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Análisis de Lípidos Simples o Neutros

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Cap. 6

Análisis de Lípidos Simples o Neutros
Gliceridos: triglicéridos y que pueden contener mono- y diglicéridos

determinación de gliceridos mediante cromatografía en capa fina isomerización de los glicéridos (presencia de ácido en la fase móvil) impregnar las placas con una disolución de ácido bórico en etanol

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Cap. 6

HC: hydrocarbons, CE: cholesterol esters, TG: Triacylglycerols, FFA: free fatty acids, 1,3-DAG: 1,3-diacylglycerols, 1,2-DAG: 1,2-diacylglycerols, Chol: cholesterol, MG: monoacylglycerols

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Cap. 6

Monoglicéridos
Emulsificantes Determinación de la composición en ácidos grasos en los 2- monoglicéridos Cromatografía en capa fina Análisis de los acidos grasos de la fracción de monoglicéridos Las bandas de monoglicéridos obtenidas tras la elución por TLC son raspadas de la placa y se eluyen con etil éter Los monoglicéridos son metilados y los ácidos grasos metil ésteres resultantes son analizados por cromatografía de gases HPLC
• • • • fase móvil acetonitrilo/ agua acidificada (99/1) columna de fase reversa detector de light scattering (evaporativo de dispersión de luz) separa los distintos 2-monoglicéridos presentes en la muestra
1 = 2-monolinolenina 2 = 2-monomyristina 3 = 2-monolinoleina 4 = 2-monooleina 5 = 2-monopalmitina

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Cap. 6

Diglicéridos
Separación por TLC y posterior análisis de su composición en ácidos grasos (derivatización) Determinación de diglicéridos (derivatización con naproxeno)
• • • • • purificación por TLC análisis por HPLC fase móvil: hexano / isopropanol 99.4/0.6 columna de sílice (fase normal) detector de fluorescencia

A: El segundo pico corresponde a dioleina B: Los tres ultimos picos corresponden a las distintas especies moleculares presentes en la muestra. La cuantificacion se estima midiendo el area de los tres picos y la curva de calibrado del standard.

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Cap. 6

Triglicéridos
Determinados por TLC seguido de derivatización y análisis de los ácidos grasos por GC Determinar triglicéridos directamente mediante HPLC

CE: ésteres de colesterol TG: triglicéridos CHOL: colesterol

Columna: sílice CN Fase móvil: hexano/diclorometano 93/7 Detector evaporativo de dispersion de luz (light scattering)
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Cap. 6

Análisis Estructural de Triglicéridos
Analizar la composición de los acidos grasos del triglicérido en posiciones 1,3 y en posición 2. 2 métodos: A. método químico B. método enzimático Método enzimático: • basado en la selectividad de la lipasa pancreatica de cerdo • simular las condiciones en las que tiene lugar la digestión de lípidos in vivo • la reacción se detiene con la adición de ácido HCl • los lípidos hidrolizados se extraen con éter • purificar la fracción de 2-monoglicéridos mediante TLC impregnada en ácido bórico • la banda de 2-monoglicéridos se raspa y se derivatiza • la composición en ácidos grasos del triglicérido es también determinada tras derivatizacion y análisis mediante GC • composición de cada ácido graso en las posiciones 1 y 3: posición 1,3 = [3 x triglicérido)-(position 2)] / 2

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Cap. 6

Análisis de los Triglicéridos Intactos
Problema muy complejo Separación de triglicéridos en HPLC usando una columna de fase reversa (RP18) Diversas fases móviles Cromatografía con sales de plata y posterior HPLC Ejemplo: • columna fase reversa (RP-18) • fase movil diclorometano/acetonitrilo 45/55 • detector evaporativo de dispersión de luz

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Cap. 6

Número de Átomos de Carbono Equivalente
Relación entre el número de átomos de carbono equivalente (ECN) y el tiempo de retención

ECN = NC − nDB

NC DB

n

número de átomos de carbono del triglicérido número de dobles enlaces presentes en el triglicérido coeficiente de contribución por doble enlace que suele ser cercano a 2.
TAGs RT (min) Log RT CN Tricaprylin (8:0) 2,0696 0,31589 Tricaprin (10:0) 4,1548 0,61855 Trilaurin (12:0) 11,5524 1,06267 Trimyristin (14:0) 21,699 1,33644 Tripalmitin (16:0) 35,3044 1,54783 Tristearin 50,8522 1,70631 1,2-Dioleoyl-3-palmitoyl-rac-glycerol (18:1,18:1,16:0) 32,7428 1,51512 1,2-Dioleoyl-3-stearoyl-rac-glycerol (18:1,18:1,18:0) 37,9958 1,57974 Triolein(18:1) 31,5998 1,49968 1,2-Dilinoleoyl-3-oleoyl-rac-glycerol (18:2,18:2,18:1) 23,1543 1,36463 Trilinolein (18:2) 19,5912 1,29206 Trilinolenin (18:3) 11,4022 1,05699 22,82443 1,3584 52 Palmitin, 2 linolein The regression equation is Log k = - 0.718 + 0.0463 CN - 0.0828 DB Predictor Coef StDev T P Constant -0.7180 0.1032 -6.96 0.000 CN 0.046310 0.002398 19.31 0.000 DB -0.082845 0.008650 -9.58 0.000 S = 0.07029 R-Sq = 97.7% R-Sq(adj) = 97.1% coeficientes CN DB DB 24 30 36 42 48 54 52 54 54 54 54 54 4 0 0 0 0 0 0 2 2 3 5 6 9 2 NUFA 0 0 0 0 0 0 2 2 3 3 3 3 ECN 24,0 30,0 36,0 42,0 48,0 54,0 48,4 50,4 48,6 45,1 43,3 37,9 44,8

2 1,5 1 0,5 0 0,0 20,0 40,0 60,0 y = 0,0463x - 0,718 R2 = 0,9766

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1 -1,78834

Cap. 6

Análisis de Ácidos Grasos por HPLC
Preparación de la muestra
• • Ácidos grasos libres: purificar por TLC, extraccion en fase solida, etc Análisis de ácidos grasos por HPLC:
derivatizacion con distintos cromóforos

ésteres de fenacilo
fluoroforos (bromometilmetoxicumarina) columnas de fase reversa (RP18)

Separación de una mezcla standard de ácidos grasos en forma de ésteres de fenacilo mediante HPLC de fase reversa. Detección espectrofotométrica a 254 nm. Columna (900 x 6.4 mm) µBondapak™ C-18, y las condiciones de elución pasaron de acetonitrilo-agua 76-33 (v-v), a 74:26 en "a", 4:1 en "b", y 97:3 en "c", a un flujo de 2 mL/min.

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Cap. 6

Análisis de Ácidos Grasos por Cromatografía de Gases
Derivatizar la muestra Preparar ésteres metílicos de los ácidos grasos ácidos grasos libres y esterificados: esterificación catalizada por ácidos (HCL, tricloruro de boro, sulfúrico, etc.,) ácidos grasos esterificados: • • • • esterificación catalizada por bases (NaOH, KOH) en metanol columnas con relleno polar como polietilenglicol (Carbowax) identificación de los ácidos grasos se realiza en función de su tiempo de retención predecir el tiempo de retención mezclas Standard de ácidos grasos metil esteres comercialmente disponibles Cromatografía de gases:

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Cap. 6

Métodos Generales para el Análisis de Ácidos Grasos
Concentración de ácidos grasos es superior a 1 mM valoración volumétrica con una disolución de KOH Métodos enzimáticos con acyl coenzima A sintetasa Unión de ácidos grasos a proteínas

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Cap. 6

Análisis de Esteroles
El principal esterol es el colesterol Metodología de análisis depende de la cantidad presente en el extracto Determinación simultánea con otros componentes de la muestra (fosfolípidos, triglicéridos, etc.,) Separar previamente por TLC Los esteroles pueden estar libres y esterificados Saponificar previamente el estracto lipídico con KOH etanólica Estrategias de análisis:
cantidad de esteroles superior a 1 microgramo metodo colorimétrico cantidades inferiores a 1 microgramo HPLC: columnas de fase reversa (RP18) fase movil acetonitrilo/ metanol 50/50 (3 % de agua) detector evaporativo de dispersión de luz (light scattering)

Cuantificar los esteroles esterificados:
• • •
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purificación por TLC analizados por GC transmetilados para conocer su composición en ácidos grasos

Cap. 6

Análisis de vitamina E
Se encuentra en numerosos extractos de origen lipídico Conviene saponificar la muestra primero Coelución de esteroles y tocoferoles en TLC y extracción en fase sólida HPLC fase reversa, fase móvil metanol/agua 98/2, detección UV, fluorescencia o light scattering Adición de un antioxidante Analizar simultáneamente tocoferoles y colesterol, fase normal, fase móvil isoctano/tetrahidrofurano 90/10, detector de fluorescencia para los tocoferoles y detector evaporativo de dispersión de la luz para el colesterol

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