Produção de Glucose Oxidase

Glucose Oxidase
Fontes: • Aspergillus niger (principal); • Penicillium notatum; • Penicillium glaucum; • Penicillium amagasakiense; • Penicillium purpurogenum • Obtida, essencialmente, como um produto ou co-produto da produção de gluconato

Glucose Oxidase
• Catalisa a reação:

Fig. 1. Representation of the GOD reaction (Witt et al., 2000)

Glucose Oxidase
• É produzida tanto no meio intracelular quanto no meio extracelular, e ambas contribuem para a produção de ácido glucônico.

• É utilizada em análises clínicas como principal reagente para a determinação dos níveis de glicose sanguínea devido ao seu custo relativamente baixo e a sua boa estabilidade.Glucose Oxidase • Enzima de grande interesse e importância para as indústrias alimentícias. . farmacêuticas e em pesquisas científicas.

. com o objetivo de aumentar a sua vida de prateleira. a GOD é empregada como antioxidante evitando alterações de cor e sabor dos alimentos devido à presença de O2. para remover resíduos de glicose e oxigênio em alimentos. • Tem sido usada.Glucose Oxidase • Na indústria alimentícia. satisfatoriamente.

pois é capaz de remover um pouco da glicose.Glucose Oxidase • Na indústria de vinho. . a necessidade de conservantes é menor. seu papel é diminuir o teor alcoólico. • Estudos mostram que vinhos tratados com glicose oxidase têm um teor alcoólico 2% menor. sendo assim. essa enzima possui efeito bactericida. Além disso. a qual posteriormente seria convertida em álcool.

A cavidade oral abriga várias espécies de estreptococos. .Glucose Oxidase • Pode ser usada como anti-microbiano em produtos de higiene oral. O H2O2 produzido pela glicose oxidase age como um útil bactericida. como o Streptococcus mutans. que é um importante contribuinte para a cárie dentária.

“Up-stream” 1.Ágar .Infusão de 20 g de batata . Escolha do microorganismo: Aspergillus niger 2. Preparo dos meios:  Meio de Ativação – Meio inclinado de PDA (Ágar Batata Dextrose) .Água destilada .Dextrose ou Glucose .

Dextrose ou Glucose . .Água destilada .“Up-stream” Meio de Esporulação de Moyer et al.Infusão de 20 g de batata .Ágar .

Água destilada .(NH4)2HPO4 .“Up-stream”  Meio de Germinação de Moyer et al.KH2PO4 .Água de milho ou Peptona .Glucose .CaCO3 .MgSO4 .Cerveja .Uréia . – Meio de Propagação .

“Up-stream” Meio de Fermentação de Moyer et al.(NH4)2HPO4 .Uréia .MgSO4 .Borato de sódio . (pH 6.KH2PO4 .CaCO3 .Glucose .0) .Peptona .

Incubou-se a 28o C por 72 horas.30oC por 5 a 7 dias.“Up-stream” 3. . Preparo do Inóculo: • Ativação do Aspergillus niger em meio inclinado de PDA esterilizado. • Inoculou-se o Aspergillus niger ativado no meio de esporulação de Moyer (frasco de Roux) e incubou-se a 25 .

• Filtrar em funil de vidro com gaze adaptado a um Erlenmeyer.“Up-stream” • Preparo da suspensão de esporos: foi adicionado assepticamente ao frasco de Roux contendo os esporos. 20 ml de água deionizada estéril para ressuspender os esporos. na capela e utilizando apenas materiais estéreis. .

“Up-stream” • ?????????????? .

Contagem de células em grande número . .“Up-stream” • Realizou-se a contagem de esporos/mL de filtrado em câmara de Neubauer.

“Up-stream” • Determinou-se o volume da suspensão de esporos a ser inoculado no meio de Moyer et al. para germinação: .

.“Up-stream” • O volume anteriormente calculado foi inoculado no meio de germinação de Moyer et al.. e incubados sob agitação (200 r. mantendo as condições de aeração e agitação até o dia seguinte.p.m.) por 48 horas. • Transferiu-se a cultura para um frasco de 2 litros contendo 500 ml do meio.

Produção em Biorreator: • O biorreator. 4.“Up-stream” • Repetiu-se a operação até obtenção de volume de inóculo suficiente para a produção em biorreator. os equipamentos auxiliares e os materiais necessários foram devidamente preparados e esterilizados .

- Manômetro Tacômetro Eletrodo + pHmetro Bomba peristáltica Manta elétrica Coletor de amostra .

“Up-Stream” • O meio de fermentação de Moyer et al. . foi adicionado ao biorreator e inoculado com o Aspergillus niger obtido na propagação com cerca de 10% do volume a ser trabalhado.

p.m Aeração pH inicial  CaCO3 a 30% Solução de Borato de sódio v.“Up-Stream” • • • • • • Temperatura de 30oC Agitação de 200 r.v.m. : .

“Up-Stream” 5. Amostragem: – Coleta de 50 mL de amostra – Após homogeneização: Tempo zero – Intervalos de tempo (± 6 horas) – 4 dias .

. agitação e aeração correspondentes ao tempo da coleta. temperatura.“Up-Stream” • Amostragem: – As amostras coletadas eram identificadas (GO0 – GO17) e registrados o pH.

“Up-Stream” • Amostragem: – Filtrou-se as amostras através de gaze. O filtrado (enzima extracelular) era coletado em frasco rotulado e identificado e armazenado em congelador. . retirou-se o excesso de água e transferiu-se para papel alumínio contendo folha de PVC onde foram embalados e levados para o congelador. – Os micélios retidos foram lavados.

calculou-se as atividades enzimáticas . o teor de proteínas. – A partir das análises. determinou-se a [açúcar redutor]. Análise das amostras: – O peso seco e a acidez total (ácido glucônico) foram determinados na produção de gluconato. a atividade da enzima intracelular e extracelular e. – De cada amostra coletada.“Up-Stream” 6.

“Up-Stream” .

“Up-Stream” .

“Up-Stream” .

“Up-Stream” .

9 L .“Up-Stream” • Término da produção: – Tempo 105 (horas) • Volume final no biorreator: – 8.

.

• [Gráfico peso seco] .

“Down-Stream” • A recuperação de enzimas ocorre através das etapas de extração e purificação • Na extração da enzima intracelular. Adicionou-se um tampão (6x o peso micelial) e triturou-se até obtenção de um material líquido. usouse areia (2x o peso micelial) para romper os micélios (método de cisalhamento) . .

“Down-Stream” • Transeriu-se o material líquido para um tubo de centrífuga e centrifugou-se por 5 minutos a 1000 r. • O sobrenadante foi transferido para um tubo de hemólise = EXTRATO BRUTO..m. .p.

Purificação de Enzimas .

Purificação de Enzimas .

Purificação de Enzimas • A pureza da enzima é determinada através de eletroforese de proteínas • Consiste na aplicação de um campo elétrico numa matriz sólida (gel de poliacrilamida) e baseia-se na migração das moléculas em relação a um campo elétrico. . devido à sua carga.

Purificação de Enzimas • O gel funciona como uma peneira molecular. permitindo a separação das macromoléculas por peso molecular .

A.Biochemical Engineering Journal 40 (2008) 54–63 Joint effect of nitrogen and phosphorous on glucose oxidase production by Aspergillus niger: Discussion of an experimental design with a risk of co-linearity J. Mirón. González. J. M.P. V´azquez.A. Murado . Ma.

Materiais e Métodos • Aspergillus niger CBS 554-65 • Cada unidade do experimento foi inoculada em uma solução de esporos até a concentração requerida pra se obter uma população inicial de 0.5 x 106 esporos/ml • Temperatura: 30ºC • Agitação: 200rpm .

Bifosfato de Potássio .Sulfato de Magnésio hepta-hidratado (0.3g/l) .Peptona • Como fonte de fósforo: .Carbonato de cálcio (22.Nitrato de Cálcio .Glicose (120g/l) .1g/l) • Como fontes de nitrogênio foram usados: .Materiais e Métodos • Componentes básicos do meio: .

650. 80. 130 e 180mg/l de fósforo .Concentração de 800 e 150mg/l de N e P. respectivamente .Cominação de níveis iniciais de nitrogênio de 350. 950 e 1259 mg/l com 30.Materiais e Métodos • As concentrações de nitrogênio e fósforo foram realizadas da seguinte maneira: .

Resultados e Discussão • Resultado expresso em N2P e NP2 (parecem mais realísticos) R2 ajustado = 1 .(ESS X ʋT/ TSS X ʋE) .

Resultados e Discussão .

.Conclusão • A produção de Glicose Oxidase é dependente da origem da força de nitrogênio. em relação a nitrogênio orgânico. • Fontes de nitrogênio inorgânico melhoram a produção de glicose oxidase.

. • Na presença de nitrogênio inorgânico. a produção de glicose é optimizada quando há um aumento na concentração de fósforo. pouca variância de resultado é observado com o aumento na concentração de fósforo.Conclusão • Na presença de nitrogênio orgânico.