REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE BIOANALISIS CATEDRA: ANALISIS INSTRUMENTAL

Cromatografía líquida de Alta Resolución HPLC

Cromatografía
 Es

un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es que no se conoce su composición.

Cromatográma
 Es

una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo.

Términos Básicos
Tiempo de Retención

Platos teóricos

Es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima intensidad. Los tiempos de retención no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna cromatográfica.

Se utiliza como una medida de la eficiencia de la columna, este directamente relacionado con la varianza, por ello resulta convenientemente medir la eficiencia de la columna en los términos de varianza y longitud de la columna.

Términos Básicos
Resolución

Selectividad

Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes.

Muestra las diferencia de afinidad por los solutos de las fases involucradas, indica el potencial de separación de esos solutos en el sistema, pero no mide la separación real.

Términos Básicos
Eficiencia

Elución

Es el procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequeña cantidad en un tiempo breve.

Términos Básicos
Fase Estacionaria

Es la que recubre la columna cromatográfica, interiormente sin desplazarse. La fase estacionaria consiste en partículas, generalmente sólidas, pequeñas y con una superficie micro porosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa.

Fase móvil

Puede ser un líquido o un gas que recorre la columna cromatográfica transportando los componentes de la mezcla a través de dicho sistema.

ELUYENTE

Es aquella sustancia que se pone en contacto con la fase estacionaria y permite que se desplace la muestra.

Fundamento de la cromatografía
Existen dos tipos de fundamento:

Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o físico químicas de los analitos: solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente divididos), volatilidad, tamaño, carga, reactividad química o bioquímica,

Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico - químicas frente a un sistema cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeñas, se basa la separación cromatográfica.

Cromatograma

Componentes de un instrumentos de cromatografía HPLC

Bomba: Envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño, generalmente de acero inoxidable.

Tipos de Bombas:  Bombas reciprocas  Bombas de desplazamiento  Bombas neumáticas

Componentes de un instrumentos de cromatografía HPLC

Válvula Inyectora: Consiste en una válvula de seis vías que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Se producen pequeñas cantidades de muestra (0.1-100μL) Columnas: Las columnas para cromatografí­a de líquidos se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. Estas ultimas solo se utilizan a presiones menores de unos 600 psi. Existen diversos tipos: columnas analíticas, precolumnas, columnas termostatizadas.

Componentes de un instrumentos de cromatografía HPLC
Detector

Registrador integrador

Produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y esa señal es enviada al registrador. Deben de tener un volumen interno pequeño para reducir el ensanchamiento de pico. Basados en una propiedad de la fase móvil (refracción, densidad etc.) y en una propiedad del soluto (absorbancia en UV, fluorescencia etc.)

Realiza un gráfico de intensidad en función del tiempo (cromatograma) que idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. Este que El integrador calcula además el área correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia

Componentes de un instrumentos de cromatografía HPLC

Cuadro comparativo de Detectores

Cromatografía de fase normal y de fase inversa

Fase normal: se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención.

La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés, sino también en factores estéricos de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención. Cayo en desuso debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retención puesto que los disolventes próticos cambiaban el estado de hidratación de la silica o alúmina de la cromatografía.

Cromatografía de fase normal y de fase inversa
Fase inversa: consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad moderada. El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía libre de la entropía asociada con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales.

Separación isocrática y separación con gradiente

Parámetros que afectan la resolución de la columna
 Diámetro

de la partícula: La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siento las de 5\mum de diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad, aumentaría la resolución de la columna, pero a la vez, aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho.

Parámetros que afectan la resolución de la columna

Longitud de la columna: El diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. La resolución aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos disfuncionales, disminuyendo por tanto la resolución.

Parámetros que afectan la resolución de la columna

Diámetro de la columna: El diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. Las columnas de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificación de compuestos para su utilización posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analítico y normalmente están asociadas a un

Características del solvente (fase móvil).
• Es un solvente líquido, el cual puede ser

puro o una mezcla de solventes. • El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. • El líquido, se obliga a pasar a través del sólido bajo presión o bien se deja percolar a través de él, por efecto de la gravedad.

Análisis cualitativos y cuantitativos en HPLC

Aplicación de la HPLC en análisis Diversos
  

 

 

Compuestos iónicos, como aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos orgánicos, etc. Compuestos de alto peso molecular, como polímeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc. Compuestos termolábiles y no volátiles, como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos farmacéuticos. Análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto tiempo. Determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos (nucleótidos, nucleósidos) por cromatografía de intercambio iónico. Determinación de esteroides. El análisis de medicamentos (determinación de los componentes activos de una tableta analgésica, análisis de barbitúricos, anticonceptivos, etc).

Aplicación de la HPLC en análisis Diversos
En separaciones según el tipo químico, ya que su finalidad no es la separación de compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en las mezcla.  La identificación y cuantificación aproximada de azúcares (separación de isómeros de las aldohexosas que son difíciles de separar con otras técnicas cromatográficas) aunque está restringido a laboratorios que puedan hacer frente a los altos costes que esta técnica tiene.  Los edulcorantes a granel al igual que los azúcares se determinan por HPLC (en refrescos y alimentos), como el aspartamo o la sacarina.  También se emplea para la determinación de vitaminas, como es el caso de la vit. B2 (riboflavina), vit. E, vit. D, vit. A y carotenoides.  Y para el análisis de residuos de pesticidas en frutas y verduras, además de la observación de ácidos

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