Reaccin en cadena de la polimerasa La PCR es sinnimo de la amplificacin in vitro de molculas de DNA o RNA mediante la reaccin en cadena de la de polimerasa PCR,

(polimeraze chain reaction) sin intervencin de clula alguna, por lo que tambin es conocida como clonacin acelular. El objetivo de esta tcnica es la amplificacin directa de un gen o de un fragmento de DNA o indirecta de un RNA (en este caso, a travs de su DNA complementario o cDNA) presentes en mezclas de muy diversas fuentes, sin necesidad de una purificacin previa de la muestra integra original. Se puede partir de homogenizados, extractos crudos de tejido, sangre completa, mezclas de fragmentos de DNA obtenida con enzimas de restriccin, muestras resultantes de la extraccin y aislamiento de DNA, etc. Principio del mtodo: Es una metodologa resultante de la aplicacin prctica de tres conceptos: Desnaturalizacin del DNA para dar hebras sencillas. Hibridacin especfica de la hebra sencilla con un oligonucletido. Tambin se denomina etapa de templado (entendido como disminucin de temperatura que permite la reasociacin de las hebras sencillas tras la desnaturalizacin trmica). Replicacin de la hebra sencilla por una DNA polimerasa a partir del oligonuclotido anterior como cebador, o polimerizacin. Mediante la aplicacin en forma cclica de estos tres procesos se consiguen mltiples copias del fragmento de cido nucleico en un corto espacio de tiempo. Para la realizacin prctica se precisan en la mezcla de reaccin los siguientes reactivos: Los cuatro dNTPs en exceso, como sustratos para la sntesis de las innumerables copias de DNA para ser reconocidos por la polimerasa deben ir acompaados de Mg. Dos oligonucleotidos de cadena sencilla (coloquialmente, oligos) generalmente sinteticos de 18-30 nt. sus secuencias han de ser complementarias respectivamente a los dos extremos 3 de la region diana, uno en cada hebra, de modo que los oligos puedan ejercer de cebadores para la replicacin de las dos hebras en la region diana. por esta razon no se puede amplificar una region de DNA si no se conoce la secuencia de sus extremos. Un DNA polimerasa termoestable, es decir, enzimaticamente activa a temperaturas relativamente altas (al menos 75C), y establece con frecuencia hasta 95C. Esta caracteristica permite su actuacin en sucesivos ciclos sin inactivarse; ademas la replicacin a temperaturas elevadas impide al formacin de hibridos parcialmente desapareados y contribuye a la especificidad y rendimiento del proceso. La enzimas mas empleadas son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Esta enzima tiene el inconveniente de carecer de la actividad exonucleasa 3 por lo que la frecuencia de errores es superior a la de la replicacin por ello se utilizan la Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Componentes y reactivos

Plantilla de ADN que contiene la regin del ADN (objetivo) para ser amplificados. Dos primers, que son complementarias a las regiones de ADN en el 5 '(cinco primeros) o 3' (tres primeros) extremos del ADN regin. Una ADN polimerasa como Taq polimerasa u otro ADN polimerasa con una temperatura ptima en torno a 70 C. Deoxynucleoside trifosfatos (dNTPs; tambin muy comn y errneamente llamados deoxynucleotide trifosfatos), los bloques de construccin a partir de la cual el ADN polimerasas sintetizan un nuevo filamento de la DNA. Buffer solucin, proporcionando un ambiente qumico adecuado para una ptima actividad y la estabilidad de la ADN polimerasa. Divalente cationes, magnesio o manganeso iones; general, Mg 2 + se utiliza, pero Mn 2 + se puede utilizar para PCR-DNA mediado por mutagnesis, como superior Mn 2 + concentracin aumenta la tasa de error durante la sntesis de ADN Monovalente cin de potasio iones.

La PCR se llev a cabo en un volumen de reaccin de 20-150 l en pequeos tubos de reaccin (0.2-0.5 ml de volumen) en un termociclador. Etapas del proceso: Se requiere un sucesion de ciclos (generalmente entre 20 y 40) de 1.5 - 5minutos de duracin cada uno desde desnaturalizacin, hibridacin y replicacin, para conseguir una enorme amplificacin del numeros de molculas que contienen la secuencia de interes o diana. Cada ciclo de una PCR consta de 3 etapas: 1.- Desnaturalizacion: calentamiento para la separacion de las dos hebras de DNA mediante una incubacion breve (30-120seg) a una temperatura entre 68 y 97C, que debe ser superior a la de fusion (Tm) de la region de DNA que se quiere amplificar. 2.- Templado (o hibridacin) enfriamiento rapido por debajo de Tm de forma que se permite la hibridacin de las hebras sencillas de DNA de interes con los oligocebadores. Generalmente se utilzan temperaturas de 37 65C que se mantienen entre 10 ny 120segundos. 3.- Elongacion (o replicacin) etapa de amplifiacion propiamente dicha (72 a 75C 13minutos) en la que la DNA polimerasa termoestable elonga los cebadores empleando como molde ambas hebras originales. la replicacin transcurre en direccion 5- 3a partir del extremo 3-OH de cada cebador empleando como sustrato los cuatro dNTPs hasta terminar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva etapa de desnaturalizacion (siguiente ciclo). Ademas de las tres etapas de cada ciclo comnmente se aade una etapa previa y otra final al conjunto de todos los cilcos. la previa, a elevada temperatura (incluso superior a la de las etapas de desnaturalizacion) sirve bsicamente para inactiva proteasas y nucleasas de la muestras asi como para asegurar la desnaturalizacion completa del DNA de partida, especialmente si este es de gran tamao o posee regiones muy compactadas (caso de un DNA genomico commpleto). La etapa final, por su parte, consiste en una prolongacin de la ultima elongacion para permitir que se completen todos los fragmentos. Variantes del metodo

Han surgido numerosas modificaciones del metodo basico inicial, con el proposito de mejorar el rendimiento o la especificidad, adaptarse a muestras particulares, amplificar molculas de RNA en lugar de DNA, producir hebras de cadena sencilla. PCR larga. Denominada .-PCR(long PCR), su objetivo es superar los lmites e la PCR convecional para amplificar con fidelidad regienes dianda de gran tamao.El principal factor limitante es la ausencia de actividad correctora de pruebas en la polimerasa Taq, por lo que se aade una cantidad menor de otra enzima con capacidad menor de otra enzima con capacidad de correccin de pruebas para contrastar la carencia de esta actividad y, al mismo tiempo, seguir aprovechando la eficacia de elongacin de la polimerasa principal (Taq similar) PCR anidada. La especificidad puede aumentarse realizando una segunda reacipn de PCR, con los dos cebadores nuevos que hibridan dentro del gragmento diana amplificado por el primer par, dando as lugar a productos de PCR ms cortos, pero ms especficos. Las copias correctas de la primera diana contendrn ambas secuencias complementarias a los nuevos cebadores, a diferenciad de los productos especficos generados en la primeroa PCR , que por ello no resultarn amplificados en la segunda. Este mtodo tambin sirve para aumentar el factor de amplificacin conseguido, al suponer dos rondas de amplificacin.

PCR inversa Se emplea para cllonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posicin vecinal a secuencias diana conocidas. Es decir, luego de amplificar la regin interna, flanqueada por los dos cebadores (PCR convencional), se amplifica la regin externa, que flanquea a los cebadores. Para ello es necesario cortar el DNA a ambos lados de la regin diana con una enzima de restriccin, de tal forma que los extremos cohesivos resultantes pueden hibridra entre si, formando una molcula circular. Esta es cerrada por una ligasa y se realiza la PCR con cebadores que hibridan con los extremos 5 de la secuencia conocida, por lo que la elongacin se exender alrededor del crculo. Se generan copias de un DNA lineal delimitado , como el DNA normal, por la posicin de ambos cebadores. PCR asimtrica Se trata de generar copias de hebra sencilla de un DNA . En la variante ms simple, se aaden cantidades muy diferentes de ambos cebadores, de modo que tras los primeros ciclos de PCR uno de ellos se agota y disponibles ya suficientes copias de DNA diana, slo una de sus hebras sigue amplificndose gracias al cebador ms abundante. RT-PCR: amplificacin de RNA El nombre de PCR con transcriptasa inversa, indica que se trata de una amplificacin de RNA (especialmente mRNA) a travs de la sntesis previa de su cDNA (DNA complementario al RNA), que despus se amplifica por PCR, es decir, no se obtienen copias de RNA de partida, sino de DNA, aunque se conserva obviamente la secuencia de aqul. El mtodo con mayor capacidad de deteccin de los disponibles para la medida de la expresin gnica. Se utiliza preferentemente para amplificar mRNAs de clulas asequibles, con una expresin elevada de ciertos genes.