You are on page 1of 333

VIRUSOLOGIE

Curs Prof. Dr. Simona Ruta


Lucrari Practice: Asist. Univ. dr. Camelia Sultana Asist. Univ. dr. Loredana Manolescu Asist. Univ. Dr. Cornel Popescu Preparator Dr. Aura Temereanca

VARIOLA (smallpox)

Variolizare
1% vs. 25% mortalitate Imunitate pe viata

Marea Britanie: sfarsit ani 1700


China 1950 Pakistan/Afghanistan/Ethiopia1970

Cowpox-Vaccinia
1800- Vaccinare obligatorie copii Marea Britanie 1930-ultimul caz indigen in Marea Britanie 1940-ultimul caz indigen in Statele Unite 1958- programul OMS de eradicare Octombrie 1977: Ultimul caz din lume (Somalia) 1980- eradicarea variolei

Jenner, 1796

Dimensiunea virusurilor

Exceptie- Virus gigant 650nm (780nm cu fibrilele de pe suprafata) denumit Mimivirus (de la Mimicking Microbe) ce infecteaza amoebae, nou patogen uman asociat pneumoniilor?

Mimivirus a fost izolat prima data in 2003, din apa din turnurile de racire in cursul unei epidemii de pneumonie din Anglia In 2008 a fost identificat un virofag ce infecteaza Mimivirus, denumit sputnick

1892- Dimitri Ivanovski -virusul mozaicului tutunuluiMartinus Willem Beijerinck contagium vivum fluidum 1898- Loeffler si Frosch- virusul febrei aftoase. 1909-Landsteiner si Popper-virusul poliomielitic

1949 - Enders, Weller si Robins introduc culturile de celule ca substrat pentru propagarea virusurilor

Microscopia electronic

(a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus. (e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage.

Premiul Nobel pentru chimie 1946

James Batcheller Sumner 1/2 of the prize

John Howard Northrop 1/4 of the prize

Wendell Meredith Stanley 1/4 of the prize

USA
Cornell University Ithaca, NY, USA

USA
Rockefeller Institute for Medical Research Princeton, NJ, USA

USA
Rockefeller Institute for Medical Research Princeton, NJ, USA

b. 1887 b. 1891 b. 1904 d. 1955 d. 1987 d. 1971 Tobacco mosaic disease virus can be crystallized in the same way as proteins and enzymes

SUMAR
STRUCTURA VIRUSURILOR.
Virusurile nu contin dect o singur specie de acid nucleic: ADN (dezoxiribovirusuri) sau ARN (ribovirusuri). Acidul nucleic constituie genomul, depozitarul infectivittii virale. Genomul viral este protejat de un nvelis proteic numit capsid. Capsida rezult din asamblarea unor subunitti numite capsomere care se asociaz potrivit regulilor de simetrie icosaedric sau helicoidal. Adesea genomul si capsida alctuiesc un ansamblu numit nucleocapsid. Capsida este nconjurat la unele virusuri de un al doilea nvelis numit anvelop sau peplos. Anvelopa este dublu codificat: de genomul viral si de genomul celulei gazd. Aceasta nseamn c n cursul eliberrii virionilor din celulele infectate ei includ n anvelop structuri codificate de genomul viral si structuri proprii membranei celulei infectate Genomul viral codific proteine structurale care alctuiesc nvelisurile genomului (capsida si anvelopa) responsabile de antigenicitatea virala si proteine reglatorii sau cu functie enzimatic, importante in cursul replicarii virale. Numrul proteinelor codificate de genomul virusurilor este foarte diferit: de la numai dou la virusul hepatitei delta la cteva sute la herpesvirusuri sau poxvirusuri.

STRUCTURA VIRUSURILOR

ASAMBLAREA CAPSOMERELOR

SIMETRIE ICOSAEDRICA

SIMETRIE HELICOIDALA

VIRUSURI ADN

Mimivirus -ADNds liniar 1,2Mb-cel mai mare genom viral descris pana in prezent, mai mare ca genomul unor bacterii

VIRUSURI ARNSS CU POLARITATE POZITIVA

VIRUSURI ARNss CU POLARITATE NEGATIVA

PRINCIPALELE FAMILII VIRALE PATOGENE PENTRU OM

Genomul ARN ss (+) ARN ss (-) ARN ss RT ARN ds ADNss ADNds

Familii representative Picorna-, Calici-, Astro-,Flavi-, Toga-viridae Orthomixo-, Paramixo-, Arena-, Rhabdo-, Bunya-viridae Retro-viridae REO-viridae: (Orbivirus, rotavirus, reovirus) Parvo-viridae Papova-, Adeno-, Herpes-, Pox-viridae

ADNds RT

Hepadna-viridae

RT- cu reverstranscriptaza, ce sintetizeaza ADN pe matrita ARN, inversand fluxul normal al informatiei genetice. Pentru detalii privind clasificarea consultati Index Virum: www.life.anu.edu.au/viruses

DETALII ULTRASTRUCTURALE ALE VIRUSURILOR IN MICROSCOPIE ELECTRONICA

Vaccinia virus. (A) Electron micrograph of purified virus, negative stain (Westwood et al., 1964). (B) Electron micrograph of a purified virion, whole mount, negative stain (Wilton et al., 1995). (C) Freeze etch electron micrograph of a purified virion (Nermut, 1973).(D) Deep etch electron micrograph of a purified virion (Heuser, 2005).(E) Atomic force micrograph of a purified virion (Malkin et al., 2003). (F) Cryoelectron micrograph of a whole mount preparation of purified virions (Griffiths et al., 2001).

PARAZITISM STICT INTRACELULAR


Mimivirus infectand Acanthamoeba polyphaga.

SUMAR
Virusurile se deosebesc de bacterii prin: parazitism exclusiv intracelular datorat dependentei de sursele de energie ale celulei (virusurile nu au mitocondrii) si de mecanismele de sintez proteic (virusurile nu au ribozomi) ale celulelor parazitate;-->mecanism de nmultire diferit de microbi -numit replicare viral si cultivare numai pe substraturi celulare vii talia mic, de 100 - 1000 ori mai mic dect a microbilor; virusurile se msoar n nanometrii (10-9 metri)--ultrafiltrabilitate si vizualizare in microscopie electronica. N.B. Singura exceptie par a fi virusurile din familia virusurilor largi nucleocitoplasmatice ADN (poxviridae, iridoviridae, asfarviridae, phycodnaviridae si mimiviridae). organizare simpl dictat de codificarea informatiei genetice de o specie unic de acid nucleic: ARN la ribovirusuri si ADN la dezoxiribovirusuri

http://www.virology.net/Big_Virology/BVHomePage.html
Departamentul de Microbiologie si Imunologie al Universittii de Medicin din Tulane, New Orleans, SUA

Fotografii de microscopie electronica:


Institutul Robert Koch din Berlin http://www.rki.de/infekt/enivd/emqm/fs_pict3.htm Universitatea din Cape Town - I spy with my little eye http://www.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/linda.html,

Preparate colorate cu efecte citopatice determinate de virusuri n culturi celulare: http://www.uct.ac.za/depts/stannard/cpe.html Please advise your students: Don't watch TV - listen to medical podcasts ! http://freemedicalpodcasts.com

IZOLAREA VIRUSURILOR IN CULTURI CELULARE


EFECTE CITOPATICE

DIRECIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC


1. Izolarea viral 2. Demonstrarea prezenei virusului / componentelor sale

3. Diagnosticul serologic

Izolarea virusurilor
3 sisteme de izolare Culturi de celule Ou de gin embrionat Animalul de laborator

AVANTAJE / DEZAVANTAJE ALE SISTEMELOR DE IZOLARE VIRALA

AVANTAJE

DEZAVANTAJE

ANIMAL DE LAB Infectie naturala

Cost / etica

O.G.E.

Cost

Susceptibilitate limitata Susceptibilitate variabila

CULTURI DE CELULE

Sensibilitate buna / disponibilitate

Componentele culturilor de celule: Celule dispersate+ mediu nutritiv Mediu nutritiv


solutie salina tamponata - Earle, Hanks substane nutritive ( SFV, lizate proteice) vitamine antibiotice i antifungice

Condiii necesare pentru pstrarea n via a celulelor din cultura celular


Condiii aseptice pH adecvat Temperatur constant atmosfer cu 10% CO2

CLASIFICAREA CULTURILOR DE CELULE


Culturi de celule dispersate
Culturi primare Tulpini celulare Linii celulare- CELULE TRANSFORMATE

CELULE TRANSFORMATE
1. conin gene implicate n imortalizarea n vitro (cultivare nr. infinit pasaje) modificari cromozomiale => cariotip aneuploid; 2. se multiplic haotic, cerine nutritive foarte sczute (se multiplic la concentraii foarte sczute de SFV), glicoliza anaerob = sursa principala de energie. 3. membran celular modificat n compoziie (absena fibronectinei => scaderea adeziunii intercelulare 4. nu au inhibitie de contact, se dispun dezordonat diferit de esutul din care deriv 5. inoculare la animale => TUMORI 6. modificarea morfologiei (rotunde, refrigente) 7. au antigene de suprafa diferite de N codif. de virus /celule gazda=> neoantigene 8. aglutineaz uor cu lectinele (antigene vegetale) 9. modificarea mesageri secunzi (AMPc)

Echipament de laborator

Hote cu flux laminar pentru obtinerea, si propagarea culturilor de celule si izolarea virala

TIPURI DE EFECTE CITOPATICE


SINCITIAL: HIV, v rujeolos, VRS PICNOTIC LITIC
enterovirusuri v. poliomielitice; v. Coxsackie; ECHO

INCLUZIONAR

EFECT CITOPATIC SINCITIAL

EFECT CITOPATIC INCLUZIONAR


Intracitoplasmatic acidofil: v rabic, v vaccinal Intranuclear -acidofil: papovavirusuri - bazofil: adenovirusuri

Mixt: v herpetice, v rujeolos

ECP picnotic litic

INCLUZII CITOPLASMATICE (RABIE)


patognomonic in SNC - CORPII BABES NEGRI in cornul lui Ammon si neuronii piramidali din cerebel

INCLUZII INTRANUCLEARE (BOALA CU


INCLUZII CMV)

INCLUZII INTRANUCLEARE

Diagnostic de laborator in neuroviroze

1. SUSPICIUNEA CLINICA

Definitie de caz meningita virala


Febra 38.5 C asociata cu minim un simptom dintre: Cefalee severa i persistenta; Redoare de ceafa Durere de ceafa asociata cu minim 2 din urmatoarele: Fotofobie Greata Varsaturi Faringita exudativa Dureri abdominale

La sugari si copiii mici semnele principale sunt febra 38.5 C asociata cu iritabilitate si pulsarea fontanelei

Algoritm de diagnostic virusologic


ETIOLOGIE POSIBILA
Produs Patologic

IZOLARE

Dg. DIRECT =detectie directa


NU

Dg. INDIRECT =serologie


DA

80%-90% Enterovirusuri

Polio Cocsackie A si B E.C.H.O.

Materii Fecale* SNF LCR**

De electie Culturi celulare Animal de laborator

10

20% alte

virusuri:VZV; V.
URLIAN; HSV; CMV; V. PARAGRIPALE
Este

important de notat ca enterovirusurile se excreta saptamani la rand, dar sansele de izolare scad. Se recomanda recoltarea a 2 - 3 probe de la pacient la interval de 24-48 ore ** Sansa de izolare din acest produs creste cnd participarea meningiana este evidenta. Acest lucru se traduce prin pleiocitoza (cresterea numarului de celule limfo-monocitare in LCR).

IZOLAREA ENTEROVIRUSURILOR IN CULTURI DE CELULE ECP picnotic litic

RSN:
IDENTIFICAREA VIRUSURILOR=VIRUS NEUTRALIZARE TITRAREA ANTICORPILOR= REACTIA DE SERONEUTRALIZARE

VIRUSNEUTRALIZARE
VIRUS NECUNOSCUT ANTICORPI CUNOSCUTI=SER IMUN DE REFERINTA

SERONEUTRALIZARE
TITRU DE ANTICORPI NECUNOSCUT VIRUS CUNOSCUT = TULPINA DE REFERINTA

ETAPE RSN
1. TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE 2. BLOCAREA INFECTIVITATII VIRALE 3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII INFECTIVITATII VIRALE

1.

TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE metoda plajelor


Dilutii seriale ale virusului

Insamantare pe celule susceptibile dupa adsorbtie, 1h la 37, se acopera cu agar Restrictia raspandirii virusului determina liza focalizata a monostratului celular vizibila sub forma plajelor, PFU

Metoda plajelor

2. BLOCAREA INFECTIVITATII VIRALE

3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII INFECTIVITATII VIRALE

= Repetarea etapei 1 cu amestecurile antigen-anticorp

Identificarea enterovirusurilor dupa metoda Tabla de sah

Lim - Benyesh Melnick

ENCEFALITE Algoritm de diagnostic virusologic


SINDROM ETIOLOGIE POSIBILA Prod. Patologic IZOLARE Dg. DIRECT =detect. directa
PCR IF

Dg. INDIRECT =serologie


NU

HERPES VIRUSURI:
HSV1 HSV2 VZV,EBV,CMV

Lichid vezicular Biopsie cerebrala LCR SALIVA, AMPRENTE DERMICE, CORNEENE, BIOPSIE CEREBRALA LCR SANGE SALIVA, BIOPSIE CEREBRALA LCR

Culturi celulare Animal de laborator

ENCEFALITA ACUTA MENINGOENCEFALITA ENCEFALOMIELITA

V. RABIC ARBOVIRUSURI
TOGAVIRUSURI FLAVIVIRUSURI BUNYAVIRUSURI POSTINFECTIOASE: V. RUJEOLOS V. URLIAN V. GRIPALE VVZ

Culturi celulare Animal de laborator

PCR IF

De electie pt. ARBO VIRUSURI

Culturi celulare

PCR IF

NU

NEUROVIROZE

POLIOMIELITA (gr- polios/myelos)


Infectie subclinica (90 - 95%) Infectie abortiva (4 - 8%)

Poliovirus- receptor CD155 gp TM din super familia Ig stabilire jonctiuni intercelulare la nivel celule epiteliale; posibil implicat in RIU intestin subtire

Invazie SNC prin : 1. Transport axonal retrograd 2. Traversare BHE 3. Transport prin macrofage infectate

Meningita polio non-paralitica (1- 2%)

6 saptamani, intermitent, > imunocompromisi

POLIOMIELITA
Boala majora (0.1 0.5%)-polio spinala sau bulbara -paralizii acute flasce
prin leziuni de neuron motor periferic

Sindromul Post-polio

(15-30 ani post polio- slabiciune musculara, dureri, astenie)

1 in 200-1000 cazuri in infectia cu virusul salbatic la copii 1 in 75 cazuri in infectia cu virusul salbatic la adulti

Polio bulbara
Rata mortalitatii 25% copii 1530% adulti

1909

- poliomielita poate fi tansmis la maimutele superioare prin filtrat de mduv spinal (Landsteiner,K., and Levaditi C. La
transmission de la paralysie infantile aux singes. C. R. Soc. Biol. 1909, 592-594).

1911-Suedia -epidemie (4000 cazuri cu zeci de decese).


Izolarea virusului pe explant de tesut histopatologia bolii experimentale demonstrarea ultrafiltrabilitatii agentului etiologic existenta infectiilor inaparente si seroconversia.- investigarea a 6 familii care au avut contact cu cazuri de polio
Constantin Levaditi (1874 1953)
lInstitutul Pasteur, Paris, 1946

1949- cultivarea virus polio pe culturi de celule nonneuronale- Enders, Robbins, Weller- 1954 Nobel

VACCINURI VIRALE
VACCINURI INACTIVATE VACCINURI VII ATENUATE
Virusuri antigenic inrudite cu agentul etiologic al virozei umane, dar nevirulente pentru om (vaccinia) Tulpini virale natural atenuate( Max Theiler) Atenuare in laborator sub selectia presori fizici, chimici, biologici Virusul neatenuat in doze mici sau asociat cu anticorpi specifici/administrat pe cai de inoculare diferite

VACCINURI ANTIPOLIO
Vaccin antipolio inactivat -SALK 1952National Foundation for Infantile Paralysis -1938
Franklin D. Roosevelt - Al 32-lea presedinte SUA 1933 1945

VIRUS

VACCIN

deteminant virulenta Determinanti antigenici

Incident Cutter 120,000 doze - 40,000 polio abortiva, 56 polio paralitica , 5 decese

VACCIN ANTIPOLIO VIU ATENUAT- SABIN 1962


Tulpini atenuate prin pasaje seriale la temperaturi suboptimale

-Baza moleculara a atenuarii distincta pentru fiecare serotip -Numar mic de mutatii disting tulpina atenuata Sabin de serotipul natural virulent (11 substitutii nucleotidice pt tip 3, 8 pt tip 2 si cel
putin 56 pt tip 1)

- Mutatii esentiale in IRES 5 NT (nucleotide apropiate pt toate


serotipurile-480 tip1; 481 tip 2, 472 tip 3)- destabilizarea structurii secundare a ARN si VP1
Element esential in replicare si initiere traducere

IRES

AVANTAJELE VACCINURILOR VII


Induc raspuns imun global (celular, umoral si local) Raspuns imun impotriva tuturor antigenelor (inactivarea poate altera antigenicitatea) Imunogene consecutiv administarii pe cale naturala (pret scazut, acceptabilitate mare) Imunogene consecutiv administrarii unice, imunitate durabila Capacitate de a disemina de la vaccinati la contactii acestora- duc la eliminarea virusului din colectivitate

DEZAVANTAJELE VACCINURILOR VII


Reversie la virulenta-poliomielita paralitica asociata vaccinrii - PPAV
1 in 2-3 milioane - polio paralitic asociat vaccinarii (Risc ~ 8-10 cazuri/an in SUA- din 2000 exclusiv VPI)

Instabilitate la transport sau stocaj, in absenta lantului de frig


Interferare de catre virusuri cu care impart acelasi habitat

Reactii severe la imunosupresati


Reactogene-grad de atenuare al tulpinii virale

Contaminarea vaccinului cu agenti criptici din substrat cu potential patogen sau


oncogen?

1988 - 350 000 cazuri in 125 tari endemice 2006 1874 cazuri in 4 tari

1988- OMS - Campania de eradicarea a poliomielitei vaccin trivalent oral Sabin


1994- Eradicare poliomielita in emisfera vestica-(1991 ultimul caz in Peru; 1979 ultimul caz in SUA) 2000- eradicare in 36 tari din Pacificul de vest ( inclusiv China and Australia) 2002 eradicare in Europa Polio endemica in : - Nord Nigeria -epidemie 2003 27, 379 cazuri de PFA intre 2001-2007-reinfectia > 20 tari anterior polio free - Nord India, granita PakistanAfghanistan (acoperire vaccinala insuficienta si eficienta neadecvata a vaccin trivalent)

Strategie eradicare polio:


1. Mentinere nivel crescut de imunizare de rutina 2. Zile nationale de Imunizare- vaccinare tuturor copiilor <5 ani in cateva zile in sezon circulatie< v. polio 3. Supravegherea tuturor cazurilor de PFA 4. Imunizarea selectiva, tintita a acelor comunitati care raman rezervoare de virus in tarile in carea primrlr 3 elemente au redus semnificativ numar cazuri polio (mopping out activities) In 2005 Initiativa Globala de Eradicare a Polio vaccin oral monovalent tip 1 ca booster de 4 x mai eficient ca vaccin polio trivalent) Incorporare pe termen lung post-eradicare a unui vaccin inactivat in programul extins OMS de imunizari

ROMANIA Calendarul de vaccinari valabil de la 1 decembrie 2008


Varsta recomandata Primele 24 de ore 4-7 zile Vaccin HepB BCG Comentarii In maternitate

2 luni 4 luni
6 luni 12 luni 4 ani** 7 ani (in cls. I) 9 ani (in cls. a III-a) 14 ani (in cls. a VIII-a)

DTPa IPV, HepB DTPa IPV


DTPa IPV, HepB DTPa IPV, RRO DTPa RRO VPO dT, Rubeolic ***

Simultan Simultan
Simultan Simultan Campanii scolare Campanii scolare Campanii scolare

Enterovirusuri:
Polioviruses 1, 2, 3 Coxsackie A1-24/ B1-6 ECHO - 33 (Enteric cytopatogenic human orphans) Enteroviruses 68-71

CARACTERE GENERALE ALE ENTEROVIRUSURILOR


Sunt virusuri cu genom ARNss, cu polaritate pozitiv, de talie mica (~30 nm) si neanvelopate. Lipsa anvelopei explic rezistenta picornavirusurilor la dezinfectante, la pH-ul acid al sucului gastric, la srurile biliare etc. Afectiuni produse de unele enterovirusuri. Virusul Boala frecvent determinat: Virusurile Cox A Herpangina, diarei minore de vara, meningite aseptice Virusurile Cox B Mialgie epidemica sau pleurodinia Bornholm,moarte subit a nounscutilor, meningite aseptice,miocardite, pancreatite, hepatite, etc.

Virusurile ECHO Enterovirusurile 68-71

Meningite aseptice, guturai, conjunctivite, exanteme Encefalite, mieloradiculonevrite.

Virusurile ECHO produc uneori epidemii extinse de meningite aseptice. Astfel, n vara anului 1999 o epidemie cu virusul ECHO 33 de peste 5000 cazuri a afectat judetele din Moldova extinzndu-se ulterior si n restul trii. Cazurile s-au datorat consumului apei infectate sau scldatului n ape contaminate si au prevalat la grupa de vrst 5-15 ani. Impactul economic al meningitelor virale (meningite aseptice sau cu lichid cefalorahidian clar) este considerabil fiind estimat la cheltuieli n jur de 5000 $ per caz (costuri directe) si 8 zile de inactivitate (costuri indirecte). n 90% din cazuri aceste meningite sunt de etiologie enteroviral. Cheltuielile directe sunt mai mari pentru cazurile pediatrice si deriva din administrarea empirica a antibioticelor si ngrijirea cazurilor cu deshidratare severa n serviciile de reanimare.

Virusul rabic -Familia


Rhabdoviridae, genul Lyssavirus

Rabia - zoonoz major anual


circa 60 000 decese

-Incubatie (10 zile- 6 luni-2


ani!?)

- Prodrom - Sindrom neurologic acut - Coma - Deces

Virusul rabic
Virusul rabic (lyssavirus) face parte din familia Rhabdoviridae virusuri ARNss cu polaritate negativ n form de glont. Virusul rabic salbatic este numit "de strada" si are o incubatie variabila; pasaje repetate la aceiasi specie stabilizeaza si scurteaza incubatia, tulpinile fiind etichetate ca "virus rabic fix". Leziunile citopatice sunt exclusiv intraneuronale, citoplasmatice si au aspectul unor incluzii granulare numite corpii Babes Negri. Tulpinile de virus fix dau incluzii mici. Corpii Babes Negri predomina n neuronii din cornul Ammon din hipocamp si n celulele Purkinje din cerebel. Aceste leziuni corespund situsurilor replicarii virale. In celulele glandelor salivare virusul se replica si se elibereaza prin nmugurire la nivelul membranei celulare ceea ce reprezinta o adaptare eficienta pentru propagarea infectiei la o noua gazda. n afara neuronilor si celulelor glandelor salivare antigenul rabic mai poate fi evidentiat n cornee, piele, mucoasa bucala - elemente care au valoare diagnostica. Patogenia infectiei este conditionat de diseminarea septinevritic centripet a virusului de la nivelul plcutelor neuromusculare periferice ctre SNC. Din SNCvirusul se propag centrifug pe calea filetelor senzitive (septinevritic) si se secret n saliv.

Neuroni fara incluzii

Incluzii i-citoplasmice Negri

Antigene rabice

1885 -Pasteur -atenuare virus rabic prin pasaje repetate intracerebral la iepure (L.Pasteur: Methode pour prevenir la rage morsure. C.R. Acad Sci,
101, 765)

1887- Babes si Puscariu -metoda romneasc de vaccinare antirabic cu virus fix -atenuat prin pasaje la cobai si prin cldur. (V.Babes: Ann. Inst. Pasteur 1889, 7, 384). 1894- Babes recomand utilizarea serurilor de la animalele imunizate cu virus fix pentru tratamentul rabiei dup musctur
(V. Babes: Romnia Medical, 1894, p. 467-469).

Vaccinarea la om - vaccin inactivat preparat pe culturi de celule diploide umane (vaccinoterapia Pasteur) Administrarea de IgG in jurul plagii muscate (seroprofilaxia Babes). Vaccinarea animalelor domestice (obligatorie) si salbaticevaccinuri vii atenuate- cu mutatii si deletii n proteina G- uz veterinar

http://americanhistory.si.edu/polio/virusvaccine/index.htm http://www.astdhpphe.org/infect/polio.html- polio facts- FAQ http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/polioandpostpoliosyndro me.html http://w3.whosea.org/EN/Section1226/Section1228.htm-

vaccin antipolio
http://www.post-polio.org/
Cello J, Paul AV, Wimmer E: Chemical synthesis of poliovirus cDNA: generation of infectious virus in the absence of natural template. Science 2002, 297:1016-1018. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=A bstract&list_uids=12114528- sintetizare virus polio in laborator

ORTHOMYXOVIRIDAE
HA - hemaglutinina
NA - neuraminidaza Nucleocapsida helicoidala (ARNss -, segmentat) anvelopa transcriptaza

Matrice
tip A, B, C : NP, M subtipuri: HA si NA 16 tipuri de HA si 9 de NA tip/subtip/ loc, an izolare/nr. pasajeA/H5N1/Guangdong/1996/1

HEMAGLUTININA

Virusul gripal tip A de la specia/organul

Receptorul cu legatura de tip

Uman, trahee uman

SA-2-6-Gal beta

principalii determinanti antigenici

Aviar (trahee sau epiteliu SA-2-3-Gal beta intestinal), ecvin Porcin, trahee porcin; SA-2-3-Gal beta si prepelit SA-2-6-Gal beta REASORTANTI

Endocitoza mediata de receptor schimbari conformationale cu expunerea peptid de fuziune N-terminal HA2- -complex ribonucleoproteic transportat in nucleu

Proteina M- rol de canal ionic

INHIBITORII DECAPSIDARII- AMANTADINA SI RIMANTADINA

INHIBITORII DE NEURAMINIDAZAO SELTAMIVIR -75 mg x 2/zi ZANAMIVIR -10 mg (2 inhalatii de 5 mg/zi)


PERAMIVIR- injectabil- aprobat in regim de urgenta

NS1 inhibitor al sintezei de IFN

de FDA pe 23 Octombrie 2009, pt utilizare in cazuri severe, spitalizate in care ceilalti inhibitori de NA sunt neutilizabili (rezistenta la Oseltamivir , imposibilitatea administrarii Zanamivir)

V. Gripale A: VARIABILITATE
DRIFT ANTIGENIC- mutatii punctiforme- EPIDEMII

VARIABILITATEA VIRUSURILOR GRIPALE A


SHIFT ANTIGENIC- PANDEMII 1. reasortarea genic ntre tulpini gripale de la specii diferite 2. transferul direct al unor tulpini gripale de la animal la om- modificri conformationale in structura hemaglutininei. 3. Re-emergenta unui virus ce a determinat epidemii cu ani inainte
La psrile domestice gripa poate evolua n dou forme, -minor (LPAI) sau asimptomatic, - afecteaz productia ou in cresctorii - majora (HPAI), foarte sever, nalt contagioas, cu mortalitate 50-100%. (aminoacizi bazici suplimentari la nivelul situs de clivare HA)

Psri acvatice slbatice (rate, gste, pescrusi)-rezervorul natural al virusurilor gripale A

Pandemii gripale
1918-H1N1 gripa spaniola -20-50 milioane decese Virus aviar 1957- H2N2 gripa asiatica-1-2 milioane decese reasortant 1968- H3N2 gripa Hong Kong -700,000 decesereasortant 1977- H1N1 gripa ruseasca-re-emergenta

A/H1N1/ 2009 pandemic


414,000 cazuri confirmate de laborator
cca 5000 decese raportate la OMS

Influenza A H1N1/2009 6 Minigene de la tulpinile porcine Nord America (reasortant 1998 suin/aviar/uman) si 2 de la tulpinile porcine izolate in Europa/Asia Aceste tulpini au coexistat pentru mai mult de 10 ani Reasortarea actuala probabil la porc- gazda ramane totusi necunoscuta (supraveghere insuficienta; infectie asimptomatica la porc, reasortare recenta?)

Primul val pandemic (H1N1) 2009


Rata de atac Varf rata de atac Rata Complicatii Rata de spitalizare Rata de fatalitate Varf rata de absenteism
Data valabile in Iulie 2009 pt UK

30% 6.5% (4.5% - 8%) per saptamana 15% din cazuri clinic aparente 2% din cazuri clinic aparente 0.1% - 0.2% (pana la 0.35%) 12% din forta de munca

Courtesy of Department of Health, UK, http://www.dh.gov.uk/en/Publicationsandstatistics/Publications/PublicationsPolicyAndGuidance/DH_102892

80

45 decese asociate cu cazuri confirmate de laborator de H1N1/pandemic 2009 in 13 tari in perioada 21- 27 Octombrie. Numar total de decese confirmate din Aprilie 2009 in 27 tari EU si 4 EFTA 317. Ukraina a raportat 12 decese cauzate de pneumonii regiunea Ternopol alte 6 decese in regiuni invecinate

53 State Membre in regiunea Europeana OMS WHO/Europe influenza surveillance (EuroFlu.org)

SHIFT ANTIGENIC- Modificri conformationale n structura hemaglutininei pentru traversarea barierei de specie
Toate virusurile gripale umane au singur reziduu bazic de arginin la nivelul sitului de clivare a hemaglutininei. Achizitia unor aminoacizi bazici suplimentari la acest nivel, duc la o conformatie asemntoare virusurilor aviare HPAI (situri de clivare multiple) si permit si altor proteaze n afara tripsinei s cliveze hemaglutinina, ceea ce duce la alterarea tropismului tisular (cu posibilitatea afectrii tesutului cerebral, miocardic si vaselor de snge) si la cresterea virulentei. O serie de mutatii punctiforme afecteaza legarea la receptori si cresc legarea de reziduri sialozidice specifice mamiferelor

2. transferul direct al unor tulpini gripale de la animal la om

V.GRIPAL 1918

Caracteristica
LD50/Soarece Pierdere greutate ziua 5 Mortalitate ziua 9 Patologie pulmonara Expresia genelor tisulare

Tulpina H1N1 A/New Caledonia/20/99


>106 PFU 10 % 0% Bronho alveolita medie focal Gene proinflamatorii

A/New Caledonia/20/99 cu HA si N A de la tulpina pandemic 1918


<103 PFU 25 % 100% Bronho alveolita necrotica difuz Gene proinflamatorii, gene de activare a functiilor fagocitare, gene induse de stress, radicali de oxigen liberi

SIMILITUDINI GENOMICE INTRE H5N1 - V.GRIPAL 1918

1997- H5N1 - Hong Kong - 1,5 milioane psri; 18 cazuri umane/6 decese

1996-H5N1 izolat de la giste din Guangdong China

Decembrie 2003- cazuri letale gripa H5N1 la feline mari Thailanda, continua in octombrie 2004 -147/441 tigrii 2004--H5N1- Coreea de Sud, Vietnam, Cambodia, Laos, Japonia, Thailanda, Indonezia, China, Hong Kong

2005-iulie-august Rusia , Kazakstan , Mongolia octombrie- decembrie-Turcia, Romania), Croatia , Kuwait, Ukraina China, Indonezia, Vietnam, Cambodia, Turcia (cazuri umane)

Transferul tulpinilor nalt patogene H5N1 din Asia ctre Estul Europei este atribuit rutei psrilor deasupra Eurasiei continentale sau de-a lungul litoralului Mrii Arctice.

2006- Iraq, Nigeria, Azerbaijan, Egipt, India, Franta (februarie-I data in UE), Niger, Albania - pasari domestice Bulgaria, Greece, Italy, Slovenia , Iran, Austria, Germania, Franta, Ungaria, Slovacia, BosniaHerzegovina, Georgia, Suedia, Elvetia , Serbia-Muntenegru, Polonia- pasari salbatice lebede, rate 2008-2009 China, Indonezia, VietNam, Egipt, Thailanda, Iraq, Turcia-cazuri umane

2009- 442 cazuri umane/262 fatale

Aprilie 2005- extinderea spectrului de gazda la pasari salbatice - 6,345 pasari din specii diferite mor in citeva saptamini in regiunea marilor lacuri (Qinghai Lake) din China centrala- se extind in n Siberia, Caucaz, Balcani.

Conditii necesare izbucnirii unor pandemii


noutatea antigenica a virusului lipsa imunittii n populatia uman facilitatea transmiterii interumane a noilor tulpini.

VACCIN INACTIVAT CU VIRUS INTREG SAU SUBUNITAR (1931-izolare in OGE, 1940- vaccin inactivat)
- Virus izolat in OGE, lichid alantoidian imbogatit, particule virale centrifugate in gradient de densitate pentru concentrare si purificare, inactivare cu formaldehida sau -propiolactona +/_ tratare cu detergent si purificare HA si NA- vaccin trivalent - Petrescu si colab., 1980 - NIVGRIP- administrarea intranazal a vaccinului inactivat preparat cu virusul ntreg prioritate romneasc.

VACCIN VIU ATENUAT CU TULPINI RECI


Tulpina master atenuata, adaptata pentru crestere la 250 C (A /H2N2 /Ann Arbor/6/60 si B/Ann Arbor/1/66) in care se insera genele pentru HA/ NAmutatii stabile in genele complexului polimerazic PA, PB1, and PB2, propagate n pasaje seriate la temperaturi din ce n ce mai sczute pe celule renale de pui de gin SPF (specific pathogen free)

Fiecare doz de vaccin contine hemaglutinina corespunztoare a 10 bilioane de virioni n cazul cultivrii virusului pe OGE (15 ug per 0.5 ml) . Cantitatea de neuraminidaz nu este standardizat -protein labil n cursul procesului de preparare si stocare a vaccinului.

PB2 PB1 PA HA NA NP M NS

PB2 PB1 PA HA NA NP M NS

Tulpina matca -PR8 (H1N1


A/PR/8/34) atenuata, nonpatogena, incapabila de replicare la om

Reasortant
virus cu 6 gene PR8, dar HA si NA tulpinii circulante

PB2 PB1 PA HA NA NP M NS

Tulpina antigenic noua

Vaccinuri Influenza A (H1N1) 2009 monovalente aprobate in US, 6 Octombrie 2009


Vaccin Producator Prezentare 0.25 mL siringa Inactivat Sanofi Pasteur SA 0.5 mL siringa 5.0 mL fiola multidoza Novartis Vaccines Diagnostics Ltd CSL Behring Ltd MedImmune LLC 5.0 mL fiola multidoza g Hg/0.5 mL 0 0 25.0 25.0 Grup varsta

No. doze 6--35 luni 2

36 luni 1 or 2

6 luni 1 or 2

4 ani 1 or 2

Inactivat

0.5 mL siringa
0.5 mL siringa

<1.0
0 24.5 0

4 ani 1 or 2
18 ani 18 ani 1 1

Inactivat Viu atenuat

5.0 mL fiola multidoza 0.2--mL spray**

2--49 ani 1 or 2

* O doza de 0.5-mL contine 15 g hemagglutinin din A/California/7/2009 (H1N1)


2 doze administrate la interval de aproximativ 4 saptamani (21 zile ) recomandat pt copii cu varste 6 luni --9 ani. Loc preferential pt nou nascuti si copii mici in coapsa antero-lateral. Vaccin anti gripal viu atenuat ( doza ce contine 106.5--7.5 fluorescent focal units de VVA A/California/7/2009 (H1N1) ** Influenza A (H1N1) 2009 0.2 mLin fiecare nara

Virus reasortant A/California/7/2009 NYMC X-179A (New York Medical College), distribuit de CDC

US 22.5 milioane doze


Use

VACCINURI LICENTIATE IN UNIUNEA EUROPEANA


Celvapan (Baxter AG);- virion ntreg, A/California/07/2009 (H1N1) inactivat,

cultivat pe celule Vero 7,5 micrograme HA per doz de 0,5 ml . Focetria (Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l)- Antigene de suprafa ale virusului gripal (hemaglutinin i neuraminidaz) din tulpina: A/California/7/2009 (H1N1) v (X-179A) cultivata n OGE 7,5 micrograme HA per doz de 0,5 ml -adjuvant (MF59C.1) Pandemrix (GlaxoSmithKline Biologicals S.A)- Virus gripal fragmentat, inactivat, coninnd HA din tulpin similar virusului A/California/7/2009 (H1N1) (X-179A) cultivata n OGE echivalent cu: 3,75 micrograme** per doz de 0,5 ml- adjuvant AS03

GRUPE DE RISC
Persoane cu risc nalt de complicatii copii < 2 ani (rate de spitalizare de 2.3 ori > ca cei 2- 4 ani, acesrtia la randul lor sanse de 20% mai frecvente complicatii) adulti > 65 ani femeile gravide n trimestrele II si III de sarcin, 2 saptamani postpartum inclusiv dupa pierdere sarcina pacienti institutionalizati adulti si copii cu boli cardiace (cu exceptia HTA) si pulmonare cronice (inclusiv astm), boli metabolice (inclusiv diabet zaharat), disfunctii hepatice, renale, hematologice , imunosupresie (inclusiv cei HIV pozitivi) Obezitate (BMI 30-35), mai ales obezitate morbida (BMI )>40 n
Persoane care pot transmite infectia gripal celor cu risc de complicatii personalul medico-sanitar angajatii institutiilor psihiatrice si cei ce ngrijesc bolnavi cronici membrii familiilor persoanelor la risc

Persoane la care vaccinarea poate fi recomandat persoane care cltoresc n zone cu epidemii de grip persoane implicate n servicii comunitare esentiale copiii din gradinite si scoli, studentii, militarii

UP TO DATE
http://ec.europa.eu/health/ph_threats/com/Influenza/h1n1_en.htm http://ec.europa.eu/health-eu/newsletter/influenza/1/newsletter_en.htm http://www.emea.europa.eu/influenza/vaccines/home.htm http://www.euro.who.int/surveillance http:// www.cdc.gov/flu/weekly http://www.ecdc.eu.int/ http://www.oie.int Organizatia Mondiala Pentru Sanatatea Animala

www.virology.ro- INSTITUTUL DE VIRUSOLOGIE St. S. Nicolau date despre debutul pandemiei www.who.int/csr/disease/avian-influenza http://www.efsa.eu.int/science/- The European Food Safety Authority http://europa.eu.int/comm/food/animal/diseases/controlmeasures/avian/ avain_influenza_22092005.pdf Taubenberger et al in Nature ( VOL. 437 October 6th 2005 ) http://www.nature.com/news/2005/051003/full/437794a.html http://www.nature.com/news/2005/051003/full/nature04230.html Tumpey et al in Science (2005; 310: 77-80).

HERPESVIRIDAE
gr. herpein

Proteine virale deja sintetizate: -inhiba sinteza proteinelor celulare, - inhiba mecanismele de aparare celulara -stimuleaza expresia genelor virale.
Centers for Disease Control and Prevention's Public Health Image Library (PHIL), identification nr #1878.

GENOMUL HERPESVIRUSURILOR
Genomul este ADNds, liniar, asamblat ca un toroid care circularizeaz cu usurint. Fiecare spir ADN contine dou componente L (long) si S (short) mrginite de secvente repetate inverse. Componentele L si S pot face rocada producnd forme lineare izomere care explic ntre altele latenta

HERPESVIRIDAE
ALPHAHERPESVIRINAE- Neuronii senzitivi din rdcina
posterioar a nervilor spinali si nucleii senzitivi ai nervilor cranieni
HERPES SIMPLEX 1 (HSV1) HERPES SIMPLEX 2 (HSV2) VARICELO-ZOSTERIAN (VZV)

BETAHERPESVIRINAE- Limfocitul T, monocite, organe solide


(plamni, rinichi) +/- epiteliul glandelor salivare
CITOMEGALIC (CMV) HUMAN HERPESVIRUS 6 (HHV6) HUMAN HERPESVIRUS 7 (HHV7)

GAMAHERPESVIRINAE- Limfocitul B, endoteliu capilar


EPSTEIN BARR (EBV) HUMAN HERPESVIRUS 8 (HHV8)-KAPOSI ASSOCIATED

gp C=receptoriglicosaminoglicani gpD =co-receptori (nectine, HVEM-herpes virus entry mediator, 3OS heparansulfat -forma
modificata a heparan sulfat sub influenta 3-O sulfotranferaza enzima prezenta in creier)

-TEGUMENT-VHS virion host shut-off protein (de decuplare a


sintezei proteinelor celulare) -factor de transcripie virional (VP16 sau alfa TIF -alfa transinducing factor)

-proteina "DNA-binding" Oct-1 n celulele nou infectate - activare specifica a unor promotori virali

ADN-ul viral ---ARN polimeraza II celulara----sinteza ARNm pt 3 specii de proteine: alfa (IE)si beta (E) (reglatorii, enzimatice, timpurii) si gama (L) (structurale, tardive).

Sinteza ADN- Rolling circle concatemeri clivati in monomeri in cursul asamblarii nucleocapsidei

LATENTA
Deficiente in transportul moleculelor alfa-TIF din citoplasma catre nucleul neuronilor -blocheaza infectia HSV productiva Fixarea unor proteine celulare cu actiune represoare, la nivelul secventelor din ADN-ul viral care controleaza expresia genelor .

-factor de transcripie virional (VP16/ alfa TIF-trans-inducing factor) -proteina "DNA-binding" Oct-1 n celulele nou infectate - activare specifica a unor promotori virali

Reducerea sau absenta expresiei proteinelor celulare necesare activarii genelor .


Prezenta de proteine care inhiba activitatea alfa-TIF. Expresia diferentiata a proteinelor celulare implicate in reglarea expresiei genelor virale reprezinta factorul major care hotareste daca un neuron infectat va evolua catre o infectie latenta sau productiva.

LATENTA
- Dou gene IE (ICP 4 si ICP 27) conditioneaz propagarea HSV 1 numai n celule

permisiv, fiind transactivatori ai genelor asociate cu infectia litica. - O singura zona a genomului viral este functionala in timpul latentei- situata in secventele repetitive ale genomului si codifica un numar inca necunoscut de molecule de ARN, denumite LATs (Latency Associated Transcript) , care nu vor fi traduse in proteine Expresia LAT in neuroni inhiba expresia unor gene litice (ICP4 si timidin kinaza), prin modificari ale histonelor ce convertesc portiuni din ADN viral in forme neproductive

Elemente din jurul genei pt ICP4 leaga o proteina - NRSF- factor de silentiere neuronala restrictiva (element represor al transcriptiei REST Repressor Element Silencing Transcription Factor)- duc la blocarea unor gene imediat timpurii stabilirea latentei. Forme truncate ale NRSF sunt produse in neuroni si controleaza selectiv expresia unor canale pentru neurotransmitatori
LAT interfera cu mecanismele naturale ale mortii celulare

GINGIVOSTOMATITA HERPETICA

HERPES FACIAL

HERPES GENITAL

Episoade recurente
adulti imunocompetenti: F -20% (8-80%); M-15% (5-50%)

Excretie virala asimptomatica (EVA)-75% din recurente

HERPES NEONATAL

1988 -PREMIUL NOBEL PENTRU MEDICINA NOI PRINCIPII TERAPEUTICE Sir James W. Black, Gertrude B. Elion , George H. Hitchings
ACYCLOVIRAnalog nucleozidic purinic aciclic , derivat din guanin- activ in forma trifosforilata

PO4 PO4 PO4

Supresia herpesului genital prin terapia cu acyclovir: Numarul mediu de episoade de herpes genital per persoana per an

VARICELA

VARICELA (LEZIUNI PROGRESIVE, IN VALURI - MACULE, VEZICULE, CRUSTE)-vs RUJEOLA (ERUPTIE MACULO-PAPULARA)

RUJEOLA (ERUPTIE MACULO-PAPULARA CU FEBRA, RINOREE, CONJUNCTIVITA, DIAREE)

VACCIN VIU ATENUANT ANTI VARICELOS administrare la 19-35 luni

VACCIN VIU ATENUANT MMR measles, mumps, rubella (rujeola, oreion, rubeola) administrare la 12 luni

Reactivarea virusului varicelo- zosterian latent = zona zoster- eruptie herpetica pe traseul unui nerv

BETAHERPESVIRINAE
CITOMEGALIC (CMV) HUMAN HERPESVIRUS 6 (HHV6) HUMAN HERPESVIRUS 7 (HHV7) Transmiterea materno-fetal a CMV majoritar la primoinfectia in sarcina:
Prenatal-teratogen determin malformatii congenitale severe (microcefalie, retard mental, chorioretinit, anomalii osoase);

Perinatal - determin boala cu incluzii citomegalice a nou nscutului (hepatosplenomegalie, icter, anemie hemolitic);
Postnatal infectie asimptomatic sau asemntoare mononucleozei

Citomegalie si incluzii intranucleare tipice in ochi de bufnita

INFECTIA CU CMV
La imunosupresati infectii primare si reactivari simptomatice: CMV POST-TRANSFUZII: mononucleosis-like CMV +SIDA: RETINITE/ encefalopatii CMV POST- TRANSPLANT : PNEUMONIE letalitate ridicata>85% Hepatite, colite, encefalite

TRATAMENT

GANCICLOVIR Cytovene
CIDOFOVIR- RETINITA CMV

FOSCARNET

MONONUCLEOZA INFECTIOASA
EPSTEIN BARR (EBV)- GAMAHERPESVIRINAE

LATENTA- EXPRESIA PROTEINELOR VIRALE TIMPURII: FACTORI DE CRESTERE AUTOCRINI PT. LIMFOCITELE B RECEPTORI AI FACTORILOR DE CRESTERE ACTIVATORI AI UNOR ONCOGENE CELULARE

HUMAN HERPES VIRUS 8 (HHV8)- SARCOMUL KAPOSI- cancer celule endoteliale

MAI MULTE INFORMATII


http://www.ashastd.org/- American Social Health Association. http://www.gotherpes.com/ http://www.famvir.com/ si http://www.herpeshelp.com/ GlaxoSmithKline si Novartis. http://www.ihmf.org/ International Herpes Management Forum. http://www.herpesdiagnosis.com/ http://www.focusdx.com/focus/splash/splash.asp http://www.webmd.com/ http://www.herpeshomepage.com/

DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN HEPATITE DE ETIOLOGIE VIRALA

ALGORITM DE DIAGNOSTIC IN HEPATITE


1. Tablou clinic 2. Teste biochimice
Markerii necrozei hepatocitare (transaminaze, LDH) Markeri colestaza (FAL, GGT, bilirubina) Markeri ai incapacitatii de sinteza la nivel hepatic (proteine serice, colesterol, trigliceride)

3. Date epidemiologice: cale transmitere, contact infectant, per. incubatie, vaccinuri 4. Diagnostic etiologic = detectia markerilor virali:
antigene virale (ag) anticorpi antivirali (anti) acid nucleic viral

Hepatita B

Hepatita acuta Hepatita cronica persistenta Hepatita cronica agresiva


Ciroza hepatica Carcinom hepato-celular ALGORITM

Sisteme antigenice VHB


Ag HBs Ac antiHBS Ag HBc Ac antiHBc Ag HBe Ac antiHBe

Infectia acuta cu VHB

evolutie spre vindecare


Simptome AgHBe ADN/VHB anti-HBe

anti-HBc totali

AgHBs

anti-HBc IgM

anti-HBs

12

16

20 24

28

32 36

52

100

Saptamini post expunere

Infectia cronica cu VHB


Acute (6 months) HBeAg HBsAg Total anti-HBc Chronic (Years) anti-HBe

IgM anti-HBc

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

52

Years

Weeks after Exposure

ELISA de detectie a Ag virale ELISA de detectie a Ac antivirali

Tehnica ELISA sandwich 1. 2. 3. 4. 5. 6.

ELISA de detectie a Ag virale

Incubare ser pacient 1h la 37C Spalare Incubare CONJUGAT 30min la 37C Spalare Incubare SUBSTRAT 20 min la t.camerei Citire la spectrofotometru => D.O., MN, MP, C.O.

SUBSTRAT + Anti HBs cuplat cu o enzima = CONJUGAT

Ag HBs Anti HBs

EVOLUTIA MARKERI DE INFECTIE VHA


simptomatologie

ALT IgM Viremie Infectie VHA in MF

IgG

10

11

12

13

saptamana
Diagnostic hepatita acuta A = detectie Ac anti VHA IgM (ELISA de captura)

ELISA de captura
ETAPE
SUBSTRAT + 1. Incubare ser pacient 1h la 37C 2. Spalare 3. Incubare conjugat 30 min la 37C 4. Spalare IgM 5. Incubare substrat 20 min la t. camerei
Anti-IgM

Ag marcat enzimatic = conjugat

6. Citire la spectrofotometru

HEPATITE VIRALE
Infectioasa HEPATITA VIRALA

A
NANB

Transmitere E Enterica

C B
Transmitere D Parenterala
Virusuri hepatitice F,G Coxackie, EBV, CMV, arbovirusuri

Serica

VIRUSUL HEPATITEI A PICORNAviridae; gen HEPARNA-viridae


VHA este rezistent la - cldur, - pH acid, - alcool-ether. Inactivare- fierbere la > 85 oC, cel putin 3 minute

CONCENTRATIA VHA IN DIFERITE FLUIDE CORPORALE


Materii fecale Ser Saliva

100
Soursa:

102

104

Digestiv Contact personal direct Sange (rar postransfuzional, IDU) (e.g., injection drug use, r 6 8 1010 10 10
TITRUL/ml

Viral Hepatitis and Liver Disease 1984;9-22 J Infect Dis 1989;160:887-890

Incubatie: medie 25 zile (limite 15-50 ) Icter: <6 ani <10% 6-14 yrs 40%-50% >14 yrs 70%-80% Complicatii: hepatita fulminanta; colestaza(rare)- vindecare completa regula in hepatita A
simptomatologie

ALT IgM Viremie Infectie VHA in MF

IgG

In Romnia, peste 80% din copiii sub 10 ani au trecut prin infectie

10

11

12

13

saptamana
profilaxie specific: vaccin inactivat profilaxie nespecific: igien personal sau gamaglobuline la contacti

Virusul Hepatitei E- Calicivirus


Incubatie: Medie 40 zile (15-60) Severitate creste cu varsta Rata fatalitatii : 1%-3%; 1983-IEM n preparat provenit de la un voluntar care a fost infectat cu filtrat de materii fecale de la un pacient cu hepatit enteric nonA nonB.

femei gravide 15-25% - avorturi sau nasteri premature: 12 30% - moartea ftului in utero: 25%; -decesul mamei prin hepatit fulminant: 25%

Ulterior, virusul transmis la maimute cynomolgus- clonat, genomul secventiat.


Retrospectiv, probe arhivate prelevate n cursul unor epidemii hidrice circulatia VHE din anii 50.

Epidemii hidrice extinse n subcontinentul indian si n America Central Rata de atac: 1-15%; adulti (3 30%); copii (0.2-10%). Transmitere interpersonala minima Nu exista vaccin- eficienta Ig din sangele donatorilor din zone neendemice?

Hepatita E o zoonoz ?
Un nou virus desemnat swine VHE a fost identificat la porci Porcii peste 3 luni din unele cresctorii prezint anticorpi, desi nu au semne clinice. Porcii <3 luni care au anticorpi prezint semne minime de inflamatie hepatic - sugereaz evolutia unei infectii clinic inaparente. Virusul crosreactioneaz cu anticorpii VHE umani. Gena orf2 a VHE porcin are 80% similitudini cu gena VHE uman iar proteina codificat peste 90% asemnare n secventa de aminoacizi. Aparitia unei xenozoonoze? -n msura n care xenotransplantarea organelor de porc la om va deveni posibil.

Virusul Hepatitei B-HEPADNAviridae


Genomul ADN partial ds, partial circular cu dimensiuni mici (3200 nucleotide) este foarte eficient organizat. Prezenta orf suprapuse permite codificarea a 50% proteine n plus, n raport cu ceea ce ar fi teoretic posibil.

GENOMUL VHB- ADNpartial ds, partial circularizat

Genomul VHB este ADN partial dublu catenar cu o spir lung (L, negativ) si una scurt (S, pozitiv). Pe spira lung se gsesc genele ce codific proteinele VHB: Antigenul de suprafa AgHBs mediaz atasarea la receptorii celulari si este implicat n virusneutralizare- Codificat de gena S- cu trei componente: preS1+preS2+S; Antigenul de centru AgHBc (gena c) care prin clivare produce AgHBe (marker de infectivitate); Reverstranscriptaza , ADN polimeraza, si proteinkinaza VHB(gena P-pol) Factori transactivatori ai unor gene celulare (gena x, implicat n cancerizare).

CICLUL REPLICATIV VHB

Dup completarea secventei spirei scurte, pe matrita ADN ds se sintetizeaz o copie ADN circular relaxat (DNAccc - DN closed covalent circular) care este transferat n nucleu n form episomal, neintegrat cromozomial. Pe acest ADN se sintetizeaz un ARN relaxat, numit ARN pregenomic. Acesta serveste fie ca ARNm pentru sinteza proteinelor virale, fie ca matrit pentru reverstranscriptaza care va sintetiza genomul progen.

ADN partial ds Virion VHB infectios Particule subvirale

ER Citoplasma Completarea spirei scurte de catre ADN polimeraza virala

ADNssARN m pregenomic incapsidat

HBeAg HBsAg HBcAg

cccDNA

mRNA Nucleu Hepatocyte

Precore/core

cccDNA, covalently closed circular DNA

Adapted from Lai CL, et al. J Med Virol. 2000;61:367-373.

Caracteristic pentru VHB este sinteza disproporionat ntre particulele virale complete (particulele Dane) cu genom ( 108 ) si cele vide (1014).

In serul bolnavilor se gsesc diferite forme ale VHB: particulele omogene, sferice de 42 nm care reprezint virionul complet (numite particule Dane) si particule neomogene, sferice sau filamentoase, (cu diametrul de 22 nm) constituind structuri lipsite de ADN si de infectivitate.

Concentratia VHB in fluide corporale


INALT Moderat Lichid spermatic Secretie vaginala Saliva Scazut/ nedetectabil Urina Materii fecale Gl. sudoripare Lacrimi

Sange Ser Exudat rani

CAI DE TRANSMITERE VHB


Parenteral Sexual Perinatal Contact

Lapte matern

Evolutia hepatitei B in functie de varsta


100
Infectia cronica (%)

Incubatie: medie 75 zile (45-180)100 Icter:


Infectia Simptomatica (%)

80

<5 ani, <10% >5 ani, 30%-50%

80

60

Infectia cronica <5 ani, 30%-90% >5 ani, 2%-10% 60 Cronicizare prematura : 15%-25% Mortalitate datorita bolii hepatice cronice
40

40

.5%-1%
20 Simptomatologie 20

Varsta la achizitia infectiei


0 nastere

1-6 luni

7-12 luni

1-4 ani

0 Copii mari si adulti

VACCINARE Engerix B (SKB) 0 2 - 6 months (10 ug / 20 ug). IG SPECIFIVCE ANTI VHB- la 48 ore de la expunere; nou nascuti din mame AgHBs/Ag HBe pozitive. ALTE MASURI Triaj donatori, precautii universale

PROFILUL HEPATITEI B CRONICE


Unul din urmtoarele patru criterii pentru diagnostic: persistenta AgHBs >6 luni, valori ale ncrcrii virale >104 copii/ml ADN/VHB, transaminaze persistent sau intermitent crescute, scor Knodell >4 pentru activitatea necroinflamatorie pe biopsia hepatic.
Immunotoleranta AgHBs AgHBe Anti-HBe ALT + + Normal hepatita B cronica AgHBe+ + + Purtator inactiv hepatita B cronica Ag HBs AgHBe(Mutante Precore ) + + Normal < 200 IU/mL (< 103 copies/mL) Normal + + > 2000 IU/mL (> 104 copies/mL*) Activa

> 20,000 IU/mL > 20,000 IU/mL ADN VHB (> 105 (> 105 copii/mL) copies/mL) Histologie

Normal/moder

Activa

eliminarea unor subseturi de limfocite Tc sensibilizate (prin antigene care induc tolerant) blocarea functiilor LTc si APC prin sinteza exagerat de IL10 viremia nalt nu se asociaz cu transaminaze crescute lipsa citopatogenittii VHB. Immune Tolerance

Pierderea efectului tolerogen precipit liza imun indus a hepatocitelor infectate Generarea limfocitelor T citotoxice specifice infectiei VHB citoliza- mecanism imun mediat

Fazele infectiei cronice cu VHB

Immune Clearance

Low Replicative Phase

Reactivation Phase

<

HBeAg+ HBV DNA 2 x 108 2 x 1011 IU/mL

><

HBeAg-/anti-HBe+ (precore/core promoter variants) > 2000 IU/mL < 2000 IU/mL

>

200,000 - 2 x 109 IU/mL

ALT

Normal/mild CH

Inflamatie

Normal/mild CH

Moderate/severe CH

Cirrhosis HBeAg+ chronic hepatitis Slide courtesy of A. S. F. Lok, MD.

Inactive cirrhosis Inactive-carrier state

Cirrhosis HBeAgchronic hepatitis

Hepatita B Cronica activa, cu AgHBe negativ la pacienti cu mutante precore/core Variantele precore previn sinteza AgHBe - sunt determinate de mutatia nonsens G1896A inltur
un semnal indispensabil ncapsidrii

Mutantele core sintetizeaz numai un produs truncat care nu este detectat de trusele ELISA pentru AgHBe/antiHBe. Cele mai frecvente mutatii sunt: A1762T si G1764A. Mutatiile duble reduc si productia viral cu peste 20%. Variantele core promoter previn initierea traducerii Sunt determinate de mutatii punctiforme la codonul start ATG. In majoritatea cazurilor, devin prevalente nc nainte de seroconversia anti HBe 6-15% -remisiuni spontane definitive (rata anual 0,5%)
Prognosticul mai rezervat dect n hepatitele cronice AgHBe pozitive att n ceea ce priveste probabilitatea cirozei ct si a carcinomului hepatic primitiv (CHP).

Evolutia Hepatitei B
400 milioane infectii cronice 500 000- 1 milion decese/an

10% HIV/ HBV coinfectii

1. Hepatita cronica persistenta asimptomatica 2. Hepatita cronica Activa simptomatica 3. Ciroza hepatica 4. Carcinom Hepatocelular

Prevalenta hepatitei B cronice

2 miliarde de infectii curente sau vindecate 4 milioane infectii acute/an 300-400 milioane infectii cronice
25% decedeaza datorita cirozei sau CHP - 1 milion de decese /an 60-80%~din cauzele de CHP 930, 000
Europeans ~ 2 million Asians

~ 400,000 South Americans HBsAg Prevalence > 8% - High 2-8% - Intermediate < 2% - Low

OMS global-VHB a 10-a cauza de mortalitate VHB este al doilea agent carcinogen dupa tutun VHB este de 100 ori mai contagios ca HIV
~ 350,000 Africans

Numarul imigrantilor pe fiecare continent intre 1996-2006

Centers for Disease Control. Hepatitis B fact sheet. Available at: http://www.cdc.gov/hepatitis. 2008. Mahoney FJ. Clin Microbiol Hepatitis B statistics 1. WHO. Hepatitis B. 2002. 2. Maynard JE, et al. In: Viral Hepatitis and Liver Disease. New York: Alan R. Liss, Inc. 1988. 3. CDC. Epidemiology & prevention of vaccine-preventable diseases. The Pink Book. 8th ed. 4. CDC. MMWR. 2001;50:RR-11

TRATAMENT IN HEPATITA B CRONICA PEG IFN + ANALOGI NUCLEOZIDICI/NUCLEOTIDICI INHIBITORI AI REVERSTRANSCRIPTAZEI


Medicament/ Nume TM Interferon alfa 2b/ Intron Peginterferon alfa 2/ Pegasys Lamivudina/ Epivir analog nucleozidic -enantiomer al 3' thiocitidinei. (preparate comerciale - Zeffix, Epivir-HBV, Heptovir, Heptodin). Anul 1991 2005 1998 Posologie Subcutan; 5MU sptmni zilnic, 16

Subcutan; 180 ug/spt, 48 sptmni per os, 100 mg zilnic >1 an

Adefovir dipivoxil/ Hepsera 2002 analog nucleotidic; este fosforilat de kinaze celulare la metabolitul activ adefovir difosfat; activ si pe tulpinile VHB rezistente la LAM Entecavir/ Baraclude deoxiguanin analog nucleozidic de 2005

per os, 10 mg zilnic >1 an

*per os, 0.5 mg zilnic >1 an

Telbivudin/ Tyzeka analog nucleozidic de de timidina

2006

per os, 600 mg zilnic >1 an

Medicamente de prim intenie: adefovir, entecavir, peginterferon; *Entecavir pentru mutante LAMRez doza crete la 1 mg/zi

TRATAMENTUL CU ANTIVIRALE N HEPATITA B CRONIC


ncetinirea progresiei fibrozei ctre ciroz, prevenirea insuficientei hepatice, prevenirea aparitiei CHP Hepatit cronic AgHBs +

Transaminaze

peste 2xLSNTrateaz Prezent Trateaz >1000 copii Trateaz

AgHBe

ADN VHB

Fibroz
Formele

PrezentTrateaz

replicative ale genomului viral rmn n nucleul hepatocitelor infectate sub forma ADN ccc, - recderi la ntreruperea terapiei sau n conditii de imunosupresie.

DESCOPERIREA VHC 1989- Clonare molecular- Choo Q-L., Science


244, 359-62

VIRUSUL HEPATITIC C- FLAVIVIRIDAEAdsorbtia complex de receptori: CD 81, receptorul scavenger B I (SR-B I); moleculele HEPACIVIRUS
de adeziune DC-SIGN Si L SIGN, claudina 1 si receptorii pentru LDL- Susceptibilitatea crescut a vrstnicilor cu leziuni de ateroscleroz Traducere IRES mediata procesarea unui precursor poliproteic larg clivat ulterior de peptidaze semnal SP si proteaze virale in 10 proteine virale . Replicarea VHC - n zone alterate ale endoteliului citoplasmic - alctuiesc reteaua /nodul replicativ (membranous web); morfologic determin incluzii intracitoplasmice cu aspect spongios.
Eliberarea la nivelul polului apical al hepatocitului structur cu bogat continut LDL- celulele depletate de insulele membranare lipidice (rafturi) sunt slab productive n particule virale infectante

Prelucrarea posttraducere n complexul replicativ proteinele nonstructurale + proteinele celulei gazd.

NS4A si p7 sunt viroporine- molecule proteice mici (n jur de 100 aminoacizi) extrem de hidrofobe care oligomerizeaza formnd pori n membranele celulelor infectate prin care virusurile se pot elibera n mediul extracelular- induc apoptoza.

O regiune a NS5A ISDR interferonsensitivitydeterminingregion - corelat cu rspunsul la terapia cu interferon

Regiuni hipervariabile la capatul 5 -frecventa extrem de mare a mutatiilor intr-o secvent de 27 codoni care codific partial proteina E2 a anvelopei

Rata replicarii: 10 trilioane virioni/zi; Titruri plasmatice > 10 milioane copii ARN VHC/ml
rata mutatiilor 105 per nucleotid per ciclu; la fiecare sit din genom produc 105 mutatii punctiforme

HETEROGENITATE VIRALA 6 genotipuri majore -20-48% diferente Cvasispecii-SECVENTA CONSENS- 2-10%-diferente escape mutants

proteaza HCV NS3/4A cliveaza molecule adaptator ce intervin in caile de semnalizarea dependente de TLR si RIG I

Ecranarea antigenicitatii virale de lipoproteine plasmatice determina seroconversia tardiva, ntre 4 i 10 sptmni post-infectie. Aceast fereastr serologic mentine riscul transmiterii VHC prin transfuzii.

RISC REZIDUAL AL TRANSFUZIEI:

Virus
HTLV: donatii HIV: donatii

fereeastra serologica
51 zile (32-72) 22 zile (6-38)

risc rezidual
1,56/1 milion de 2,03/1 milion de 9.7 /1 milion de 15.8/1 milion de

HCV: 82 zile ( 54-192) Reducerea riscului rezidual asociat transfuziilor donatii


Virus si test Risc rezidual prin triaj serologi c - 15.83 9.7

75 zile (37-87) RiscHBV: Reduc Cost rezidual erea Per test donatii prin testare risculu (USD) acizi i nucleici
9.12 42.4% 30

VHB ADN/PCR VHC ARN/Rt- PCR HIV - Ag p24

2.72
1.48

72.0% 200
27.3% 27.3% 50.0% 5 50 200

HIV - ADN/PCR HIV

2.03

1.48 1.01

TRANSMITERE VHC
PARENTERAL Transfuzii /transplant de la donator infectat IDU Rapid dupa initierea administrarii de droguri 30% prevalenta dupa 3 ani >50% dupa 5 ani de 4 x mai frecvent ca HIV Hemodializa Leziuni accidentale in md spitalicesc/nonspitalicesc Incidenta medie 1.8% dupa intepatura ac/obiect taios Transmitere dupa expunere oculara sau piele aparent fara leziuni rar Prevalenta 1-2% personal medicosanitar (< populatia generala) 10 ori mai scazut ca HIV PERINATAL Transmitere doar de la mame HCV-RNA pozitive la nastere Rata medie de infectie 6% Mai ridicata (17%)la coinfectie cu HIV Fara asociere cu mod nastere/alaptare Copii infectati asimptomatici, evolutie buna, hepatita severa rara

SEXUAL Eficienta redusa Rar in cupluri monogame MSM

PATOGENIE- CLINICA
Incubatie medie 6-7 saptamani (226 ) Icter <20%) Rata caz fatalitate Scazut Cronicizare >85% Hepatita cronica activa 10%-60% Ciroza <5%-20% Mortalitate prin bola cronica hepatica 1%-5%

TRATAMENT: PEG- IFN+RBV 48 sptmni, cost estimat in 2006 30-40000 dolari.


INITIERE : ARN VHC detectabil ; ALT crescut >6 luni; Inflamatie/necroza moderata/fibroza scazuta
Factori predictivi pentru RSV: Genotip 2/3 VL baseline <2x106 copii ARN HCV /ml Absenta fibrozei portale Sex F, varsta <40 ani

MONITORIZAREA TERAPIEI IN HEPATITA C CRONICA


RSV- raspuns virusologic sustinut vindecarea se obine n >95% cazuri (ARN nedetectabil; mbuntirea histologiei hepatice cu dispariia inflamaiei i regresia fibrozei) Rspuns tranzitoriu (dispariia ARN VHC la sfritul tratamentului, cu recderi ulterioare)- 10-25% din pacieni retratarea acestor pacieni poate furniza uneori RSV, dar la doze mai mari i pe termen mai lung de administrare a medicamentelor.

Absena rspunsului la tratament -30% din pacieni -chiar dac se nregistreaz scderea nivelului ncrcrii virale sub tratament nu se produce niciodat dispariia virusului din organism- recderea este regul.

Denumire VEVR Rspuns virusologic foarte rapid RVR Rspuns virusologic rapid EVR Rspuns virusologic timpuriu CVR Rspuns virusologic complet LVR (slow responderi) Rspuns virusologic lent

Criterii Scadere >1.4 log10 HCV ARN la 24 ore ; recul viral dupa 7 zile? HCV ARN nedetectabil la 4 saptamani ; predictor RSV <2 log declin in HCV ARN la 12 saptamani; predictor non RSV HCV ARN nedetectabil la 12 saptamani indica sansa maxima de RSV , nu exista risc recderi dup terminarea curei. HCV ARN nedetectabil intre 12-24 saptamani ; frecvent recderi dup terminarea tratamentului

RIBAVIRINA
800-1200 mg n 2 prize zilnic

IFN
PEG-IFN alpha-2b (PEG-Intron; ScheringPlough)- 1.5 mg/kgcorp o dat pe sptmn.
PEG-IFN alpha-2a (PEGASYS; Roche)- 180 g odat pe sptmn.

Imunomodulator Creste rata de mutatii VHC (viral fitness) Mutageneza letala a VHC Scade frecventa reculului viral Accentueaza apoptoza celulelor infectate

Antiviral Imunomodulator
stimuleaz activitatea citolitic a limfocitelor CD8 contribuie la limitarea accesului intralobular al limfocitelor implicate n rspunsul inflamator. cresterea markerilor de activare a macrofagelor (exemplu, CD 69); cresterea activittii celulelor NK si armarea perforinelor; adugarea ribavirinei creste rspunsul antiinflamator prin scderea citokinelor IL-2 si IL12 si cresterea IL-10.

MECANISMUL REZISTENTEI LA IFN A VHC

Interferon (IFN)

Inhibata de C si poliproteina VHC

Receptori pentru IFN MECANISM ANTIVIRAL

Inhibata de NS5A VHC direct sau prin IL8


activarea PKR

Inductia 25 oligoadenilat sintetazei

Activarea 25 oligoadenilat sintetazei (fosforilare)

Inhibata de E2 VHC

Inductia PKR

Activarea RN aza L

Fosforilarea eIF-2 (necesar sintezei proteice)

Degradarea ARN mesager

Inhibarea formarii complexului de initiere a sintezei proteice

VIRUSUL HEPATITEI DELTA = virus DEFECTIV


antigen

HBsAg

RNA HDV

1977 Mario Rizzetto

Coinfectie VHB - VHD


Simptome ALT crescute BOALA ACUTA SEVERA RISC SCAZUT DE CRONICIZARE PROFILAXIA HEPATITEI B

Titru
IgM anti-HDV + IgM anti HBc HDV RNA AgHBs; ADN VHB

Ac antiHBs

Ac anti-VHD totali

Timp dupa

SUPRAINFECTIA VHB - VHD


Icter Simptome ALT BOALA ACUTA ? RISC CRESCUT DE CRONICIZARE IN FORME SEVERE TRATAMENT VHB/REDUCERE RISC TRANSMITERE VHD

Titru

Ac Totali antiHDV + anti HBc IgG

ARN VHD AgHBs IgM anti-HDV

Timp dupa

Asociatia American pentru studiul bolilor hepatice http://www.aasld.org/netFORUMAASLD/eweb/docs/update Centrul pentru Controlul si Profilaxia Bolilor CDC Atlanta http://www.cdc.gov Clinical Care Options for Hepatitis http://www.clinicalcareoptions.com/hepatitis.aspx Medscape Hepatitis Resource Center http://www.medscape.com/resource/hbv Projects In Knowledge, Advanced Certificate Program in the Management of Chronic Hepatitis http://www.projectsinknowledge.com/1712 Viral Hepatitis Serology A-E: CDC-sponsored http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/hepatitis/serology/

Hepatologie 2009 www.HepatologyTextbook.com Versiunea in limba romanahttp://www.fb4d.com hepatologie 2009 Versiunea in limba romana.

Traducerea a fost asigurata de colectivul Disciplinei de Virusologie, UMF Carol Davila Institutul de Virusologie St. S. Nicolau 285, sos. Mihai Bravu, Bucuresti Romania Tel/fax +40213242590

DIAGNOSTIC SEROLOGIC

1. DIAGNOSTIC SEROLOGIC IN INFECTIA HIV/SIDA


TESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta
ELISA de detectie a Ac antivirali
TESTE RAPIDE

TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta


WESTERN BLOT
RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA) IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

2. DETECTIA DIRECTA A VIRUSULUI SAU A PRODUSELOR VIRALE


IZOLARE VIRALA DETECTIA ANTIGENEMIEI p24 ELISA de detectie a Ag virale DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL

ELISA de detectie a anticorpilor antivirali


TEHNICA INDIRECTA

ETAPE 1. Incubare ser pacient 1h la 37C 2. Spalare 3. Incubare conjugat (Ac anti IgG uman x enzima)- 1h la 37C 4. Spalare 5. Incubare substrat 20 30 min la temp camerei

6. Citire la spectrofotometru DO probe, martori, cut off, zona gri

ELISA de captura detectia de Ac de clasa IgM


ETAPE
1. Incubare ser pacient 1h la 37C

Ag marcat enzimatic = conjugat


IgM

2. Spalare 3. Incubare conjugat 30 min la 37C 4. Spalare 5. Incubare substrat 20 min la t. camerei

Ac Anti-IgM

6. Citire la spectrofotometru

TESTE DE CONFIRMARE
Tehnica
WESTERN BLOT
1. SDS-PAGE
2. BLOT (transfer) 3. DETECTIA ANTICORPILOR

WESTERN BLOT detectia Ac serici


Substrate Stop

Antiviral antibody

color

gp160 gp120

Western blot in infectia HIV


Criteriul minim de pozitivitate
2 env + 1 gag

p66

p55 p51

gp41

p31 p24

p17 p10/11 p7/9

Test imunoblot pt confirmarea infectiei VHC


RIBA (Recombinant Imunoblotting Assay)

DIAGNOSTIC SEROLOGIC IN INFECTIA HIV


ELISA
NEGATIV= ABSENTA INFECTIEI HIV POZITIV IN DUPLICAT

WESTERN BLOT
NEGATIV

POZITIV= INFECTIE HIV

! Ferestra serologica
risc rezidual al transfuziei = 2/1 milion

INDETERMINAT
repeta la 6-8 saptamini alt test de confirmare

Ag p24- 1.48/1 milion ADN proviral1.48/1 milion ARN HIV 1.01/1 milion

HIV/SIDA
Human Immunodeficiency Virus

Acquired immunodeficiency syndrome


Sindrome dimmunodeficience aquise

173

Premiul Nobel pentru Medicina sau fiziologie 2008

Franoise BarrSinoussi 1/4 of the prize

Luc Montagnier 1/4 of the prize

Regulation of Retroviral Infections World Foundation for AIDS Unit, Institut Research and Prevention Pasteur Paris, ,Paris, France France

b. 1947

b. 1932

174

1981- primele cazuri AIDS (sindrom de imunodeficienta umana dobandita ) raportate in SUA la homosexuali tineri, anterior sanatosi 1981-83- grupe de risc, AIDS- boala transmisa parenteral, sexual (hetero si homosexual), materno-fetal 1983 - se stabileste etiologia virala a bolii prin izolarea virusului - tulpina numita LAV (Lymphadenopathy Associated Virus) - Luc Montaigner, Institutul Pasteur din Paris / tulpina numita HTLV III (Human T-cell Leukemia Virus III) - Robert Gallo, Bethesda, SUA/tulpina ARV AIDS associated retrovirus (J. Levy, San Francisco, SUA) 1985 cele 3 tulpini sunt demonstrate a apartine aceluiasi virus redenumit HIV (Human Imunodeficiency Virus), Familia RETROVIRIDAE, GEN LENTIVIRINAE

1985 - sunt livrate primele truse de diagnostic imunoenzimatic


1986 - se descopera HIV2 (Africa de Vest) 1998 secventierea prin Rt-PCR celei mai vechi probe de plasma HIV1 pozitiva cunoscuta -recoltata n 1959, de la un barbat din Congo.
175

Argumente SIV-HIV:

Camerun; Gabon, Guineea Ecuatoriala

Similitudini in organizarea genomului Inrudire filogenetica Prevalenta in gazda naturala Areal geografic Cai plauzibile de transmitere

HIV-1 N Camerun

1992 - 1993 - variantele genomice ale HIV1-M sunt ncadrate n 8 clade (A-H), Media distantei intercladale este de aproximativ 27%, izolatele din aceeasi clada nu se deosebesc decit prin176 11% din nucleotide.

1999 - se descopera rezervorul natural al HIV1 SIV cpz- provenit de la o subspecie din Africa Centrala, Pan troglodites troglodites 2006- identificare v. la cimpanzei care traiesc in salbaticie in sud Camerun

3 transferuri distincte ale SIV cpz de la aceeasi specie: Pan troglodites troglodites
Gao.F et al, Nature, 1999, 397, 436-41Weiss RA, Wrangham RW, Nature, 1999, 397, 385-6. 177 Keele, BF, 2006 Science www. sciencexpress.org

Gp160-precursor

GENOMUL HIV: 1.Gene structurale: env (anvelopa-gp120, gp41) gag :antigene de grup: (capsida, matricea, nucleocapsida;) pol: cx polimerazic-(reverstranscriptaza, integraza, proteaza) 2.Gene reglatorii(rev, tat, nef) 3. Gene accesorii (de maturare)

Gp120superficiala P66-Rt

P55-Rt

Gp41-transmembranara P32-proteaza P24- capsida P17- matricea p10/11-integraza p7/9- nucleocapsida

Western

178

CELULE TINTA IN INFECTIA HIV- celule CD4 pozitive : limfocitele T helper macrofage celule foliculare dendritice (CFD)

179

CELULE TINTA IN INFECTIA HIV


Celule murine transfectate cu CD4 nu sunt infectate
cofactor in celulele umane

Co-Receptori?
CD8+ Cells

MIP-1 alpha MIP-1 beta RANTES


Chemokine

Blocare infectie HIV -Co-Receptori=Receptori pentru chemokine

CCR5 Macrofage limfocite


celule Th de memorie din tesuturi nonlimfoide-

CXCR4
180 celule Th nave si de memorie

Tropism HIV
Tulpini R5 M-trope Asociate cu transmiterea HIV
Tulpini R5/X4 Dual-trope

Tulpini X4 T-trope Asociate cu progresia bolii

Linii celulare T CD4+ CCR5+/CXCR4+

Macrofage CD4+ CCR5+

Limfocite T CD4+ CXCR4+

Forma modificata a CCR5- Deletie 32 bp Alela prezenta in forma homozigota- pacienti expusi dar neinfectati HIV Heterozigota- supravietuitori de lunga durata (non-progresori, lent progresori)

Polimorfism populational
In stadiile timpurii ale infectiei, tulpini:
Macrofagotrope

Nonsincitizante
rata replicativa scazuta

In stadiile tardive ale infectiei, tulpini:


limfotrope

sincitizante
rata replicativa inalta
182

Ciclul Replicativ viral: faza de eclipsa

183

CRESTEREA LOGARITMICA
NUCLEU

vp Rata mare de erori a Rt-azei: 3x10-5 mutatii/ nucleotid/ ciclu r replicativ


Rata mare de recombinari in cursul reverstranscrierii

In fiecare zi circa 10 miliarde de virioni Pol II rata mare de erori 1:2,000-10,000 INTEGRAZA 9749 nucleotides genom HIV LTR FIECARE virion progen poate avea cel putin o mutatie!

ARN polimeraza ADN dependenta -POLII

Tat, rev

CITOPLASMA

184

ROLUL PROTEINELOR REGLATORII SI ACCESORII

NEF interactioneaza cu proteine celulare implicate in


semnalizarea celulara permitand supravietuirea pe termen lung a LTh infectate si la promovarea apoptozei LT neinfectate

VIF Interactioneaza cu citozindeaminaza celulara APOBEC3G

Salvarea nu era in fidelitatea fata de uniforme si forme, ci tocmai in desfiintarea lor


B. Pasternak: Doctor Jivago

integraza

ADN proviral
Reverstranscriptaza virala
LTR HIV

ADN celular

COFACTORI

ARN HIV

Proteine celulare implicate in replicarea HIV: -TRIM5 (TRIpartite Motif) la primate intervine in degradarea cx de reverstranscriere in proteazomi

PROTEINE

-APOBEC3G citozin deaminaza converteste citozina in uracil in 186 curs

MATURARE- ASAMBLAREELIBERARE

Maturarea-Clivarea precursorilor polipeptidici sub influenta proteazei virale

Eliberare prin inmugurire

187

TINTE ALE MEDICAMENTELOR ANTIRETROVIRALE


Inhibitori de RT NRTI NNRTI INHIBITORI ATASARII DE CORECEPTORI SI INHIBITORII INTERNALIZARII

INHIBITORI DE INTEGRAZA

INHIBITORI DE PROTEAZA
188

3 CLASE MAJORE DE INHIBITORI AI FAZEI DE ECLIPSA

Inhibitori CD4??neaprobati pt utilizare- in curs de testare


gp41 gp120 Variable loops

Inhibitori ai corecptorilor CCR5

Inhibitorii Fuziunii

CD4

Native Trimer

CD4 Binding ENV binding site exposure

CoR Binding Fusion peptide insertion?

6-Helix Bundle Formation Membrane fusion

TNX-355

Maraviroc (R5) Vicriviroc (R5)

Fuzeon (Enfuvirtide)

INHIBITORII FUZIUNII FUZEON (ENFIVURTIDE)

Source: www.trimeris.com

PRINCIPALELE CLASE DE ANTIRETOVIRALE FOLOSITE IN PRACTICA


De prima linie: Analogii nucleozidici inhibitori ai reverstranscriptazei virale (NRTI) - compusi apartinnd
clasei dideoxinucleozidelor, substante chimice formate dintr-o baza azotat si un rest glucidic a crui grupare hidroxil din pozitia 3' a fost nlocuit cu un alt substituent care nu permite participarea acestei structuri la legturi fosfodisterice. In celulele umane, analogii nucleozidici sunt fosforilati de enzimele celulare Mecanismele care stau la baza acestei activitti sunt: - blocarea elongatiei lantului ADN rezultat prin retrotranscriere, datorit imposibilittii pozitiei 3' a dideoxinucleozidelor de a participa la legturi fosfodiesterice cu alte nucleozide; - competitia cu nucleozidele fiziologice la nivelul situsurilor de legare ale reverstranscriptazei.

Inhibitorii nonnucleozidici ai reverstranscriptazei virale (NNRTI) sunt activi direct, fr a


necesita fosforilare intracelular-blocheaz direct activitatea enzimei, fixndu-se la nivelul unui "buzunar" hidrofob, situat foarte aproape de situl catalitic al Rt

Inhibitorii proteazei virale (PI)-blocheaza clivarea precursorului gag-pol n:- proteine structurale gag(p24, p17, p7) si pol- enzime virale (RT-aza, intrgraza si proteaza p32 nssi). Sunt medicamente active ca atare-blocheaz maturarea si inhib infectivitatea virionilor progeni att n celulele infectate activ ct si n cele infectate cronic, penetrarea lor intracelular fiind bun (inclusiv n macrofage si celule foliculare dendritice - CFD). De rezerva- Inhibitorii fuziunii (Fuzeon), antagonistii coreceptorilor CCR5 (Maraviroc, vicriviroc) si inhibitorii integrazei (Raltegravir)
191

Situatia globala a epidemiei HIV la 1 decembrie 2009 (date UNAIDS)

Global estimates for adults and children, 2008

People living with HIV


million]

33.4 million [31.1 35.8 2.7 million 2.0 million


[ 2.4 3.0

New HIV infections in 2008


million]

Deaths due to AIDS in 2008

[1.7 2.4 million]

December 2009

Adults and children estimated to be living with HIV, 2008


Eastern Europe Western & Central Europe & Central Asia North America

1.4 million
[1.2 1.6 million]

850 000
310 000

1.5 million

[1.4 1.7 million] Asia [710 000 970 000] East

Caribbean

Middle East & North Africa


[250 000 380 000]

850 000
[700 000 1.0 million]

240 000
[220 000 260 000]

South & South-East Asia

Sub-Saharan Africa Latin America

3.8 million
[3.4 4.3 million]

2.0 million
[1.8 2.2 million]

22.4 million
[20.8 24.1 million]

Oceania

59 000
[51 000 68 000]

Total: 33.4 million (31.1 35.8 million)


December 2009

Estimated number of adults and children newly infected with HIV, 2008
Eastern Europe Western & Central Europe & Central Asia North America

55 000
[36 000 61 000]

30 000
35 000

110 000

[23 000 35 000] [100 000 130 000] East Asia

Caribbean

Middle East & North Africa


[24 000 46 000]

75 000
[58 000 88 000]

20 000
[16 000 24 000]

South & South-East Asia

Sub-Saharan Africa Latin America

280 000
[240 000 320 000]

170 000
[150 000 200 000]

1.9 million
[1.6 2.2 million]

Oceania

3900
[2900 5100]

Total: 2.7 million (2.4 3.0 million)


December 2009

Estimated adult and child deaths due to AIDS, 2008


Eastern Europe Western & Central Europe & Central Asia North America

25 000
[20 000 31 000]

13 000
20 000

87 000

000] [10 000 15 000] [72 000 110East Asia

Caribbean

Middle East & North Africa


[15 000 25 000]

59 000
[46 000 71 000]

12 000
[9300 14 000]

South & South-East Asia

Sub-Saharan Africa Latin America

270 000
[220 000 310 000]

77 000
[66 000 89 000]

1.4 million
[1.1 1.7 million]

Oceania

2000
[1100 3100]

Total: 2.0 million (1.7 2.4 million)


December 2009

Children (<15 years) estimated to be living with HIV, 2008


Eastern Europe Western & Central Europe & Central Asia North America

<100
[<100]

<100
[<100]

20 000

[12 000 28 000] Asia East

Caribbean

Middle East & North Africa

16 000
[11 000 23 000]

11 000
[7400 16 000]

15 000
[7600 24 000]

South & South-East Asia

Sub-Saharan Africa Latin America

140 000
[91 000 200 000]

31 000
[22 000 40 000]

1.8 million
[1.0 2.5 million]

Oceania

1500
[<1000 2600]

Total: 2.1 million (1.2 2.9 million)


December 2009

Over 7400 new HIV infections a day in 2008

More than 97% are in low- and middle-income countries


About 1200 are in children under 15 years of age

About 6200 are in adults aged 15 years and older,


of whom: almost 48% are among women about 40% are among young people (1524)

December 2009

1. Infectia primara (sindrom retroviral acut)


Titru viral ridicat > 10 milioane copii ARN HIV/ml
Scadere tranzitorie a nr celule CD4+ Infectia preponderenta a macrofagelor

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

Fereastra serologica

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

2. Infectia asimptomatica- raspuns imun puternic


Eficienta rspunsului imun n infectia primar influenteaz nivelul ncrcrii virale fixnd un set-point (o anumit concentratie plasmatic a virusului.)

Virionii provin din celule CD4+ infectate recent, activate si in curs de diviziune Raspuns citotoxic eficient Productia de novo de limfocite CD4+ compenseaza liza produsa direct de virus si cea CD8 indusa

CD4
ARN HIV

Virusul persista in ganglioni limfatici si celule dendritice;


ADN proviral integrat

limfocitele CD4+ de memorie au

Catedra de Virusologie UMF Carol Davila- 2009

Walker BD, Goulder PJ. AIDS. Escape from the immune system. Nature. 2000;407:313-4. Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

HIV and AIDS

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

3. ARC Pierdere masiva de celule CD4+ celule tinta pentru replicarea virala Celulele Dendritice prezinta antigenele HIV pe masura ce sunt activate

deletie clonala a LT CD4 + care prolifereaza ca raspuns la prezenta virusului


Variabilitate virala eludarea raspunsului imun

IOAIDSrisc vital 4. fara


Limfocitele CD8+ distrug din ce in ce mai multe celule CD4+ Scaderea nr celulelor CD8+ Cresterea masiva a titrului viral scaderea nr celulelor CD4+<200/mm3-SIDA infectii oportuniste cu risc vital deces in
Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

Evolutia infectiei HIV Replicare viral masiv n tesutul limfoid, Depletia limfocitelor T CD4+ infectate, Hiper-reactivitate imun generalizat. Catedra de Virusologie UMF Carol Davila- 2009

MODEL PENTRU EXPLICAREA ACTIVARII SI TUROVERULUI CRESCUT AL LT CD8 + Distrugerea GALT permite translocarea produse microbiene liganzi TLR in circulatia sistemica

Atragerea celulelor efectorii la siturile privilegiate ale replicarii HIV disfunctionalitati in ciclul celular si cresterea apoptozei

Expunerea celulelor imunocompetente la liganzi TLR determina activarea hiper-activare imuna APC si TCR si secretie masiva citokine

Cresterea expresiei CD69 pe suprafata LT CD8+ determina retinerea acestora in gg limfatici- activarea CD4+ efectorii si de memorie cu intrare ciclu celular si apoptoza

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

TINTE PENTRU INHIBAREA REPLICARII HIV

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

Anti-HIV Strategies
Highly
Active AntiRetroviral Therapy
HAART: 2NRTI+ 1 PI 2NRTI+ 1 NNRTI
Catedra de Virusologie UMF Carol Davila- 2009

Highly
Expensive AntiRetroviral Therapy

Risks and Benefits of Early Therapy


BENEFITS Earlier suppression of viral replication Preservation of immune function Prolongation of disease-free survival Lower risk of resistance with complete viral suppression Decreased risk of HIV transmission RISKS Drug-related reduction in quality of life Drug-related toxicities Earlier development of drug resistance, if viral suppression is sub-optimal Limitation of future treatment options Unknown durability of current therapies

Catedra de Virusologie UMF Carol Davila- 2009

PROFILAXIA TRANSMITERII MATERNO-FETALE Delivery Plasma HIV RNA Levels and Perinatal Transmission in WITS, 1990-1999
Blattner W. XIII AIDS Conf, July 2000, Durban S Africa (LBOr4)

40
% Transmission

32% 21%

30 20

11%
10

6% 1%
<400 4003000 3000- 40000- >100000 40000 100000

Delivery Plasma HIV RNA


Catedra de Virusologie UMF Carol Davila- 2009

PACTG 076 targeted multiple potential transmission time points


Pregnancy
Labor & Delivery

Newborn

ZDV ZDV 100mg po 5x/d Target: In Utero ZDV IV:


Load 2mg/kg 1 mg/kg/hr

2mg/kg q 6

ZDV syrup hr x 6 wk

Target: Intrapartum

Target: Postpartum

Catedra de Virusologie UMF Carol Davila- 2009

Reducing intrapartum HIV transmission

ACTG 076: Three part ZDV regimen Transmission rate 25% (placebo) to < 8% (ZDV)
HIVNET 012 in Uganda - 200 mg oral nevirapine at onset of labor + 2 mg/kg oral nevirapine given to infant within first 3 days. Transmission rate 25% (placebo) vs. 13% (NVP)

C-section
Protective effect of C/S - Risk of transmission 50%< Elective C/S + ARV - Risk of transmission 87%<
Catedra de Virusologie UMF Carol Davila- 2009

Adrese de Internet utile celor interesati de diagnosticul, tratamentul si prevenirea infectiei HIV
http://hivatis.org/atisnew.html (HIV AIDS Treatment Information Service) http://www.actis.org (AIDS Clinical Trials Information Service) si de aici prin - http://www.actis.org/relatedwebs.html o suita de alte situri grupate pe capitole de interes (prevenie, transmitere, vaccinuri, infectia HIV pediatric, reagenti pentru diagnostic, etc.), http://hivinsite.ucsf.edu/InSite extrem de complexa baza de date a Universittii din California, San Francisco, cu statistici de ultim or si informatii despre preventie, transmitere, terapie, cercetri multidisciplinare. http//www.medscape.com/Home/Topics/ID/AIDS.html- o adresa indispensabil tuturor specialistilor implicati n tratarea pacientilor HIV pozitivi. http://www.cdc.gov/std/program- pentru preventia bolilor transmisibile sexual (STD), a TBC si SIDA http://www.atdn.org/access/drugs.html-date actualizate despre medicamentele antiretrovirale
Catedra de Virusologie UMF Carol Davila- 2009

Diagnosticul molecular in virusologie


AMPLIFICAREA TINTEI
PCR NASBA (nucleic acid sequenced based amplification)

AMPLIFICAREA SEMNALULUI
B-DNA (branched DNA)

B-DNA
Amplifies signal

PCR
Amplifies a Targeted Sequence

Target Sequence DNA Strand

Double Helix DNA Strand

Chromosome

Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon

No. of Cycles 1 2 3 4 5

No. Amplicon Copies of Target 2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,822

2 cycle = 4 Amplicon

3 cycle = 8 Amplicon

4 cycle = 16 Amplicon

5 cycle = 32 Amplicon

6 cycle = 64 Amplicon

6 20 30

7 cycle = 128 Amplicon

PCR: Componentele Master Mix


ADN tinta

Mg2+ Mn2+ Taq DNA Polimeraza

dNTP Primeri Sens Antisens

The central dogma

RT- PCR
Reverstranscriere

+ PCR

DETECTIA AMPLICONULUI
Electroforeza in gel de agar colorare cu bromura de ethidiu si comparare cu markeri de GM cunoscuta
Hibridizare cu sonde moleculare marcate complementare si apoi detectie (+/spectrofotometrica)

Hibridizare cu sonde moleculare marcate complementare

(more formally called an DNA blot) Southern blot

Hibridizare
Avidin-horseradish peroxidase (Av-HRP conjugate) Biotin Tetramethylbenzidine (TMB) Substrate

BSA

Microwell Plate

Addition of Substrate

Hydrogen Peroxide

Capture Probe Detectie spectrofotometrica


BSA

Add Stop Solution and Measure Absorbance

Utilizarea metodelor moleculare in infectia HIV


Fereastra serologica Nou-nascuti din mame seropozitive HIV Initierea si monitorizarea terapiei antiretrovirale
iv>5-10.000 corelat cu nr. CD4 si status clinic iv>30-50.000 indiferent de nr. CD4 si status clinic Monitorizarea: reducerea iv sub 50 copii ARN HIV/ml la 24 sapt

Diagnosticul infeciei VHC


TESTE SEROLOGICE EXEMPLE ELISA RIBA / Western Blot TESTE CALITATIVE RT-PCR APLICATII Nu pot diferenia ntre o infecie acut, cronic sau vindecat Diagnosticul infectiei active COMENTARII ELISA-sensibilitate mare, n populaii cu risc sczut de infecie are valoare predictiv mic Detecia timpurie a infectiei O singur determinare negativ-neconcludent

MOLECULARE

TESTE CANTITATIVE -Rt-PCR -b-DNA TESTE DE GENOTIPARE Secveniere nucleotidic, RFLP, LiPA

Aprecierea rezultatelor terapiei Genotipuri Subtipuri Qvasispecii

Nu exclude diagnosticul infeciei

Apreciaz durata tratamentului i prognosticul rspunsului virusologic susinut

Monitorizarea evolutiei naturale /sub tratament a hepatitei virale B


Riscul de ciroza creste cu nivelul VL, atat pt persoanele AgHBe negative, cat si pt cele AgHBe pozitive

Initiere tratamentului pt hepatita cronica B


Tratamentul este initiat pe baza
PBH VL Transaminaze serice La persoanele AgHBe negative, iv >10.000 copii/ml indica infectie activa (marker de infectivitate virala).

Diagnostic HPV
1. Detectia prezentei virusului / Demonstrarea infectiei active - detectia ADN-ului viral din leziune 2. Decelarea genotipului de virus implicat in infectie

Genotipare HPV : Inno lipa (Microgen) 26 genotipuri

Genotipare HPV :
Linear Array HPV (CE-IVD); Roche 37 genotipuri
6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39, and CP6108. Inregistrat in UE bazat pe PCR urmat de hibridizarea acizilor nucleici

ALGORITMUL DIAGNOSTICULUI IN VIROZE

Etapele diagnosticului virusologic


Recoltarea produsului patologic Transportul produselor patologice Direciile diagnosticului virusologic

RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE STERIL!!!

Fluidele orale reduc riscul contaminarii, simplifica procedura de recoltare

Snge - 3-5 ml prin punctia venoasa aseptica, pe anticoagulant. Virusuri frecvent izolate: virusuri care disemineaza viremic si agentii etiologici ai febrelor hemoragice. Materiile fecale - 4-8 g in solutie de Mg SO4 (stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor). Virusuri frecvent izolate: enterovirusuri, rotavirusuri, calicivirusuri, mai rar adenovirusuri enterice. Secretii nazo faringiene a) spalatura nazo faringiana se obtine cu ajutorul unor tampoane cu coada (sterile) introduse in cornetul nazal inferior. b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic. c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat Virusuri frecvent izolate: virusurile gripale A si B, virusurile paragripale, adenovirusuri, rhinovirusuri, coronavirusuri, virusul respirator sincitial, v.rujeolos, v. rubeolos, v. urlian. Lichid cefalorahidian (LCR) - 5-6 ml prin punctie rahidiana, inainte de inceperea tratamentului. Virusuri frecvent izolate: virusul rabic, unele arbovirusuri.

PRODUSE PATOLOGICE

PRODUSE PATOLOGICE
Saliva. Se recolteaza saliva de langa ductul Stenon cu tampon steril. Frecvent este limitata la diagnosticul infectiei rabice. Lichid vezicular - Colectarea lichidului din vezicule, bule, pustule se face dupa dezinfectia prealabila a regiunii cutanate sau mucoase. Se perforeaza vezicula cu un ac atasat la o seringa de tuberculina sau cu ajutorul unei pipete. Virusuri frecvent izolate: HSV I, HSV II si VZV. Urina -100 ml - orice specimen urinar obtinut prin abstinenta de la mictiune timp de 2 ore este adecvat pentru diagnosticul virusologic. Virusuri frecvent izolate. V. citomegalic, v. rujeolos. Tampoane vaginale, lavaj cervico-vaginal, tampon uretral de la nivelul colului uterin si uretrei (atat la femeie cat si la barbat); cu tampoane sterile, respectiv periuta citologica (pentru uretra masculina), fara toaleta prealabila a regiunii. Virusuri frecvent izolate: virusuri herpetice si papilomavirusuri; diagnostic BTS, uretritelor, leziunilor veziculare si hiperplazice genitale. Biopsia tisulara. Fragmente de organ recoltate n ctiva ml de solutie salina + ser de vitel 10% + antibiotice n concentratiile folosite n culturile de celule.

Transportul probelor recoltate


Rapid La rece Sigur
ambalare riguros corecta etichetarea cu semn biorisc documentatie in legatura cu agentul biologic transportat

Formular de trimitere pentru diagnostic virusologic


Adresa spitalului/policlinicii/ cabinetului ce trimite produsul patologic Nume, prenume pacient Date clinice, suspiciune diagnostic Tipul produs patologic Tipul tratamentului administrat in prealabil Medicul caruia i se va comunica rezultatul (tel, fax, email) Sex, Varsta Data debutului simptomatolgiei Data, ora recoltarii Date epidemiologice (contact cu boli infectioase transmisibile, vectori, calatorii in zone endemice pt o anumita boala, vaccinari)

Analiza solicitata Semnatura, parafa medicului

Direciile diagnosticului virusologic


1. Izolare virala in:
Culturi de celule Ou de gaina embrionat Animal de laborator

2. Detectia directa a :
Particulelor virale EM , IEM Antigene virale ELISA, IF Genom viral PCR; Rt-PCR

3. Teste Serologice:
a. Ac virus- specifici tip IgM b. seroconversia in ac virus- specifici tip IgG

Izolarea virala prin inoculare pe OGE

Pocks-uri pe MCA a OGE - v. variolic

Detectia directa a particulei virale prin Microscopie Electronica


Coloratia negativa acetat de uranil acid fosfotungstic Metode care cresc sensibilitatea (106-108 particule/ml): SPIEM, SIA Metode de concentrare:
ultracentrifugare difuzia in agar

centrifugare directa pe grila de ME

Diagnosticul serologic
pe prob unic de ser - anticorpi antivirali de tip IgM (rspunsul imun primar) - ELISA de captur pe probe pereche de ser
- proba I - la debut - proba II - la 2-3 sptmni

ELISA tehnica indirect sau de competiie


seroconversia (proba I - nu exist anticorpi/ proba II - apar anticorpi specifici virusului de detectat), creterea semnificativ a titrului de anticorpi ntre cele 2 probe (de minim 4 ori)

Etapele diagnosticului virusologic


Izolarea viral Diagnosticul serologic

Dem. virusului/componente

Direciile diagnosticului virusologic


Transportul produselor patologice

Recoltarea produsului patologic

Suspiciunea de viroz

IMUNITATE ANTIVIRALA
Raspunsul imun nespecific (innascut)
Efectori umorali: interferoni Efectori celulari: celule NK

Raspunsul imun specific (dobandit):


Rspunsul primar: timpuriu, pasager, anticorpii sintetizati sunt de tip IgM., cu afinitate redus, sunt relativ putin specifici. Rspunsul secundar este tardiv, persistent, anticorpii sintetizai sunt de tip IgG ce recunosc cu mare specificitate un anumit tip sau subtip de virus. In cursul rspunsului secundar se produce maturarea afinittii anticorpilor.

Efectori umorali: anticorpi- limfocite B Efectori celulari: celule imunocompetente-limfocite T

ROLUL INTERFERONILOR
PAMPs -pathogenassociated molecular patterns

pattern recognition receptors

Legati de membrana-Toll like receptors (TLR3) Citoplasmatici RIG-I- gena inductibila de acid retinoic (DEAD-box protein 58 )- motivul conservat Asp-GluAla-Asp (DEAD)- ARN helicaza- implicata in legarea si alterarea structurii secundare a ARN

Efectele biologice ale IFN: - antiviral, mai ales pe v. ARN, - anticelular inhib diviziunea celulelor normale si canceroase, - imunomodulator stimuleaz sau inhib actiunea altor citokine.

Sinteza de IFN

MECANISMUL ACTIUNII IFN

IFN cuplat la receptori (o categorie de receptori pentru IFN alfa/beta, alt categorie de receptori pentru IFN gama) recruteaz tirozinkinaze din familia Janus care fosforileaz proteinele citoplasmatice STAT care odata fosforilate, migreaz n nucleu activnd genele inductibile de interferon

JAK- Janus kinase ( "Just another kinase") ;STAT -signal transducer and activator of transcription ISGF3 -IFN-stimulated gene factor 3 (contine STAT1, STAT2 si un alt factor de transcriptie-IRF9 ISRE -IFN-stimulated response element ;ISGs -IFN-stimulated genes; GAS -gamma activated sequence

MECANISMUL ACTIUNII ANTIVIRALE A IFN


Actiunea antiviral a interferonului este speci-specific, dar virus nespecific

PREMIUL NOBEL PENTRU MEDICINA SI FIZIOLOGIE 2006

siRNA (small interfering RNAs) ARNds 21-23 bp, )+ molecule proteice -helicazelor si nucleazelor

RNA interference specificity complex

transfectia celulelor cu siRNA sintetici; productia endogen de shRNAs

Andrew Z. Fire
1/2 of the prize USA Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA b. 1959

Craig C. Mello
1/2 of the prize USA University of Massachusetts Medical School Worcester, MA, USA b. 1960

"for their discovery of RNA interference - gene silencing by ds RNA

siRNAs inductori puternici ai IFN si altor citokine inflamatorii in vivo and in vitro

CELULE IMUNOCOMPETENTE

RECEPTORI LIMFOCITARI
Limfocite B- receptori - imunoglobuline de suprafata

Limfocitele B recunosc epitopi conformationali- proteine virale native

Limfocite T- receptori - TCR

Limfocitele T recunosc Epitopi liniariproteine virale procesate si prezentate de APC

ACTIVAREA LIMFOCITELOR B

CLASELE DE IMUNOGLOBULINE

Actiunea antivirala a anticorpilor


Anticorpii (suportul imunittii umorale) actioneaz att asupra virionilor liberi extracelulari ct si asupra celulelor infectate viral.Actiunea asupra virionilor liberi este virus-neutralizant. Legarea structurilor superficiale (anvelop, capsid) ale virionilor, produce modificri conformationale si impiedic adsorbtia si internalizarea.

Efectorii rspunsului imun celular: APC-antigen presenting cells-Celule foliculare dendritice (CFD ) si Macrofage Limfocitele T helper (CD4+) Limfocitele T citotoxice (CD8+)
CFD

Proteinele virale (mai ales cele din anvelop sau capsid) nu sunt recunoscute ca atare de TCR, clivare n peptide, unele cu rol determinant n protectie - epitopi dominanti

PREMIUL NOBEL PENTRU MEDICINA SI FIZIOLOGIE 1996

FENOMENUL DUBLEI RESTRICTII ZINKERNAGEL - DOHERTY CMH TCR - ANTIGEN PROCESAT

Peter C. Doherty
1/2 of the prize Australia St. Jude Children's Research Hospital Memphis, TN, USA b. 1940

Rolf M. Zinkernagel
1/2 of the prize Switzerland University of Zurich, Institute of Experimental Immunology Zurich, Switzerland b. 1944

"for their discoveries concerning the specificity of the cell mediated immune defence"

PROCESAREA ANTIGENELOR VIRALE PENTRU RECUNOASTERE DE CATRE TCR

MOLECULE CMH

CMH I-procesare intracelulara Peptid 8-10 aa, fixat

CMH II- procesare extracelulara Peptid 12-25 aa, labil

SELECTIA LIMFOCITELOR- Tc-CD8+ - CMH I; Th CD4+ - CMH II

ROLUL LIMFOCITELOR Th
Exist dou subseturi de celule Th, dupa profilul citokinelor sintetizate: Th1 - IL2 si interferon gama regleaza RI celular Th2 - IL-4, IL-5 , 6, 10 regleaza RI umoral
Ag Ag Ag

APC

Antigen-presenting cell IL4, 5, 6, 10

Th2

Th1
IL2 + IFN gama Tc cell
Granulocyte

B cell

Macrophage

NK NK cell

IL1, TNFalfa, IFN

ROLUL LIMFOCITELOR Tc

Tc cell
Perforin polymerizes Ca++

Perforin monomers

Tc cell

Granzymes

Polyperforin channels

Target cell

Target cell

LIMFOCITE T CITOTOXICE

Proteina TM ce apartine familiei TNF

Efectori celulari in rezistenta naturala CELULE NK

CELULE CE ASIGURA CITOTOXICITATEA IN INFECTIA VIRALA

MACROPHAGE

IMUNITATE ANTIVIRALA- cooperare intercelulara

VIRUSURI SI CANCERE
RETROVIRIDAE-ONCOVIRINAE HEPADNAVIRIDAE- VHB HERPESVIRIDAE- EBV; HHV8 PAPOVAVIRIDAE-PAPILOMAVIRINAE

273

PAPILOMAVIRUSURI
Expresia genelor L1 si L2 limitata la keratinocitele diferentiate din stratul extern

E1 codifica o proteina cu rol de helicaza ce initiaza replicarea virala E2 reglator transcriptional

E4 implicat in eliberare disruptia citoskelet E5 destabilizeaza expresia multor proteine membranare-inclusiv CMH- previne distrugere celule infectate de LTc 274

INFECTIE LITICA infectia productiva in celule permisive

din stratul extern ce se exfoliaza

Expresia genelor E1 si E2 necesara replicarii Woodman et al. Nature Reviews Cancer 7, 1122 (January 2007) | doi:10.1038/nrc2050 si mentinerii ADN viral in stare epiomala.

INFECTIA PERSISTENTA in celule nonpermisive din stratul bazal cu TRANSFORMARE

LCR-Controlul expresiei genelor virale contine enhanceri care pot fi activati de factori celulari sau virali

Woodman et al. Nature Reviews Cancer 7, 1122 (January 2007) | doi:10.1038/nrc2050

Supraexpresia genelor E6 si E7-pierdere control ciclu celular

P53 -factor de transcriptie activeaza expresia p21, un inhibitor al complexului ciclinelor. Control progresie ciclului celular in toate fazele

Rb previne intrarea celulei in faza S. Rb nefosforilat se leaga de factor de transcriptie E2F si previne activarea gene necesare pentru sinteza ADN

277

E6 HPV- asociat cu P53 =degradare la nivel proteazom -pierderea controlului

ciclinelor progresie necontrolata in ciclul celular


Rb inhiba expresia p16-INK4A, inhibitor de kinaza ciclindependenta P16 TSG- exprimat in concentratii foarte reduse in celule normale si supraexprimat in celule transformate HPV Supraexpresia P16 marker al activarii expresiei oncogenelor virale si dereglarii ciclului celular

E7 HPV asociat cu Rb = inactivare-eliberare E2F-

activare necontrolata a genelor implicate in sinteza ADN (c-myc si c-fos, ADN polimeraza).

278

VIRUSURI ONCOGENE ADN-HPV


ADN polimeraza ADN-dependenta (celulara sau virala)

enom viral ADN

ARN polimeraza celulara


ARNm viral

Proteine virale timpurii ce cupleaza antioncogene celulare Inactivare/degradare


TRANSFORMARE
279

HPV Risc oncogen inalt :

cervical ; cancere anogenitale,

16, 18, 31, 33, 35, 39, LGSIL; HSIL ; cancer 45, 51, 52, 56, 58, 59, alte
68, 73, 82 cancer cap-gat

HPV Risc oncogen scazut:


6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81

displazie cervicala usoara

condiloma accuminata papilomatoza respiratorie recurenta

280

INFECTIA HPV
Incubatie variabila (2->6 luni) Infectie asimptomatica posibila (latenta) Localizareuretra, penis, scrot, vulva, vagin, cervix, perineu, perianal (autoinoculare sex nonpenetrativ) Infectie multipla posibila 74% -persoane 15-24 ani

281

Premiul Nobel pentru Medicina sau fiziologie 2008

Papiloma virusuri se gasesc la > 95% din femeile cu cancer de col uterin
Harald zur Hausen 1/2 of the prize German Cancer Research Centre Heidelberg b. 1936

282

Progresia de la infectia HPV persistenta la cancer invaziv 10-15 ani. Leziuni cervicale pre-invasive gradate pe baza aspect HP CIN 1 -CIN 3 (cea mai scazuta probabilitate de regresie spontana)

Screening
La 3 ani de la inceperea vietii sexuale/ sau la 21 ani Citologie Pap conventionala sau in faza lichida +/- testare ADN HPV

Incidenta cancer cervical pre-PAP 30- 40/100 000 post PAP 8.8/ 100 000 (cca 75% reducere), de 15 x< cancer de san

LSIL(low-grade squamous intraepithelial cells) displazie usoara, CIN I (Cervical intraepithelial neoplasia) - Colposcopie si biopsie HSIL(high grade squamous intraepithelial cells), displazie moderata/severa, CIN II/III,carcinom in situ- Colposcopie si biopsie si/sau chiuretaj endocervical Tratament cu LEEP, crioterapie, laser, conizatie sau histerectomie

283

RECOMANDARI OMS
Screening anual nu este recomandat la nici o grupa de varsta Screening periodic femei >30 ani; Pentru grupa de varsta 2549 ani screening o data la 3 ani Daca screeningul nu se poate realiza periodic varsta optima este intre 35- 45 ani; Pentru femei cu varsta> 50 de ani screening o data la 5 ani Screening nu este necesar pentru femei >65 ani daca ultimele 2 frotiuri PAP au fost negative

284

CANCER DE COL UTERIN 270 000 decese/an 70% din cazuri datorate HPV 16, 18

ROMANIA 3 448 CAZURI NOI/AN 2 094 DECESE/AN


RATA STANDARDIZATA PE VARSTA- 23.9 / 100 000 FEMEI RATA MORTALITATII 13 / 100 000 FEMEI
Sursa: IARC Globocan Cancer Base No. 5, version 2.0., 2002 Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide. (http://wwwdep.iarc.fr/globocan/downloads.htm, accessed 26 March 2008).

285

Site Cervix Penis

HPV (%) 100 40

HPV 16, 18 (%) 70 63

% of all cancers 3.18 0.06

Vulva, vagina
Anus Mouth

40
90 3

80
92 95

0.12
0.23 0.07

Oro-pharynx

12

89

0.05

Source: Parkin DM, Bray F. Vaccine, 2006, 24(Suppl. 3):S11S25.

286

VACCINAREA ANTI HPVPROFILACTIC

GARDASIL Merck-cvadrivalent- genotipurile HPV 16/18; HPV 6/11 3 doze 0, 2 ,6 luni-acceptat iunie 2006 de FDA si septembrie 2006 de EMEA (vaccinare fete virste 9-15 ani) introdus in UE (27 tari)- din octombrie 2007 si alte tari din regiunea europeana OMS (Bosnia si Herzegovina, Croatia, Islanda, Israel, Liechtenstein, Norvegia, Rusia, Serbia, Elvetia, FYR Macedonia, Turcia.) . Protectie impotriva displaziei cervicale si vulvare de grad inalt, cancer cervical si papiloame genitale produse de infectia cu HPV 6, 11, 16, 18

CERVARIX

Glaxo Smith Kline - bivalent genotipurile HPV 16/18 In

Septemberie 2007, autorizatie de marketing de la EMEA pentru

prevenirea leziunilor cervicale precanceroase (CIN grad 2 si 3) si cancer


cervical determinat de infectia cu HPV 16 si 18 Din Octombrie 2007, inregistrat si in Islanda, Kazakhstan si Norvegia A 2a jumatate a lui 2009 in SUA
287

288

ROMANIA Scaderea varstei medii la inceperea vietii sexuale 1 din 5 adulti tineri > 1 partener sexual in ultimele 3 luni 58,9% din barbati si 52,9% din femei utilizeaza prezervativul la primul contact sexual sau in cursul activitatii sexuale curente

289

PARTICULE "VIRUS-LIKE (VLP)-PROTEINA CAPSIDARA MAJORA L1 ANTICORPI NEUTRALIZANTI SPECIFICI DE TIP

290

Vaccinuri anti HPV


informatii derivate din studii preliminare
inalt imunogene si sigure, protectie pentru 5 ani- 98% seropozitivitate anti HPV-16/18 96.9% eficienta impotriva aparitiei de noi infectii cu HPV-16 and HPV-18 94.3% impotriva persistentei infectiei 100% eficienta impotriva leziunilor de neoplazie cervicala intraepiteliala protectie impotriva dezvoltarii altor leziuni citohistologice si impotriva infectiilor noi cu genotipuri inrudite structural
HPV 31, 33, 52, 58 similare HPV 16 HPV 39, 45, 59 similare HPV 18

100% din femeile vaccinate cu varste 1126 ani au dezvoltat un raspuns umoral cu titru inalt de VACCINAREA NUluna a anticorpi (de 10- 10 000ade orisi>apoi constant cel INLOCUIESTE SCREENINGULdecat in infectiile naturale) varf in 7 a declin pana in luna 18 a putin 5 ani) CITOLOGIC/VIRUSOLOGIC PERIODIC SI NU TREBUIE SA

AFECTEZA MASURILE DE PROFILAXIE IMPOTRIVA BTS


291

292

SIGURANTA VACCIN ANTI HPV


7 STUDII CLINICE PRE-APROBARE- 21,000 FETE 9 - 26 ANI The Vaccine Adverse Event Reporting System (VAERS)-The Vaccine Safety Datalink (VSD) -un proiect intre CDC si 8 organizatii ce studiaza pattern rapoarte si stabilesc legatura cauzala . The Clinical Immunization Safety Assessment (CISA) Network- un proiect intre 6 centre academice ce studiaza efectele adverse produse de vaccinare Septembrie 2009> 26 milioane doze Gardasil distribuite SUA , -15,037 rapoarte asupra efectelor adverse ce urmeaza vaccinarea cu Gardasil in VAERS 93% reactii adverse usoare (durere, lesin, inflamatie la loc injectare, cefalee, greata, febra) 7% reactii adverse severe Guillain-Barr Syndrome slabiciune musculara-1-2/ 100,000 persoane Tromboza (contraceptive) 44 decese in US-17 neidentificare persoana; 27 investigate- fara legatura cauzala cu vaccin

293

VIRUSURI IMPLICATE IN ONCOGENEZA


ACTIVEAZA ONCOGENE celularemutatii gain of function

INACTIVEAZA ANTIONCOGENE mutatii loss of function G2

Rb P53 cicline

G1

Stabilitate genica
294

TERAPIA GENICA IN CANCER


Terapia genic "ex vivo" -transferul unor gene clonate n prealabil n culturi de celule autologe -posibilitatea seleciei celulelor n care transfectia s-a realizat cu succes i care exprima gena i amplificarea lor n cultur nainte de transfer. Terapia genic "in vivo" - transferul direct al genelor clonate n esuturile pacientului - vehicul de tip lipozomi sau vectori virali recombinani care produc i transfer gena n celulele nvecinate. Eficiena transferului i expresiei genei fara posibilitatea seleciei i amplificarii celulelor ce preiau i explim gena de interes. Gena transferat -o minigen artificial - o secven de ADN complementar celei de interes -se poate integra n cromozomii celulei sau poate rmne 295 episomal

VIROTERAPIA- ONCOLIZA VIRALA


VIRUS ONCOLITIC SELECTIV IDEAL
Infecteaz, se replic si lizeaz celulele tumorale Nu se replic n celule normale esentiale pentru organism Determin cel mult simpomatologie limitat Exist medicamente antivirale specifice eficiente Este stabil genetic Nu se integreaz n genomul celular Poate fi produs n concentratii mari dup protocoale GMP recunoscute

CAPACITATE CITOTOXIC FOCALIZAT NUMAI ASUPRA CELULELOR CANCEROASE Deletia structurilor care leag receptorul natural si redirectionarea adsorbtiei ctre proteine exprimate de celulele canceroase- Adenovirus delta -24 RDG Mutante virale cu gene timpurii deletate - Selectia unor mutante virale care se replic numai n celulele tumorale care au alterat expresia unor antioncogene. Mutante virale dependente de promotori activi doar intra-tumoral ( Adenovirus reglat de PS; adeno si herpesvirusuri reglate de

Doi vectori virali HSV-1- G207 and NV1020, cu multiple mutatii (ce aduc gena pt TK sub controlul unui alt promotor) si nu au capacitate de replicare in celulele ce nu se divid Infectie virala litica genereaza expresia genelor pentru TK si sensibilizeaza celulele canceroase la ganciclovir (trialuri faza i/II pt gliom si cancer colorectal cu metastaze hepatice )

Mutante adenovirale cu genele timpurii deletate ex: ONYX-015- adenovirus ce nu exprima proteina E1B se replica doar in celule deficiente in expresia p53 Primul adenovirus oncolitic a nceput s fie aplicat pe scar larg n China din 2005 pentru tratamentul carcinomului nazofaringian. Adenovirusurile oncolitice sunt folosite experimental si n tratamentul unor glioame sau unor tumori hepatice. Efectul este sinergic n cazul administrrii simultane de citostatice.

297

Companii ce dezvolta terapii genice in cancer

Cell Genesis - www.cellgenesys.com Crusadehttp://www.crusadelabs.com/cancer Medigene-www.medigene.com Oncolytics-www.oncolyticsbiotech.com

298

3. PLATOU -Maturarea proteinelor virale -Asamblarea acizilor nucleici cu proteinele structurale -Eliberarea virionilor progeni

1. ECLIPSA -Adsorbtie - Internalizare - Decapsidare

2. CRESTERE LOGARITMICA -Sinteza de proteine virale timpurii: (rol enzimatic si in edificarea incluziilor) -sinteza de noi acizi nucleici virali -sinteza de noi proteine virale structurale

ADSORBTIA

Model in punte-v. anvelopate Model creasta canion- v. neanvelopate

HIV atasat de un limfocit T CD4

CORECEPTORI

Multiplii bacteriofagi atasati de peretele celular bacterian

Internalizare prin fuziune-v. anvelopatefactori de fuziune prin endocitoza mediata de receptori- v. Neanvelopate

Dupa Endocytosis, Edited by Ira Pastan and Mark C. Willingham, Plenum Press, N.Y., 1986

VIRUSURI ADN 1. SINTEZA PROTEINELOR TIMPURII

INCLUZII

2.REPLICAREA VIRUSURILOR ADN


Intranuclear (cu exceptia poxviridae) Fidelitate mare a transcrierii

PREMIUL NOBEL PENTRU CHIMIE 2009

"for studies of the structure and function of the ribosome"

Venkatraman Ramakrishnan 1/3 of the prize United Kingdom MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, UK b. 1952

Thomas A. Steitz 1/3 of the prize USA Yale University New Haven, CT, USA; Howard Hughes Medical Institute b. 1940

Ada E. Yonath 1/3 of the prize Israel Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel b. 1939

VIRUSURI ARNSS CU POLARITATE POZITIVAintracitoplasmatic


Picornaviridae, flaviviridae
Genom parental=ARNmdebut cu traducere proteine ARNm viral nu are structura 5' cap metilata tipica pentru ARNm eucariot , ci o pista de aterizare pentru ribozomi Gazda eucariota utilizeaza pentru sinteza proteinelor ARNm monocistronic

ARNm viral actioneaza ca un transcript monocistronic

VIRUSURI ARNss CU POLARITATE NEGATIVA obligatoriu asociate cu transcriptaza virala


intracitoplasmatic, cu exceptia Orthomixoviridae
Prima etapa =sinteza , prin intermediul transcriptazei virale, a spirei complementare ARNss cu polaritate pozitiva=ARNm Virusul sintetizeaza mai multe specii de ARNm monocistronic sau transcriptele primare sunt prelucrate prin splicing de gazda pentru a rezulta mai multe specii de ARNm monocistronic

CLASIFICAREA BALTIMORE
I: virusuri ADN ds (Adenoviruses, Herpesviruses, Poxviruses) II : virusuri ADN ss (Parvoviruses) III: : virusuri ARN ds ( Reoviruses) IV: : virusuri ARNss (+) ( Picornaviruses) V: : virusuri ARN SS() (Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses) VI: : virusuri ARN ss RT (Retroviruses) VII: : virusuri ADNds-RT ( Hepadnaviruses)

MATURARE-ASAMBLARE-ELIBERARE
In maturare si asamblare intervin chaperoni -dirijeaza asamblarea post-translationala, impachetarea proteinelor si previn agregarea in structuri nefunctionale a lanturilor proteice nou sintetizate. -sunt implicati in transportul transmembranar

ELIBERARE-INMUGURIRE

SUMAR
Replicarea virusurilor se desfsoar n trei faze succesive. ECLIPSA ( adsorbtie, internalizare si decapsidare)
Adsorbtia este urmarea cuplrii unor proteine virale superficiale (liganzi sau antireceptori) de receptori situati pe membrana celular. Acestia sunt de nalt afinitate (ce induc si modificari conformationale in virionii adsorbiti) si uneori si de joas afinitate (co-receptori) Internalizarea se realizeaz fie prin viropexie (endocitoz), fie prin fuziunea anvelopei virale cu membrana celular Decapsidarea este un proces simultan cu internalizarea n care intervin determinant proteaze celulare. Absenta acestor proteaze fac celula nesusceptibil sau partial permisiv la infectia viral

FAZA DE CRESTERE LOGARITMIC ( sinteza proteinelor timpurii, sinteza genomurilor progene , sinteza proteinelor tardive (structurale)
fidelitatea replicrii este mai mare la virusurile ADN comparativ cu virusurile ARN. In plus, virusurile mai complexe sunt mai stabile fizic dect virionii mici.

FAZA DE PLATOU (maturare, asamblare si eliberare a virionilor progeni din celula infectat)
Asamblarea este guvernat de legile simetriei care tind s asigure soliditatea particulei virale ca element cu minim energie liber. Uneori, n procesul de asamblare intervin proteinele chaperon (petitor) care dirijeaz capsomerele virale spre areale ale membranei celulare unde se asambleaz virionii progeni. Acestia din urm se elibereaz prin nmugurire (n cazul virusurilor anvelopate) sau prin citoliz (n cazul virusurilor neanvelopate).

http://www.virology.net/Big_Virology/BVFamilyGroup.html

http://www.virology.net/Tutorials.html.-puteti nvta replicare viral,- nu trebuie dect s v decideti dac vreti s fiti pentru cteva minute un poliovirus, un coronavirus sau chiar HIV! Dac nu stiti ceva sunteti rapid trimisi la studiu, ctre foarte multe situri specializate

Aceleasi informaii, n versiuni mai sofisticate se obtin de la: http://www2.tulane.edu si www.virology.science.org/jov. (Jov este sintagma pentru Journal of Virology)

VIRUSURI SI CANCERE

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

CARCINOGENEZA-pierdere control ciclu celular


INITIEREA-modificari genetice determinate de doze subliminare ale unor agenti transformanti PROMOVAREA-factori necarcinogeni ce cresc frecventa sau scad latenta aparitiei tumorilor PROGRESIA-actiune persistenta sau noi expuneri la agenti transformanti
Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

CARCINOGENEZA-pierdere control ciclu celularPrize in Physiology or Medicine 2001 The Nobel


"for their discoveries of key regulators of the cell cycle"
Leland H. Hartwell, USA Tim Hunt, UK Sir Paul M. Nurse, UK

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

CARACTERELE CELULELOR TRANSFORMATE BIOCHIMICE: glicoliza anaeroba, autocrine, modificari in kinetica


mesagerilor secundari

ANTIGENICE: NEOANTIGENE codificate de


Gazda: antigene oncofetale (CEA , alfa FP) Virusuri: (TSTA- tumor specific transplantation antigens) produse in cursul infectiei abortive, persistente

MORFOLOGICE: aspect, forma variabila, raport N/C, fara inhibitie de


contact, independente de ancorare, aberatii cromozomiale, telomeraza activa

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 Elizabeth H. Blackburn, USA Carol W. Greider, USA Jack W. Szostak, USA for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

VIRUSURI SI CANCERE
Premiul Nobel pentru medicina sau fiziologie
1966-Peyton Rous, USA -"for his discovery of tumour-inducing viruses 1911descopera virusul sarcomulyui Rous

1989-J. Michael Bishop si retroviral oncogenes"

Harold E. Varmus -"for their discovery of the cellular origin of

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

ONCOGENE gene ce codifica o proteina capabila sa induca transformare celulara in


vitro /in vivo PROTO-ONCOGENE (ONCOGENE CELULARE)implicate in controlul ciclului celular

c-onc

Gene reglatorii

ONCOGENE VIRALE-v-onc

--fara introni -Nu sunt sub actiunea reglatorie a promotori celulari -Mutatii sau deletii ce altereaza produsul proteic -Produs v-onc e exprimat fuzionat cu alte proteine virale

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

PROTO-ONCOGENELE
Codifica proteine implicate in controlul cresterii si diferentierii celulare
Oncogenele RAS (K-RAS, N-RAS, and H-RAS,) sunt activate prin mutatii punctiforme in mai mult de 20% din cancerele umane (prevalent in cancer pancreatic, pulmonar si de colon)

Factori de crestere:sis~PDGF
Receptori pentru factori de crestere: EGFR, HER2/neu erb B/receptori hormonali: erb-A Mesageri secundari: PTK mb: src PTK solubile, citoplasmatice: ras Factori de Transcriere: jun,fos, myc

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

VIRUSURI SI CANCERE
RETROVIRIDAE-ONCOVIRINAE HEPADNAVIRIDAE- VHB HERPESVIRIDAE- EBV; HHV8 PAPOVAVIRIDAE-PAPILOMAVIRINAE

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

RETROVIRUSURI- ONCOVIRINAE; lentivirinae (HIV) , Spumavirinae


Murine leukemia virus; Feline leukemia virus

Bovine leukemia virus; Human T-lymphotropic virus

Avian leukosis virus; Rous sarcoma virus

Human T cell lymphotropic virus -1 (HTLV-1)-Adult T cell leukemia, Sezary T-cell leukemia Mouse mammary (Africa, Caribbean, Japanese Islands) tumour virus Simian foamy virus Human T cell lymphotropic virus -2 (HTLV-2)Hairy cell leukemia
Endogenous retroviruses (ERV) -8% of human DNA represents fossil retroviral genomes, + LINE elements (long interspersed elements)and other retrotransposons
Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

ONCOVIRUSURI
Genom ARN
TRANSFORMANTE in vitro si rapid oncogene in vivo au oncogene replicare defectiva NON-TRANSFORMANTE in vitro si lent oncogene in vivo nu au oncogene ACTIVARE INSERTIONALA

Rt
ADN proviral

Integraza
Integrare in genom celular

cofactori activatori
genom ARN +PROTEINE

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

Structura unui retrovirus tipic


LTR U5 GAG POL ENV U3 LTR

ONCOVIRUSURI TRANSFORMANTE in vitro, rapid oncogene in vivo Unele retrovirusuri au gene suplimentare-v-onc Rous Sarcoma Virus
LTR U5 GAG POL ENV U3 LTR

SRC

Unele retrovirusuri au oncogene in locul unei gene structurale-replicare defectiva

Avian Myelocytoma Virus (MC29)- oncogena myc in locul genei pol


LTR U5 dGAG
MYC dENV U3

LTR

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

RETROVIRUSURI NON-TRANSFORMANTE nu au oncogene virale, dar integrarea Provirusului ADN se realizeaza intotdeauna langa o protooncogena, care trece sub controlul promotorului transcriptional viral- activare aberanta
Genom ARN

ALV-Avian Leukosis Virus


Rt ADN proviral

U5

GAG

POL

ENV U3

R
Integraza Integrare

in cazul tumorilor ALV se integreaza in genom celular INTOTDEAUNA in ACELASI LOC- linga C-myc! ONCOGENEZA PRIN ACTIVARE INSERTIONALA

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

HEPADNAVIRIDAE- VHB
CHP - a 5-a localizare ca frecven a bolii canceroase i a 3-a ca mortalitate Incidena anual a CHP, 500 000 cazuri jumtate din CHP sunt asociate infeciei persistente cu VHB purttorii cronici de AgHBs au un risc de 25-37 x > de CHP

Proces multifactorial:

China: 500,000 - 1 milioane cazuri noi de CHP/an; Taiwan: RR CHP de 217 x > la purtatori cronici AgHBs Incrcarea viral; genotipul B peste 50% din cazurile CHP n Taiwan Factori alimentari- aflatoxina B1- metabolit al ciupercii Aspergillus flavus care contamineaz hrana vegetal -substane care rup helixul ADN. In Europa, 90% din CHP dupa ciroza avansate Coinfecia cu VHC, HIV Obezitatea, diabetul,alcoolism

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

Genomul viral poate induce deleii n genomul hepatocitar la situl de integrare--gene care afecteaz ciclul celular, viabilitatea celular sau cascade de semnalizare membran nucleu Amplificarea genica a unui segment de ADN ce contine protooncogena-supraexpresia proteinei Translocatii cromozomiale ce aduc proto-oncogena sub controlul unui promotor diferit- expresie aberanta

Genom ADN Proteinele reglatorii codificate ARNm de genele X si pre S2hiperexpresia unor inhibitori ai apoptozei genom ADN si ADNccc integrat
RNA polymerase II

Reverstranscriptaza

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila- 2009

HERPESVIRIDAE HHV8-SARCOMUL KAPOSI


HHV8-gene virale omologe ciclinelor

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

HERPES VIRUSURI
Epstein-Barr Virus Limfom Burkitt Carcinom Nasofaringean Boala limfoproliferativa Transforma limfocitele B umane in vitro

HIPEREXPRESIA UNOR PROTEINE VIRALE TIMPURII: FACTORI DE CRESTERE AUTOCRINI PT. LIMFOCITELE B RECEPTORI AI FACTORILOR DE CRESTERE ACTIVATORI AI UNOR ONCOGENE CELULARE

LIMFOM BURKITT- Latenta cu antigene virale asociate EBNA - Epstein Barr nuclear antigens Boala limfoproliferativ post transplant. antigene asociate LMP latent membrane proteins,

Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

Limfom Burkitt Translocatie 8:14

Procesele neoplazice apar frecvent ca rezultat al translocarii genelor

myb

myc

myc

fes
Catedra de Virusologie UMFCarol Davila2009

Leucemie mielocitara acuta 7:15 9:18 11:15:17