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Técnicas de purificación y caracterización de proteínas

IBI. Fernando Acosta Gómez

Proteínas

separarlas y determinar su estructura es extremadamente difícil. La purificación depende de lo que se va a determinar en una proteína: o o o o o o Peso Molecular Punto isoeléctrico numero de subunidades numero de aminoácidos tipo de aminoácidos secuencia de aminoácidos Una vez determinados los Aminoácidos: o Cromatografía según su polaridad. .Una célula contiene millones de proteínas distintas.

* purificación de proteínas .

* purificación de proteínas Para estudiar detalladamente las propiedades de cualquier proteína es preciso contar con una muestra homogénea que sólo contenga moléculas de un tipo. . la carga y la polaridad. El porcentaje de recuperación indica cuánto de la proteína de interés se ha conservado en cada paso. Las técnicas de separación se concentran en el tamaño. que es donde residen las diferencias de las moléculas. Se aplican muchas técnicas para eliminar contaminantes y lograr una muestra pura de la proteína de interés.

* Aislamiento de proteínas de células .

* aislamiento de proteínas de células Para estudiar detalladamente las proteínas se necesita extraer las proteínas de la células y orgánulos subcelulares. Homogeneización: Ruptura de la célula.   Moler el tejido en una licuadora homogeneizador Potter-elvejhem. .

entonces la velocidad aumenta. para separar las mitocondrias y así hasta obtener las proteínas deseadas para su investigación.*Centrifugación Diferencial Después de la homogeneización. . la muestra se hace girar a unas 500 veces la fuerza de la gravedad (500 x g). se someten a una purificación bruda. Si la proteína deseada no se consigue. las células se someten a centrifugación diferencial. Una vez solubilizadas. comúnmente hecha con el sulfato de amonio y a esto se le conoce como precipitación por sales. por ejemplo a 10 000 x g.

Partiendo de un homogeneizador de células.* aislamiento de proteínas de células Uso de centrifugación diferencial para separar los componentes de las células. una fuerza gravitacional (g) creciente hará que se sedimenten diferentes componentes de las células Centrifugación diferencial .

Se separa por centrifugación y se desechan. una parte del agua forma enlaces iondipolo con la sal. Luego se añade más sal hasta que se precipita un grupo distinto de proteínas. se forma un precipitado que contiene las proteínas contaminantes.* aislamiento de proteínas de células Las proteínas se mantienen disueltas gracias a sus interacciones con el agua. donde se consigue la proteína de interés. Cuando se añade sulfato de amonio a una solución de proteína. A una concentración definida de sulfato de amonio. ´setas comienzan a interactuar hidrofóbicamente entre ellas. Al haber menos agua disponible para hidratar las proteínas. .

* Cromatografía de columna .

que esta fluye sobre el material estacionario y se lleva consigo la muestra a separar.* Cromatografía de columna Esta técnica comenzó a usarse a principios del siglo XX para separar pigmentos vegetales cuyos colores se distinguían con facilidad. estacionaria y la móvil. El material que se constituye en la fase estacionaria se empaca en una columna. se compone de 2 fases. . o porciones separables de materia. pero en la actualidad es posible separar compuestos incoloros. la fase móvil se pasa a través de la columna. se basa en el hecho de que diferentes compuestos pueden distribuirse en distinto grado entre diferente fase.

* Cromatografía de columna .

están en forma de granulado y consisten en uno o dos tipos de polímeros. En esta forma de cromatografía la fase estacionaria consiste en partículas de gel que forman enlaces cruzados. es útil para ordenar proteínas con pesos moleculares variados.* Cromatografía por filtración en gel También llamada por excusión de tamaño. . separa moléculas con base en su tamaño. Uno de carbohidrato como dextrano o agarosa y el segundo puede ser una poliacrilamida y la estructura creada con enlaces cruzados de estos polímeros crea poros en el material.

* Cromatografía por filtración en gel .

mientras que la proteína unida permanece en la columna. se distingue porque el polímero esta unido por enlaces covalentes con algún compuesto. .* Cromatografía por afinidad aprovecha las propiedades especificas de unión de muchas proteínas. que se une específicamente a la proteína deseada. también se usa un material polimérico como fase estacionaria. llamado ligando. Las demás ´proteínas de la muestra no se unen en la columnas y se eluyen con facilidad con amortiguador.

*Electroforesis .

una vez que las proteínas se separan en el gel se tiñe para revelar la ubicación de las proteínas. que incluyen papel y líquidos. Se aplica una muestra a depresiones moldeadas en el medio de soporte. a un voltaje controlado.*Electroforesis La electroforesis se basa en el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico. La movilidad de las macromoléculas depende de su carga. Aunque se han usado muchos medios de soporte para electroforesis. . forma y tamaño. para lograr la separación deseada. Se hace pasar una corriente eléctrica por el medio. el soporte más común es un polímero de agarosa o acrilamida similar a los empleados en cromatografía de columna. hacia un electrodo con carga opuesta.

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*Electroforesis .

*Electroforesis .

Electroforesis Bidimensional .

*Determinación de la estructura primaria de una proteína .

Las distintas partes se deben efectuar cuidadosamente para obtener resultados correctos. aunque no trivial. Basta calentar una solución de la proteína en ácido. por lo regular HCL 6 m a 100-110°C durante 12-36 horas para hidrolizar los enlaces pepiticos. en bioquímica clásica. El primer paso es averiguar que aminoácidos están presentes y en que proporciones.*Determinación de la estructura primaria de una proteína Determinar la sucesión de aminoácidos de una proteína es una operación rutinaria. .