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UNIDAD DE APRENDIZAJE: Toxicología Avanzada

Modelos in vitro y cultivos celulares/tisulares
febrero de 2013.

UNIÓN A PROTEINAS PLASMÁTIAS
Métodos para la determinación de la unión a proteínas plasmáticas

Existen distintos métodos para la caracterización y cuantificación del grado de unión de las proteínas plasmáticas. Estos estudios se realizan in vitro, de manera que los resultados obtenidos puedan ser extrapolados a situaciones in vivo. Salvo que existan evidencias experimentales que nos indiquen los contrario, antes de estudiar la unión a las proteínas plasmáticas, se pueden asumir dos hechos importantes: - La unión es 100 % reversible, sin que existan enlaces químicos que den lugar a uniones irreversibles. - La unión es especifica, pudiéndose detectar zonas de unión de fármacos en las moléculas proteicas.

•Se enfrenta el plasma a una membrana semipermeable •Mediante centrifugación o presión positiva se fuerza a que la fracción plasmática libre de proteínas atraviese esa membrana •Quedando retenida la porción plasmática proteica . es decir la fracción libre de proteínas donde estará presente el fármaco no unido.Ultrafiltración  Fundamento: el grado de unión a las proteínas plasmáticas se evalúa tras obtener el agua plasmática.

Desventajas: se realiza en condiciones poco fisiológicas. Ventajas: evita interacciones entre la muestra y otros componentes del sistema experimental (como por ejemplo membranas). Los tiempos de centrifugación oscilan entre 4 y 16 horas La fuerza de centrifugación varía de 160. se produce una distribución de los componentes plasmáticos en función de su densidad. así la fracción que en mayor proporción une el compuesto. cuando se desconoce totalmente el tipo de interacción entre la sustancia y los componentes del suero.000 x g . estas condiciones de ultracentrifugación requieren refrigeración de la muestra (la temperatura de trabajo es normalmente 4 ºC) y vacío. este método permite fraccionar los distintos componentes proteicos e identificar.Ultracentrifugación  Fundamento: Cuando el suero es sometido a procesos de ultracentrifugación.000 a 250.

que alberga el tampón libre de proteínas La semi-cápsula A que se llena con la mezcla matriz proteicafármaco .Diálisis  Fundamento: el experimento se realiza en un recipiente separado en dos partes iguales por una membrana. que permite el paso de sustancias en función del peso molecular. La membrana C. semipermeable en función del peso molecular del compuesto. La cápsula de diálisis cuenta con tres partes: La semi-cápsula B.

Unión a proteínas plasmáticas in vivo .

. producen sistemáticamente lesiones en todos los individuos expuestos. el cloroformo y el fósforo blanco. sales de hierro. ketoconazol. el cobre. Toxinas Capacidad metabólica hepática Toxinas intrínsecas (Predecible) Toxinas idiosincráticas (Impredecibles) A una cierta concentración. amiodarona. Acetaminofeno. Producen lesión solo en algunos individuos.CLASIFICACION DE LAS TOXINAS Y ESTUDIO IN VITRO DE LA TOXICIDAD DE XENOBIÓTICOS  Las substancias que producen efectos negativos en el organismo se les denomina toxinas. y no se correlacionan con la dosis administrada. Isoniazida. etc. el ácido valproico.

Activas Son tóxicas ¿Qué es? Solubilidad de los xenobióticos Biotransformación Conjunto de reacciones enzimáticas ¿Qué ayudan a? Facilitar su eliminación Reacciones de fase 1 Contiene 20 enzimas p450s Reacciones de fase 2 Xenobióticos Latentes No son tóxicas directamente A d s o r c i ó n Oxidación Reducción Hidrolisis Conjugación Producto primario Exposición o adición de grupos funcionales Biosíntesis por adicción de grupos endógenos (glicina y aminoácidos) Producto secundario Metabolitos tóxicos (radicales libres) Excreción Vía biliar o renal .

y por ello la información que son capaces de proporcionar es en ocasiones parcial. . células manipuladas genéticamente. Una nueva conciencia sobre el uso racional y limitado de los animales de experimentación La información que dan depende de: • Del empleo de un sistema biológico adecuado cultivos primarios. líneas celulares. cocultivos. Test dirigidos a la detección de toxicidad organo-específica. Mecanismos de toxicidad que subyacen a los efectos observados. Estudio del metabolismo del compuesto utilizando cultivos de hepatocitos. Tests de citotoxicidad general. Los estudios que se realizan para evaluar in vitro la potencial toxicidad de un compuesto entran en 4 categorías: 1. 3. • De la selección de los parámetros para evaluar los efectos tóxicos • Y de la extrapolación de los datos in vitro a in vivo.Estudios toxicológicos Son para conocer: Nuevo medicamento  Cosmético  Producto químico Y generalmente se ocupan  Estudios In vitro Son una simplificación de una realidad mucho más compleja que es el ser vivo. 2. 4.

MODELOS HEPÁTICOS PARA EL ESTUDIO in vitro DEL METABOLISMO Y HEPATOTOXICIDAD DE XENOBIÓTICOS .

Supersomes®). Transfectadas mediante vectores adecuados con el cDNA que codifica el CYP de interés. A partir de hepatomas. Expresar un único isoenzima del P450. . Diferentes orígenes (hepáticas o no.e. Mantienen un fenotipo estable.000 x g) de homogenados de hígado. o de otras especies) .MODELOS HEPÁTICOS PARA EL ESTUDIO in vitro DEL METABOLISMO Y HEPATOTOXICIDAD DE XENOBIÓTICOS Microsomas Líneas celulares hepáticas Lineas celulares hepáticas obtenidas mediante manipulación genética Obtenido mediante la centrifugación (100. Células manipuladas para la expresión de un único P450 (p. Tienen capacidad de proliferación en cultivo.

la respuesta a hormonas.MODELOS HEPÁTICOS PARA EL ESTUDIO in vitro DEL METABOLISMO Y HEPATOTOXICIDAD DE XENOBIÓTICOS Cultivo primario de hepatocito: Constituyen el modelo más próximo al hígado. . la síntesis de proteínas plasmáticas. la biotransformación y la elevación de los niveles intracelulares de glutatión como mecanismo de autoprotección. Gluconeogénesis.

Cultivo de hepatocitos de rata •Se realiza una incisión longitudinal en el abdomen (piel y músculo) para que accesible toda la cavidad abdominal .5 % para evitar la coagulación de la sangre en el hígado 4 • secciona el diafragma y se sitúa una tercera ligadura alrededor de la cava superior.5 mM de EGTA para eliminar la sangre del mismo y debilitar las uniones intercelulares 1 3 5 . Se le administran por vía vena femoral 500 μL de heparina sódica al 0. •La rata se anestesia con pentotal sódico administrado por vía intraperitoneal. 2 •. a través de la cual se perfunden las soluciones. practicándose una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón por la que se introduce la cánula. •Se perfunde el hígado en primer lugar con 50-100 mL de solución de Krebs-Ringer con 0.

se perfunde con la misma solución pero con colagenasa y 2. se suspenden en 100 rnL de medio de cultivo. para que sedimenten de forma selectiva los hepatocitos y queden en el sobrenadante células muertas o más ligeras.Cultivo de hepatocitos de rata •A continuación. manteniendo la perfusión con la enzima durante 10 minutos como máximo . las células se lavan una vez más con la misma solución y finalmente. 9 •se realiza el recuento celular y la medida de la viabilidad mediante el test del colorante azul trípano •Finalmente. •Tras eliminar elsobrenadante. 7 •Tras disgregar el hígado se prepara una suspensión celular en solución de Krebs-Ringer con CaCI2 y se centrifuga a 500 rpm durante 1 minuto.5 mM de CaCI2. 6 8 10 . se prepara una suspensión de hepatocitos (5 x 105 hepatocitos viables/rnL) y se siembran en placas de cultivo recubiertas con fibronectina para facilitar su adhesión al plástico.

que contenga 5 rnM de CaCl2 y colagenasa de gran actividad específica.5 rnM de EGTA.5 que contenga 0. para que la digestión sea rápida y evitar la anoxia del tejido hepático.MODELOS HEPÁTICOS PARA EL ESTUDIO in vitro DEL METABOLISMO Y HEPATOTOXICIDAD DE XENOBIÓTICOS 1) Que la biopsia tenga una sola superficie de corte Cultivo de hepatocitos humanos Microperfusión de pequeñas biopsias (1-5 g) . . 3) la digestión del tejido con la misma solución de lavado. 4) la oxigenación continua de las soluciones de perfusión y la presencia de glucosa. se procede para la realización del cultivo de la misma manera que se ha descrito en el apartado anterior para los hepatocitos de rata. Una vez obtenida la suspensión celular.(18-25 x 106 células/g 2) la realización de un lavado del tejido por perfusión con una solución de Krebs-Ringer tamponado con Hepes a pH 7.

velocidad y grado de metabolismo. metabolitos tóxicos.ESTUDIOS IN VITRO DEL METABOLISMO DE LOS XENOBIÓTICOS El objetivo principal de los estudios de metabolismo de xenobióticos es conocer el patrón de ese metabolismo (metabolitos que predominan. . parámetros cinéticos). Inducción inhibición Al analizar los factores Influye: Polimorfismos Patologías Edad Identificación de enzimas implicadas de forma especifica Las diferencias metabólicas entre el ser humano y la especie animal escogida para realizar los ensayos preclínicos son algunas de las causas más frecuentes del fracaso de nuevos fármacos.

se incuban directamente con los fármacos. Pero estos tienen un defecto que únicamente contienen enzimas unidos a membrana (fundamentalmente P450) y no enzimas citosólicos de conjugación y solo se incuba solo una hora como máximo. Células enteras Hepatocitos Las células del parénquima hepático Se aíslan y se hace la suspensión de hepatocitos. para analizar el compuestos que se metaboliza o realizar estudios de inducción. Diversos estudios refuerzan la idea de que los hepatocitos proporcionan un perfil metabólico más completo y reproducen mejor que los microsomas el metabolismo de fármacos que tiene lugar en el hígado. La incubación será de varias horas e incluso días.Uno de los modelos más ampliamente utilizados son:  Los microsomas hepáticos  Los microsomas obtenidos a partir de células que expresan un único CYP. .

. La incubación del fármaco con microsomas (obtenidos por células genéticamente) permite identificar de forma sencilla e inequívoca los P450s responsables de la formación de cada metabolito. el siguiente paso es la identificación de los enzimas que intervienen en cada uno de los procesos que conducen a la formación de los metabolitos.Estabilidad metabólica Si tiene metabolismo rápido El perfil metabólico se obtiene Es descartada desde el principio Con la incubación de un compuesto con compuesto hepáticos y análisis hepático  Una vez conocido el perfil metabólico del fármaco. La incubación del fármaco con microsomas completamente caracterizados fue el primer protocolo utilizado con este objetivo.

El ensayo por separado con cada línea celular • permite establecer si el fármaco es substrato de un isoenzima en particular y qué metabolito(s) es formado por cada CYP.Estudios alternativos Incubación directa del substrato con las células en cultivo. Incubación con las células en monocapa • se puede prolongar durante varias horas • para identificar la participación de formas minoritarias del P450. .

. latentes: no son tóxicas directamente. sin necesidad de biotransformación. producen sistemáticamente lesiones en todos los individuos expuestos sustancias que producen efectos negativos en el organismo TOXINA Idiosincrásicas: producen lesión sólo en algunos individuos.ESTUDIO IN VITRO DE LA TOXICIDAD DE XENOBIÓTICOS Intrínsecas: por encima de una cierta concentración. activas: son tóxicas per se. y sin relación con la dosis administrada. es decir. pero tras su biotransformación por el hígado dan origen a metabolitos tóxicos.

. el test mitocondrial del MTT y el de captación de rojo neutro por los lisosomas (test RN) vertido hacia el exterior de enzimas citoplásmicos daño celular alteración de la mermbrana celular LDH marcador para evaluar la citotoxicidad.Tests de citotoxicidad general Lineas celulares de distintos tejidos Exposición al xenobiotico Los ensayos de viabilidad son muy utilizados como indicadores de citotoxicidad.

mejor será el estado de las células en cultivo. Cuanto más elevado sea el valor de la absorbencia obtenido. En las condiciones de trabajo in vitro. a un formazán insoluble de color azul. . soluble y del color amarillo. Test mitocondrial del MTT • El ensayo del MTI se basa en la reducción de una sal de tetrazolio (MTI).Tests de citotoxicidad Test del rojo neutro • El rojo neutro es un colorante que es captado activamente por las células vivas y se acumula en los lisosomas. Esta reducción se realiza en el interior de la célula por la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa.

ureogénesis. síntesis de proteinas plasmáticas. etc. del transporte de iones. respuesta a hormonas.Test dirigidos a la detección de toxicidad órganoespecífica Una de las manifestaciones más frecuentes de hepatotoxicidad es la alteración de las funciones metabólicas del hepatocito Deberá investigarse los posibles efectos de concentraciones sub-citotóxicas del compuesto en estudio sobre funciones bioquímicas específicas metabolismo de carbohidratos. síntesis de triglicéridos. o competir con metabolitos celulares en rutas metábólicas del hepatocito . Ciertos compuestos pueden actuar como inhibidores enzimáticos.

alteracion de la homeostasis del calcio intracelular. disminución del potencial tóxico pueden generar intermedios metabólicos más reactivos y tóxicos que el compuesto original. . unión covalente a macromoléculas.MECANISMOS MOLECULARES DE TOXICIDAD Biotransformación Detoxificación. Estos metabolitos altamente reactivos son capaces de reaccionar con nucleófilos Reacciones de bioactivación Se unen covalentemente a macromoléculas o iniciar en la célula reacciones radicalarias en cadena dando como resultado daño celular en ocasiones irreversible extrés oxidativo. peroxidación lipídica. etc.

detoxificación y los mecanismos de defensa. lo que determina si la biotransformación de un xenobiótico. .El balance entre la bioactivación. llegará a producir daño a los hepatocitos.