You are on page 1of 7

21 Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental

XI-025 - COMPARAO ENTRE AS TCNICAS DE TUBOS MLTIPLOS E CROMOGNICA NA ENUMERAO DE COLIFORMES EM GUAS DE PRAIAS

Vera Nobre Braz (1) Qumica Industrial, Mestre em Geoqumica pelo Centro de Geocincias da UFPA. Professora Adjunto IV do Dep de Eng Qumica da UFPA. Pesquisadora nas reas de Qualidade da gua e Controle Ambiental. Consuelo L. Sousa Qumica Industrial, Mestre em Cincias Biolgicas, Professora Assistente do Dep de Eng Qumica da UFPA. Pesquisadora nas reas de Controle Ambiental em gua e alimentos. Maria do Socorro M. Bezerra Estudante do curso de Eng Sanitria da UFPA David Franco Lopes Estudante do curso de Eng Sanitria da UFPA Endereo(1): Rua Oliveira Belo, 488 Belm Par - Brasil CEP 66050-380 - Tel: (091) 211-1115 - e-mail: verabraz@ufpa.br RESUMO Mtodos rpidos de identificao de coliformes totais e fecais vem sendo propostos, o que tem facilitado estudos das mais diversas naturezas, inclusive o de balneabilidade. No entanto, tornou-se necessrio a verificao da correlao entre tais mtodos e o mtodo clssico de anlise de gua, que o de Tubos Mltiplos, para que se tivesse certeza da pertinncia de seu uso em estudos com guas brutas . Foram analisadas 175 amostras na comparao entre Tubos Mltiplos e Colilert e 225 entre Tubos Mltiplos e Meio A1. Ambos apresentaram boa correlao demonstrando a possibilidade de sua utilizao em estudos de balneabilidade na regio Norte PALAVRAS-CHAVE: gua, Praia, Coliformes, Cromognico, Meio A1. INTRODUO A quantidade de gua doce na regio Amaznica vital para a humanidade, sendo necessria a conservao deste bem e portanto, estudos que avaliem suas condies de qualidade a fim de que possam ser preservadas. Em Belm, alm das praias do Mosqueiro, as praias mais procuradas pelos veranistas, quer pela sua beleza ou pela sua proximidade com a capital, so as da ilha do Outeiro e do Distrito de Icoaraci (Braz et al., 1997), que fazem parte do estudo proposto. A pesquisa de microrganismos patognicos na gua, requer procedimentos complexos e longo tempo para obteno de resultados, o que inviabiliza sua aplicao na rotina, alm do que normalmente, encontram-se em nmero reduzido e sua chegada gua intermitente. Portanto, para a avaliao de sua qualidade do ponto de vista bacteriolgico, imprescindvel a utilizao de organismos indicadores de contaminao (Bonde, 1977). Dentre os principais indicadores de contaminao esto os coliformes totais, coliformes fecais, E.coli e estreptococos fecais. Outros indicadores tem sido propostos, e todos apresentam vantagens e desvantagens de aplicao para a avaliao da qualidade sanitria dos ambientes aquticos, no entanto, os padres bacteriolgicos de qualidade da gua a nvel nacional e internacional esto baseados na deteco e enumerao de coliformes totais, coliformes fecais e E.coIi (Conselho Nacional do Meio Ambiente CONAMA. l986; WorId Health Organisation WHO, l987; Environmental Protection Agency- EPA, 1992; APHA. 1995). ABES Trabalhos Tcnicos 1

21 Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental


Os mtodos chamados rpidos surgiram como conseqncia da necessidade de se abreviar o tempo necessrio para a obteno de resultados analticos e de se melhorar a produtividade laboratorial. Alm desses objetivos, esses mtodos visam a simplificao do trabalho e a reduo de custos com meios de cultura e equipamentos. A essas vantagens aliam-se outras como maior sensibilidade e especificidade que os mtodos convencionais. Nos ltimos anos, tem se observado que a rea de mtodos rpidos desenvolve-se de forma acelerada, com o surgimento constante de novos sistemas e instrumentos, destinados aos mais variados tipos de anlise (Franco, 1998). Pela simplicidade e rapidez de processamento, o teste cromognico tem sido implantado em muitos laboratrios bacteriolgicos. Esse teste fornece os resultados em 24 horas e podem ser obtidos nos formatos de presena /ausncia, nmero mais provvel (NMP) e por Unidade Formadora de Colnia (UFC) Membrana Filtrante. O princpio do sistema ou teste cromognico est na definio dos substratos especficos para o grupo ou espcie de microorganismos a ser determinado. Para a determinao de coliformes, utiliza-se o substrato galactopiranosdeo que especfico para uma enzima encontrada nas bactrias desse grupo a D galactosidade. (Heizmann et all, 1988). Vrios trabalhos tm relatado a atividade desses substratos na deteco de coliformes em amostras de gua ( Pellizari, et al., 1993; Trepta & Edberg, 1994 ; Fricker & Fricker, 1996 ). O outro mtodo utilizado, desenvolvido por Andrews e Presnell em 1972, utiliza o meio A1 na tcnica de Tubos Mltiplos para a determinao de coliformes fecais em guas estuarinas, sendo os resultados obtidos em 24 horas. O objetivo deste trabalho foi o de comparar resultados obtidos atravs da tcnica convencional de Tubos Mltiplos (TM) com os obtidos pelas tcnicas cromognica (Colilert) para coliformes totais e a que utiliza o meio A1 para coliformes fecais, em praias de gua doce. Importante ainda que tal comparao seja efetuada em cada regio, pois a caracterstica das guas, condies climticas, e fatores geolgicos, podero alterar a eficincia dos mtodos, diferenciando resultados em cada regio estudada. MATERIAIS E MTODOS AMOSTRAS Foram analisadas 225 amostras provenientes de 15 praias estuarinas de gua doce, localizadas no municpio de Belm-Pa, ao longo de cinco campanhas, constitudas cada uma de cinco coletas consecutivas semanais, durante o perodo de 1998 a 2000. Para comparao entre os mtodos de TM e A1 todas as amostras foram utilizadas e para a comparao entre as tcnicas TM e Colilert apenas 175. A coleta das mesmas seguiu as recomendaes do Stardard Methods (APHA,1995) e da resoluo n 20 do CONAMA (1986). DETERMINAES As anlises foram realizadas com metodologia descrita no Standard Methods (APHA,1995): Tubos Mltiplos. Diluies decimais das amostras foram inoculadas em 5 tubos contendo caldo lactosado e incubadas por 48hs a 35oC; os tubos positivos foram confirmados em caldo lactose verde brilhante bile a 2% e em meio EC por 48 h a 350C e por 24hs a 44,5C respectivamente para coliformes totais e fecais. Cromognico. Foi utilizado o kit Colilert (Idexx/Quanti-tray) o qual detecta coliformes totais e E.coli em amostras de gua atravs da reao com ONPG (o-nitro fenil-beta-D-galactopiranosideo) e MUG (4metilumbeliferil-beta-D-glucoronida) respectivamente. O meio de cultura j vem na quantidade certa para a analise de 100ml de gua, bastando adicionar o contedo de um recipiente a amostra. Este volume

ABES Trabalhos Tcnicos

21 Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental


foi colocado em cartela prpria (quanti-tray), com 97 quadrculas que aps selada foi incubada a 35C por 24hs. Amostras que ficaram amarelas foram consideradas positivas para coliformes totais. Os resultados foram lidos em tabela prpria, fornecida pelo fabricante. Meio A1: Diluies decimais das amostras foram incubadas em 5 tubos de ensaio contendo meio de cultura denominado de meio A1, o qual difere do caldo lactosado pela substituio da triptose por triptona, pela eliminao do sistema tampo fosfato e adio de salicina e triton. Foram seguidas alteraes propostas por tcnicos da Cetesb, com relao a incubao, a qual foi feita a 44,5C em banho maria por 24 horas. A diferena que a tcnica recomenda incubao prvia de 3hs em estufa a 35C e aps em banho maria a 44,5C por 21hs. O resultado foi verificado atravs da leitura dos tubos positivos (produo de gs no tubo de Durhan), na mesma tabela de NMP utilizada para os Tubos Mltiplos.

ANLISE ESTATSTICA Os resultados foram convertidos ao logaritmo na base 10. Para verificar a correlao entre os mtodos, utilizou-se o Teste F de Snedecor com nvel de significncia a 5% (=5%), como recomendado pelo Standard Methods (APHA, 1995) para amostras ambientais. RESULTADOS E DISCUSSES Nas Tabelas 1 e 2 so apresentadas as percentagens de resultados positivos de coliformes totais e fecais, obtidos pela comparao com os resultados de Tubos Mltiplos e Colilert e Tubos Mltiplos e A1 respectivamente. Optou-se pelas faixas de 5x103 para coliforme total e 103 para coliforme fecal pelo fato de se constiturem os limites de balneabilidade para estes dois indicadores. Nas Figuras 1 e 2 verifica-se comportamento semelhante ou seja a tcnica de TM apresentou-se mais sensvel para faixas mais baixas enquanto que as tcnicas do meio A1 e Colilert para faixas mais elevadas. Tabela 1: NMP de coliformes totais obtidos pelas tcnicas dos Tubos Mltiplos e Colilert em 175 amostras de 15 praias Determinaes Tcnicas Tubos Mltiplos (TM) Colilert Faixas NMP < 5x10 NMP < 5x10 NMP 5x10 NMP 5x10 Coliforme Total N % N % N % N % 121 69,14 54 30,86 48 27,43 127 72,57

140 120 100 80 60 40 20 0 NMP< 5x10 faixas NMP > 5x10

N de resultados

TM Colilert

Figura 1: Representao grfica da Tabela 1

ABES Trabalhos Tcnicos

21 Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental


Tabela 2: NMP de coliformes fecais obtidos pelas tcnicas dos Tubos Mltiplos e meio A1 em 225 amostras de 15 praias Determinaes Tcnicas Tubos Mltiplos (TM) Meio A1 Faixas NMP < 10 NMP < 10 NMP 10 NMP 10 Coliforme Fecal N % N % N % N % 120 53,33 105 46,67 106 47,11 119 52,89

125 N de resultados 120 115 110 105 100 95 NMP< 10 Faixas Figura 2: Representao grfica da Tabela 2 NMP >10 TM Colilert

Nas Tabelas 3 e 4 esto apresentados os resultados dos dados estatsticos por pontos de coleta, para coliformes totais e fecais, comparando-se os mtodos analisados. Verificou-se que mais de 50% dos resultados tanto para coliformes totais como para fecais, apresentaram boa correlao (r>0,5). Tabela 3: Dados estatsticos por ponto de coleta para coliformes total (TM x Colilert) Praias N de Mdia Desvio Padro amostras TM Colilert TM Colilert Areio Praia Grande Farol Chapel Virado Porto Artur Murubira Ariramba So Francisco Marah Paraso Barro Branco Praia Grande Braslia Cruzeiro 1 Cruzeiro 2 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 15 15 15 15 15 3,084 3,176 3,519 3,248 3,075 3,235 3,054 3,145 2,600 2,792 3,485 3,428 3,472 4,164 4,169 3,617 3,653 3,900 3,737 4,053 3,811 3,817 3,985 3,686 3,622 3,972 3,824 3,794 4,360 4,571 0,512 0,596 0,874 0,854 0,808 0,817 0,996 0,868 0,514 0,531 0,600 0,549 0,391 0,395 0,634 0,638 0,461 0,427 0,579 0,331 0,421 0,340 0,368 0,297 0,325 0,493 0,399 0,360 0,395 0,419

Correla o (r) -0,705 0,618 0,830 0,516 0,381 0,599 0,492 0,424 0,386 0,832 0,312 0,777 0,374 0,510 0,372

ABES Trabalhos Tcnicos

21 Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental

Tabela 4: Dados estatsticos por ponto de coleta para coliformes fecais (TM x A1) Praias N de Mdia Desvio Padro amostras TM A1 TM A1 Areio 14 2,666 2,753 0,734 0,678 Praia Grande 14 2,468 2,946 0,662 1,140 Farol 14 3,054 2,590 1,321 0,777 Chapel Virado 14 2,833 2,965 0,876 0,705 Porto Artur 15 2,649 2,939 0,632 1,123 Murubira 15 2,831 2,822 1,077 1,126 Ariramba 15 2,853 3,130 1,206 1,035 So Francisco 15 2,773 3,133 0,724 1,061 Marah 15 2,459 2,372 1,140 0,947 Paraso 14 2,453 2,756 0,618 1,135 Barro Branco 16 3,034 3,344 0,587 0,633 Praia Grande 16 2,914 3,112 0,537 0,641 Braslia 16 3,012 2,931 0,401 0,457 Cruzeiro 1 16 3,587 3,586 0,510 0,581 Cruzeiro 2 16 3,652 3,570 0,392 0,518

Correlao (r) 0,751 0,781 0,609 0,403 0,487 0,908 0,864 0,542 0,658 0,496 0,576 0,461 0,396 0,256 -0,322

Nas Figuras 3 e 4 esto representadas graficamente as mdias gerais dos logaritmos dos resultados por pontos de coleta para coliforme total e fecal respectivamente. Os ndices de correlao obtidos foram de: r= 0,824, entre TMx Colilert para coliforme fecal r= 0,762, entre TMxA1 para coliforme fecal

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0


A rth ur M ur ub ira A rir am S o ba Fr an ci sc o M ar ah Pa ra B s ar o ro B ra Pr nc ai o a G ra nd e A re Pr i ai o a G ra nd e l Fa ra do ro

NMP/100mL

r=0,824

TM Colilert
B ra s lia C ru ze iro 1 C ru ze iro 2

ha

Po rto

Vi

Pontos de Coleta

Figura 3: Mdia geral do logaritimo dos resultados de coliforme total (TM x Colilert) por ponto

ABES Trabalhos Tcnicos

21 Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0


Ar ei o G ra nd e

NMP/100mL

r=0,762

TM A1
Ch Fa ap ro u l Vi ra do Po rto Ar th ur M ur ub ira Ar ira S m ba o Fr an ci sc o M ar ah Pa ra Ba s rr o o Br an Pr co ai a G ra nd e Br as li a C ru ze iro 1 C ru ze iro 2

Pr ai a

Pontos de Coleta

Figura 4: Mdia geral do logaritimo dos resultados de coliforme fecal (TM x A1) por ponto

Verificando a significncia dos resultados pelo Teste F de Snedecor, a nvel de 5% conforme Tabela 5, encontram-se os valores de 8,55x10-9 para TM x Colilert e 0,342 para TM x A1, o que comprova a correlao apresentada nas Figuras 3 e 4. Tabela 5: Resultados dos valores obtidos e do Teste F de Snedecor Comparaes TM Colilert TM A1 Dados n= 175 n = 225 Mdia 3,413 3,948 2,925 3,028 Valor mximo 5,477 5,384 6,204 6,204 Valor mnimo 1,301 2,000 0,903 0,041 Desvio Padro 0,764 0,504 0,837 0,890 Mximo calculado 4,177 4,452 3,762 3,918 Mnimo calculado 2,650 3,444 2,087 2,139 Teste F 8,55x10-09 0,342 3,84 3,84 Teste F tabelado p/ n>120 = 5% = 5% CONCLUSES Pelos resultados encontrados, verifica-se boa correlao entre as metodologias testadas, indicando a possibilidade de utilizao dos mtodos rpidos em estudos de balneabilidade e outros de natureza semelhante em guas brutas. Os mesmos estudos devero ser efetuados para guas subterrneas e tratadas, para verificar a pertinncia do uso dos mtodos. Devero tambm ser desenvolvidas anlises comparativas entre os valores de E.coli, obtidos pela tcnica de Tubos Mltiplos e pela tcnica cromognica.

ABES Trabalhos Tcnicos

21 Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental


REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1. 2. 3. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water and wastewater. 19 ed. Washington, APHA, 1995. 1100p. BONDE, G.J. Bacterial indicators of water pollution. Adv. Aquatic. Microbiol., 1: 273 - 364, 1977. BRAZ, V.N., SOUSA, C.L., LOUREIRO, E.C.B., MODESTO, H.S., NUNES, A.B.A. Estudo da balneabilidade em guas de praias da Ilha do Mosqueiro, Belm-Pa. Dados preliminares. In: XIX Congresso Brasileiro de Microbiologia, 11/97, Rio de Janeiro/RJ, Resumo. p. 22. CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE. Resoluo n 20 de 18 de junho de 1986. In: Legislao de Conservao da Natureza, 4 ed., So Paulo, FBCN/CESP, 1986, 720p. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. Federal Register, 57: 24744-24747, 1992. FRANCO, B. D.G.M. Mtodos alternativos de analise microbiolgicos de alimentos CONGRESSO LATINO-AMERICANO DE MICROBILOGIA DOS ALIMENTOS, 5 So Paulo, 1998. FRICKER, E. J. ; FRICKER, C. R. Aternative Approaches to the Detection of Escherichia coli and coliformes in Water. Microbiology Europe. V.4. n.2. p. 16-20. March/April. 1996. HEIZMANN, W.; DOLLER, P.C.; GUTBROD, B.; WERNER, H. Rapid Identification of Escherichia coli by Fluorocult Media and Positive Indole Reaction. Journal of Clinical Miclobiology. V.26.n.12 p.2682-2684. December. 1988. PELLIZARI, V.H.; PEDROSO, D. M. M. KIRSCHNER, C.C.; SILVA, L.A.G.; MARTINS, M. T. Assessment of media using --D-glucuronidase activity for the detection of Escherichia coli in Water.Ver Microbiol. , So Paulo, V.24. n.3. p.182-6, 1993. TREPTA, R.W.; EDBERG, S.C. Methyl lumberliferyl--D-glucuronide-based medium for rapid isolation and identification of Escherichia coli. J.Clin. Microbiol., 19: 26682-2684,1994. WORLD HEALTH ORGANIZATION. The international drinking water supply and sanitation decade: review of mid-decade progress (as at December, 1985). Geneva, WHO, 1987. 25p.

4. 5. 6. 7. 8.

9.

10. 11.

ABES Trabalhos Tcnicos