatement la lame avec un papier absorbant. Marquer la lame. EMPLOI DU MICROSCOPE Nettoyer objectifs et oculaires au papier Joseph avant et aprs chaque utilisation. Ne pas coller les yeux sur les oculaires. Lobjectif x 40 ne doit jamais recevoir dhuile. - Lames colores Les bactries sont tues, fixes sur la lame et colores. Condensateur mont jusqu la lame si le microscope le permet. Diaphragme ouvert. Objectif x 100 immersion (avec huile). Pour la mise au point, lobjectif trempe dans la goutte dhuile. Nettoyer au papier Joseph aprs utilisation de lobjectif. - Etat frais Les bactries sont vivantes en bouillon. Dposer une anse de bouillon entre lame et lamelle. Observer labondance, (la forme), le groupement et la mobilit des bactries. Condensateur baiss si le microscope le permet. Diaphragme ferm. Objectif x 40 sec (sans huile). Pour la mise au point, lobjectif est environ 1 mm au-dessus de la lamelle. TECHNIQUES DENSEMENCEMENT DES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE - Milieux liquides Pour tous les milieux liquides, dissocier dans le liquide une colonie prleve avec lanse mtallique. ex : - bouillon trypticase-soja (TS) - milieu de RM/VP (Clark et Lubs) - milieu ure-indole de Ferguson - Milieux solides - en botes de Petri. --> Isolement en quadrant. - glose TS (peptones, NaCl 5%, agar) - milieu de Drigalski (peptone, lactose, bleu de bromothymol, cristal violet, sels biliaires, agar) - milieu de Chapman (peptone, mannitol, rouge de phnol, NaCl 75 g/L, agar) --> Faire une strie. - glose lADN ( peptone, ADN, NaCl 5%, agar). - en tube. Milieu mannitol-mobilit viande-foie Kliger-Hajna Ensemencement Piqre Piqre strie sur la pente + piqre du culot ferm entrouvert entrouvert Bouchon

Fiches techniques

REVELATION ET LECTURE DES MILIEUX DIDENTIFICATION Milieux de Drigalski et de Chapman : lire le mtabolisme des sucres. Lecture test positif test ngatif rouge anneau rose brun fonc rouge rose en 10- tube inclin halo clair jaune bulle paisseur de la glose trouble orange jaune, beige brun clair jaune jaune, beige

Milieu ure-indole

Test urase indole TDA RM VP

Ractif ajouter

Clark et Lubs

Glose lADN MannitolMobilit

0 Kovacs FeCl3 rouge de mthyle 10 gouttes NaOH puis 10 gouttes Naphtol DNAse HC1 Mannitol 0 Gazogne 0 Mobilit 0

rouge paisseur de la glose limpide

TECHNIQUE DE LANTIBIOGRAMME PAR DIFFUSION EN GELOSE - Protocole Prparer la dilution suivante de manire obtenir 106 bactries/mL : - Entrobactrie ou Pseudomonas : - 1 colonie dans 10 mL deau puis 3 gouttes de cette dilution dans 10 mL deau - 1 anse de platine dun bouillon de 18 heures dans 10 mL deau - Streptocoque : 2 colonies dans 10 mL deau - Staphylocoque : colonie dans 10 mL deau Vortexer la suspension. Ensemencer une glose de Mueller-Hinton (MH) prsche par inondation puis raspiration immdiate du surplus. Quand la bote est sche, dposer sa surface avec les distributeurs ou si ncessaire laide dune pince strilise par flambage des disques de papier buvard imprgns dantibiotique que vous espacerez de 3 cm. Laisser la bote 15 min. sur la paillasse (prdiffusion de lantibiotique). Incuber 18 24 heures 37C. - Lecture et interprtation . . 3 , . , . -lactamines la prsence et la nature de la -lactamase (pnicillinase ou cphalosporinase ou absence de -lactamase). Commenter la sensibilit aux sulfamides et au trimthoprime et lassociation des 2 composs.