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Endonucleases de

restrição

Tesouras da Natureza
• As enzimas de restrição, só se encontram em
seres procariontes.

• Reconhecem e degradam o DNA de


organismos exógenos.

• As bactérias enfrentam, apesar de não


possuírem sistema imunitário, a invasão de
DNA exógeno há milhões de anos e
desenvolveram estas enzimas como
mecanismos de protecção que preservam o
seu próprio DNA enquanto destroem o DNA
invasor.
EXEMPLO:
• As endonucleases de restrição são
classificadas em três tipos: I,II e III.

• As endonucleases de tipo II são as mais


interessantes para os biólogos
moleculares. Não precisam de ATP para
trabalhar e, mais importante, quase todas
actuam em sequências simétricas e
cortam dentro dessa sequência.
• As sequências específicas têm usualmente 4 a
6 pares de bases de DNA, cortando as ligações
açúcar- fosfato do DNA.

• Geralmente a sequência-alvo é um palíndromo,


pois é lida simetricamente, isto é, de 5’→3’ nas
duas cadeias. A sequência a seguir apresentada
é a sequência de reconhecimento da EcoRI,
endonuclease de restrição isolada a partir da E.
coli.

5’ N-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-N 3’
3’ N-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-N 5’
A EcoRI reconhece e corta o DNA no
mesmo local nas duas cadeias.

5’ N-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-N 3’
3’ N-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-N 5’
Assim, quando se separa o DNA cortado
pela EcoRI obteremos extremidades
chamadas coesivas ou adesivas (corte
assimétrico) porque se podem sobrepor
novamente.

5’ N-N-N-G 5’ A-A-T-T-C-N-N-N 3’
3’ N-N-N-C-T-T-A-A 5’ G-N-N-N 5’
• Nem todas as enzimas de restrição produzem
extremidades coesivas. Algumas fazem cortes
simétricos resultando extremidades denominadas
abruptas ou rectas.
A sequência a seguir apresentada é a sequência de
reconhecimento da SmaI, endonuclease de
restrição isolada a partir da Serratia marcescens.

5’ N-N-N-N-C-C-C-G-G-G-N-N-N-N 3’
3’ N-N-N-N-G-G-G-C-C-C-N-N-N-N 5’
Neste caso, o resultado é:

5’ N-N-N-N-C-C-C 5’ G-G-G-N-N-N-N 3’

3’ N-N-N-N-G-G-G 5’ C-C-C-N-N-N-N 5’

• Em conclusão, da especificidade da sequência


de determinada molécula de DNA, cada enzima
de restrição gera um conjunto único de
fragmentos.
• Outros exemplos de endonucleases de
restrição:
M

• Quais as enzimas que produzem:


a) Extremidades abruptas?
b) Extremidades coesivas?
• A disponibilidade de tal ampla gama de enzimas
serve para os pesquisadores, como ferramenta
das mais variadas aplicações biotecnológicas,
tais como na indústria farmacêutica, na
agricultura e na medicina, entre outras.

• Dentre os exemplos mencionados, as


endonucleases que produzem fragmentos de
DNA com extremidades coesivas são uma das
pedras angulares da tecnologia do DNA
recombinante.
• Nesta aula iremos utilizar ferramentas básicas de Bioinformática.

• A Bioinformática deu os primeiros passos com o Projecto do Genoma


Humano em 1987 e surge actualmente como a pedra basilar da Bioquímica
e da Genética.
• A Bioinformática consiste no depósito e análise de sequências genéticas
em bases de dados e consequente manipulação e análise destas
sequências com a utilização de ferramentas (software) específicas.
• As sequências (de DNA ou de proteínas) que são determinadas de novo
podem ser comparadas com as já existentes nos bancos de dados, sendo
efectuada uma busca de similaridades e de sequências homólogas.
Sequências de DNA que codificam proteínas podem ser traduzidas, por
meio de software adequado e disponível livremente, e a sequência de
aminoácidos resultante pode ser também comparada com outras. Relações
filogenéticas podem, então, ser estabelecidas entre genes ou proteínas
homólogas em diferentes organismos.
Através da Bioinformática é possível:

 realizar diagnósticos clínicos


 desenvolver novos e altamente
específicos produtos farmacêuticos
 estudar e controlar surtos
epidémicos.

Por outro lado a Bioinformática é a


ferramenta da globalização da Ciência, ou
seja, do armazenamento, organização,
integração e gestão de bases de dados
universais.
• Como aplicação deste assunto os alunos
irão resolver a ficha de trabalho que a
seguir se apresenta, utilizando
ferramentas básicas de Bioinformática.