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HPLC CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA

Alexandre Alves de Castro Maisa Carla Ragozoni Pereira

DQI - Qumica Analtica Instrumental II


LAVRAS 2013

Introduo

Nas

indstrias

qumicas, alimentcias, petroqumicas,

farmacuticas, refinarias,

laboratrios de anlises clnicas, ambiental e forense;

Frequentemente

necessrio

separar, isolar, purificar, identificar e


quantificar os componentes de

misturas muitas vezes bastante

Introduo

Definio de cromatografia: Conjunto de tcnicas de separao cujo princpio depende da distribuio diferenciada de um dos

componentes de uma mistura entre duas fases, uma


considerada estacionria, e a outra, mvel;

A natureza qumica e fsica dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenomeno de migrao

diferencial.

Introduo

HPLC Do ingles HPLC High tambm Performance conhecida Liquid como:

Chromatography.

Cromatografia Lquida de Alta Performance, de Alta


Presso ou de Alto Desempenho;

uma tcnica ultra-microanalise podendo, dependendo da substncia e do detector empregado, quantificar massas inferiores a 10-18 g.

Descrio Geral da HPLC

A amostra dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatogrfica preenchida com a fase estacionria (FE); Um solvente (FM) bombeado com vazo constante e desloca os componentes da mistura atravs da coluna; Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal eltrico o qual registrado, constituindo um cromatograma.

Descrio Geral da HPLC

Descrio Geral da HPLC

Descrio Geral da HPLC

Descrio Geral da HPLC

Descrio Geral da HPLC

Descrio Geral da HPLC

Descrio Geral da HPLC

Descrio Geral da HPLC

Descrio Geral da HPLC

Descrio Geral da HPLC

Conceitos Fundamentais da HPLC

Operao pela qual uma mistura dividida em pelo menos duas fraes com diferentes composies; obtida por meios fsicos embora reaes qumicas possam ser envolvidas no processo; Os mtodos fsico-qumicos de separao so baseados na utilizao de alguma propriedade fsica das substncias a serem separadas.

Conceitos Fundamentais da HPLC

Importncia da cromatografia: Velocidade; Poder de resoluo; Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 1015g); Simplicidade da tcnica. Objetivo: Separar individualmente os diversos constituintes de uma mistura de substncias seja para identificao, quantificao ou obteno da substncia pura para os mais diversos fins.

Instrumentao em HPLC

Fase Mvel

A fase mvel no pode conter partculas para evitar danos bomba, injetor e coluna; A escolha do filtro funo da natureza da fase mvel; A fase mvel deve ser degaseificada; As tcnicas de degaseificao so: refluxo com resistncia de aquecimento; vcuo (trompa dgua); purga com hlio; uso de membrana semipermevel.

Fase Estcionria
Basicamente so dois tipo de FE: Pelicular: Consiste de leito de polmero ou vidro noporoso, esfrico, com dimetros tpicos da ordem de 30 a 40 mm, recoberto com uma camada fina e porosa de: Slica; Alumina;

Fase Estcionaria

Partcula Porosa: Consiste em micropartculas porosas com diametros de 3 a 10 mm. As partculas so consttuidas dos mesmos materias do recobrimento pelicular; Quanto MENOR for a partcula, MAIOR ser a eficincia na separao.

Partculas menores reduzem a distancia de contato do soluto com as FE e FM, facilitando o equilbrio, e consequentemente melhorando a eficincia da coluna.

Fase Estcionaria

De acordo com as fases mvel e estacionria pode-se classificar o processo basicamente como: Cromatografia em fase normal: a fase estacionria utilizada polar e a fase mvel apolar, em relao a eluio, os solutos mais apolares so eludos primeiramente, enquanto que os polares so retidos pela fase estcionaria e so eludos depois; Cromatografia em fase reversa (FR): a fase estacionria apolar e a fase mvel polar, portanto os compostos polares so eludos primeiro e os mais apolares eludos posteriormente.

Bomba

Principais caractersticas da bomba: Leva a fase mvel desde o reservatrio at a coluna; Deve operar a presses de at 500 atm com a mesma preciso e exatido de operaes a presso quase ambiente; Devem ser constitudas de material inerte; Alta resistncia corroso inrcia qumica a solventes comuns; As vazes normalmente empregadas

Bombeamento por Gradiente

Alterao da composio da fase mvel, sem alterao da vazo total; O bombeamento por gradiente pode ocorrer baixa presso ou a alta presso; Bombeamento por gradiente baixa presso:

Bombeamento por Gradiente

Bombeamento por gradiente alta presso:

Injetor

Uso de vlvulas especiais que permitem introduo com grande preciso e exatido de volumes que variam, em geral, de 5 a 20l;

A amostra introduzida na vlvula com auxlio de uma microseringa com agulha sem ponta;
A injeo efetuada pela rotao da vlvula da posio de carga para a posio de injeo.

Colunas Cromatogrficas

Na HPLC podem ser usados trs tipos de colunas:

Colunas Cromatogrficas

Coluna de saturao: colocada entre a bomba e o injetor sendo usada para condicionar a fase estcionaria; Empregada com finalidade de saturar a FM com o lquido da FE.

Colunas Cromatogrficas

Coluna de guarda: colocada entre o injetor e a coluna analtica, esta possui de 2 a 5 cm; utilizada para prevenir impurezas e compostos fortemente retidos; Satura rapidamente; Aumenta o tempo de vida til da coluna analtica; O custo das diversas trocas dessas coluna ainda menor do que uma nova coluna analtica.

Colunas Cromatogrficas

Coluna de separao: Responsvel pela separao dos componentes da amostra. Podem ser separadas em colunas analticas e colunas preparativas.

Colunas Cromatogrficas

Coluna preparativa: Cromatografia de filtrao em gel- separao, isolamento e purificao de protenas. Coluna analtica: Permitem a separao de pequenas quantidades do material a ser analisado; So constitu das de um tubo de algum material inerte. O ao inoxidvel o material mais frequentemente utlizado;

Colunas Cromatogrficas

Os tubos das colunas so preenchidos com a fase estacionria conveniente, geralmente slica ou seus derivados; Tem dimetro interno uniforme, capaz de resistir s presses em que ser usada; So normalmente retas, pois apresentam perda na eficincia quando so dobradas.

A coluna deve ser guardada em solvente orgnico ou FM.

Detector

Dispositivos que examinam continuamente o material elido, gerando sinal quando da passagem de substncias; Um detector ideal deve possuir as seguintes caractersticas: Alta sensibilidade; Estabilidade; Reprodutibilidade; Resposta linear; Resposta rpida aos analticos; No contribuir para o alargamento do pico;

Detector

Falicidade do manuseio; No destrutivo; Seletividade.

Tipos de detectores: Os principais detectores utilizados em HPLC so: ndice de refrao; Espectrofotometira UV-Visvel; Fluorescncia; Eletroqumico; Espectrometria de massa LC/MS.

Aquisio de dados

Atualmente utilizam-se softwares que permitem: Processar os dados de cromatograma; Armazenar e registrar; Controlar a composio da fase mvel (isocrtica e por gradiente), vazo da bomba,amostrador automtico, temperatura da coluna; Realizar clculos para System Suitability Test (SST).

Vantagens e Desvantagens

Vantagens: No necessita que a amostra seja voltil ( requisito da CG); Tempo reduzido da anlise; Alta resoluo; Boa detectabilidade e bons resultados quali e quantitativos.

Desvantagens: Alto custo do equipamento e manuteno; No existe um detector universal com boa detectabilidade e baixo custo:

Aplicabilidade

Aplicabilidade

Aplicabilidade

Dicas do que no fazer em HPLC


Lavar um sistema com tampo usando orgnico puro: precitiao; Injetar amostras que podem precipitar a fase mvel: testar miscibilidade; Usar HCl, H2SO4 CCl3 em sistema de ao inox: corroso do sistema; Usar fita Teflon para vedar as conexes: sem efeito e pode causa entupimento; Deixar o sistema parado com a fase mvel contendo tampo ou acidos/bases fortes: cristalizao= danificao dos selos da bomba, injetor, entupimento do detector.

Referncias

HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis George Lunn Norman Schmulf Wiley Interscience 1997 (1632 pag.) ISBN 0471181765. HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals George Lunn Wiley 2005 (717 pag.) ISBN 9780471669418. HPLC for Pharmaceutical Scientists Yuri Kazakevich Rosario Lobrutto Wiley Jan 2007(1104 pag.) ISBN 9780471681625.

HPLC Made to Measure Stravos Kromidas Wiley 2006 ISBN 352731377X.

Validation Chromatographic Methods A Practical Guide David M. Bliesner Wiley 2006 (304 pag.) ISBN 9780471741473.

HPLC Practical and Industrial Applications Joel Swadesh. Modern HPLC for practicing scientists Michael W.Dong Wiley Interscience 2006. HPLC A practical users guide Marvin C. McMaster John Wiley & Sons 2007. Fundamentos da Cromatografia a lquido de alto desempenho REMOLO CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1 Ed. The Reporter, Optimizing HPLC Separations http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.htl Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, nmero 3, junho 1998, Validao de mtodos cromatogrficos, pg. 12.

Obrigado!

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