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ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº 1 EMPLEO DEL MICROSCOPIO

200 mm (0.2 mm) Límites de resolución

Las células animales típicas miden entre 10 y 120 µm de diámetro Son incoloras translúcidas. y

0.2 mm (real: 0.5 mm)

Se requiere el empleo de un aparato que magnifique la imagen. Se precisan sustancias que tiñan o confieran colores de contraste a las estructuras del tejido.

0.1 nm

MICROSCOPIO ÓPTICO (MO)

es colocado en una platina. . para visualizar como separadas. Mientras menor sea la distancia entre las dos estructuras. es la capacidad que entrega el microscopio. que permita observarlas separadas.f En un microscopio óptico de campo brillante (comúnmente usado en los laboratorios). El poder de resolución. dos estructuras contígüas (muy cercanas entre sí). mayor será el poder de resolución del microscopio. La magnificación final (aumento con el cual se observa) se obtiene al multiplicar el aumento del lente ocular por el aumento del lente objetivo. el preparado o especimen.

Platina y pinza Revolver y lentes objetivos Tornillos macro y micrométrico Base y fuente de iluminación .

.

.

entrega un valor de D = 0. mostrando estructuras intracelulares e intercelulares. la longitud de onda es de 0. Al reemplazar en la fórmula de cálculo del poder de resolución.004 nm. .2 nm.000 V. En este microscopio. los electrones atraviesan el tejido.Microscopio electrónico de transmisión (MET) l: en un MET que posee una velocidad de aceleración de los electrones de 100.

MET de traquea. donde se observan células epiteliales ciliadas y células secretoras de mucus. Note que con este microscopio. . los electrones atraviesan la muestra permitiendo la visualización de estructuras intra y extracelulares .

expresan el poder de resolución. D = 3 . es decir la capacidad para ver separadas dos estructuras que realmente se encuentran separadas. respecto al de transmisión. por lo tanto su poder de resolución es menor.Microscopio electrónico de barrido (MEB) Nota: Los valores de D. .20 nm El valor de D (límite de resolución) es mayor en el microscopio de barrido.

donde se observan células que constituyen el túbulo seminífero. los electrones chocan sobre la superficie de las muestra. Note que con este microscopio. con los espermatozoides en su interior. permitiendo visualizar en tercera dimensión de estructuras celulares completas .MEB de testículo. .

Identifica los diferentes componentes del microscopio óptico. 10 11 .

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS .

• Deshidratación  Diafanización o aclaramiento. • Observación al microscopio. obtener una lámina delgada de tejido y aumentar su contraste. Etapas: • Fijación.TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Procedimientos en serie  visualización en microscopio. . Objetivo: Preservar tejido en el tiempo evitando su descomposición. • Tinción. • Corte o sección. • Montaje y desparafinado. • Inclusión o infiltración.

 Se tiñe con colorantes aumentar el contraste.  Lavado de la muestra ya fijada.  Se sumerge en Xilol (aclaramiento). la muestra. Obtención de la muestra.7 mm).  Se sumerge la muestra en baterías de alcohol en grado decreciente (desparafinación). para  Se cubren los preparados para su observación.  Fijación de (formaldehído).  Se sumerge la muestra en baterías de alcohol en grado creciente (deshidratación).  La muestra se incuba en parafina liquida a 60ºc.  Corte en un microtomo (5 . .

Finalidad de fijación:     Evitar la autolisis. Acción antiséptica que evita contaminación del operador y descomposición del tejido. Endurecer los tejidos. Preservar estructuras con un mínimo de alteración. . permitiendo avanzar a los pasos siguientes.

.Los tejidos fijados. son procesados en forma secuencial en un equipo automatizado.

Una vez obtenido el bloque de tejido y parafina se procede a realizar el corte. .

O y de 20 a 100 nm en M. • En M. • Para M.). .CORTE: • Obtención de láminas delgadas de tejido (3 a 10 mm en M. óptica se emplea un micrótomo con navajas de acero. electrónica se utiliza un ultramicrótomo con navajas de vidrio o diamante.E.

para su estiramiento y montaje sobre un portaobjetos de vidrio.Los cortes de tejido de 5µm de espesor se estiran en un baño de flotación a 37-40ºC. .

hidratado y su posterior tinción. . para proceder a su desparafinado.Los tejidos montados en portaobjetos se dejan secar en una superficie a 37ºC.

-Al+3 (hematoxilina) .TINCIÓN: Colorantes más utilizados  BÁSICOS: hematoxilina azul de toluidina  ÁCIDOS: eosina floxina Las estructuras que se tiñen con colorantes básicos se denominan BASÓFILAS. Las estructuras que se tiñen con colorantes ácidos se denominan ACIDÓFILAS. (tetrabromofluoresceína) --Al+3 .

o Radicales básicos del colorante. o Eosina es de color rojo  posee pH ácido y carga (-). o Plata (argéntica)  tiñe láminas basales y fibras reticulares. o Hematoxilina es de color azul-morado  posee pH básico y carga (+). Pb. o Orceína  tiñe fibras elásticas de color castaño. U) para M. se unen a estructuras celulares básicas. electrónica. . se unen a estructuras celulares ácidas. o También se utilizan metales pesados (Os. o Radicales ácidos del colorante.TINCIÓN: o Genera uniones moleculares con colorante activo.

EOSINA HEMATOXILINA .

por alguno de los dos colorantes de la tinción. se tiñen de color azul/morado y se denominan basófilos. Los elementos del tejido que presentan afinidad por la Eosina.Los elementos del tejido que presenten una afinidad química (por carga eléctrica. . presentan carga eléctrica negativa. lo retendrán y se teñirán con su color. Los elementos del tejido que presentan afinidad por la Hematoxilina. pH). presentan carga eléctrica positiva. se tiñen de color rojo/rosado y se denominan acidófilos.

por su afinidad por un colorante de tipo básico. Las estructuras de color azul-morado. . denominándose acidófilas. denominándose basófilas.Este preparado ha sido teñido con una tinción llamada Hematoxilina y Eosina (H+E). que en este caso corresponden a núcleos de células. se han teñido con la hematoxilina. han captado el colorante ácido llamado eosina. Las estructuras que se observan de color rosado.

El reactivo de Schiff en sí es incoloro. pero al reaccionar con un tejido que presente estos grupos aldehidos.Otra tinción bastante empleada. Ella se basa en la presencia de grupos químicos aldehidos. presentes por ejemplo en el mucus o en los cartílagos. . se torna de un color fucsia magenta muy característico. Si la cantidad de grupos aldehidos vecinos entre sí. es la reacción del ácido peryódico-Schiff o tinción de PAS. la reacción será leve. es alta. Si la cantidad es menor. los que se encuentran abundantemente en los hidratos de carbono. la reacción será muy intensa.

las células o glándulas caliciformes. corresponden a un tipo de células secretoras de mucus.Este preparado corresponde a colon y ha sido teñido con tinción de PAS. las estructuras que se observan de color fucsia. la que corresponde al contenido intestinal. producido por estas células. . mezclado con el mucus. rico en carbohidratos. En la zona superior de la preparación. se observa una capa. El mucus es un material lubricante rico en hidratos de carbono.

Ellas se basan en la especificidad que poseen los anticuerpos (Ig o Ac) por sustancias denominadas antígenos (Ag) contra la cual se producen. más sofisticadas y específicas son las llamadas técnicas de Inmunocitoquímica. .Otro tipo de técnicas de tinción. Estos anticuerpos se colocan en contacto con el tejido a teñir y si en él existen antígenos. los anticuerpos se fijarán sobre ellos en forma específica. es decir reconocerán a esa sustancia en particular.

el anticuerpo Ac. Ag Ac Ag + Ac En A. En C. Si colocamos un anticuerpo marcado en presencia del tejido con el antígeno. En B. al microscopio óptico. hablamos de una técnica de inmunocitoquímica directa. . el que permite visualizar la zona de unión de Ag + Ac. se utiliza una enzima. la que se visualiza en un microscopio de fluorescencia. debe colorearse o marcarse al anticuerpo para su observación al microscopio. se encuentra marcado por una sustancia fluorescente. la peroxidasa. se ha marcado el antícuerpo con un metal pesado. la que muestra un color marrón.Para poder visualizar la unión de un anticuerpo a un antígeno presente en un tejido. al microscopio electrónico.

se agrega un 2° anticuerpo el que se encuentra marcado con una sustancia fluorescente. que está unido a una molécula que resulta visible al microscopio. Primer anticuerpo (Ac1). preparado en conejo. el cual no está marcado y no puede ser visualizado. una enzima coloreada o un metal pesado. .Otra técnica es la llamada inmunocitoquímica indirecta. para poder detectar la unión al antígeno. preparado en oveja (u otra especie distinta a conejo). en la cual el antígeno es marcado con un anticuerpo 1°. Segundo anticuerpo (Ac2) contra el anticuerpo de conejo Ac1. contra antígeno (Ag) X del tejido.

Inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos fluorescentes anti-actina y anti ADN .

se marcará de color café. . La zona que entrega presencia de la sustancia en estudio.Inmunocitoquímica con anticuerpos anti-enolasa (método peroxidasa).

COLOCAR UN CUBREOBJETOS:   Permite proteger muestra frente al roce y ambiente.Una vez teñido el preparado se deshidrata y se aclara la muestra. . Permite conservar el preparado histológico por un tiempo más prolongado.

. para obtener una visión panorámica del preparado y luego ir aumentando al objetivo medio y mayor. según se requieran obtener detalles.OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO La observación al microscopio se debe iniciar con el aumento menor.