v = c/ l

E = hv

Diagrama de Jablonski Conversin interna

S2
(10-12 s)

S1
Fluorescencia (10-9 s-10-8 s)

Energa

Absorcin (10-15 s)

Nr

S0
Corrimiento de Stokes : lemisin > labsorcin

Diagrama de Jablonski Conversin interna

S2
(10-12 s)

Relajacin del solvente

(10-10 s)

S1

Energa S0

Corrimiento de Stokes : lemisin > labsorcin

Absorcin (10-15 s)

Absorcin

G
relajacin trmica

relajacin trmica

Fluorescencia

Propiedades fundamentales de la fluorescencia

(a) Principio de Frack-Condon: las transiciones son verticales (los ncleos no cambian de posicin en 10-15 s). (c) La excitacin es desde el nivel vibracional ms bajo del estado basal hacia cualquier nivel vibracional del estado excitado. La emisin es desde el menor nivel vibracional del estado excitado hasta cualquier nivel vibracional del estado basal. La excitacin revela los estados vibracionales del estado excitado; la emisin los del estado basal. (b) Si una transicin es la ms probable para la excitacin, la recproca lo ser para la emisin. Ej.: 02 (excitacin), 02 (emisin). El espectro de emisin es una imagen especular del de eexcitacin. (d) El espectro de emisin est corrido a menores energas respecto al de excitacin (corrimiento de Stokes).

Tiempos tpicos de las interacciones entre la materia y la luz visible-UV

Absorcin de fotones, 10-15 s Vibracin interatmica, 10-12 s Conversin interna, relajacin del solvente, 10 -1210-10 s Emisin de fluorescencia 10 -1010-9 s Fosforescencia 10-3 s

Quantum yield

Tiempo de vida

Quenching the fluorescencia

Puede ser esttico o dinmico

Resonance Energy Transfer

FLUORFOROS INTRNSECOS
Triptofano es el fluorforo intrnseco dominante. Trp es muy sensible al entorno. Es posible ver cambios en los espectros de emisin en respuesta a cambios conformacionales, asociacin de subunidades, unin de sustratos, desnaturalizacin y cualquier cosa que afecte el entorno local del anillo indol. Trp es muy sensible a la atenuacin colisional, tanto por grupos externos como por grupos vecinos, en la protena. Trp puede ser excitado selectivamente a 295 nm. (para evitar la excitacin de la Tyr).

Trp 48

Azurina 4AZU lmax= 308nm

Trp 48
Protena G lmax= 342.5 nm

Trp 25

Glucagon 1GCN lmax 350.8 nm

Flurescence (arbitrary units)

375 325 275 225 175 125 75 25 0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

[parinaric acid]/[YLSCP2]
225

Flurescence (arbitrary units)

200 175 150 125 100 75 50 25 0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

[parinaric acid]/[IFABP]

Fluorforos extrnsecos

*
S1 (no polar)

et

_ (estable en ambiente polar)

+ Transferencia electrnica absorcin fluorescencia (no polar)

S1 ct

fluorescencia (ambiente polar)

Variacin en el rendimiento cuntico del ANS

S0 np

U ESL9 (5 M GdmCl) IP ESL9 N ESL9 (0.05 M GdmCl)

N-terminal

Esquema de la estructura de la -lactamasa. Se muestran las hlices C y N terminales.

C-terminal

Fluorescencia

Longitud de onda