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TECNICAS ENZIMATICAS

Dr. Ronald Navarro Oviedo Departamento Académico de Biología Cátedra de Enzimología U.N.S.A.

TECNICAS ENZIMATICAS
 La propiedad mas característica de una enzima es

su poder para catalizar una reacción química definida  La presencia de una enzima se detecta por las reacciones que ellas catalizan  La cantidad de una enzima se estima a partir de la velocidad de reacción

MEDICION DE LA VELOCIDAD
 Las curvas de progreso de las reacciones enzimáticas,   


muestran que la velocidad decae con el tiempo (velocidad vs. tiempo) Las causas de esta caída son: A) Los productos de la reacción pueden inhibir a la enzima. B) El grado de saturación de la enzima por el S puede disminuir a causa de la caida de la [S] conforme procede la reacción C) La reacción inversa puede hacerse mas importante a medida que aumenta la [ ] de los productos. D) La enzima puede inactivarse por la temperatura o el pH de la reacción

UNA TÌPICA CURVA DE PROGRESO

Hay que determinar la causa. la Vmax o la inclinación de la curva en otro punto dan una medida exacta de la actividad de la enzima.CURVA DE PROGRESO NO TIPICA No es fácil decidir si la velocidad inicial. para luego modificar el procedimiento para eliminar esto de modo que se pueda usar la velocidad en la forma normal .

 Esto se puede eliminar incubando primero la enzima con la coenzima y el S se añade al final para iniciar la reacción. . produciendo una aceleración. la cantidad de enzima activa aumenta tiempo. por lo tanto. después de mezclar los reactivos.Ejemplo  A) La D-aminoácido oxidasa requiere una coenzima flavínica que se combina lentamente con la enzima.

que se disocia a la forma totalmente activa durante la dilución de la mezcla de reacción. B) Una enzima en una solución stock concentrada puede estar en la forma de un agregado parcialmente activo.  Esto se trata añadiendo primero la E y luego el S para iniciar la reacción .

 C) La enzima en la solución stock se halla formando un complejo revresible con un ión metálico inhibidor (impureza) que se disocia por dilución.  Este caso se trata igual que a y b .

 Por lo tanto. no es fácil decidir si la velocidad inicial. la Vmax o la pendiente de la curva en otro punto dan una medida exacta de la actividad de la enzima .

. 20% de consumo de sustrato). ej. Es decir: a) en el punto inicial. solo es necesario determinar la primera parte de la curva de progreso y luego se traza una tangente al origen.  Para obtener la velocidad inicial. Mejor no mas del 5% del S.MEDICIÓN DE LA VELOCIDAD  Por esta razón solo se trabaja en velocidad inicial (vi) de reacción enzimática. Las curvas casi son líneas rectas cuando el cambio no excede de 20% del total (P. c) donde las condiciones son correctamente conocidas. b) cuando las causas anteriores no tienen tiempo para operar.

derivada a partir de los puntos de (a) a tres tiempos diferentes. (b) velocidad aparente. (a) Curvas de progreso con tres cantidades diferentes de enzima.Importancia de tomar las velocidades iniciales. ploteada frente a la cantidad de enzima .

. curvas discontinuas)  Métodos continuos: Las observaciones se hacen en la misma mezcla de reacción. curvas continuas. Muchas lecturas o por registro automático.CLASES DE METODOS  Para seguir las reacciones enzimáticas existen dos tipos de métodos:  Métodos por muestreo: Las observaciones no se realizan en la misma mezcla de reacción sino sobre muestras retiradas a varios tiempos (puntos separados.

ASPECTOS PRACTICOS: Para obtener linearidad  Se deben mantener constantes las condiciones de la     mezcla de reacción La reacción debe ser realizada en un termostato Todos los reactivos deben ser llevados a la temperatura correcta antes de iniciar la reacción Usar un buffer adecuado para evitar cambios en el pH Escoger condiciones de pH y temperatura adecuados apara la enzima .

ASPECTOS PRÁCTICOS: Debido a la alta actividad catalítica de las enzimas  Evitar las trazas de enzimas en las puntas de pipetas o los polvos enzimáticos (trazas de saliva: usar tapones de algodón en los topes de las pipetas cuando se trabaje con amilasas) .

ASPECTOS PRACTICOS: Para hacer lecturas correctas  Ajustar la velocidad de reacción por dilución adecuada de la enzima  Mezcla rápida y completa .

Precipitación con sulfato de amonio B. Concentración con membranas diaflo (AMICON)  Para iniciar la reacción: realizar mezcla rápida y completa por agitación (manual o con vortex) . Concentración con cromatografía C.ASPECTOS PRACTICOS: Cómo guardar las enzimas  Las enzimas deben ser guardadas en soluciones stock altamente concentradas: A.

soluciones ácidas o alcalinas (evitar pH <5 o >9).MANEJO GENERAL DE ENZIMAS  Evitar inactivación  Eliminar condiciones en las que la enzima es inestable: altas temperaturas. alcohol  Durante la purificación usar cuarto frio. o baño refrigerado que contiene alcohol diluido (usar vasos de acero)  La mayoría de enzimas se inactivan a pH pH <5 o >9. Agregar ácido por las paredes del vaso y con agitación .

hojas de agitador sumergidas profundamente y el vástago debe girar a plomo  Las sales: agregar poco a poco para evitar burbujas. alcohol)  Los detergentes pueden afectar a la enzima y son difíciles de eliminarlos . Usar soluciones saturadas de sal.MANEJO GENERAL DE ENZIMAS  Evitar formación de espuma.  Usar solventes fríos para el fraccionamiento (acetona. pues las enzimas se desnaturalizan en las superficies: El vaciado de un vaso a otro se debe realizar por las paredes (inclinando).

solo en algunos casos por filtración (papel. hyflo.  Guardar las enzimas en frío (congelación)  El secado de las enzimas debe hacerse al vacio y a baja temperatura (liofilización)  La contaminación bacteriana.MANEJO GENERAL DE ENZIMAS  Los precipitados deben ser separados por centrifugación.)  Realizar la purificación sin pérdida de tiempo para evitar pérdida de actividad (en 2 – 3 días) a menos que la enzima sea bastante estable. supergel. etc. solo es un problema si las soluciones se dejan en reposo por largos tiempos . celita.

EL ESTUDIO DE UNA ENZIMA .

. oxidación y radiaciones  Disociación en pequeñas subunidades  Espectro de absorción. calor.Propiedades proteicas  Homogeneidad  Número de isoenzimas  Peso molecular  Forma de la molécula  Curva de titulación  Punto isoeléctrico  Movilidad electroforética  Grado de hidratación  Estabilidad frente al pH. etc.

Estructura  Composición de aminoácidos  Número de cadenas peptídicas  Secuencia de aminoácidos  Plegamiento de las cadenas  Presencia de grupos prostéticos  Número de grupos –SH  Efecto de reactivos químicos  Dispersión rotatoria óptica  Dicroismo circular  Resonancia magnética nuclear  Resonancia del spin electrónico .

Propiedades de la enzima  Naturaleza de la reacción  Implicación de coenzima  Especificidad por el sustrato  Reversibilidad de la reacción  Especificidad hacia inhibidores .

Centro activo  Número por molécula  Estructura química  Efecto de la combinación con el sustrato  Mecanismo de reacción  Modo de acción del grupo prostético .

Cinética  Actividad específica  Actividad molecular  Actividades absolutas por centro activo  Medida de las constantes de velocidad  Efecto de activadores  Efecto de iones a diferente pH  Efectos alostéricos  Secuencia de las etapas de reacción  Ecuación de velocidad .

Termodinámica  Reversibilidad y Keq de la reacción  Coeficiente de temperatura  Energías libres y entropías  Afinidad de la enzima por el sustrato (Km)  Efecto del pH sobre Km  Afinidad por un inhibidor (Ki) .

Propiedades biológicas  Significado de las enzimas en el metabolismo  Acoplamiento con otras enzimas  Ocurrencia y distribución en especies y tejidos  Localización intracelular  Formación a partir de precursores  Formación adaptativa  Genética de la enzima  Efecto de las mutaciones génicas .

Propiedades biológicas  Existencia de isoenzimas  Efectos de la deficiencia de enzimas  Efectos del envenenamiento específico  Comportamiento inmunológico  Antienzimas .

LAS ACTIVIDADES ESPECIFICA Y MOLECULAR  Se debe definir un parámetro que exprese la velocidad de reacción que puede ser alcanzada por una determinada cantidad de enzima  En otros campos se usa:  cantidad / unidad de peso con el adjetivo “Específico”  Cantidad / molécula con el adjetivo “molecular” .

para peptidasas  C) mMoles de S que reaccionan / min / mg de enzima  D) mMoles de S que reaccionan / min / 100. F. coeficiente proteolítico.Z.ej. P. la unidad es arbitraria (p. Kat.Actividad específica  Ha sido expresada de diferentes maneras:  A) Unidades / mg de enzima.000 g de enzima . para catalasa. para peroxidasas)  B) Constante de velocidad / mg de enzima.

pero ha creado confusión. Por acuerdo internacional. para la segunda se usa “actividad de centro catalítico” .Actividad molecular  Moléculas de S que reaccionan / min / molécula de enzima ( = “actividad molecular”)  Moléculas de S que reaccionan / min / centro activo ( = “actividad de centro catalítico”) Nota: “Número de recambio”: se usó para las dos.

)  Una unidad U: “ cantidad de enzima que transforma 1 mMol de S / min”  Actividad específica: “Unidades de enzima / mg de proteína”  Actividad molecular: “Unidades / mMol de enzima ( = Nº de moléculas de S transformadas / min / molécula de enzima  Actividad absoluta por centro activo. (E.B.C.Según la I.U. o actividad de centro catalítico: Nº de moléculas de S transformadas / min / centro catalítico .

Katal (kat)  Cantidad de enzima que transforma 1 mol de S / seg  Microkatales (mkat).67 nkat .01667 mkat = 16. nanokatales (nkat) o picokatales (pkat)  1 kat = 6 x 107 UI  1 UI = 0.

AFINIDADES ENZIMATICAS  Constantes de disociación E – S  Km: E + S ==== ES  Ki:  Ka E + I ==== EI E + A ==== EA .

METODOS PARA SEGUIR CUANTITATIVAMENTE LAS REACCIONES ENZIMATICAS  Métodos espectrofotométicos  Métodos de fluorescencia  Métodos manométricos  Métodos de electrodo  Métodos polarimétricos  Métodos por muestreo .

Los artificios para la espectrofotometría anaeróbica han sido discutidos por DIXON (11). Las longitudes de onda dadas corresponden a las bandas de máxima absorción. especialmente las formas reducidas de las flavinas y colorantes. así. la molaridad real de una solución se obtiene dividiendo la absorbancia observada por la absorbancia molar.y ferrocianuro a 314 nm y citocromo oxidado. reaccionan rápidamente con el oxígeno. el cual debe ser rigurosamente excluido. ferri. fenazina metosulfato reducida.La absorbancia molar es la absorbancia de una solución 1 M de la sustancia en una cubeta de 1 cm. . Se debe notar que algunas de estas sustancias. excepto para el azul de metileno. Para referencias ver (12).

Espectrofotómetro Beckman .

Beckman DU-650 UV-Vis spectrophotometer with sipper and sampler .

ESPECTROFOTÓMETRO DE FLUORESCENCIA .

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pH-STAT Titrator. Biburette motor positions without Burette stand (Radiometer Analytical) .

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Polarímetro de Disco .