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MTODOS CROMATOGRFICOS

INTRODUCCIN
La Cromatografa es una tcnica de anlisis qumico utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas. Esta tcnica depende del principio de adsorcin selectiva. La cromatografa fue descubierta por el botnico ruso, de origen italiano, Mijal Tswett en 1906, pero su uso no se generaliz hasta la dcada de 1930.
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En general, se emplea una fase estacionaria y una fase mvil. Las separaciones estn basadas en las diferencias en la velocidad de migracin, entre los componentes de la muestra. La fase mvil puede ser lquida o gaseosa. Tswett separ los pigmentos de las plantas (clorofila), vertiendo extracto de hojas verdes en ter de petrleo, sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta.

CLASIFICACIN
Cromatografa en columna La fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase mvil es forzada a pasar a traves del tubo, bajo presin o por gravedad. Cromatografa planar La fase estacionaria est sostenida por una placa plana o en los poros de un papel, la fase mvil se mueve por capilaridad o gravedad.
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Clasificacin general
Cromatografa lquida (CL)

Mtodo especfico
Lquido-lquido, o particin

Fase estacionaria
Lquido adsorbido sobre un slido

Tipo de equilibrio
Particin entre lquidos inmisciles

Lquido-fase unida

Especies orgnicas unidas a una superficie slida


Slido

Particin entre lquido y superficie unida


Adsorcin

Lquido slido o adsorcin Intercambio de iones Exclusin por tamaos

Resina de intercambio inico Liquido en intersticios de un slido polimrico

Intercambio inico

Particin/tamizado

Clasificacin general
Cromatografa gaseosa (CG)

Mtodo especfico
Gas-lquido

Fase estacionaria
Lquido adsorbido sobre un slido

Tipo de equilibrio
Particin entre gas y lquido

Gas-fase unida

Especies orgnicas unidas a una superficie slida


Slido

Particin entre lquido y superficie unida


Adsorcin

Gas-slido

Cromatografa fluida supercrtica (CFS)

Especies orgnicas unidas a una superficie slida

Particin entre fluido supercrtico y superficie unida

Seal en el detector

tiempo
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VELOCIDADES DE MIGRACIN DE LOS SOLUTOS

En la separacin de solutos, la efectividad de la columna cromatogrfica, depende en parte de las velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. Estas velocidades son determinadas, a su vez, por las relaciones de particin de los solutos entre las dos fases.
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Relaciones de particin
La separacin se basa en diferencias del grado de distribucin, de los solutos, en la fase mvil y la estacionaria. Para una especie A Amvil Aestacionaria
La constante de equilibrio K para esta reaccin se llama relacin de particin o coeficiente de particin.
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Coeficiente de particin
K = Cs / Cm
En donde: Cs =concentracin molar analtica de un soluto en la fase estacionaria Cm= Concentracin analtiva en la fase mvil Idealmente, la relacn de particin es constante en un intervalo amplio de concentraciones de soluto; Cs es directamente proporcional a Cm.
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Tiempo de retencin
tR

tM

tM = tiempo muerto tR = tiempo de retencin

Velocidad lineal promedio de migracin del soluto, v v = L / tR L = longitud del empaque en la columna Velocidad lineal promedio, u, de las molculas de la fase mvil u = L / tM 11

La velocidad de migracin de un soluto es funcin de la relacin de particin as como una funcin de los volumenes de las fases estacionaria y mvil.

v = u

_____1_____ X1+ KV / V S M

_____1_____ = fraccin de tiempo en el que el soluto 1+ KVS / VM transcurreen la fase mvil


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Factor de capacidad
Parmetro experimental, se emplea para describir las velocidades de migracin de solutos en columnas. En una especie a el factor de capacidad es kA
kA = KA VS VM v=uX 1 _ 1+ kA
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v=uX

1 _ 1+ kA

v = L / tR u = L / tM L / tR = L / tM X
1 _ 1+ kA

kA =

tR tM tM

tR y tM se obtienen a partir de un cromatograma Cuando kA es <1 la elucin es rpida. Cuando kA > 20-30 los tiempos de retencin son largos Cuando kA esta entre 1 y 5, la separacin es ideal.
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Los factores de capacidad (k),en la cromatografa gaseosa se pueden variar cambiando las temperaturas y el empaque de la columna. En la cromatografa lquida los factores de capacidad (k) pueden manipularse, variando la composicin de la fase mvil y de la fase estacionaria.
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Factor de selectividad (velocidades relativas de migracin)


=KB / KA = kB / kA
KA es la relacin de particin de la especie que es eluida ms rpidamente. kB y kA son los factores de capacidad para B y para A, cuya sostitucin, con respecto a tiempos tenemos:
(tR)B tM = (tR)A - tM

Esta expresin puede detrminarse a partir de un cromatograma experimental.


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Eficiencia de la columna
N= L/H H =altura de un plato N =numero de platos tericos L =longitud del empaque de la columna La eficiencia de las columnas se incrementa a medida que se hace mayor el N y a medida que H se hace menor.
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Altura de plato, H
La eficiencia de la columna se refleja en la anchura de los picos cromatogrficos. H = 2 / L
(L - 1) (L + 1)

= LW / 4tR

= desviacin estandar 2 = varianza


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Numero de platos, N
A partir de un cromatograma se puede determinar N
tR tM W tiempo N = 16 tR W
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tM = tiempo muerto tR = tiempo de retencin

W= anchura del pico en su base, en unidades de tiempo


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Variables que afectan la eficiencia de la columna Velocidad de flujo de la fase mvil.


El grado de ensanchamiento de la banda depende del tiempo en que la fase mvil est en contacto con la fase estacionaria. La eficiencia mxima de la cromatografa de liquidos, ocurre a velocidades inferiores que las requeridas para la cromatografa de gases. Las columnas en CG pueden tener una longitud de 50m o ms, mientras que las de CL no pueden ser ms largas de 25-50cm, debido a la elevada presin de las gotas sobre ellas.

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Otras variables
Si se disminuye el tamao de la particula del empaque se incrementa la eficiencia de la columna, empleando capas ms delgadas de la fase estacionaria y abatiendo la viscisidad de la fase mvil.
0.6-0.8mm

Altura De plato
0.1-0.15mm 5 Velocidad lineal cm/s 20

El incremento de la temperatura tambin reduce el ensanchamiento de la banda en la mayora de los casos.


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RESOLUCIN DE COLUMNAS
Medicin cuantitativa, en una columna, de la capacidad para separar analitos. Rs=
2Z WA + WB

2((tR)B (tR)A) WA + WB

La resolucin para una fase estacionaria dada se puede mejorar alargando la columna, incrementando el numero de platos, sin embargo, se requira ms tiempo para la resolucin.
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Resolucin
A B

Rs= 0.75

//
A B

Rs= 1

// (tR)A tM // //

Z
A

Rs= 1.5

WA

WB

Tiempo

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APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA
La cromatografa es una herramienta para la separacin de especies quimicas estrechamente relacionadas. Puede emplearse para la identificacin cualitativa (presencia o ausencia de componentes) y la determinacin cuantitativa (comparacin con estandares) de especies separadas.
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Anlisis cuantitativo
Altura de pico.
Debe controlarse la temperatura de la columna la velocidad del eluyente la velocidad de inyeccin Errores relativos del 5-10%

Area de pico.
El area de pico es inependiente de los efectos de las variables anteriores Es ms satisfactorio y las areas se determinan facilmente

h
W a

Para picos simetricos A= h*a

Calibracin con estandares Mtodo de estandar interno


Mayor presicin, el pico del estandar debe estar separado pero cercano al pico del analito Error relativo 0.5-1%
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CROMATOGRAFA DE GASES
Jeringa Regulador de presin Inyector Detector Registrador Electrmetro O puente

Suministro del gas acarreador

Columna

Sistema de adquisicin de datos

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Suministro de gas acarreador


El gas debe ser quimicamente inerte. He, Ar, N2 e H2. Se contienen en tanques presurizados. Se requieren reguladores de presin, calibradoresy medidores de flujo para controlar la velocidad. Presiones de entrada: 0.7 3.5 Kg /cm2 Velocidad de flujo: 25-50 mL/min.
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Inyeccin de muestras
La inyeccin lenta o en cantidad exesiva causan el ensanchamiento de la banda y una resolucin pobre. Se utilizan microjeringas calibradas para inyectar muestras liquidas o gaseosas. El inyector debe mantenerse a una temperatura alrededor de 50C por arriba del punto de ebullicin del componente menos voltil. Para columnas empacadas normales el tamao de muestra oscila desde decimos de L a 20 L. Las columnas capilares requieren menor cantidad de muestra.

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Columnas tubulares abiertas, capilares


Son fabricadas de vidrio o slice fundida, tienen diametros interiores de 0.25 a 0.50mm y longitudes de 25 a 50m. La fase estacionaria se encuetra fija en la superficie interna. Los capilares de silicio tienen paredes ms delgadas que los tubos metlicos, y estan recubiertos de poliimida lo que le da mayor resistencia. Por ser flexibles y fuertes, pueden enrrollarse en bobinas. La mayor ventaja de stas columnas es su mnima tendencia a adsorber molculas de analitos.
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Termoesttica
L atemperatura de la columna debe controlarse (hasta en dcimos de grado) para reproducir los tiempos de retencin. La columna embobinada se guarda en una estufa de temperatura ajustable. La temperatura depende de los puntos de ebullicin de los componentes de la mezcla. Para mezclas con intervalos amplios de puntos de ebullicin, es necesario un programa para el control de temperatura. La resolucin ptima se da a bajas temperaturas, pero resultan tiempos de elucin largos.

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Efecto de la temperatura sobre los cromatogramas


1 2 3 4

Isoterma a 45C

x4

5 6

7 8

Isoterma a 145C

3 1 2

4 5 6 8 7

Programa de 30 a 180C
tiempo, min temperatura, C
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|0 |0

10| |60 |90

20| |120 |150

30| |180

Detectores
1. CARACTERSTICAS DEL DETECTOR IDEAL El detector ideal en cromatografa de gas tiene las siguientes caractersticas: Sensibilidad adecuada: Lo que constituye la sensibilidad adecuada no puede describirse en trminos cuantitativos. En general, las sensibilidades de los detectores actuales estn en el rango de 10-18 a 10-15 g de analito/s. Buena estabilidad y buena reproducibilidad. Una respuesta lineal al analito por encima de varios rdenes de magnitud. Un rango de temperatura del cuarto de por lo menos 400 C. Un tiempo de la respuesta corto, independiente de proporcin de flujo. Alta fiabilidad y facilidad de uso. Similitud en respuesta, muy predecible y selectiva hacia uno o ms clases de analitos. - No destructivo. - El ruido de fondo bajo y facilidad de funcionamiento
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CLASIFICACIN DE DETECTORES
Hay muchos tipos de detectores que se usan en cromatografa de gases. La razn para esta variedad involucra la necesidad de los sistemas de deteccin de proporcionar respuestas selectivas a los grupos particulares de compuestos, simplificando los cromatogramas de las muestras complejas. Los diferentes detectores dan diferentes tipos de selectividad. El grado de selectividad puede clasificarse como sigue. No-selectivo (o universal) los detectores responden a todos los compuestos que difieren del gas acarreador : TCD Los detectores selectivos responden a un rango de compuestos que tienen algn qumico comn o una propiedad fsica: ECD, NPD, FPD, Los detectores especficos responden a un solo compuesto qumico.

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Detectores dependientes de la concentracin: TCD, ECD, FID


Adems la selectividad, los detectores pueden clasificarse segn la forma en que responden a la cantidad de analito que atraviesa. Los detectores producen una seal que se relaciona con el tiempo y la concentracin de soluto presente en gas acarreador, en un punto. Normalmente son no-destructivos y as que pueden usarse en serie con otros detectores. Su respuesta se expresa en unidades de seal por la concentracin del analito. Debido a su sensibilidad a la respuesta del analito, cualquier dilucin del effluente de la columna con un gas bajar la respuesta.
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Detectores dependientes del flujo de masa: FID, NPD, FPD


Estos detectores producen una seal que se relaciona a la proporcin a la que las molculas del soluto entran en el detector. Estos detectores normalmente generan una seal como resultado de algn proceso destructivo que ocurre en las molculas del soluto. Su respuesta se expresa en unidades de seal por el flujo de masa del analito.

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Detectores
Detector de Ionizacin de llama (FID) Detector Nitrgeno Fosforoso (NPD) Detector de Captura de electrn (ECD) Detector de Conductividad termal (TCD) Detector fotemetrico de Llama (FPD) Detector de Emisin atmica (AED) Detector de Fotoionization (PID) Detector de Conductividad elctrica (ELCD) Detector de espectrometra de masas (MS)
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FID
El FID es uno de los detectores ampliamente usados, generalmente aplicables para cromatografa de gases. Es fcil de usar pero es destructivo de la muestra. FIDs consisten en una llama de hidrogeno/aire y un plato colector.

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FID
El efluente de la columna, se mezcla con hidrgeno y aire, y entonces es encendido elctricamente. La mayora de los compuestos orgnicos producen iones y electrones que pueden conducir electricidad a travs de la llama. Hay un electrodo sobre la llama que es colector de los iones formados a una llama de hidrogeno/aire. El nmero de iones que llegan al colector es moderado y se genera una seal. La cantidad de iones producida es aproximadamente proporcional al nmero de tomos del carbono reducidos presente en la llama y del nmero de molculas.
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FID
Los grupos funcionales, como carbonil, alcohol, halgeno, y amina, rinden menos iones o ninguno en una llama. Adems, el detector es insensible hacia gases incombustibles como H2O, CO2, SO2 y NOx. Selectividad: Compuestos con enlaces C-H. Una respuesta pobre para compuestos organicos que contienen poco o nada de hidrgeno (ej., hexachlorobenzeno). Sensibilidad: 0.1-10 ng Gases: Combustin - el hidrgeno y aire; Composicin - helio o nitrgeno Temperatura: 250-300 C; 400-450 C para los anlisis de temperatura altos.

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TCD
Un TCD es un detector muy primitivo utilizado en cromatografa de gases y todava tiene amplias aplicaciones. Se basa en los cambios de la conductividad trmica de un flujo de gas. Cambios en conductividad trmica por la presencia de analitos. Las molculas orgnicas causan un aumento de temperatura en el elemento, que se da como un cambio en resistencia. El TCD no es tan sensible como otros detectores pero es noespecfico y no-destructivo. La ventaja del detector, es su simplicidad, su rango dinmico lineal grande, su respuesta general a las especies orgnicas e inorgnicas y su carcter no destructivo que permite la coleccin de solutos despus de la deteccin.
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TCD
Una clula del descubridor contiene un filamento elctricamente acalorado cuya la temperatura a poder elctrico constante depende en la conductibilidad termal del gas circundante. Las conductividades trmicas de helio y hidrgeno son seis a diez veces mayor que aquellas de la mayora de los compuestos orgnicos. As, en la presencia de incluso cantidades pequeas de materiales orgnicos, representa una disminucin relativamente grande en la conductividad trmica del efluente de la columna; por consiguiente, el descubridor sufre un marcado aumento en su temperatura.

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El circuito del puente permite amplificacin de cambios de resistencia debido a analitos que pasa sobre el termoconduccin de la muestra y no amplifica cambios en resistencia que ambos juegos de producto de los detectores debido a fluctuaciones de

proporcin de flujo
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TCD
Selectividad: Todos componen salvo el gas del portador Sensibilidad: 5-20 ng Gases: Composicin igual que el gas acarreador. Temperatura: 150-250 C

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ELCD
Los compuestos son mezclados con un gas de la reaccin y atraviesan un tubo de reaccin de alta temperatura. Se crean productos de la reaccin especficos qu se mezcla con un solvente y atraviesan una celda de conductividad electroltica. El cambio en la conductividad electroltica del solvente es moderado y se genera una seal.
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ELCD

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ELCD
Selectividad: Los halgenos, azufre o nitrgeno que contienen compuestos. nico en un momento.
Sensibilidad: 5-10 pg (halgenos); 10-20 pg (S); 10-20 pg (N) Gases: Hidrgeno (halgenos y nitrgeno); el aire (azufre)

Temperatura: 800-1000 C (halgenos); 850-925 C (N); 750-825 C (S)


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ECD
Detector de captura de electrnes (ECD) opera en mucho de la misma manera como un medidor de radiacin-X. Aqu el efluente de la columna pasa por un -emisor, como 63Ni o tritium (absorbido en platino o lamina del titanio). Un electrn del emisor causa ionizacin del gas del portador (a menudo el nitrgeno) y la produccin de un estallido de electrones.

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ECD
El detector de captura de electrnes fue el primer detector selectivo inventado para el cromatografa de gas. La cmara interior del detector se disea tan pequeo como sea factible y est radiado con un beta-emisor radiactivo contenido es una lamina sellada. La fuente normalmente es
3H

o 63Ni.

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ECD
Selectividad: Halgenos, nitratos y carbonilos Sensibilidad: 0.1-10 pg (en compuestos halogenados); 1-100 pg (nitratos); 0.1-1 ng (carbonilos) Gases: Nitrgeno o argn / metano Temperatura: 300-400 C
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