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Gentica molecular em plantas

Gentica molecular em plantas


1) Dificuldades para se trabalhar com plantas
As plantas mais importantes economicamente so POLIPLIDES: possuem ao menos 4 cpias para cada cromossomo, o que cria dificuldades para a identificao de mutaes recessivas uma caracterstica importante pode ser o produto da ao de vrios genes Genomas muito grandes ex.: o milho possui o genoma 7 vezes maior que o do homem Importncia econmica Caractersticas biolgicas favorveis: 10.000 plantas por acre Vrias espigas/planta, com mais de 500 gros cada Partes masculinas e femininas em flores separadas polinizao controlada Elementos Ac e Ds: sondas para genes de interesse

2) O milho e a soja so as plantas mais bem conhecidas geneticamente

3) Arabidopsis thaliana:

Planta modelo, sem valor econmico ou nutricional Tempo de gerao de 5 semanas Produz 104 sementes/planta Tamanho pequeno Auto-fertilizao mutaes so tornadas homozigotas Suscetvel infeco por Agrobacterium Genoma pequeno e sem muitas regies repetidas

Tcnicas de transformao gentica de plantas


1) Agrobacterium:
+ + + + + + transformao permanente altamente eficiente infeco de clulas intactas, regenerao facilitada transferncia de grandes molculas de DNA rearranjos de DNA raros simples e pouco oneroso limitado nmero de espcies vegetais falso-positivos devido contaminao bacteriana

2) Bombardeamento ou Biolstica
+ transferncia para qualquer tipo de tecido ou clula + ilimitado nmero de espcies + sem falso-positivos +/- transformao transiente - baixa freqncia de integrao estvel - pequenas molculas de DNA - rearranjos de DNA so comuns - complexidade relativa e oneroso

3) Eletroporao
+ ilimitado nmero de espcies + sem falso-positivos +/- transformao transiente +/- requer protoplastos, regenerao dificultada - baixa freqncia de integrao estvel - pequenas molculas de DNA - rearranjos de DNA so comuns - complexo e oneroso

4) Eletroforese e outros...

Electroporation. Foreign DNA can be introduced into plant cells by electroporation, the application of intense electric fields to make their plasma membranes transiently permeable.

Modelos de aceleradores de partculas atualmente utilizados:


Acelerador de micropartculas de gs hlio sob alta presso (AMHP)

Foi desenvolvido, principalmente, para a introduo de macromolculas in vitro, e tem sido responsvel pela quase totalidade das plantas transgnicas e microrganismos transfectados, obtidos atravs do processo de biobalstica.

Acelerador de micropartculas de gs hlio sob baixa presso (AMLP). Foi desenvolvido, principalmente, para a introduo de macromolculas em organismos superiores in vivo, e tem sido utilizado para a estudos bsicos sobre a induo da resposta imune humoral e celular, terapia gnica e protica

Objetivos principais de utilizao dos sistemas de transformao vegetal:


Desenvolvimento de transgnicos; Estudos de regulao da expresso gnica;

Introduo de seqncias de DNA/RNA, objetivando estudos de aspectos fundamentais e aplicados da induo da resposta imune;
Estudos de um novo processo de vacinao; Introduo de macromolculas em organismos superiores in vitro e in vivo; Terapia gnica e da funo gnica.

Transformao gentica de plantas


Interesse biotecnolgico:
Aumentar a biossntese nos vegetais
Aumentar a concentrao nos tecidos Aumentar a resistncia a doenas e pragas

Reduzir a biossntese nos vegetais


Reduzir a concentrao de compostos txicos Reduzir o teor de componentes de baixa qualidade

Alterar a biossntese para a gerao de novos compostos

Mtodos biotecnolgicos
Cultura de tecidos in vitro
Desinfeco de patgenos Rejuvenescimento Micropropagao Variao somaclonal Cultura de tecidos produtores em larga escala Seleo de meios de cultivo

Fitoqumica Bioqumica de protenas e enzimas Biologia molecular


Caracterizao de genes biossintetizantes Estudo da regulao da expresso de genes Transformao gentica e alterao das expresses

Transformao gentica de plantas via Agrobacterium tumefaciens


Agrobacterium:

Bactria aerbica, gram-negativa, fitopatognica, Rhizobiaceae Espcies: A. tumefaciens galha da coroa A. rhizogenes sndrome de razes adventcias A. rubi tumores em partes areas A. vitis tumores em videiras

famlia

A. tumefaciens: exerce uma modificao gentica nas clulas da planta hospedeira, com conseqncias tanto para o parasita como para o hospedeiro melhora as condies para a sobrevivncia do parasita e faz com que as clulas da planta cresam como um tumor crown gall disease

Tumors in Plants. Crown gall, a plant tumor, is caused by a bacterium (Agrobacterium tumefaciens) that carries a tumor-inducing plasmid (Ti plasmid).

In the process of causing crown gall disease, the bacterium Agrobacterium tumefaciens inserts a part of its Ti plasmid a region called T-DNA into a chromosome of the host plant.

Infeco de plantas via A. tumefaciens

Os tumores sintetizam opinas (derivados de arginina), que so utilizadas como fonte de carbono ou nitrognio pela bactria Linhagens de Agrobacterium podem ser classificadas de acordo com o tipo de opinas que o tumor produz. O princpio indutor de tumor da bactria reside no plasmdeo Ti (tumor inducing), o qual carrega os genes que controlam o catabolismo da opina na Agrobactria e os genes que determinam a sntese da opina nas clulas de planta transformadas
Os plasmdeos Ti podem ser divididos em quatro grupos, de acordo com o tipo de opinas que eles produzem: Plasmdeos nopalina criam teratomas Plasmdeos octopina no formam teratomas Plasmdeos agropina tumores no se diferenciam, desenvolvimento precrio Plasmdeos Ri induzem a doena da raiz ou tumor em algumas plantas

Alm dos genes para a sntese e utilizao da opina, outros genes esto presentes nos plasmdeos Ti A clula da planta transformada sintetiza aquela opina que a bactria pode utilizar Trs lcus no cromossomo da bactria, chvA, chvB e pscA so necessrios nos estgios iniciais de ligao da bactria clula vegetal sntese de um polissacardeo na superfcie da clula bacteriana Plasmdeos nopalina e octopina: 30% dos ~ 200 kb so idnticos; A bactria no entra na planta ela transfere parte do plasmdeo Ti T-DNA Regio T: ~ 23 kb, dos quais ~ 9 kb so idnticos nos dois plasmdeos, cada plasmdeo carrega os genes correspondentes sntese da opina (nos, ocs) dentro da regio T e os genes correspondentes ao catabolismo dessa opina (noc, occ) em algum outro local do plasmdeo Genes de virulncia, situados em uma outra regio do plasmdeo Ti (regio vir), comandam o processo de transferncia do T-DNA: 6 genes: vir A-G (40 kb) Agrobacterium faz contato com a planta e os genes vir so induzidos Os produtos dos genes vir fazem com que o T-DNA seja transferido para o ncleo da clula vegetal virA e virG genes reguladores expresso constitutiva virB, virC, virD e virE transferncia do T-DNA As funes que envolvem a oncogenicidade (capacidade de formar o tumor) no esto confinadas na regio T.

Sinal para a induo: compostos fenlicos produzidos pela planta como resposta a um FERIMENTO Exemplo: N. tabacum (lmina 2) produz acetoseringona, que converte VirA para uma forma ativa (auto-fosforilao). VirA encontra-se na membrana interna da clula bacteriana. A forma ativa de VirA ativa (fosforila) VirG (transcrio induzida a partir de um novo stio de iniciao). VirG induz a expresso dos demais genes vir VirD1 e VirD2 constituem uma endonuclease que corta o T-DNA em local especfico e inicia o processo de transferncia VirE2 uma ssDNA -binding protein T-DNA possui repeties de 25 pares de bases quase idnticas em cada extremidade do plasmdeo Ti:
A repetio da direita necessria para a transferncia e a integrao precisa no genoma da planta. O T-DNA que integrado no genoma da planta gera uma juno precisa direita, mantendo 1-2 pb da repetio direita, mas a sua juno esquerda varia, podendo ficar a uma distncia de at 100 pb da repetio esquerda. Nopalina T-DNA integram como uma nica unidade; octopina T-DNA so mais variveis, mais de uma cpia do T-DNA pode ser integrada no mesmo genoma Somente a repetio de 25 pb DIREITA necessria para o processo de transferncia e funciona somente em uma orientao processo com polaridade

O operon virB codifica 11 produtos que esto envolvidos na reao de transferncia; so homlogos s protenas Tra de certos plasmdeos bacterianos Seqncia overdrive (de sobremarcha): localizada fora do T-DNA mas imediatamente adjacente a sua extremidade direita, estimula muito o processo de transferncia. Semelhante a um reforador. As protenas VirC1 e VirC2 podem agir nessa seqncia As seqncias que flanqueiam o T-DNA integrado tendem a ser ricas em pares de bases A-T O T-DNA expressado no seu stio de integrao. A regio contm vrias unidades de transcrio, cada uma contendo, provavelmente, um gene expressado a partir de um promotor individual As funes desses genes esto relacionadas ao estado da clula da planta, estando envolvidas com a manuteno das propriedades tumorignicas da clula hospedeira, o controle da formao de brotos e razes e a supresso da diferenciao em outros tecidos. Nenhum desses genes necessrio para a transferncia do T-DNA.

Utilizao dos plasmdeos Ti na transformao de plantas


T-DNA pode ser clivado substituio da regio envolvida na sntese de opinas por um gene de interesse, com promotor e sinal de poliadenilao da opina sintetase vetor natural para a transferncia de genes para plantas Vetores comerciais utilizam como gene reprter o gene para bglucuronidase (GUS) para testar a atividade em plantas transgnicas permite a anlise em condies in vivo Gene gusA de E. coli protena b-Glu degrada o substrato X-Gluc, que se deposita como um corante de cor azul Quase todas as plantas e muitas bactrias, fungos, insetos, etc. no possuem a atividade GUS logo, nfimas quantidades de atividade podem ser medidas quando o gene gusA utilizado como gene reprter Protocolo bsico de transformao via A. tumefaciens

(a) To produce transgenic plants, an intermediate vector of manageable size is used to clone the segment of interest. In the method shown here, the intermediate vector is then recombined with an attenuated ("disarmed") Ti plasmid to generate a cointegrate structure bearing the insert of interest and a selectable plant kanamycin-resistance marker between the T-DNA borders, which is all the TDNA that is necessary to promote insertion. (b) The generation of a transgenic plant through the growth of a cell transformed by TDNA.

T-DNA and any DNA contained within it are inserted into a plant chromosome in the transgenic plant and then transmitted in a Mendelian pattern of inheritance.