Trabajo Práctico Nº4

Aislamiento de Microorganismos
Diversidad Metabólica

Objetivo del Trabajo Práctico
Aislamiento de microorganismos partir de distintos inóculos (agua, ricota, arroz, tierra y yogurt)
1)Enriquecimiento-Selección 2)Selección-Diferenciación 3)Obtención de un cultivo puro (Tinción de Gram y Pruebas Bioquímicas)

Microorganismos a aislar:
• • • • • • Enterobacterias (agua) Pseudomonas spp. (agua) Staphylococcus spp. (ricota) Bacillus spp. (arroz) Lactobacillus spp. (yogurt) Azotobacter spp. (tierra)

Medios de Cultivo: características generales
•Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgánicas, vitaminas)

•Disponibilidad de oxígeno
•pH •Humedad •Temperatura •Esterilidad

• Medios Definidos o Complejos

• Medios Mínimos (definidos) o Ricos (complejos).

•Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones) son conocidos. Ejemplo de Medio Definido para Escherichia coli:
Componente Glucosa Na2HPO4 KH2PO4 NH4Cl NaCl MgSO4•7H2O CaCl2•2H2O Gramos/litro 5 6 3 1 0.5 0.12 0.01 Fuente de C y energía Buffer, fuente de P Buffer, fuente de P Fuente de N Fuente de Na Fuente de Mg Fuente de Ca

•Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composición exacta de desconoce (extractos, peptonas, etc).
Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:
Componente
Extracto de carne Peptona Glucosa Na2HPO4•12H2O FeSO4•7H2O Indicador Sulfito de Bismuto Verde Brillante Ágar

Gramos/litro
5 6 5 4 0.3 8 Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y micronutrientes. También fuente de C. Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y micronutrientes. También fuente de C. Fuente de C y energía. Buffer y fuente de P. Indicador de producción de H2S. Fuente de Fe y S. Inhibe el crecimiento de Gram positivos

0.025 20

Inhibe el crecimiento de Gram positivos

Peptonas: péptidos (aminoácidos libres), carbono y nucleótidos. •Peptona de caseína (triptona): degradación pancreática de la caseína. •Peptona de carne: degradación pancreática de la carne. •Peptona de gelatina: degradación pancreática de la gelatina.

•Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporción de péptidos de menor PM, aminoácidos libres y factores de crecimiento. •Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levadura autolizada. Alto contenido de vitaminas.

•Medio Mínimo: posee la mínima cantidad de nutrientes requeridos para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.
•Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia (provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios complejos. Por ej: Luria-Bertani (LB):
Componente Triptona Extracto de Levadura NaCl Gramos/litro 10 5 10 Aminoácidos, carbono, energía, macro y micronutrientes. Vitaminas, macro y micronutrientes. Balance osmótico.

•Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el aislamiento de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el cultivo en el organismo de interés. •Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un grupo de bacterias y que inhiben el desarrollo de otros grupos. Por ej: sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram positivos. •Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algún cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reacción química. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo cuando el pH del medio es ácido (permite distinguir a las bacterias que fermentan lactosa). •Medio Selectivo y Diferencial.

Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):

1.

Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en un caldo de enriquecimiento.

2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados. 3. Estriar en medio selectivo (además puede ser diferencial). Obtención de colonias aisladas. 4. Tinción de Gram 5. Pruebas Bioquímicas: TP Nro. 5.

Enterobacterias
g-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Fermentadores de glucosa Anaerobios facultativos Flagelos peritricos Escherichia coli (algunas cepas patógenas) Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella, Proteus, entre otros. Todos con especies patógenas.  Oxidasa negativos       

Aislamiento de Enterobacterias (agua)
1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche. Peptona de Caseína Lactosa Bilis de Buey Púrpura de Bromocresol pH= 7,4±0,2 Incubar por 48 hs a 37ºC

Si hay fermentación de lactosa:
Sólo ácido Gas + ácido Coliformes, sin E. coli E.coli (junto a otras coliformes)

Aislamiento de Enterobacterias (agua)
Crecimiento en Caldo Mac Conkey Cambio de color a amarillo
Sí Sí

Formación de Gas
Sí Sí

Escherichia coli
(lactosa +)

Bueno Bueno

Enterobacter cloacae
(lactosa +)

Klebsiella pneumoniae
(lactosa +)

Bueno

Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

Bueno
Malo Malo

No

No

Si hay formación de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, el siguiente paso es estriar en ágar Mac Conkey y ágar EMB.

Aislamiento de Enterobacterias (agua)
2. Ágar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.
•Peptona de Caseína •Peptona de Carne •Cloruro de Sodio •Lactosa •Sales biliares •Cristal violeta •Rojo Neutro pH= 7,1±0,1 Incubar por 24 hs a 37ºC
Apariencia de las colonias Microorganismo

Grandes, rojas, con halo
Grandes, rosadas, mucoides Incoloras, transparentes Pequeñas, opacas, aisladas

Escherichia coli (lactosa +)
Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa +) Salmonella spp., Shigella spp., Proteus spp.
Enterococci, Staphylococci

Ágar Mac Conkey
Lactosa + Lactosa -

Escherichia coli

Salmonella typhimurium

Aislamiento de Enterobacterias (agua)
2. Ágar EMB: medio selectivo y diferencial (enterobacterias patógenas). •Peptona de Carne •Hidrógenofosfato dipotásico •Lactosa Apariencia de las •Sacarosa colonias •Eosina Amarillenta Transparentes, de color •Azul de Metileno ámbar pH=7,0±0,2 Incubar por 24 hs a 37ºC
Verdosas con brillo metálico a la luz reflejada, con el centro negroazulado a la luz transmitida

Microorganismo

Salmonella spp., Shigella spp. Escherichia coli (lactosa +,
sacarosa +)

Más grandes que las de E. coli, mucosas, confluentes, con el centro pardo-grisáceo a la luz transmitida

Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa+, sacarosa-)

Ágar EMB
Lactosa + Lactosa +

Escherichia coli

Enterobacter spp.

Pseudomonas spp.
        g-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Aerobios estrictos Con flagelos polares Producen pigmentos No fermentadores Oxidasa positivos Patógenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos

Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua)
1. Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42ºC: enriquecimiento y selección.

2. Estriar en Ágar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas

aeruginosa

• • • • •

Peptona de Gelatina MgCl2 Cetrimida Glicerina SO4K2

Incubar por 48 hs a 37ºC.
Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus spp.
• • • • • • Cocos Gram positivos Anaerobios facultativos Fermentan glucosa (ac. láctico) Asociados a piel y mucosas Patógenos (S. aureus) Resisten altas concentraciones salinas

Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota)
1.
2.

Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento (2 hs a temperatura ambiente)
Mezclar con Caldo Cerebro Corazón (con NaCl 13%): medio selectivo para Estafilococos patógenos.

• Infusión de cerebro • Infusión de corazón • Proteosa peptona • D(+) Glucosa • NaCl (7.5% final) • Hidrógenofosfato disódico pH=7,4±0,2 Incubar por 48 hs a 37ºC

Si hay crecimiento, estriar en Ágar manitol salado-rojo fenol y Ágar azida

Aislamiento de Staphylococcus aureus
3. Ágar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite distinguir entre S. aureus y otras especies no patógenas).

• Peptona de carne • Extracto de carne • NaCl 7.5% • D(-)Manitol • Rojo fenol pH=7,4±0,2
Incubar por 48 hs a 37ºC

Apariencia de las colonias
Con halo amarillo, luminoso; crecimiento intenso Sin cambio de color; poco crecimiento

Microorganismo
Manitol-positivos: S.

aureus

Manitol-negativos: S. epidermidis y otros.

1. 2. 3.

S. aureus S. epidermidis Micrococcus luteus

3. Ágar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp. Incubar por 48 hs a 37ºC

Bacillus spp.
• • • • • • Bacilos Gram positivos Forman endosporas Generalmente móviles con flagelos peritricos Aerobios (facultativos) B. cereus (alimentos)

B. anthracis

Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz)
1. 2. 3. 4. • • • • • • Arroz en PBS (80ºC por 5 min.): selección. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento. Incubar por 48 hs a 37ºC. Estriar en Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo: selectivo y diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis) Peptona de carne Extracto de carne D(-)Manitol NaCl Rojo Fenol Emulsión de yema de huevo/Polimixina B

Incubar por 48 hs a37ºC.

Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado
blanco (Manitol – y lecitinasa +).

Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).

Lactobacillus spp.
• Bacilos o cocobacilos Gram positivos • Fermentadores lácticos • Aerobios facultativos o microaerófilos

Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)
1. Ágar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento selectivo. Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso. pH = 5.7. Incubación en microaerobiosis. 2. Ágar Rogosa: medio más selectivo que el anterior, con mayores concentraciones de acetato y pH = 5.5 que inhiben flora acompañante. Incubación en microaerobiosis.
Ágar MRS-Lactobacillus casei

Azotobacter spp.
• • • • • Bacilos o cocos Gram negativos Habitan en el suelo y en el agua Fijan nitrógeno atmosférico (N2 a NH3) Vida libre Forman quistes (similar a endosporas)

Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de nitrógeno. Contiene manitol (azúcar fermentable). Crecimiento a 28ºC.

Microorganismo
Agua Agua Ricota

Enriquecimiento -Selección

SelecciónDiferenciación
Ágar Mc Conkey y ágar EMB Ágar Cetrimida Ágar manitol salado rojo fenol y ágar azida Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo y PmB.

Enterobacterias Caldo Mc Conkey Pseudomonas Staphylococcus Caldo M9-42ºC Caldo cerebrocorazón con 7.5% NaCl 80ºC y caldo nutritivo

Arroz

Bacillus

Yogurt
Tierra

Lactobacillus
Azotobacter

Ágar MRS Microaerobiosis
Caldo Fred& Waskman-28ºC

Ágar Rogosa Microaerobiosis
Ágar Fred & Waskman-28ºC

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