UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN

ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES

ELECTROFORESIS CON DETERGENTE
I. INDICE: RESUMEN: INTRODUCCIÓN:

Actualmente una de las técnicas preparativas y analíticas más importante que existe es la electroforesis. Desde que Teselius ideó el primer equipo de electroforesis (1903) hasta hoy, la tecnología aplicada a este método de separación ha mostrado grandes avances. El fundamento de este método está basado en la migración de solutos cargados al aplicársele un campo eléctrico. La mayor parte de moléculas biológicas tienen carga eléctrica cuya magnitud depende de la molécula en sí (sus características de tamaño, forma, peso, etc). del pH y de la composición del medio en que se encuentre. La dirección y velocidad del movimiento de estos solutos depende del signo y número de estas cargas. Las moléculas ingresan a los electrodos de polaridad opuesta. Esto es: De tal modo que las moléculas catiónicas (cargadas positivamente) migran al cátodo (electrodo negativo) y las moléculas aniónicas (cargadas negativamente) migrarán al ánodo (electrodo positivo). Ahora bien, la presencia de cargas puede ser debido a la ionización de grupos sobre la molécula del soluto o a la inducción de cargas por el electrolito. El número de cargas debido a grupos ionizables depende de pH del medio y el pK de los grupos individuales. El comportamiento de solutos es muy peculiar, ya que debido a su naturaleza anfotérica (se comportan como ácidos y como bases) pueden migrar hacia el ánodo o hacia el cátodo dependiendo de las condiciones del medio. Al enfrentarnos a un experimento de separación mediante electroforesis debemos preguntarnos a que pH vamos a realizarlo, ya que a la vista de la gráfica la carga de las proteínas es función del pH, en estas condiciones utilizamos la electroforesis con detergentes -condiciones

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La muestra se deposita en forma de un pequeño trazo transversal en la tira. no por su carga. Las placas son reveladas con sales de plata. II. La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un electrolito. azul de Coomassie. La distancia de migración se mide en relación un marcador interno. o reactivos en particular. Según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa. ELECTROFORESIS: La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas. y por lo tanto es el que se ocupa de dar carga a alas proteínas. todas las proteínas cargadas negativamente. que se basa en añadir compuestos que alteren las condiciones nativas de las proteínas y que se agrupan en el llamado tampón de carga que se añade antes de cargar las muestras en el gel y después se incuban a unos 100 ºC durante 4 minutos para que tenga su efecto. MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES desnaturalizantes. dependiendo de la técnica que se use. FUNDAMENTO TEORICO: 1. con la relación q/m constante se consigue que las proteínas se separen por su tamaño. Página 2 . la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica.UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. SDS (dodecil sulfato sódico) es el detergente cargado negativamente. Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que contienen ambos al electrolito y están unidos a los electrodos del generador de corriente.

y compuestos de pequeña masa molecular. Página 3 . Esta técnica permite separar bastante bien biomoléculas. difíciles de estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración en soporte. donde la cromatografía líquida se muestra menos eficaz. MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES FUNDAMENTOS Y CONCEPTOS BÁSICOS: La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha desarrollado gracias a los avances de la cromatografía líquida de alta eficacia junto con los procedimientos más tradicionales de electroforesis.UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies de la muestra en disolución. bajo el efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte (medio de desplazamiento) adecuado. portadoras de una carga eléctrica global. La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica de electroforesis.

El flujo electroosmótico crece con el pH del medio electroforético. La detección por fluorescencia resulta más sensible si se emplea una fuente láser muy intensa. que muestra el registro de la composición de la muestra. 2. MÉTODOS DE DETECCIÓN: En la detección UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a través del capilar en una pequeña zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco. y está lleno de una solución buffer. TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS: 1. Solo las especies que se dirigen hacia el cátodo serán detectadas. Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC) Página 4 . La señal obtenida es la base de la obtención del electroferograma. en el cual el capilar es recorrido por el electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato).UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. o anfótero (carácter ácido y básico). fabricado con un diámetro pequeño (15 a 150µm). El capilar oscila entre 20 y 80cm. básico (borato). Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE) Es el procedimiento de electroforesis más habitual. asociada a menudo a un procedimiento de preformación de derivados de los analitos portadores de un fluoróforo. cerca del compartimiento catódico. Un detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar. MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto en sus extremos.

se desplazan las especies separadas hacia el detector. FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESIS: En general la electroforesis depende directamente del campo eléctrico y este depende de distintos parámetros. Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0.02 unidades de pH. Los oligonucleótidos. poco frágiles. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoeléctrico (al pI su carga neta es nula). bajo el efecto de una presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico. Electroforesis capilar en gel (CGE) Esta es la transposición de la electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. Basándose en la ley de Ohm se tiene que Diferencia de potencial (V): define el campo eléctrico. también conocida como electroforesis en soporte. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución retienen a los compuestos neutros de un modo más o menos eficaz. Isoelectro-enfoque capilar (CIEF) Esta técnica. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que tienen tendencia a migrar sin separación. 4. Página 5 . 3. se pueden separar de este modo. Seguidamente.UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. consiste en crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un anfótero. como es el caso de algunos enantiomeros. El capilar está relleno con un electrolito que contiene al gel. MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES En esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un compuesto catiónico o aniónico para formar micelas cargadas. Se produce un efecto de filtración que ralentiza a las grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de convección o de difusión. por afinidad hidrófilahidrófoba. la velocidad de avance es directamente proporcional a ella.

Se trata de geles porosos. Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migración de las proteínas es un campo eléctrico. Página 6 . en las electroforesis las proteínas mayores son retardadas y se mueven más lentamente a través del gel. Intensidad (I) : cuantifica el flujo de carga eléctrica. otro factor que afecta significativamente a la electroforesis es la temperatura. las muestras. ay que las va frenando el tamaño del poro y las proteínas más pequeñas avanzan más rápidamente. esta es importante puesto que por el efecto Joule el paso de una corriente eléctrica va a producir calor y este es directamente proporcional a la diferencia de potencial y a la resistencia. Por lo tanto. En la figura vemos un típico aparato de electroforesis. es decir si la proteína está pura. Por último. y el gel actúa como filtro molecular. se requieren las técnicas electroforéticas. MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES Resistencia (R): la movilidad de las moléculas es inversamente proporcional a ella. que se desplazarán por calles paralelas al aplicar el campo eléctrico. La electroforesis de proteínas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. ralentizando la migración de las proteínas en función de su relación carga/masa. El gel se encuentra entre dos placas (normalmente de vidrio). La colocación de un peine de electroforesis en la parte superior antes de que la acrilamida gelifique permite la formación de unos pocillos. 2. es necesario controlar de manera estricta la temperatura para que esta no afecte a la muestra desnaturalizándola. Métodos electroforéticos: Para comprobar si la proteína de interés se ha separado del resto.UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. donde se colocarán posteriormente y una vez retirado el peine. se relaciona directamente con la distancia recorrida por las moléculas. cuya porosidad se puede regular en función de la concentración de acrilamida. A diferencia de lo que ocurría en la cromatografía de filtración.

MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES Las muestras de proteína se disuelven en una pequeña cantidad de una solución tampón. que tiñe por completo el gel. Página 7 . El sistema se conecta a una fuente de alimentación y las proteínas migran hacia el polo positivo. Después el gel se saca del recipiente que lo contiene y se incuba en presencia del colorante adecuado (azul de Coomassie).UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. A continuación se destiñe con una disolución de etanol/acético y el gel queda transparente y las bandas de proteínas quedan teñidas de color azul. El tampón de electroforesis cierra el circuito entre el cátodo (+) y el ánodo (-). situado en la base del gel. que hace que la muestra se sitúe en el fondo del pocillo y un colorante azul (azul de bromofenol) de pequeño peso molecular que nos indica migración del frente. que contiene glicerol.

el SDS (dodecil sulfato sódico). Las electroforesis en SDS además de permitir calcular el peso molecular de las cadenas polipeptídicas. y en condiciones desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia de un detergente. que son proteínas de peso molecular conocido que nos permiten determinar el peso molecular de la cadena polipeptídica. nos indican las distintas subunidades que posee la proteína. en condiciones Nativas las proteínas se separan en función de su carga/masa. que se une a todas las proteínas en la misma proporción formando una especie de micela cargada negativamente. Generalmente la proteína interés se analizan incluyendo calles con marcadores moleculares. Página 8 . MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES Existen dos tipos principales de electroforesis. como se muestra en la siguiente figura. El único inconveniente de esta técnica es que el SDS desnaturaliza las proteínas y las proteínas multiméricas se separan en sus subunidades. La gran carga negativa del SDS enmascara la carga intrínseca de las proteínas.UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. El SDS es un detergente aniónico. con lo que éstas se separan solo en función de su masa e independientemente de su carga.

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puede llevarse a cabo en posición horizontal o vertical (dependiendo del tipo de cubeta empleada). puede dividirse en varias en SDS. la proteína está pura (pues solo aparece un banda) y que además posee 2 subunidades de 15000 g/mol (o lo que es lo mismo 15 kDa ) cada una. Como se aprecia en la figura una banda en la Nativa. La siguiente figura nuestra la diferencia entre las electroforesis nativa (NATIVAPAGE) y la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). si la proteína tiene varias subunidades de distinto peso molecular. en la calle 2 se encuentra la proteína sujeta a estudio. o bien en una banda de menor peso molecular. ELECTROFORESIS CON DE DETERGENTE: Generalmente se realiza en placas. De la figura se deduce que. de tal manera que se puede hacer una relación lineal entre el Log del peso molecular de las proteínas y la distancia que recorren en el gel (Rf=distancia de la banda/distancia del frente). si las subunidades poseen el mismo peso molecular.UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES En la calle 1 se encuentran los patrones de peso molecular conocido. 3. aunque lo más habitual (sobre todo para la separación de proteínas) Página 10 .

MIGUEL ANGEL LARREA CESPEDES es el modo vertical.     Castellan. En la figura 2 se muestra en ejemplo del poder de resolución y la reproducibilidad del SDS-PAGE. (2001) Lehninger Principios de Bioquímica. D. de forma que las proteínas tratadas con SDS tienden a presentar relaciones carga/masa idénticas y formas similares. G. Págs. (2003) Análisis Químico: Métodos y Técnicas Instrumentales Modernas. Págs. la mayoría de las proteínas en SDS en la misma proporción.UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMAN ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DR. España. 461-462 Rouessac.) Uso de detergentes como: a. DODECIL SULFATO SODICO BIBLIOGRAFÍA: III. México. la electroforesis de proteínas en un gel de poliacrilamida con SDS separa estas macromoléculas en el orden de sus masas moleculares por los efectos de filtración por geles. Omega. 2 ed. VOET. (1998) Fisicoquímica. La gran carga negativa que le imparte el SDS a las proteínas enmascara a las cargas proteicas a las cargas proteicas intrínsecas. En consecuencia. 123-125 Página 11 . PearsonAdisson Wesley. (DONALD VOET. DODECILSULFATO SDS b. 121-133 Nelson. McGraw Hill. 1. Págs. F. 3 ed.4 g de SDS por gramos de proteína (cerca de 1 molécula de SDS por cada 2 residuos de aminoácidos. JUDITH G. DETERGENTE IONICO SDS c. 2006.El DODECIL SULFATO DE SODIO Un detergente usado con frecuencia en las preparaciones bioquímicas. Los jabones y los detergentes son moléculas antipáticas con un gran poder de desnaturalización proteica . se une con firmeza a las proteínas y las hace asumir una forma cilíndrica. España.