TÉCNICAS EN EL ANÁLISIS DE MICROSATÉLITES UTILIZADOS EN IDENTIFICACIÓN HUMANA

PASOS EN EL PROCESAMIENTO DE UNA MUESTRA DE ADN
Muestra obtenida de la escena del crimen o de una prueba de paternidad Extraccion de ADN

BIOLOGÍA
Cuantificacion de ADN Amplificación PCR de marcadores STRs

TECNOLOGÍA
Separación y Detección de productos PCR ( Alelos de STRs)

Determinación genotipo muestra

Comparación del genotipo de la muestra con otros resultados

GENÉTICA

Entrega de resultados (cálculos estadísiticos)

Análisis de los resultados (comparación con datos poblacionales)

•Describir tipo de

muestra, su color, su forma, su marca, etiqueta y talla si procede, tipo de envoltorio que lo contenía y estado de conservación.

•Muestras dubitadas

•Muestras indubitadas

Muestras utilizadas para extracción de ADN

EXTRACCION DE ADN
 Extracción

cloroformo)

orgánica

(fenol-

 Extracción no orgánica (agentes

quelantes): agentes quelantes: resina Chelex, formada por copolímeros de estirenodivinilbenceno que contienen iones iminodiacetato que actúan como grupos quelantes.

CUANTIFICACION DEL ADN
 Fluorometría

Fundamento: capacidad de unión del ADN a ciertos tintes fluorescentes como H33258 Comparación de las muestras problema con muestras de cantidad de ADN conocida Se utiliza un Fluorímetro: lámpara de mercurio y un detector para medir fluorescencia relativa a 460nm ADN de doble cadena

CUANTIFICACION DEL ADN
 Espectrofotometría

Medida de la cantidad de luz ultravioleta que absorben las bases nitrogenadas Utiliza un espectrofotómetro, medidas de absorbancia a 260 y 280nm OD260/OD280: ácido nucleico pureza del

Poco sensible: no dectecta concentraciones de ADN inferiores a 250ng/ml

ESPECTRO DE ABSORBANCIA ADN

http://www.cardiff.ac.uk/biosi/staffinfo/kille/Methods/Gene/Spec_Anal ysis.html

CUANTIFICACION DEL ADN
 Minigel de agarosa

Midiendo la fluorescencia inducida por ultravioleta que se produce cuando se intercalan moléculas de bromuro de etidio entre el ADN Comparar con patrones estandar de cantidad de ADN conocida Poco sensible Ventajas: se puede visualizar el grado de degradación del ADN

CUANTIFICACION DEL ADN
 Hibridación con sondas (Dot Blot y

Slot Blot)

Hibridación de las muestras a cuantificar con una sonda del locus humano alfa satélite D17Z11. ADN problema se inmoviliza en una membrana de nylon (punto: dot-blot; guión:slot-blot), se pone en contacto con la sonda Sondas marcadas Comparación intensidad de señal de la muestra con estándares

CUANTIFICACION DEL ADN

•Solo cuantifica ADN humano •Altamente sensible, detecta cantidades del orden de 20pg •Cuantifica ADN de cadena sencilla y muestras de ADN no purificadas

 Hibridación con sondas (Dot Blot y Slot Blot)

CUANTIFICACION DEL ADN

QuantiBlot

CUANTIFICACION DEL ADN
Cuantificación enzimática  Uso de una serie de enzimas para producir una cantidad de ATP que depende de la cantidad de AD N presente en la muestra seguida de la generación de una señal luminosa, dependiente de la concentración de ATP

AMPLIFICACION DEL ADN

TÉCNICA DE PCR
5’ 5’ 3’ 3’
Cadenas separadas (denaturación)

3’ 3’ 5’ 5’ ADN MOLDE

Forward primer

5’

3’
Copias (extensión Adición de de primers ) primers 5’ (alineamiento)

5’

3’

3’

3’

5’

Reverse primer

MULTIPLES COPIAS DE ADN POR PCR

Original DNA target region

Thermal cycle

En 32 ciclos con un 100% de eficiencia se pueden producir hasta 1.07 billones de copias de ADN molde

MULTIPLEX PCR
 Se pueden analizar hasta

10 loci simultáneamente

 Alta sensibilidad menos de

1 ng de ADN

 Util

en análisis de muestras degradadas y de mezclas disminuye costos, tiempo, contaminación del ADN

 Ventajas:

SEPARACION de PRODUCTOS PCR
 PCR

Multiple: diferentes marcadores fluorocromos pueden ser usados para el análisis de loci donde se sobrelapan el tamaño de los alelos

 Separación de productos PCR:
 

TIPIFICACION MANUAL: Tinción de nitrato de plata DETECCION FLUORESCENTE SEMIAUTOMATICA Electroforesis capilar Electroforesis en geles de poliacrilamida

EJEMPLO DE UN KIT DE MULTIPLEX
AmpFlSTR® Profiler Plus™
100 pb 200 pb 300 pb 400 pb

Separación por tamaño Separación por color

D3 A D8 D5

vWA D21 D13

FGA D18 D7

5-FAM (blue) JOE (green) NED (yellow) ROX (red)

Estandar interno GS500

9 STRs amplificados junto con Amelogenina en una sola reacción de PCR

ELECTROFORESIS
Electroforesis convencional  Geles de agarosa  Geles de poliacrilamida Fundamento  El ADN está cargado negativamente y al someterlo a una diferencia de potencial se moverá hacia el ánodo a través del gel una distancia proporcional a su tamaño, alcanzando mayor distancia las moléculas de menor peso.

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

ESCALERAS ALELICAS

ELECTROFORESIS CAPILAR

Cuando los fragmentos de ADN alcanzan la ventana capilar, el láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia emitida por los colorantes es colectada por el detector a longitudes de onda particulares y registrados como señales digitales en el computador.

TIPIFICACION DE STRs

TECNICAS DE HIBRIDACION

SECUENCIACION

http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Automat1.jpg

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