Protokol Pengambilan Gen Keratinase

Pada makalah ini, gen keratinase yang diperoleh bersumber dari bakteri Pseudomonas
aeruginosa yang berada dalam limbah bulu ayam. Dimana keratin itu sendiri dikenal akan
stabilitasnya yang kuat terhadap reagen kimia seperti asam, alkali dan enzim proteolitik umum
seperti tripsin, papain dan pepsin (Mabrouk 2008).

Pertimbangan bahwa keratin pada limbah bulu ayam ini memiliki kandungan protein yang
tinggi, keratin tersebut dapat digunakan sebagai sumber protein dan asam amino untuk pakan
ternak dan aplikasi lainnya. Mikroorganisme yang memproduksi protease keratinase mungkin
memiliki kegunaan penting dalam hidrolisis limbah yang mengandung keratin dari industri kulit
dan unggas, sehingga hal ini merupakan metode alternatif yang menarik dalam biokonversi yang
efisien serta meningkatkan nilai gizi limbah keratin dengan mengembangkan ekonomi yang ramah
lingkungan.

Bahan yang digunakan dalam ekstraksi keratinase yaitu berbagai macam reagen dan bulu ayam.
Reagen – reagen tersebut antara lain : Folin-Ciocalteu, Pyrobest Taq polymerase,
Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), dithiothreitol (DTT), casein, dan beberapa reagen
lainnya. Di samping itu, bulu – bulu ayam yang telah dikumpulkan, dicuci dengan air keran, dan
dipotong – potong menjadi beberapa bagian dengan panjang sekitar 5mm, lalu diautoklaf pada
suhu 121℃ selama 15 menit. Setelah itu, langkah selanjutnya adalah dikeringkan pada suhu 60℃
selama 24 jam. Bulu – bulu yang telah dikeringkan, lalu digiling menjadi bubuk yang akan
digunakan untuk mengisolasi strain dari keratinase pada media agar serta juga digunakan dalam
menentukan aktivitas keratinase.
Langkah – langkah dalam mengekstraksi keratinase :

1. Screening dan Isolasi Strain Bakteri Keratinolitik

Sampel diambil dari limbah bulu ayam yang telah diproses menjadi bubuk. 5 g sampel
ditambahkan ke dalam 100 mL 0,85% larutan saline. Campuran ini yang akan disebarkan
pada media agar selektif yang di dalamnya mengandung (g / L, pH 7.5): bubuk bulu, 20,0;
peptone, 5.0; ekstrak ragi, 5,0; K2HPO4, 1.0; MgSO4 • 7H2O, 0,2; agar, 18. Kemudian
diinkubasi pada 30°C selama 2 hari. Koloni yang membentuk zona hidrolisis diinokulasi
ke dalam media kultur cair pada suhu 30 ° C selama 4 hari pada rotary shaker dengan 180
rpm. Media kultur cair mengandung (g / L, pH 7.5): bulu, 20,0; peptone, 5.0; ekstrak ragi,
5,0; K2HPO4, 1.0; MgSO4 • 7H2O, 0,2. Strain keratinolitik dikonfirmasi dengan tiga cara
yang berbeda, yaitu, penentuan aktivitas keratinolitik menggunakan bubuk bulu sebagai
substrat, pengukuran ukuran zona hidrolisis di sekitar koloni tunggal pada lempeng agar
padat yang mengandung bubuk bulu, dan pengamatan degradasi bulu di pada kultur cair.

2. Identifikasi Morfologi, Biokimia dan Molekul dari Strain Bakteri Keratinolitik

Karakteristik morfologi dan biokimia dari bakteri yang diisolasi dipelajari sesuai
dengan Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Brenner et al., 2004). Identifikasi
 lebih lanjut dari mikroorganisme dilakukan melalui sekuens 16S rDNA. DNA kromosom
diekstraksi dari sel-sel kultur 18 jam menggunakan metode CTAB (Xu et al., 2007). 16S
rDNA diamplifikasi oleh PCR menggunakan pengendara sepeda termal DNA (Prisma,
MWG-Biotech). Primer 16S rDNA bakteri yang digunakan untuk amplifikasi gen dan
sekuensing adalah 8f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCCCCC-3 ') dan 1492r (5'-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’). Setelah denaturasi awal pada 98°C selama 5 menit,
reaksi PCR dilakukan menggunakan Pyrobest Taq polimerase. Kondisi untuk setiap siklus
adalah sebagai berikut: denaturasi pada 95°C selama 35 detik, annealing pada 55 ° C
selama 35 detik, dan ekstensi pada 72°C selama 90 detik. Langkah ekstensi terakhir selama
8 menit pada 72°C dilakukan pada akhir 35 siklus. Produk PCR yang diamplifikasi
disekuensing oleh Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Urutan nukleotida dari produk
PCR yang diperbesar dibandingkan dengan sekuens-sekuens lainnya yang disimpan di
Genbank melalui program online BLAST (alat pencarian keselarasan lokal dasar). Urutan
gen kemudia diselaraskan dengan menggunakan perangkat lunak penyelarasan multi-
urutan.

3. Estimasi Protein dan Penentuan Aktivitas Keratinolik

P. aeruginosa dikultur pada 30°C selama 4 hari pada pengocok putar pada 180 rpm
untuk produksi protease keratinolitik. Media biakan (g/L, pH 7,5) dilengkapi dengan bubuk
bulu, 30; trypton, 5; MgSO4, 0,1; ekstrak ragi, 5; K2HPO4, 1 dan air suling. Konsentrasi
protein ditentukan pada 750 nm menurut metode Lowry (Scopes 1982) menggunakan
bovine serum albumin (BSA) sebagai standar. Aktivitas keratinolitik ditentukan secara
spektrofotometri menggunakan metode Folin-Ciocalteu yang dimodifikasi (Margesin et al.,
1991). Larutan enzim (0,5 ml) diinkubasi dengan 1% (b / v) bubuk bulu (1,5 ml), dalam 50
mmol / L barbital / HCl buffer (pH 7.5) pada 50 ° C selama 2 jam. Reaksi diakhiri dengan
3 ml asam trikloroasetat 10% (b / v) (TCA) dan kemudian reaktan dibiarkan selama 30
menit. Setelah sentrifugasi pada 10.000 × g selama 10 menit, 1 ml supernatan ditambahkan
dengan 5 ml 0,55 mol / L Na2CO3 dan 1 ml reagen Folin-Ciocalteu, dan kemudian
campuran diinkubasi pada 40 ° C selama 15 menit. Aktivitas keratinolytic diukur pada 750
nm dengan 721 spektrometer terlihat (Cina). Satu unit aktivitas keratinolytic (U)
didefinisikan sebagai peningkatan 0,01 OD pada 750 nm dalam 1 jam.

4. Pemurnian Keratinolitik Protease

Supernatan kultur diperoleh dengan sentrifugasi pada 10.000 × g selama 5 menit,
kemudian amonium sulfat padat secara bertahap ditambahkan ke saturasi 30%. Endapan
yang terbentuk dihilangkan dengan sentrifugasi pada 10.000 × g selama 5 menit. Setelah
penambahan lebih lanjut dari amonium sulfat padat menjadi supernatan hingga 50%
saturasi, endapan yang dihasilkan dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 10.000 × g
selama 5 menit. Endapan yang dikumpulkan dilarutkan dalam buffer Tris-HCl (25 mM,
pH 7.8), didialisis dengan 10 mM dari buffer yang sama selama 24 jam, dan terkonsentrasi.
 Langkah pemurnian berikutnya dari sampel pekat dilakukan melalui kolom gel filtrasi
Sephadex G-75 yang disetimbangkan dengan 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8). Fraksi aktif
keratinolitik dielusi dengan buffer yang sama, dikumpulkan dan terkonsentrasi. Zat yang
tidak larut dihilangkan dengan sentrifugasi pada 10.000 xg selama 5 menit, dan sampel
diaplikasikan pada kolom fast flow DEAE sepharose yang disetimbangkan dengan 10 mM
Tris-HCl buffer (pH 7.8). Elusi dilakukan dengan gradien linier dari buffer Tris-HCl (10
mM, pH 7.8) yang mengandung NaCl dari 0 hingga 0,5 M. Fraksi yang memiliki aktivitas
keratinolytic dikumpulkan dan terkonsentrasi. Fraksi aktif yang dielusi dari kolom DEAE
sepharose fastflow digunakan untuk analisis aktivitas keratinolitik. Semua langkah
pemurnian dilakukan pada 4 ° C. Untuk menguji kemurnian dan menentukan berat molekul
enzim, terputusnya elektroforesis gel dodekil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE)
dilakukan dengan 12% gel poliakrilamida seperti yang dijelaskan (Laemmli et al., 1970).
Pita protein diwarnai dengan larutan Coomassie blue R-250.

5. Pengaruh pH dan Suhu pada Aktivitas dan Stabilitas Keratinolitik

PH optimal untuk aktivitas keratinolytic ditentukan selama rentang pH 6.0-9,5. Untuk
menentukan stabilitas pH, enzim yang dimurnikan itu dipreinkubasi dalam buffer pada
rentang pH 3,0-11,0 pada 50°C selama 60 menit. Asam sitrat / buffer natrium fosfat
digunakan untuk pH antara 3,0 dan 7,5; barbital / HCl untuk pH antara 7,0 dan 9,0 dan
buffer natrium karbonat untuk pH antara 9,0 dan 11. Suhu optimal untuk protease
keratinolitik puri ditentukan selama rentang 40–70 ° C di barbital buffer (pH 7,5). Untuk
menentukan termostabilitas, enzim-enzim itu diinkubasi di barbital buffer (pH 7.5) pada
suhu di atas kisaran 50-80°C.

6. Pengaruh Ion Logam, Aditif dan Inhibitor Protease pada Aktivitas Keratinolitik
Protease dimurnikan yang preincubated di barbital buffer (pH 7,5) pada 30 ° C selama
10 menit dengan Ca2 +, Mg2 +, Mn2 +, Co2 +, Cu2 +, Zn2 +, Hg2 +, Pb2 +, Fe2 +, Li +,
ethylenediaminetetracetic acid (EDTA), 2-mercaptoethanol, dithiothreitol (DTT) dan
phenylmethylsulfonyl fuoride (PMSF) pada 2,0 dan 10 mM, dan dengan gycerol dan
dimethyl sulfoxide (DMSO) pada 1% dan 5% (v / v). Aktivitas kontrol tanpa penambahan
aditif diambil sebagai 100%.

Protokol Memasukkan Gen ke Dalam E.coli

Langkah – langkah tranformasi gen ke dalam Escherichia coli.

1. Kloning dan Sekuensing Gen keratinase

DNA genom diekstraksi dari P. aeruginosa KS-1 yang sebelumnya diisolasi menggunakan
kit persiapan DNA genom. Primer dirancang sesuai dengan keselarasan lengkap antara
urutan peptida yang diperoleh setelah analisis MS keratinase dari strain liar dengan
database protein fungsional P. aeruginosa. Urutan sinyal diidentifikasi menggunakan
 server SignalP (Versi 3.0) dan primer disintesis tanpa urutan sinyal. Urutan primer maju
bersama dengan situs EcoRI adalah 5′-GCGAATTCGAATTGGCCAACA-3 ′ dan primer
terbalik dengan situs BamHI adalah 5′-CGGGATCCATGAAGAAGGTT-3 ′. Kondisi
PCR terdiri dari denaturasi awal pada 95°C selama 4 menit diikuti oleh 30 siklus 95 ° C
selama 30 detik, 43 ° C untuk 1 menit dan 72 ° C untuk 45 detik, dan perpanjangan akhir
10 menit pada 72 ° C. Produk PCR diikat dengan vektor mudah pGEM-T dan diubah
menjadi sel E. coli DH5α yang kompeten. Koloni positif disaring oleh PCR koloni.

2. Ekspresi Rekombinan Keratinase Ker P

Vektor ekspresi, pEZZ 18 (GE HealthCare Science, India) digunakan untuk ekspresi
ekstraseluler pada E. coli. Ini digariskan oleh pencernaan ganda dengan EcoRI / BamHI
pada 37 ° C selama 4 jam diikuti oleh elusi gel. Kerusakan gen keratinase diperoleh setelah
pencernaan ganda pGEM-T-Ker P dengan EcoRI / BamHI diikat semalam ke dalam
lineized pEZZ 18 menggunakan T4 DNA ligase pada 16 ° C. Plasmid yang dihasilkan
diubah menjadi sel E. coli HB101. E. coli rekombinan dengan pEZZ 18-Ker P
dibudidayakan dalam medium LB yang dilengkapi dengan 100 µg ampicillin / ml pada 37 °
C, 300 rpm. Setelah 18 jam inkubasi, sel-sel dipisahkan dengan sentrifugasi pada 7400 × g
selama 10 menit dan ekspresi diperiksa dalam kaldu ekstraseluler dengan tes keratinase
dan analisis SDS-PAGE. E. coli HB101cells hanya menyimpan pEZZ 18 tanpa insert
diproses dengan cara yang sama dan diambil sebagai kontrol.

3. Pemurnian rekombinan keratinase Ker P

Supernatan kultur dipekatkan sepuluh kali menggunakan ultrafiltrasi oleh 10 kDa kaset
cut-off molekul. Retentat diaplikasikan pada kolom IgG-Sepharose yang pra-ekuilibrasi
dengan TST (50 mM Tris / HCl buffer, pH 7,6, 150 mM NaCl dan 0,05% Tween 20).
Kolom kemudian dicuci menggunakan 5 mM amonium asetat, pH 5,0 dan protein terikat
dielusi menggunakan 0,5 M asam asetat, pH 3,4. Fraksi tak terikat yang memiliki aktivitas
keratinase utama juga dimurnikan oleh kolom Q-Sepharose yang pra-ekuilibrasi dengan 10
mM Tris / buffer HCl, pH 8. Kemurnian dikonfirmasi oleh SDS-PAGE.

4. Aktivitas keratinase dan estimasi protein

Aktivitas keratinase ditentukan seperti yang dijelaskan oleh Ramnani et al. (2005)
dengan bulu ayam sebagai substrat. Campuran assay yang mengandung 1 ml enzim yang
diencerkan dengan tepat, 4 ml glisin / buffer NaOH (50 mM, pH 9), dan 20 mg bulu
diinkubasi pada 60 ° C selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 4 ml 5% (b
/ v) asam trikloroasetat, diikuti dengan menahan pada suhu kamar selama 1 jam. Residu
bulu dan tidak larut dipindahkan dengan penyaringan melalui glass wool, dan filtrat
disentrifugasi pada 7400 × g selama 5 menit. Kontrol enzim disiapkan dengan cara yang
 sama kecuali bahwa 1 ml 5% (b / v) asam trikloroasetat dan 3 ml buffer ditambahkan bukan
buffer 4 ml dalam sampel uji. Produk proteolitik dalam supernatan ditentukan oleh
absorbansi pada 280 nm terhadap kontrol (enzim dan kontrol substrat). Peningkatan
absorbansi 0,01 dianggap sebagai aktivitas enzim 1 U / ml. Total kandungan protein
diperkirakan dengan metode Lowry.

5. Karakterisasi Keratinase Ker P

Karakterisasi dilakukan pada pH 9,0 (Tris / HCl, 50 mM) dan 50 ° C menggunakan
enzim yang diencerkan secara tepat. Berbagai inhibitor, PMSF, EDTA, asam bromoasetat,
1,10-fenantrolin, asam benzoat p-chloromercuric, inhibitor tripsin, DTT, asam iodoasetat
dan β-mercaptoethanol, pada 5 mM diinkubasi dengan enzim. Kegiatan ini dinyatakan
dalam bentuk aktivitas persentase residual terhadap kontrol tanpa inhibitor yang diambil
sebagai 100%.

Kesimpulan :

 Gen keratinase yang diperoleh bersumber dari bakteri Pseudomonas aeruginosa yang
berada dalam limbah bulu ayam. Dimana keratin itu sendiri dikenal akan stabilitasnya yang
kuat terhadap reagen kimia seperti asam, alkali dan enzim proteolitik umum seperti tripsin,
papain dan pepsin.
 Digunakan vector ekspresi pEZZ 18 (GE HealthCare Science, India) sebagai sarana
rekombinan keratinase Ker P dalam Escherichia coli.

Refrensi :
Sharma R, Gupta R (2010). Extracellular expression of keratinase Ker P from Pseudomonas
aeruginosa in E. coli. Biotechnol. Lett., 32: 1863-1868.
(PDF) Isolation and characterization of a keratinolytic protease from a feather-degrading
bacterium Pseudomonas aeruginosa C11. Available from:
https://www.researchgate.net/publication/262567899_Isolation_and_characterization_of_a_kerat
inolytic_protease_from_a_feather-degrading_bacterium_Pseudomonas_aeruginosa_C11
[accessed Oct 14 2018].