Genética molecular em plantas

Genética molecular em plantas
1) Dificuldades para se trabalhar com plantas
• As plantas mais importantes economicamente são POLIPLÓIDES: possuem ao menos 4 cópias para cada cromossomo, o que cria dificuldades para a identificação de mutações recessivas  uma característica importante pode ser o produto da ação de vários genes Genomas muito grandes  ex.: o milho possui o genoma 7 vezes maior que o do homem • Importância econômica • Características biológicas favoráveis: – 10.000 plantas por acre – Várias espigas/planta, com mais de 500 grãos cada – Partes masculinas e femininas em flores separadas polinização controlada – Elementos Ac e Ds: sondas para genes de interesse

2) O milho e a soja são as plantas mais bem conhecidas geneticamente

sem valor econômico ou nutricional Tempo de geração de 5 semanas Produz 104 sementes/planta Tamanho pequeno Auto-fertilização  mutações são tornadas homozigotas Suscetível à infecção por Agrobacterium Genoma pequeno e sem muitas regiões repetidas .3) Arabidopsis thaliana: • • • • • • • Planta modelo.

regeneração facilitada transferência de grandes moléculas de DNA rearranjos de DNA raros simples e pouco oneroso limitado número de espécies vegetais falso-positivos devido à contaminação bacteriana .Técnicas de transformação genética de plantas 1) Agrobacterium: • • • • • • • • + + + + + + transformação permanente altamente eficiente infecção de células intactas.

transformação transiente .pequenas moléculas de DNA .2) Bombardeamento ou Biolística • • • • • • • • + transferência para qualquer tipo de tecido ou célula + ilimitado número de espécies + sem falso-positivos +/.baixa freqüência de integração estável .complexidade relativa e oneroso .rearranjos de DNA são comuns .

requer protoplastos..rearranjos de DNA são comuns . regeneração dificultada .complexo e oneroso 4) Eletroforese e outros.baixa freqüência de integração estável .3) Eletroporação • • • • • • • • + ilimitado número de espécies + sem falso-positivos +/. ..pequenas moléculas de DNA .transformação transiente +/.

Foreign DNA can be introduced into plant cells by electroporation. . the application of intense electric fields to make their plasma membranes transiently permeable.Electroporation.

obtidos através do processo de biobalística. para a introdução de macromoléculas in vitro.Modelos de aceleradores de partículas atualmente utilizados: Acelerador de micropartículas de gás hélio sob alta pressão (AMHP) Foi desenvolvido. . e tem sido responsável pela quase totalidade das plantas transgênicas e microrganismos transfectados. principalmente.

principalmente. e tem sido utilizado para a estudos básicos sobre a indução da resposta imune humoral e celular.Acelerador de micropartículas de gás hélio sob baixa pressão (AMLP). terapia gênica e protêica . Foi desenvolvido. para a introdução de macromoléculas em organismos superiores in vivo.

. objetivando estudos de aspectos fundamentais e aplicados da indução da resposta imune. •Estudos de regulação da expressão gênica. • Terapia gênica e da função gênica. •Estudos de um novo processo de vacinação. • Introdução de seqüências de DNA/RNA.Objetivos principais de utilização dos sistemas de transformação vegetal: •Desenvolvimento de transgênicos. •Introdução de macromoléculas em organismos superiores in vitro e in vivo.

Transformação genética de plantas • Interesse biotecnológico: – Aumentar a biossíntese nos vegetais • Aumentar a concentração nos tecidos • Aumentar a resistência a doenças e pragas – Reduzir a biossíntese nos vegetais • Reduzir a concentração de compostos tóxicos • Reduzir o teor de componentes de baixa qualidade – Alterar a biossíntese para a geração de novos compostos .

• Métodos biotecnológicos – Cultura de tecidos in vitro • • • • • • Desinfecção de patógenos Rejuvenescimento Micropropagação Variação somaclonal Cultura de tecidos produtores em larga escala Seleção de meios de cultivo – – – Fitoquímica Bioquímica de proteínas e enzimas Biologia molecular • Caracterização de genes biossintetizantes • Estudo da regulação da expressão de genes • Transformação genética e alteração das expressões .

rubi  tumores em partes aéreas • A. rhizogenes  síndrome de raízes adventícias • A. com conseqüências tanto para o parasita como para o hospedeiro  melhora as condições para a sobrevivência do parasita e faz com que as células da planta cresçam como um tumor  crown gall disease .Transformação genética de plantas via Agrobacterium tumefaciens • Agrobacterium: – – Bactéria aeróbica. fitopatogênica. tumefaciens: exerce uma modificação genética nas células da planta hospedeira. Rhizobiaceae Espécies: • A. tumefaciens  galha da coroa • A. vitis  tumores em videiras família • A. gram-negativa.

a plant tumor. . Crown gall.Tumors in Plants. is caused by a bacterium (Agrobacterium tumefaciens) that carries a tumor-inducing plasmid (Ti plasmid).

the bacterium Agrobacterium tumefaciens inserts a part of its Ti plasmid a region called T-DNA into a chromosome of the host plant.In the process of causing crown gall disease. .

O princípio indutor de tumor da bactéria reside no plasmídeo Ti (tumor inducing). que são utilizadas como fonte de carbono ou nitrogênio pela bactéria Linhagens de Agrobacterium podem ser classificadas de acordo com o tipo de opinas que o tumor produz. o qual carrega os genes que controlam o catabolismo da opina na Agrobactéria e os genes que determinam a síntese da opina nas células de planta transformadas – Os plasmídeos Ti podem ser divididos em quatro grupos. de acordo com o tipo de opinas que eles produzem: • Plasmídeos nopalina  criam teratomas • Plasmídeos octopina  não formam teratomas • Plasmídeos agropina  tumores não se diferenciam.Infecção de plantas via A. desenvolvimento precário • Plasmídeos Ri  induzem a doença da raiz ou tumor em algumas plantas . tumefaciens • • • Os tumores sintetizam opinas (derivados de arginina).

• • • • • • • • • • Além dos genes para a síntese e utilização da opina. . chvB e pscA são necessários nos estágios iniciais de ligação da bactéria à célula vegetal  síntese de um polissacarídeo na superfície da célula bacteriana Plasmídeos nopalina e octopina: 30% dos ~ 200 kb são idênticos. situados em uma outra região do plasmídeo Ti (região vir). comandam o processo de transferência do T-DNA: 6 genes: vir A-G (40 kb) Agrobacterium faz contato com a planta e os genes vir são induzidos Os produtos dos genes vir fazem com que o T-DNA seja transferido para o núcleo da célula vegetal – virA e virG  genes reguladores  expressão constitutiva – virB. cada plasmídeo carrega os genes correspondentes à síntese da opina (nos. ocs) dentro da região T e os genes correspondentes ao catabolismo dessa opina (noc. chvA. A bactéria não entra na planta  ela transfere parte do plasmídeo Ti  T-DNA Região T: ~ 23 kb. outros genes estão presentes nos plasmídeos Ti A célula da planta transformada sintetiza aquela opina que a bactéria pode utilizar Três lócus no cromossomo da bactéria. dos quais ~ 9 kb são idênticos nos dois plasmídeos. virC. virD e virE  transferência do T-DNA As funções que envolvem a oncogenicidade (capacidade de formar o tumor) não estão confinadas na região T. occ) em algum outro local do plasmídeo Genes de virulência.

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mantendo 1-2 pb da repetição direita. mas a sua junção à esquerda varia. tabacum (lâmina 2) produz acetoseringona. octopina T-DNA são mais variáveis. VirG induz a expressão dos demais genes vir VirD1 e VirD2 constituem uma endonuclease que corta o T-DNA em local específico e inicia o processo de transferência VirE2 é uma ssDNA -binding protein T-DNA possui repetições de 25 pares de bases quase idênticas em cada extremidade do plasmídeo Ti: – A repetição da direita é necessária para a transferência e a integração precisa no genoma da planta. mais de uma cópia do T-DNA pode ser integrada no mesmo genoma Somente a repetição de 25 pb DIREITA é necessária para o processo de transferência e funciona somente em uma orientação  processo com polaridade – – . que converte VirA para uma forma ativa (auto-fosforilação). VirA encontra-se na membrana interna da célula bacteriana. O T-DNA que é integrado no genoma da planta gera uma junção precisa à direita.• • • • • • Sinal para a indução: compostos fenólicos produzidos pela planta como resposta a um FERIMENTO Exemplo: N. podendo ficar a uma distância de até 100 pb da repetição esquerda. Nopalina T-DNA integram como uma única unidade. A forma ativa de VirA ativa (fosforila) VirG (transcrição induzida a partir de um novo sítio de iniciação).

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• • • • • O operon virB codifica 11 produtos que estão envolvidos na reação de transferência. A região contém várias unidades de transcrição. As proteínas VirC1 e VirC2 podem agir nessa seqüência As seqüências que flanqueiam o T-DNA integrado tendem a ser ricas em pares de bases A-T O T-DNA é expressado no seu sítio de integração. . um gene expressado a partir de um promotor individual As funções desses genes estão relacionadas ao estado da célula da planta. cada uma contendo. Nenhum desses genes é necessário para a transferência do T-DNA. estando envolvidas com a manutenção das propriedades tumorigênicas da célula hospedeira. o controle da formação de brotos e raízes e a supressão da diferenciação em outros tecidos. estimula muito o processo de transferência. provavelmente. Semelhante a um reforçador. são homólogos às proteínas Tra de certos plasmídeos bacterianos Seqüência overdrive (de sobremarcha): localizada fora do T-DNA mas imediatamente adjacente a sua extremidade direita.

tumefaciens • • • • . etc.Utilização dos plasmídeos Ti na transformação de plantas • T-DNA pode ser clivado  substituição da região envolvida na síntese de opinas por um gene de interesse. insetos. que se deposita como um corante de cor azul Quase todas as plantas e muitas bactérias. fungos. ínfimas quantidades de atividade podem ser medidas quando o gene gusA é utilizado como gene repórter Protocolo básico de transformação via A. com promotor e sinal de poliadenilação da opina sintetase  vetor natural para a transferência de genes para plantas Vetores comerciais utilizam como gene repórter o gene para bglucuronidase (GUS) para testar a atividade em plantas transgênicas  permite a análise em condições in vivo Gene gusA de E. coli  proteína b-Glu  degrada o substrato X-Gluc. não possuem a atividade GUS  logo.

. an intermediate vector of manageable size is used to clone the segment of interest.(a) To produce transgenic plants. which is all the TDNA that is necessary to promote insertion. the intermediate vector is then recombined with an attenuated ("disarmed") Ti plasmid to generate a cointegrate structure bearing the insert of interest and a selectable plant kanamycin-resistance marker between the T-DNA borders. In the method shown here. (b) The generation of a transgenic plant through the growth of a cell transformed by TDNA.

T-DNA and any DNA contained within it are inserted into a plant chromosome in the transgenic plant and then transmitted in a Mendelian pattern of inheritance. .

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