ELECTROFORESIS

Por: Robinson Pérez Alejandra Villa Catalina Burbano Clara Bedoya

Electroforesis
Tecnica de separacion en la cual una particula cargada se hace desplazar a traves de un medio de soporte aplicando un campo electrico.  La primera electroforesis fue realizada por Tiselius en 1937

Realización de la electroforesis Realización de la muestra selección y preparación del soporte Aplicación de la muestra Electroforesis Revelado lectura .

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La velocidad de migración depende de: la carga neta  Fuerza del campo F=Q. v  .V  Coeficiente de fricción Fr = f .

. carga que dependerá del pH de la solución en que se encuentren. Algunos factores que afectan la migracion de particular son: Efecto del pH en el tampón: la carga neta se determina por el pH de buffer. Tamaño y forma: entre mas grande mas difícil la migración ( depende del soporte utilizado). Potencial del campo eléctrico: entre mas alto mas rápido se moverá la partícula. Una partícula migra hacia el ánodo o cátodo dependiendo de su carga neta.

 Papel  Acetato de celulosa  Agarosa .SOPORTES Los principales soportes utilizados son de dos tipos: NO RESTRICTIVOS: en funcion solo a la carga electrica de la particula.

. La intensidad de resistencia dependerá del tamaño del poro del gel y de la partícula. Presenta ciertos inconvenientes  Geles de poliacrilamida.RESTRICTIVOS:el soporte ejerce algún tipo de resistencia al desplazamiento. soporte ideal para mas y mejores separaciones.  Gel de almidón.

 Electroforesis de papel  Electroforesis en acetato de celulosa  Electroforesis en gel de agarosa  Electroforesis en gel de almidón  Electroforesis en gel de poliacrilamida  Isoelectroenfoque .Técnicas electroforeticas Los diversos tipos de electroforesis son determinados por el soporte que utilizan.

La electroforesis es aplicada a la separación de partículas como: ADN y ARN Proteínas .

Electroforesis de ARN y ADN  Las moléculas de DNA y RNA son en general demasiado grandes para que avancen a una velocidad razonable por estos geles. porque poseen carga neta negativa a pH superiores a 8. por lo que lo habitual es fragmentarlas antes de someterlas a electroforesis.  . las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán al polo positivo.

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA .

que es una sustancia firme como la gelatina. en un campo eléctrico de acuerdo al tamaño y a su carga eléctrica.ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA Técnica por la cual se separan proteínas en mezclas complejas. . La electricidad impulsa las moléculas a través de los poros de un gel. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las más grandes. El gel puede hacerse de manera que sus poros tengan distintas dimensiones.

Forma.FORMACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador (bis-acrilamaida). capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. insolubles en agua y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. geles transparentes con estabilidad mecánica. se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro. además. . Variando la concentración de acrilamida. es químicamente inerte.

La velocidad de polimerización depende de la concentración del catalizador y el iniciador. El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separación del gel.  Las soluciones se desgasifican pues el oxígeno es un inhibidor de la polimerización. como iniciador usualmente se utiliza el TEMED y como catalizador el ion persulfato .Características de la electroforesis en geles de poliacrilamida.  Los geles de poliacrilamida se forman de la polimerización de la acrilamida por acción de la Bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un catalizador.  .   La porocidad del gel esta determinada por las porciones de poliacridamida y bis-acrilamida existentes.

Clasificación: De acuerdo al estado de la proteína.  Nativa: somete a las proteínas a migración pero sin desnaturalizarlas. Carga-tamaño-forma.  Desnaturalizante: es la que somete a la proteina a migrar pero desnaturalizandola completamente. Carga-tamaño. la electroforesis se puede clasificar en nativa o desnaturalizante. .

Se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en el que las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes y son separados como cadenas polipeptidicas aisladas.SDS-PAGE.  Es la mas usada. . Este sistema permite la separación de grandes volúmenes de muestras sin perdidad de resolución.

La región del ánodo(+) es ácida y la del cátodo (-) es alcalina.  Se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. .Isolectroenfoque. Las moleculas amfotéricas como los aminoacidos se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH.

Isolectroenfoque. Ánodo Cátodo .

ELECTROFORESIS DE GELES EN GRADIENTE El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de arcrilamida + bisacrilamida. y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño del poro. . En un gel en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el tamaño de poro impida cualquier avance.

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ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Le electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas de una mezcla según dos propiedades moleculares. una primera dimensión mediante isoelectroenfoque y una segunda dimensión según peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida-SDS. pero existen sistemas que permiten la comparación automática de manchas ('spots') para la identificación precisa de las mismas necesaria en el análisis cuantitativo. una en cada dimensión. . Uno de los mayores problemas es el análisis.

S D S 12% Electroforesis 2D de músculo esquelético de rata. rango de pI 310. Primera dimensión: Isoelectroenfoque. Segunda dimensión: SDS-PAGE 12% .

DETECCIÓN DE PROTEÍNAS EN GEL Las proteínas que se han separado de un gel de poliacrilamida.2 y 0.6 microg de proteína. pueden ser detectadas por diferentes métodos entre los cuales se destacan: 1.COLORANTES: La tinción con azul de COOMASIE permite detectar hasta 0. .

2. TINCIÓN CON PLATA: Es muy fácil de usar y tiene una gran sensibilidad (entre 50 y 100 veces más sensible que con azul de coomasie) .

permitiendo ser detectada mediante el revelado de la esta. que emplea emulsiones fotográficas sensibles a la partícula radiactiva. . La emulsión contiene plata que es sensible a la radiación. de forma que se precipita como plata metálica. AUTORRADOGRAFÍA: Detección de moléculas marcadas radiactivamente.3.

AUTORRADIOGRAFÍA .

FLUORGRAFÍA: Las proteínas marcada con isótopos de emisión mas débil como H3. . se detectan mucho mas fácilmente si se las impregna con una solución de centelleo y posteriormente se expone ante película fotográfica. C14 o S35.4.

FLUOROGRAFÍA .

Pureza de reactivos 4. Temperatura 2. Preparación de muestras . Niveles de catalizador 3.FUETES DE ERROR EN LA ELECTROFORESIS La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por por muchos errores experimentales como: 1. Tiempo de corrida 5. Velocidad de la polimerización.