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Universidad Nacional Mayor de San Marcos FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Departamento Académico de Microbiología

Dr. Gerardo Gamarra Ballena

BIOTECNOLOGÍA BÁSICA
1750 Lázaro Spallanzani aporta evidencias de que los microorganismos no surgen espontáneamente. 1815 Gay – Lussac. Estudio Cualitativo y Cuantitativo de la fermentación alcohólica. 1828 Wholer sintetiza la úrea, desmintiendo el punto de vista de que los compuestos orgánicos sólo pueden ser sintetizados por organismos vivos. 1837 C. Cagniard – Latour, Th. Schwann y F. Kutzing proponen de manera independiente que las levaduras que aparecen durante la fermentación son plantas microscópicas y son las causantes de ésta. 1838–1839 Schleiden y Schwann dan argumentos convincentes para la doctrina celular.

BIOTECNOLOGÍA BÁSICA
1876 Tyndall creó un método de esterilización por calentamiento discontinuo. 1876 Roberto Koch demuestra la causa bacteriológica o etiología del ántrax. 1857 – 77 Luis Pasteur. Estudio sobre las fermentaciones: Informe sobre fermentaciones lácticas. Investigación sobre la fermentación alcohólica (cerveza, vino). Fermentación butírica. Bacterias anaeróbicas. Estudio sobre el vinagre. 1859–62 Estudios sobre la generación espontánea. Se pone en evidencia la existencia de microorganismos en la atmósfera. 1865–70 Estudios sobre las enfermedades del gusano de seda.

BIOTECNOLOGÍA BÁSICA
1876 En colaboración con Chamberland: Esterilización por el calor húmedo bajo presión (autoclave). 1880 Investigaciones sobre el cólera de los pollos y descubrimiento de la inmunización de animales con cultivos bacterianos atenuados. 1880 Vacunación anticarbonosa. 1880 Estudios sobre la erisipela porcina. 1884 Vacunación contra la rabia. 1886 Aplicación del tratamiento antirrábico al hombre.

PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA, ENZIMOLOGÍA MICROBIANA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.
1868 1886 1897 Mischer descubre los ácidos nucleicos. Waldeyer propone la palbra “cromosoma”. Buchner: Realización de la fermentación alcohólica con extractos de levaduras trituradas. Descubrimiento del papel de substancias endocelulares, las enzimas, en el poder fermentativo. De Vries, Tchermak y Correns redescubren las leyes de la herencia de Mendel (1865 ). Painter definió los cromosomas y su significado. Stanley descubre los virus. – 53 Watson y Crick: Esquema general de la conformación espacial del DNA.

1900 1933 1935 1952

PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA, ENZIMOLOGÍA MICROBIANA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.
La era de los antibióticos (1940 – 1960). Penicilina: Tecnología de la fermentación sumergida. Gran variedad de antibióticos. Tecnología de la estructura de la célula animal; vacunas contra virus. Transformaciones microbiológicas de esteroides.

PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA, ENZIMOLOGÍA MICROBIANA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.
La era Post antibióticos (1960 – 1975). Aminoácidos. Proteína celular (SCP). Enzimas (detergentes). Tecnología de las células y las enzimas inmovilizadas (Glucosa Isomerasa). Tratamiento anaerobio de aguas de desecho (Biogas). Polisacáridos bacterianos (Goma de xantán). Gasohol. Teoría de los genes de Carison. Watson escribe “La doble hélice” (DNA).

PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA, ENZIMOLOGÍA MICROBIANA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.
La era de la nueva biotecnología (1975). Tecnología de los hibridomas: Anticuerpos monoclonales. Pruebas diagnósticas con anticuerpos monoclonales (1980). Ingeniería genética (1974). Vacunas de origen animal contra la diarrea (1982). Insulina humana (1982).

¿QUÉ ES LA BIOTECNOLOGÍA?

La federación Europea la define como la aplicación de agentes biológicos, ya sea en la industria manufacturera o en operaciones de servicio. La biotecnología por su naturaleza multidisciplinaria requiere de las grandes aportaciones de las ciencias: Microbiología, Bioquímica, Ingeniería de Procesos, Industria de la Fermentación, Genética molecular, etc.

Biotecnología – Trevan. Es la aplicación de organismos, sistemas y procesos biológicos en las industrias manufactureras y de servicio. Es multidisciplinaria, es decir, que abarca una amplia variedad de áreas distintas.

Biotecnología.Como presencia de microorganismos que utilizan la materia prima, para degradarla, sintetizarla y obtener un producto, (procesos biológicos y de servicio), y se caracteriza por su aspecto multidisciplinario y sistemático.

Biología celular Diagnósticos Clínicos Ingeniería de Procesos

Biología molecular

Bioquímica

Genética molecular

Microbiología

Fermentación

Industria enzimática

Industria farmacéutica Ambiente y energía Industria de fermentación

Industria Química

Industria alimentaria y forrajera

Dr. Gerardo Gamarra Ballena

APLICACIÓN DE MICROORGANISMOS Y SISTEMAS O PROCESOS BIOLÓGICOS EN LAS INDUSTRIAS MANUFACTURERAS Y DE SERVICIO

DNA RECOMBINANTE INGENIEÍA GENÉTICA

ENZIMAS Y BIOCATALIZADORES Elaboración de alimentos

INGENIERÍA DE PROCESOS

Donador de DNA

Sustancias químicas Quimioterapia

Recolección Pretratamientos Filtración

Efluentes Reciclado de aguas Extracción de productos

Vector de DNA
Hospedador de DNA Producto deseado Sust. químicas Hormonas Anticuerpos Factores de la sangre Enzimas Vacunas

Equipo de diagnósticos

Biosensores

Reactores nuevos Recuperación de Catalizadores/microorganismos

COMBUSTIBLES Alcohol, por ejemplo, caña de azúcar

Hidrógeno, por ejemplo, fotolisis

Metano, por ejemplo, digestores de biomasa INTERFERONES y ANTICUERPOS MONOCLONALES Equipos de diagnóstico Terapéuticos FIAJCIÓN DE NITRÓGENO Producción de biomasa Proteínas unicelulares Sustancias químicas, Por ejemplo: esteroides alcaloides CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES Y PROTEÍNAS UNICELULARES

TRATAMIENTO y UTILIZACIÓN DE RESIDUOS

Reducción del uso de fertilizantes-N para plantas

N atmosférico a amoníaco

Detoxificación, por ejemplo, herbicidas.

Aguas residuales FERMENTACIONES TRADICIONALES

Utilización de subproductos, Por ejemplo, suero de quesería, residuos de celulosa

Alcohol

Antibióticos

Sust. Químicas

Dr. Gerardo Gamarra Ballena

Dr. Gerardo Gamarra Ballena

Fig. 1 Esquema de Levadura en Reposo (según Prescott)

ESTRUCTURA DE LAS LEVADURAS
Las estructuras se observarán a microscopio simple en diferentes formas de acuerdo a su clasificación. Estas son: Ascomycetos y Basidiomycetos. Pero al microscopio electrónico en los ascomycetos se ve toda la estructura de una levadura. Su pared celular aparece como una copa ancha y una capa clara y oscura más fina, mientras en los basidiomycetos se observa un número variable de capas claras y oscuras alternas.

También existe diferencias a nivel las de cicatrices de la yema. En los ascomycetos, las levaduras tienen una germinación polar o bipolar presentan más cicatrices pocas profundas y concéntricas que son los residuos de las paredes celulares. En los basidiomycetos, la germinación polar deja cicatrices más profundas.

Las paredes de las levaduras están compuestas de polisacáridos y proteínas. Los ascomycetos contienen esencialmente glucanos, mannanas, y quitina;
Los basidiomycetos contienen esencialmente glucanos y quitina. Las levaduras de los ascomycetos presentan una reproducción sexual por formación de Asca que encierra ascosporas, por ejemplo: Saccharomyces cerevisiae.

Las paredes de las levaduras en general están esencialmente compuestas de polisacáridos de cápsulas (galactosa, xilosa, manosa).

Su pared contiene glucanos, polímeros de la glucosa unidos por enlaces  (1 – 3)  (1 – 6). La síntesis de los glucanos se realiza por 2 enzimas: una glucano sintetasa y una enzima ramificada. La actividad de la glucano sintetasa es máxima en el momento del crecimiento de la yema, y disminuye cuando alcanza su tamaño normal.

Los glucanos que se forman se dirigen hacia la yema formando la pared celular de la célula hija. La quitina, es un polímero N – Acetil glucosamina, que es el constituyente típico de los septos y de las cicatrices de las yemas.
Su síntesis comienza con la iniciación de la yema, cuando el septo entre la yema y la célula madre se está formado.

Las levaduras poseen también una membrana citoplasmática, que es una de las estructuras de singular importancia por su valor biológico durante el desarrollo en la vida de las levaduras. Esta formada con una fina estructura compuesta de lípidos y proteínas en la capa exterior.
Entre la pared celular y la membrana citoplasmática hay espacios periplasmáticos, donde están también las enzimas que participan en la biosíntesis de la pared celular, regulando la entrada y salida de los solutos moleculares de la célula. Se distinguen por la invaginación que presentan.

El citoplasma.- Se presenta como un líquido denso donde encontramos el núcleo, ribosomas, los polifosfatos, mitocondrias, vacuolas, etc. El núcleo con su membrana nuclear, es el que dirige la información genética, también se encuentra el centrosoma, los centríolos, muy cerca se observa la pared de cromosomas y el ADN. Por cada molécula de ADN hay un cromosoma (las bacterias poseen 16 cromosomas generalmente).

Las mitocondrias.- Son ricas en lípidos, poseen una membrana interna donde se encuentra la matriz, las crestas, y que están plegadas hacia el interior. En la membrana interna están presentes las enzimas del ciclo de Krebs, las enzimas de la cadena respiratoria, los citocromos.

Los ribosomas participan en las síntesis de las proteínas.

Reproducción vegetativa.- En las levaduras puede reproducirse por gemación o por escisión binaria. La formación de la yema comienza por una invaginación de la célula, luego la levadura aumenta de tamaño antes de separarse de la célula madre. La gemación puede ser polar únicamente en un extremo de la levadura, bipolar (los dos extremos) y multilateral, cuando las yemas se localizan en el perímetro de la célula madre. La división celular se presenta en aumento de tamaño, hay una división nuclear seguida de una división citoplasmática, que contiene los mismos elementos de la madre.

Fig. 2 Corte Transversal de una Célula de Levadura

Gemación axial o polar. Gemación multilateral

Gemación bipolar.

REPRODUCCIÓN DE LEVADURAS POR GEMACIÓN. SE TOMARON LAS MICROFOTOGRAFÍAS A INTERVALOS DE 15 MINUTOS

Dr. Gerardo Gamarra Ballena

Dr. Gerardo Gamarra Ballena

Dr. Gerardo Gamarra Ballena

Microfotografía electrónica de cortes finos de Saccharomyces cerevisiae, en la que pueden apreciarse botones o yemas, y estructuras de la pared celular. A, es un brote cuyo citoplasma se continúa con el de la célula madre. B, es un botón maduro, con pared transversal en desarrollo, entre la células madre e hija. C, es la prolongación de la sustancia de pared celular en el interior del citoplasma, fenómeno al parecer característico de las fases tardías del proceso de gemación. D, es una cicatriz de botón cuya superficie es siempre convexa.

Dr. Gerardo Gamarra Ballena

La imagen de la izquierda muestra una célula normal, de levadura con su brote o yema y otras dos células en proceso de conjugación. En la reproducción de la derecha pueden verse ascosporas de levadura. Dr. Gerardo Gamarra Ballena

Crecimiento líquido.-

de

levaduras

en

medio

Se puede efectuar en medio de cultivo de extracto de malta o mygp (disco) o en medio Saboroud se cultivan a 28°C por 72 horas. Se observa crecimiento por la turbidez y formación de un sedimento en el fondo del tubo, de aspecto fino o grueso que puede presentar una película la superficie, generalmente con formación de gas.

El crecimiento en medio sólido.Se realiza usando extracto de malta o saboroud al cual se le agrega 2% de agar y se coloca en una placa petri, la siembra se realiza por estrías. La observación de los cultivos permite definir tamaño de las colonias. La forma de las colonias pueden ser: convexas, cóncavas, contornos nítidos o irregulares.

Por su aspecto la colonia puede ser de color mate o brillante, blanca o pigmentada.

Las levaduras pueden ser esféricas, ovoides, alargadas, elípticas, apiculadas (forma de limón), forma de botella por ejemplo: Malassezia), forma triangular el género Trigonopsis. Una misma especie de levadura está sujeta a las formas de variación, ejemplo: Saccharomyces cerevisiae.

Características bioquímicas y fisiológicas.Mientras que las características morfológicas y sexuales permiten identificar el género, las características bioquímicas permiten definir la especie de la levadura. Las levaduras se identifican mediante el consumo de azúcares en un tubo de prueba, donde está previsto de Tubos de Durhan. Los azúcares que van a producir fermentación son: Celulosa, galactosa, sacarosa, maltosa, rafinosa, melobiosa, sorbosa, L- ribosa, celobiosa, salicina, manitol, sorbitol.

La concentración de azúcares es de 2%, salvo para la rafinosa 4%.
Los cultivos se incuban 25° - 28°C, por un tiempo de 48 horas o más. Se dice que el azúcar es fermentativo cuando hay presencia de gas en la campana de Durhan.

FACTOR KILLER EN LEVADURAS
Los investigadores BEVAN Y MAKOVER ,identifican las levaduras Killer,que segregan una toxina proteica, que tienen una acciòn letal, y que mata otras levaduras sensibles, ser de un estirpe celular de una población de una misma especie o de otra diferente. En toda población de un cultivo de levaduras puras, de una determinada especie existen 4 efectos de la célula: a) Productoras de toxinas letales (Muerte). b) Las sensibles que mueren bajo su acción de la toxina . c) Neutras, es decir que no la producen, ni se afectan por la toxina. d) Una sensible a su propia toxina que se denominan células suicidas.

FACTOR KILLER EN LEVADURAS
Se pueden distinguir 4 fenotipos diferentes: Killer (K) Sensible (N) Neutro (S)

Suicida (S)
Existen diferentes actividades y resistencias de cada fenotipo.

Ejemplo: Saccharomyces cerevisiae sensible, según su grado de resistencia.

ESTUDIO DE LA TOXINA KILLER
Se ha demotrado que el lugar de la acciòn toxica de la toxina K esta en la membrana citoplamtica de la levadura . La síntesis de la toxina se realiza en el citoplasma y el proceso esta controlado por el genoma nuclear. Su mecanismo, la toxina Killer es producida en las fermentaciones de cerveza (mosto); se ha comprobado que no es necesario el contacto intercelular, para perder sus compuestos metabòlicos y detener su sìntesis de la cèlula y producir su muerte.

ESTUDIO DE LA TOXINA KILLER
La toxina una vez medio medio de cultivo actúa sobre receptores glucosídicos de la pared celular de la cepa sensible, específicamente en los enlaces 1-6-glucano de la pared celular, impidiendo la entrada de la glucosa al interior de la levadura privándole por lo tanto su nutrición y energía, anulando su metabolismo celular enérgico de la célula, inhibe la síntesis de ATP, variando el pH, 6.3 a 5.1, cambia la polaridad y permeabilidad de la membrana celular y alterándo por lo tanto la función bioquímica.

CONSERVACIÓN DE CEPAS PURAS
Una cepa industrial debe conservarse, con cierta regularidad en medios adecuados y las condiciones que requiere el mantenimiento de cada cepa. Tradicionalmente los microorganismos se han conservado por sucesivos cultivos por período sin tiempo. Pero las células son pocas las que sobrevivien, que no pueden ser representativas de un cultivo inicial. En efecto la comparación con otros microorganismos las levaduras están predispuestas a sufrir daño durante su mantenimiento. Por que producen no producen esporas resistentes como los hongos o algunas

CONSERVACIÓN DE CEPAS PURAS
Las principales Técnicas de Conservación: 1. SUBCULTIVO: Se trata de transferir regularmente las células de los microorganismos a un medio de cultivo en lo posible recién preparado, como medio nitrógeno base extrato de levadura más glucosa (Difco) son adecuadas para la mayoría de cepas. Los medios líquidos son preferibles que los de medios de cultivos sólidos, pueden provocar la formación de Ascosporas, lo que no es deseable para la estabilidad de las cepas.

CONSERVACIÓN DE CEPAS PURAS
Si en un subcultivo preparamos un tubo con el medio cultivo mencionados sembramos, incubamos a temperatura de 28°C por 72 horas, que esta en la fase estacionaria y colocarlos entre 1°C y 4°C y pueden mantenerse hasta los 6 meses. Después hacer otra transferencia al medio de cultivo. Este método no es bueno para un mantenimiento a largo plazo. En cambio para un corto plazo presenta la ventaja de la simplicidad y bajo costo.

CONSERVACIÓN DE CEPAS PURAS
2. MÉTODO DE LIOFILIZACIÓN: Para la mayoría de los Investigadores, el mejor método es de liofilización para conservar los cultivos puros, durante largo tiempo en stock. Su principio consiste en colocar los frascos en el liofilizador para un enfriamiento brusco hasta la congelación es un factor importante y luego una desecación a muy baja temperatura y al vacío que va permitir la mejor supervivencia de los microorganismos. Esta técnica se conserva: Levaduras, hongos, bacterias, virus y algas, sin haber alteraciones genéticas, bioquímicas estructurales.

CONSERVACIÓN DE CEPAS PURAS
La técnica recomienda usar un medio pobre, que permita una mejor supervivencia que un medio rico.. Se puede utilizar glucosa suero, inositol suero, leche descremada, sacarosa. Se ha comprobado que en el caso de Saccharomyces cerevisiae presenta un75 % de supervivencia, pero en algunas cepas se obtienen del 95 a 100% de supervivencia. Para su conservaciòn se guardan en ampollas estériles y se llenan con 2ml de la mezcla de la cepa en stock.

CONSERVACIÓN DE CEPAS PURAS
3. MÉTODO DE DESECACIÓN: La desecación se lleva a cabo con la ayuda silica gel. El método o técnica directa, consiste en colocar algunas gotas de una suspensión concentrada de células, recogidas en la fase estacionaria, , en leche esteril en un pequeño tubo que contenga sílicagel (al (alrededor de 1ml de altura) previamente autoclado. Los geles se conservan durante 2 semanas a temperatura ambiente y después se llevan a temperatura 4°C para su conservación. La supervivencia de las células es variable según la clase de cepas. Se ha demostrado que el 50% de las cepas son revivibles tras dos años en el silica gel.

CONSERVACIÓN DE CEPAS PURAS
MÉTODOS DE CONGELACIÓN: La técnica usa cultivos líquidos con una supervivencia prolongada, para los cultivos ,se usa el glicerol (510%) estéril. Después son llevados a congelación a-- 30°C durante 2 horas al medio ambiente para luego llevarlos a conservar a-- 70°C tambièn por congelación. Se debe agitar 1 vez al año para oxigenarlos. Los cultivos debe tener una concentración de células 106 y 107 por mililitro. Para ser usados se colocan en Baño María a 30ºc para su revivificación.

OPERACIONES UNITARIAS O RECUPERACIÓN DE LA LEVADURA EN LA ALIMENTACIÓN
La levadura producida con fines alimentarios, tiene como principal riqueza, las proteínas ricas en vitaminas del complejo B, en especial para la alimentación de animales de interés veterinario, conocida como levadura forrajera. Éstas son obtenidas usando cepas del género Candida y Saccharomyces cerevisiae. Las levaduras de alimentación son cepas secas, inactivadas y muertas, muy poco se usan cepas vivas en la alimentación. EN la fermentación alcohólica se obtiene leche de levadura, generalmente por separación de uno o más lavados por centrifugación.

Esquema de Operaciones unitarias o Recuperación de levaduras de alimentación.

FERMENTADOR

1
Líquido fermentado por levaduras

OPERACIONES UNITARIAS O RECUPERACIÓN DE LEVADURA DE PANIFICACIÓN
Se obtiene mediante la fermentación en tanques de 20 a 50 toneladas, dotadas de sistema de agitación permanente a 28°C en medio de cultivo esterilizado a 120°C por 70 minutos, el cual contiene el elemento principal que es un azúcar, factores de crecimiento y otros micro elementos. Es preciso separar el inóculo en el laboratorio, para producir el inóculo industrial representado por una importante masa microbiana de la cepa de Saccharomyces cerevisiae. Este inóculo industrial es sometido a un proceso de fermentación discontínua, hasta lograr un buen paquete celular. Obtenido el producto, se inicia el proceso de recuperación y purificación, que vienen a ser las “Operaciones Unitarias”.

Esquema de Operaciones Unitarias o Recuperación de levadura de panificación

OPERACIONES UNITARIAS O RECUPERACIÓN DE LA VITAMINA B12
La obtención de la vitamina B12 se hace por fermentación industrial, utilizando cepas de Streptomyces olivaceus. Se fermenta por 60 hrs. obteniéndose una elevada biomasa que es separada por filtración, centrifugación y finalmente por operaciones unitarias. El licor fermentado es trasvasado a un tanque de tratamiento con sistema de agitación y chaqueta para mantener la temperatura mediante un equipo regulador con entrada y salida de agua temperada. En este tanque se añade ácido sulfúrico para ajustar a pH 5. Luego se calienta hasta ebullición siempre con agitación del medio. Así la vitamina B12 es liberada de la biomasa por centrifugas equipadas con filtros rotatorios al vacío. El líquido filtrado pasa a un concentrador al vacío hasta la obtención de jarabe concentrado de vitamina B12.

ESQUEMA DE RECUPERACION DE VITAMINA B 12

Esquema de Operaciones Unitarias o Recuperación de Vitamina B12 FILTRO ROTATIVO AL VACIO

1
60 hr

FERMENTADOR STREPTONYCIS OLIVACIUS

3

SECADOR

CONCETRADOR

H2 504 P5=5
CENTRIFUGA - SEPARADORA

4

6

3 2

SECADOR LICOR MADRE 3

JARABE Na 2SO3 3 LICOR MADRE

5
MOLINO EMBALAJE

OPERACIONES UNITARIAS O RECUPERACIÓN DE LA VITAMINA B2 RIVOFLAVINA
Bacterias, levaduras y algunos hongos son capaces de producir Rivoflavina (B2), sin embargo los hongos más utilizados son: Ashby gossepii y Eremothecium ashbyii. Se sabe que el procedimiento de fermentación sumergida (del cual nos ocuparemos más adelante), es mejor ya que por lo general se obtiene un rendimiento de 0.2 a0.6 g de rivoflavina. Existen dos métodos de aplicación de operaciones unitarias:

• Obtención de rivoflavina suministrada directamente por fermentación
• Rivoflavina purificada y concentrada por extracción sucesiva a partir del medio fermentado.

CONCETRACION AL VACIO ESQUEMA DE RECUPERACION DE VITAMINA B2

25%
CENTRIFUGACION FERMENTADOR FILTRO CONCENTRADO

ASHBY GOSSEPII

2
SOLVENTE

SECADOR DE TAXBOR

1 3

6
5

8 EMBALAJE

CRISTALIZADOR

7 SECADOR

Dr. Gerardo Gamarra Ballena