Presentación de resultados Laboratorio de Enzimas

Laboratorio de Biorreactores IEB448
Integrantes: Luis Herrera Eduardo Ortega Leonardo Serrano Nicolás Trujillo Profesores: Zaida Cabrera Álvaro Díaz

Introducción

•Caracterización de un preparado enzimático •Actividad y estabilidad enzimática •Reactor enzimático por lotes •Comportamiento cinético de la enzima •Elaboración de un manjar a partir de leche sin procesar

Materiales y métodos Determinación de la actividad enzimática * Adicionamos 4 mL de una solución de lactosa en un tubo de ensayo. Reactor enzimático por lotes * Para la puesta en marcha del reactor. con el cual haremos mediciones periódicas. Determinamos la concentración de glucosa mediante el método del glucostat. * Adicionamos 0. * Realizamos un blanco repitiendo lo anterior pero sin enzima. instalamos y calibramos el electrodo de pH (en nuestro caso fue fuera del equipo no in situ) finalmente ponemos en marcha el sistema de calefacción. . verificamos las mangueras y sellos del equipo.1 mL de la muestra enzimática. y dejamos reaccionar por 5 minutos mas. evaluamos la potencia de agitación. Para esta actividad utilizaremos termómetros de alcohol. cumplido este tiempo tomamos la solución y la colocamos en un vaso precipitado con agua hirviendo para detener la reacción. que tenia como liquido agua en uno de los baños y aceite en el otro. incubamos en un baño con recirculación a 45 °C hasta que el sustrato alcance dicha temperatura. * Repetimos la actividad pero a 55 °C.

adicionamos sulfato de zinc e hidróxido de bario. Leemos contra un blanco e interceptamos con la curva de calibrado.5 mL respectivamente. Tomamos 0. hasta alcanzar el grado de hidrolisis prestablecido. seleccionaremos leche semi-descremada.1 mL en un tubo eppendorf de la muestra de reacción enzimática (inactivada). luego medimos la absorbancia en un espectrofotómetro a 505 nm.1 mL de la muestra de reacción enzimática. Adicionamos 1 mL de reactivo y dejamos incubar a temperatura ambiente. colocamos 0. . Incubamos por 30 minutos a temperatura ambiente y luego leemos la absorbancia en un espectrofotómetro a 505 nm. Pondremos en marcha el sistema de calentamiento del reactor (baño con agua o aceite para calentar según corresponda). 0. mediremos su pH. Agitamos en un vórtex.1 mL del sobrenadante y lo colocamos en un tubo eppendorf y colocamos 1 mL de reactivo para determinar la glucosa.Determinación de la concentración de glucosa * Si utilizamos lactosa. disponemos en un tubo eppendorf 0. luego llevamos a la centrifuga a 5000 rpm por 5 minutos. Hidrolisis enzimática Para esta operación. mantenemos la leche bajo agitación suave y temperatura deseada. tomaremos una muestra en un tubo de ensayo y determinaremos la concentración de lactosa y glucosa inicial. leemos contra un blanco e interceptamos con la curva de calibrado. Tomamos muestras en tubos de ensayo cada 15 minutos y le realizamos las pruebas prestablecidas. * Si utilizamos leche como sustrato. esperamos que se alcance la temperatura deseada y adicionamos la enzima.

calentaremos en una olla. la leche. el que se determina mediante un refractómetro y entrega un valor en ° Brix. que en nuestro caso será alcanzar unos 70% app. a partir de leche y leche hidrolizada. a unos 80 °C. . Todo esto sobre un anafe que nos proporcionara la temperatura deseada.Elaboración de manjar Para la fabricación de manjar. Adicionaremos sacarosa de acuerdo a la dosificación sugerida. con agitación manual en base a una cuchara de palo. Mantenemos bajo agitación hasta alcanzar unos 65-75% de sólidos.

Práctico 1: Caracterización del preparado enzimático Ejemplo de cálculo de la actividad enzimática .

Actividad enzimática de Biolactasa-NTL en lactosa a distintas temperaturas Lactosa (100 g/L) Leche Semidescremada .

Seguimiento de actividad enzimática a distintas condiciones de temperatura .

La estabilidad de una enzima puede definirse como la capacidad de retener su actividad en una condición ambiental determinada .

Estabilidad de Biolactasa-NTL a 55ºC y 45ºC 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Tiempo [min] Actividad Relativa [%] 45ºC 55ºC .

.

el cual se reguló a 55ºC. Se puso en marcha el sistema de calefacción. Se verificó cada cierto tiempo que la temperatura efectivamente fuera constante.Práctico 2: Hidrólisis de lactosa en un reactor enzimático por lotes Puesta en marcha del reactor Se verificaron las conexiones de las mangueras y el estado de los sellos del reactor. . Se verificó el electrodo de pH. Se evaluó la potencia de agitación y se estableció en 200RPM.

Hidrólisis enzimática Antes de comenzar la experiencia. Se procedió a su cálculo reemplazando los datos en la ecuación siguiente: Donde: . se calculó la cantidad de enzima a adicionar. para alcanzar un grado de conversión del 99% en dos horas de operación.

Reemplazando: Despejando: Transformando a [UI]: .

Considerando que la actividad a 55ºC es 5978[UI/mL]. entonces el volumen de enzima a agregar es: .

Grado de conversión de lactosa en la hidrólisis enzimática de leche semidescremada a 55ºC 120 100 Grado de Conversión [%] 80 60 40 20 0 0 15 30 45 60 75 90 Tiempo [min] 105 120 135 150 .

760 59. También podemos advertir que a tiempo 1[h] la concentración de estos azúcares aumentó. donde se estimó que con un 1[mL] de enzima.125 66.462 Se puede advertir que a tiempo 0[h] la concentración medida de azúcares reductores es similar a la declarada en el envase de la leche semidescremada (47[g/L] de hidratos de carbono).154 4. usando la ecuación de un reactor enzimático por lotes. Tabla de concentración de azúcares reductores versus el tiempo Tiempo [h] 0 1 2 Azúcares reductores [g/L] 44. debido a que por cada mol de lactosa consumido. estamos produciendo dos moles de azúcares reductores nuevos (glucosa y galactosa). . confirmando los cálculos efectuados anteriormente. se podría hidrolizar toda la lactosa en las 2 horas de tiempo de reacción.147 3.525 Desviación Estándar 3.El grado de conversión fue aumentando a medida que el tiempo transcurrió.

854 13.1.Práctico 3: Elaboración de Manjar Elaboración de manjar a partir de leche deslactosada en un 35%.007 1.524 13.047 [min] 0 30 60 90 Brix 32 40 42 66 0 30 30 60 60 60 60 0. tiempo en el cual se debió haber llegado a un 35% de conversión de lactosa a glucosa. Datos obtenidos a partir de elaboración de manjar con leche Tiempo Grados deslactosada.231 14.220 7.426 .305 3.206 3.373 3.909 1. La Hidrolisis de lactosa se llevo a cabo en un reactor enzimático de 5 Lt con 1 mL de preparado enzimático Biolactasa NTL a 45 ºC por un tiempo de reacción de 60 minutos.805 14.030 8.118 0. Tabla 3.011 Grado de Conversión [%] 0. Tiempo [min] 0 Concentración de Glucosa [g/l] 0.824 3.

Tabla 3.3. Llevando la reacción hasta una concentración de 70% en sólidos.Elaboración de manjar a partir de leche sin procesar. Tiempo [min] 0 30 60 90 Grados Brix 26 30 32 86 . Para la elaboración de manjar se procedió a concentrar 400 mL de leche sin procesar a 80º C adicionándole 80 g de azúcar. datos de °Brix en los tiempos determinados a partir de leche entera.

Datos Referenciales respecto a la experiencia de elaboración de manjar Humedad: máximo TREINTA POR CIENTO (30%) peso sobre peso (p/p). Instituto Nacional de Tecnología Industrial Sede Central: Avenida General Paz 5445 B1650KNA San Martín Buenos Aires. En general la unidad de medición son los grados Brix. el mechero se apaga cuando el dulce tiene un 67-68% de sólidos. (67 . se reducirá la humedad hasta el valor final deseado (30 %). Un dulce de leche ya terminado y listo para consumir debería tener una concentración de sólidos correspondientes a 70º Brix. Según las diferentes fabricaciones. los sesenta Y NUEVE GRADOS BRIX (69° Brix) y SETENTA Y CUATRO GRADOS BRIX (74° Brix) (la muestra debe estar a la misma temperatura a la que se efectúa ladeterminación). estimando que con la evaporación producida mientras el dulce se descarga y enfría. . Se lo usa también con el mismo fin para la elaboración de miel y mermeladas. escala utilizada por el refractómetro).68° Brix. Argentina El refractómetro es un pequeño instrumento que permite estimar la cantidad de sólidos presentes en un fluido. (Recomendación Norma FIL 15B: 1988). y que determina el punto final del proceso de calentamiento.

ya que no se repitió el experimento. para obtener conclusiones más acertadas del fenómeno. las graficas de estabilidad no se obtienen datos muy confiables a 45ºC lo cual indica error experimental. y en 55ºC la enzima mantuvo su valor de actividad residual lo cual es esperable contrastado con el catálogo adjunto del preparado enzimático. Por otra parte. Se pudo comprobar que el grado de conversión de lactosa aumenta a medida que transcurre el tiempo de reacción. La cantidad de azúcares reductores aumenta a medida que el tiempo de reacción transcurre.CONCLUSIONES Del primer práctico se puede concluir que la actividad enzimática a 55º da un valor mayor que la obtenida a los 45ºC tanto si es incubada en leche o lactosa. Se puede concluir que efectivamente se puede predecir teóricamente a partir de los datos de actividad inicial y las ecuaciones que rigen el sistema del reactor por lotes enzimático. También se pudo comprobar que la cantidad de azúcares reductores en la leche semidescremada es similar al declarado en la etiqueta del envase. . el volumen de enzima a utilizar (1mL) y el grado de conversión a lograr.

. esto quiere decir que la concentración de sacarosa en el medio tenia una diferencia sustancial que finalmente es la que determina las características tanto de una como la otra. lactosa) presentó un manjar de mejores características organolépticas que el de leche entera. llegando a un 66% para la leche deslactosada y un 86% para la leche entera. la concentración final de sólidos marco una gran diferencia. un tono café un poco mas tenue que el de la leche entera. con una diferencia de 20 °Brix entre ellas.Claramente podemos apreciar según los resultados obtenidos que la leche deslactosada (sin el “azúcar” natural de la leche. menor presencia de cristales. o sea una mayor cremosidad. A pesar que el tiempo que se empleo para ambas experiencias fue el mismo.