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CINETICA ENZIMATICA

BIOQUIMICA APLICADA

CINETICA ENZIMATICA
Estudia la velocidad de las reacciones catalizadas enzimticamente Los principios generales de las reacciones qumicas se aplican tambin a las reacciones enzimticas

Factores que afectan la velocidad de una reaccin enzimtica

1.Concentracin de Enzima 2.Concentracin de sustrato 3.pH 4.Temperatura 5.Presencia de activadores

1. Concentracin de Enzima
En presencia de exceso de sustrato, la actividad es proporcional a la concentracin enzimtica

2. Concentracin de sustrato
Las reacciones enzimticas se saturan con el sustrato

Efecto autosaturante

Efecto autosaturante

Las enzimas tienen una capacidad limite de interaccin. (3 de las 6)

Efecto autosaturante
Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia

3. Efecto del pH
La actividad enzimtica pasa por un mximo (pH ptimo). El pH ptimo de las enzimas varia ampliamente; para la pepsina, del estmago, es de 1,5, la arginasa tiene un pH ptimo de 9,7. La gran mayora de enzimas tienen un ptimo alrededor del pH fisiolgico de, ~7.0

3. Efecto del pH
Explicacin: El sitio activo de la enzima esta frecuentemente compuesto de grupos ionizables que deben estar en la forma inica para tener actividad, unir los sustratos o catalizar la reaccin. Una enzima que se someta a valores extremos de pH, se desnaturaliza.

En el efecto de la temperatura hay dos componentes: 1. Aceleracin de la reaccin segn la ecuacin de Arrhenius. (dentro del margen de actividad) k = A exp (-Ea/RT) Al aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10C duplica e incluso triplica la velocidad de reaccin.
2. Desnaturalizacin trmica de la protena. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica est muy prxima de la temperatura ptima.

4. Temperatura

CINETICA ENZIMATICA
Cintica de reacciones con un slo substrato
Michaelis y Menten propusieron un modelo para relacionar la velocidad de reaccin con la concentracin de substrato. Suponiendo la existencia de un solo complejo central, el esquema de reaccin sera:

Velocidad de reaccin

VS

concentracin

La ecuacin de MichaelisMenten describe como vara la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas de acuerdo a la concentracin de sustrato:

Parmetros enzimticos
1. Km (constante de Michaelis-Menten para cada enzima) = concentracin de S a la que la V es 1/2 Vmax. 2. Vmax = velocidad mxima terica = la velocidad cuando todos los centros activos estn ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad)
Unidades

Caractersticas de Km:
Es una medida de la afinidad del enzima por el S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad del enzima por el S. Una Km pequea, refleja una gran afinidad por el sustrato, ya que bajas concentraciones de sustrato son suficientes para saturar al 50% de la enzima es decir, para alcanzar Vmax. Una Km grande, refleja una baja afinidad de la enzima por su sustrato, ya que son necesarias grandes concentraciones de sustrato para saturar el 50% de la enzima.

Km de algunas enzimas
ENZIMA Catalasa SUSTRATO H2O2 Km (mM) 25.0

Hexoquinasa

ATP
D-Glucosa D-Fructosa

0.4
0.05 1.5 9.0 108.0 2.5 4.0 5.0

Anhidrasa carbnica Quimotripsina -Galactosidasa Treonina deshidrogenasa

HCO3Gliciltirosinilglicina N-Benzoiltirosinamida D-Lactosa L-Treonina

Vmax
Vmax es una constante Vmax es la velocidad mxima terica de la reaccin pero, en realidad, nunca se alcanza Para alcanzar la velocidad mxima se requiere que [S] >> [E] y que TODAS las molculas de enzima estn unidas al sustrato. Vmax se alcanza asintticamente a medida que la concentracin de sustrato aumenta

CALCULO DE PARMETROS DE LA ECUACIN


Linearizacin de LineweaverBurk . Artificio matemtico que permite deducir grficamente los valores de km y Vm. El artificio consiste en convertir a la ecuacin M-M en la ecuacin de una recta. Recta de forma Y = A + BX, donde: Y = 1/v, A = 1/Vm, B = km/Vm, y X = 1/[S]

Ploteo de Eadie-Hostee
El ploteo se realiza vi/ vi/[S], con ese fin se multiplica ambos miembros de la inversa de la ecuacin M-M por vi.Vmax obtenindose: Vmax (vi) = KmVmax(vi) + Vmax(vi)[S] vi Vmax[S] Vmax [S] Vmax = Km.vi + vi [S] Ordenando: vi = Vmax - Km.vi [S] Esta es una ecuacin de lnea recta de la forma Y = a bX. Pendiente= Km, Ordenada en el origen= Vmax.

Ploteo de Hanes- Wolf


[S] = Km. Vi Vmax + [S] . 1 . Vmax

[S] V

a Vm

Km V max

[S]

Ploteo Eisentahl-Cornish
Vmax = vi + vi.Km
[S]
V

V max

[S]
Km

limitaciones de Cinetica Michaeliana


Para utilizar la ecuacin de Michaelis-Menten deben asumirse: Las concentraciones relativas de E y S: La concentracin de sustrato [S] es mucho mayor que la concentracin de enzima [E], de manera que la proporcin de ES es relativamente pequea. La reaccin esta en equilibrio: [ES] no cambia en el tiempo (la velocidad de formacin de ES es igual a la velocidad de su transformacin en E + S y en E + P). Deben usarse velocidades iniciales (vo). Esto significa que la velocidad de la reaccin debe determinarse tan pronto como sustrato y la enzima se mezclan. En dicho tiempo, la concentracin de productos es despreciable y, por lo tanto, la reaccin inversa de productos a sustratos puede ser ignorada

Enzimas con cinetica no Michaeliana


Hay enzimas que no obedecen la ecuacin de MichaelisMenten. Su cintica no es Michaeliana. Esto ocurre con las llamadas enzimas alostricas, cuya grfica v contra [S] no es una hiprbola, sino una sigmoide (en forma de s)

Actividad enzimtica
Actividad enzimtica = cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por min = una forma comn de expresar la velocidad Actividad especfica = unidades por mg de protena total de la preparacin enzimtica. Unidad ms moderna: kat = nmoles de producto / seg

Regulacin de la actividad enzimtica

Se usan como medicamentos, antibioticos, insecticidas, herbicidas. etc

IRREVERSIBLES.
Inhibicin permanente Unin irreversible por medio de enlaces covalentes. Modificaciones qumicas de los grupos catalticos. Modificada la enzima, est siempre inhibida. Ejm: efecto del mercurio, plomo, gases neurotxicos y compuestos arsenicales. In cianuro, CN-: Se fija con gran afinidad a la sexta posicin de coordinacin del Fe hemnico del complejo citocromo oxidasa. Penicilinas: Inhiben enzimas sernicas que participan en la formacin de la pared bacteriana

INHIBIDORES
REVERSIBLES. La unin del inhibidor y la enzima es reversible. Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad. Se unen a la enzima por el mismo tipo de interacciones que se producen entre las enzimas y los sustratos.

hay inhibidores:
COMPETITIVOS, NO COMPETITIVOS, y ACOMPETITIVOS.

a.- Inhibidores irreversibles: Venenos


Los gases nerviosos. Organofosforados. Carbamatos. Actan sobre las enzimas del sistema nervioso. Neurotransmisores

Agentes nerviosos
Los agentes nerviosos son esteres del cido fosfrico, con los OH sustituidos por otros radicales. Inhiben la acetilcolinesterasa

Plaguisidas organfosforados
Organofosforados: malathion Carbamatos: como el carbaril (Sevin). Organofosforados: Esteres de fosfato con O sustituidos con S u otros radicales. Con enlace P-C fosfonato, Con enlace P-N fosforamido, Con enlace P-S fosfotiolato Inhiben la acetilcolinesterasa

Neurotransmisin intoxicacin
Circuito elctrico de transmisin de seal entre una sensacin (nervio sensitivo) y un movimiento muscular (nervio motor).
Acetilcolina --- colina + acetato Enzima: acetilcolinesterasa Un inhibidor de la acetilcolinesterasa, inhibidor de la colinesterasa o anticolinesterasa es un compuesto qumico que inhibe a la enzima colinesterasa impidiendo que se destruya la acetilcolina liberada, produciendo como consecuencia un aumento en la concentracin y en la duracin de los efectos del neurotransmisor.

Los venenos inhiben la acetilcolinesterasa Reaccionan con la enzima de manera similar a la acetilcolina. La reactivacin de la enzima dura menos tiempo con los carbamatos, que con los organofosforados. De ah que, los carbamatos se consideran inhibidores reversibles porque en poco tiempo dejan la enzima libre, mientras que a los organofosforados se les llama inhibidores irreversibles porque el proceso de reactivacin, tarda mucho mas tiempo, y la enzima pierda propiedades catalizadoras

Armas qumicas
El Gas sarn. Es un lquido incoloro e inoloro usado como arma qumica debido a su extrema potencia como agente nervioso. Fue clasificado como arma de destruccin masiva en la resolucin 687 de la ONU. La produccin y almacenamiento de gas sarn fue declarada ilegal en la Convencin sobre Armas Qumicas de 1993. Fue desarrollado como pesticida en 1939 en Alemania. Puede convertirse en vapor (gas) y propagarse al ambiente.

b.- Inhibidor Reversible


La unin del inhibidor y la enzima es reversible. Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad. Hay 3 tipos:

Competitiva No Competitiva Acompetitiva (Alostrica)

Inhibidores competitivos
Los inhibidores competitivos tienen gran parecido estructural con el sustrato natural. Compiten con el sustrato por ocupar el sitio activo de la enzima. Esta unin es reversible y aumentando la concentracin de sustrato aumentamos el nmero de molculas de enzima libre. Sulfas (inhibe pasos metablicos en bacterias

Inhibicin competitiva

Malonato succnico
Sulfas microbianas

Deshidrogenasa del cido

Infecciones

Antihipertensores: Captopril y Enalopril Alopurinol Fluoruracilo Controla la gota Cncer

Efecto antibiotico de las sulfas


Las bacterias sensibles Requieren del (para amino benzoico) PABA para la produccin del cido dihidroflico, un paso esencial en la produccin de las purinas y la sntesis de cidos nucleicos. Las sulfamidas actan como anlogos estructurales del PABA, inhibiendo competitivamente a la enzima dihidropteroato sintasa. Al bloquear la sntesis del cido flico, se inhibe el crecimiento y reproduccin del germen

Inhibidor competitivo

Competitiva

Inhibicin No Competitiva
El inhibidor se combina con la enzima o con el complejo ES, interfiriendo con la formacin de producto. El valor de Km no vara Ejm. Yodoacetato. Se une a SH de cisteina y modifica el centro activo

No competitiva
V = Vmax. S . .1. Kmax+S (1+I/Ki)

Km se mantiene

Inhibicin acompetitiva
El inhibidor se une solo al complejo ES para dar un complejo inactivo. La Km se mantiene y la Vmax disminuye.

Diferenciacin de tipos de inhibiciones reversibles.

Aplicaciones
Muchos medicamentos son inhibidores enzimticos. La validez de un inhibidor enzimtico medicinal suele venir determinada por su especificidad (su carencia de unirse a otras protenas) y su potencia (su constante de disociacin, la cual indica la concentracin necesaria para inhibir a una enzima). Una alta especificidad y potencia asegura que el medicamento va a tener pocos efectos secundarios y por tanto una baja toxicidad.

REACCIONES CON MS DE UN SUBSTRATO


Mecanismos para explicar este tipo de reacciones: la mayora pueden clasificarse en dos tipos:

a)Se libera un producto a partir de un primer complejo binario antes de la unin con el segundo substrato. b)Todos los substratos se unen a la enzima antes de la catlisis (en caso de dos substratos se denomina mecanismo de formacin de complejo ternario)

a.- Reacciones mediante formacin de un complejo ternario. En este caso, el complejo ternario puede formarse independientemente del orden de unin de los substratos (aleatorio), o bien nicamente en un orden determinado (mecanismo ordenado). Mecanismo aleatorio. Los substratos A y B forman un complejo con la enzima. Cualquiera de ambos puede combinarse con el otro substrato para formar el complejo ternario EAB, que conduce a los productos X e Y y a regenerar la enzima:

Mecanismo ordenado. Un substrato (A) se une inicialmente con la enzima


formando el complejo EA. El segundo substrato slo se une al complejo EA para conducir al complejo ternario EAB:

b.- Reacciones enzimticas sin formacin de un complejo ternario. El mecanismo se denomina ping-pong, formndose un complejo de la enzima con un substrato (EA), que libera el producto X, quedando como EA' (por ejemplo, un acil-enzima) que es atacado por el segundo substrato (por ejemplo, transfirindose el grupo acilo).

Regulacin de la actividad enzimtica


Los seres vivos han generado mecanismos para regular las rutas bioqumicas. La regulacin es esencial por las siguientes razones: Mantenimiento de un estado ordenado no hay desperdicio de recursos. Conservacin de la energa utilizacin de la Energa suficiente en las clulas, para consumir los nutrientes segn sus necesidades energticas. Respuesta a variaciones ambientales son los ajustes rpidos que deben realizar las clulas (pH, [S], TC), por su capacidad de aumentar o disminuir la velocidad de las reacciones especficas.

Sobre la actividad de la enzima Sobre la cantidad de la enzima

Clases de regulacin enzimtica


1. Alostricas. Su actividad cataltica es regulada por unin no covalente de un metabolito especfico, en un sitio de la protena diferente al centro activo. 2. NO Alostricas. Se unen covalentemente y se interconvierten en forma activa e inactiva, por accin de otras enzimas:

1.- Control a nivel de sustrato


Mediante interaccin de los sustratos y productos de cada reaccin con la enzima hexoquinasa Glucosa + ATP -------> Glucosa-6-fosfato + ADP

El propio producto de la reaccin puede inhibir competitivamente a la enzima

2.- Control por retroalimentacin (Negativa)


Un aumento de concentracin del producto final de una ruta metablica inhibe una de las primeras reacciones de la ruta (generalmente la primera) A ---> B ---> C ---> D ---> E

E acta como inhibidor del primer enzima.

Ello impide: La utilizacin innecesaria del primer sustrato La acumulacin del producto final Se evita la acumulacin de intermedios (al ser la mayora R. Reversibles)

RUTAS METABLICAS CONTROLADAS POR RETROALIMENTACIN

RUTA

ENZIMA

INHIBIDOR

Glicolisis Neoglucognesis Bios. cs. Grasos Bios. Colesterol Bios. Purinas

Fosfofructokinasa FBP fosfatasa AcetilCoA carboxilasa HMGCoA reductasa PRPP sintetasa

ATP AMP AcilCoA Colesterol AMP,GMP,IMP

Presentan una cintica sigmoidal, indicativa de efectos cooperativos en la unin del sustrato. Su actividad est regulada por otras molculas efectoras. Pueden mantener las concentraciones de sus sustratos en valores bastante constantes: Existe una concentracin crtica de sustrato ([S]c) por debajo de la cul la enzima es prcticamente inactiva

Enzimas alostericas

Ejemplos de cintica.
1. En una reaccin enzimtica que transcurre con una concentracin de enzimas de 0,015g/l, se obtienen los siguientes datos: [S] (g/l) 20 15 10 6.5 5.0 4.0 3.3 2.5 v(g/l-min)1.14 1.01 0.87 0.7 0.59 0.5 0.44 0.35 Deduzca el modelo que representa la cintica del proceso.

Representando grficamente se tiene:

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0 0 5 10 15 20 25

Deduccin de los, coeficientes de la ecuacin .


S 20 15 v (g/l-min) 1.14 1.01 1/S 0.05 0.066 1/v 0.877 0.990

10
6.5 5.0 4.0 3.3 2.5

0.87
0.70 0.59 0.50 0.44 0.35

0.10
0.15 0.20 0.25 0.30 0.40

1.149
1.428 1.695 2.000 2.273 2.857

Grafica Linewaber-Burk
1/v

3.0000

2.5000

y = 5.3879x + 0.6147 R = 0.9914

2.0000

1.5000

1.0000

0.5000

0.0000 0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

0.450

Segn Linewaber-Burk

Interaccin.= 1/vmax=0.614 vmax = 1.628 g/l-min. Pendiente: Km/vmax. = 5.387 Km = 8.776 g/l El modelo ser. V = Vmax.S/(Km+S) V = 1.628S/(8.776+S) Comprobar por Eadie-Hostfee

Liberalizacin de Eadie-Hostfee

V = Vmax Km.V/S
v/S
0.160

0.140

0.120

0.100

0.080

0.060

0.040

y = -0.1148x + 0.1861 R = 0.9758

0.020

0.000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

INMOVILIZACION DE ENZIMAS
Se entiende por enzima inmovilizada (EI) aquella asociada a una matriz no esencial para su actividad.

Operacin continua

El biocatalizador se confina a una regin determinada a travs de la cual se pasa la solucin del substrato, que sale como un producto, libre de catalizador.

Reutilizacin

Heterogneo: uso continuado

Mtodos de Inmovilizacin

Retencin

fsica
Atrapamiento o
inclusin

Inmovilizacin

qumica

Adsorcin

Unin covalente

Entrecruzamiento

Soportes de inmovilizacin

Agarosa Celulosa Quitina

Dextrano cidos naturales


Almidn

Inmovilizacin de enzimas

Enzimas: Aplicaciones

Fabricacin del Queso


La operacin mas importante es la coagulacin de la caseina Para ello utilizamos una serie de enzimas que podemos encontrar en vegetales o animales La pepsina y la quimosina son las enzimas mas importantes. Se encuentran en varios animales, entre ellos los rumiantes. Otras enzimas como papaina. Estos producen cogulos elsticos La utilizacin de unas u otras enzimas repercute activamente en el sabor y en la naturaleza del queso

Industrias Lcteas

La lactasa es el enzima que consigue romper la lactosa, que es el azcar que contiene la leche Mucha gente es intolerante a la lactosa Existen en el mercado leches que vienen con lactasa

Industria Panadera
La mas comnmente utilizada es la lipoxidasa, que conjuntamente con el blanqueante, le da a la masa un carcter mas manejable Esta contenida en la harina de soja y de otras leguminosas.

Para aumentar la accin de la levadura se aade amilasa, en forma de harina de malta Se usan para ello tambin algunos mohos que contienen la enzima La harina de malta, tiene un inconveniente, y es que cambia el color del pan

Industria Cervecera
El proceso fundamental es la rotura del almidn Los azucares simples formados son fermentados por las levaduras Esto se lleva a cabo con las amilasas, provenientes de la malta. A veces se aaden otros almidones como de arroz o patata para aprovechar al mximo la actividad de las enzimas

Fabricacin de Zumos
Las peptinas provocan que los zumos sean demasiado viscosos y turbios. Esto se elimina con enzimas, contenidos en el propio zumo o que se pueden aadir En el proceso, como subproducto tenemos metanol, que aparece en muy baja concentracin

Tipos de pectinasas

Detergentes

Estos llevan enzimas que ayudan a limpiar Las proteasas facilitan la eliminacin de manchas de origen proteico Las lipasas eliminan las manchas de grasa y otros compuestos orgnicos Estos detergentes que llevan enzimas se denominan detergentes biolgicos

Medicina y Farmacia
El uso de enzimas en el sector mdico y farmacutico es potencialmente inmensa, pero su utilizacin es mnima Se usan slo si se tiene una seguridad absoluta de su eficacia. Alrededor de 150 enfermedades metablicas se han atribuido a defectos enzimticos. En teora, y una vez conocido el defecto, debera ser posible administrar la enzima ausente al paciente y aliviar o eliminar los sntomas de la alteracin. Los intentos para tratar las enfermedades metablicas hereditarias mediante la administracin de enzimas tienen xito parcial. El principal problema es que la enzima incorporada al organismo tiende a acumularse en el hgado y el bazo.