GENETICA MOLECULAR

1
2
3
 13 / 11 / 200
Los números del genoma humano
Total de genes estimado 20.000-25.000

Genes identificados 19073

Genes mitocondriales 37
Genes secuencia conocida 12527
Descripción fenotípica 374
Otros 6172

Genes con localización física 11419

enes localizados por cromosoma

1097
717

617 429 532 683

508
406 427 413 717 601

641
206 356 328
443 664 160 727 277 139 286 45

4
 Características de los genes humanos que codifican proteínas.

Característica Mediana Promedio Tamaño muestra

Tamaño exones 122 bp 145 bp 43.317

Número exones 7 8.8 3.501

Tamaño intrones 1.023 bp 3.365 bp 27.238

3’ UTR 400 bp 770 bp 689 (crom. 22)

5’ UTR 240 300 463 (crom. 22)

Secuencia codificadora 1.100 bp 1.340 bp 1.804

(CDS) 367 aa 447 aa

Extensión genómica 14 kb 27 kb 1.804

5
Los genes humanos varían enormemente
en tamaño y cantidad de exones

6
 La densidad de genes no es homogénea

Región del HLA de tipo III en el cromosoma 6p21.3

Gen de la distrofina en el cromosoma Xp21

7
 La densidad génica se correlaciona con el bandeo cromosómico

Xp21
6p21.3

BANDAS G
Claras oscuras

Comparativamente ricas en GC Comparativamente ricas en AT

Sensibles a la DNAsa Insensibles a la DNAsa
Condensación tardía en el ciclo celular Condensación temprana en el ciclo celular
Replicación temprana Replicación tardía
Alta densidad génica Baja densidad génica
Pobres en secuencias repetidas Ricas en secuencias repetidas

8
Aunque es raro, existen genes solapados y anidados

A) Región del HLA de tipo III en el cromosoma 6p21.3

B) Intrón 26 del gen de la neurofibromatosis tipo 1

9
 El tamaño de los genomas
No existe una buena correlación entre
el tamaño del genoma y complejidad
genética

Existe una tamaño mínimo del genoma

necesario para incrementar la
complejidad

Se detecta una gran variación en el

tamaño del genoma dentro de un
mismo phylum

10
 Secuencias de DNA repetitivas

Generalmente, los genes son

codificados por secuencias únicas
de DNA

Los genomas más grandes dentro

de un mismo phylum no contienen
necesariamente más genes

Una gran parte del ADN repetitivo

puede proceder de los elementos
transponibles

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 Contenido en repeticiones del genoma humano

Derivados de elementos transponibles

Pseudogenes procesados
Repeticiones de secuencias sencillas
Duplicaciones segmentales 10-300 kb
Bloques de secuencias repetidas en tándem (centrómeros, telómeros,...)

Derivados de trasposones

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 Contenido en repeticiones del genoma humano

Elementos H. sapiens D. melanogaster C. elegans A. thaliana

LINE/SINE 33.40% 0.70% 0.40% 0.50%

LTR 8.10% 1.50% 0.00% 4.80%

DNA 2.80% 0.70% 5.30% 5.10%

Total 44.40% 3.10% 6.50% 10.50%

13
 ORGANIZACION
GENOMA
GENERAL DEL NUCLEAR
GENOMA HUMANO

GENOMA genes y secuencias

ADN extragénico
MITOCONDRIAL relacionadas
75%
25%

Moderada o altamente Secs. únicas o

Codificante No codificante
Repetido bajo número de copias
2.5% 22.5%
30% 45%

Repetidos en tándem
35000 genes 500 RNA Repetidos dispersos o agrupados
proteínas funcionales 12% 18%

4 genes rRNA Satélite

Cortos (SINEs) Largos (LINEs)

Minisatélites
>40 tRNA

>500 otros Microsatélite

RNA funcionales

Intrones, secuencias Fragmentos

Pseudogenes
no traducidas génicos

14
 INGENIERIA GENETICA

Deberán quedar bien claros los siguientes puntos:

•¿Cómo se manipula el DNA?

•Las endonucleasas (enzimas) de restricción
• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación,
organismo huésped, selección de vectores
•Vectores eucarióticos
•Organismos transgénicos
•Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
•Mapas de restricción
•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
•La secuenciación del DNA

15
 Manipulación del DNA

Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse

en un conjunto heterogéneo de secuencias.

Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un

fragmento de DNA específico
Esta tecnología se denomina:
Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o
ingeniería genética
Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La

extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias
de bases complementarias constituye un poderoso instrumento
para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de
DNA complementarios a uno dado
16
 Herramienta básica

Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias

que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el
esqueleto azúcar-fosfato.

•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de

reconocimiento (al azar)

•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son
repeticiones invertidas o palíndromes

5´-GGATCC- 3´

3´-CCTAGG- 5´

17
 Dos tipos de cortes:
EcoRI: E. Coli
BamHI: Bacillus amyloliquefaciens •Corte plano:
extremos romos
•Corte escalonado:
extremos pegajosos o
cohesivos
18
 Herramienta básica

Las enzimas de restricción tipo II:

Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en

secuencias específicas, produciendo por tanto una población
heterogénea de fragmentos de extremos idénticos
19
 Clonación del
DNA
•DNA foráneo (secuencia que
se desea clonar) Vector
híbrido
•Vector de clonación
(vehículo)

•Organismo huésped (E. Coli)

•Selección de vectores

20
C
Fago λ
l
o Vectores de
n clonación
a
c •Fago λ (2 sitios de
i corte) < 24 kb
ó
n
•Cromosomas
d artificiales P1
e (derivados del
l bacteriófago P1,
pueden aceptar
insertos de 80 y 100
D kb
N
A

21
C Vectores de clonación
l •Cósmido: extremos cos λ + DNA plásmido (origen replicación)
o + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb
n
•BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido
a F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas
c
i Cósmido
ó
n

d
e
l

D
N
A

22
C
l
o Huésped: E. coli
n
a
Inserción del vector híbrido en el huésped:
c
i
•Plásmido: transformación (solución diluida
ó
cloruro de calcio) y replicación autónoma
n
•Fago λ (transducción, inserción en DNA
d
e huésped)
l
•Cósmido (transducción como fago y
D replicación como plásmido)
N
A

23
C Selección de vectores híbridos
l
o •Plásmido: resistencia a antibióticos
n
a
c
i
ó
n

d
e
l

D
N •Fago λ : Inserción en E. coli (sólo se puede
A empaquetar el DNA de λ si contiene el
inserto foráneo) 24
C Obtención de la secuencia que se
l clona
o •Un gen
n •Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene
a intrones): uso de la transcriptasa inversa que
c hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina
i humana recombinante en bacterias)
ó
n •Síntesis automatizada de DNA in vitro: a
partir de la secuencia aminoacídica se puede
hacer DNA con la ayuda del código (no región
d
promotora ni controladora de la expresión)
e ~100bp
l
•Fragmentos del genoma por digestión con enzimas
D de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun)
N •Se obtiene genoteca, juego completo
A fragmentos clonados del genoma del organismo
25
Vectores eucarióticos
Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas

•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de

levaduras (YACs):
Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de
levadura + (telómero levadura)
Puede incorporar más de 500 kb de DNA

Resistencia a antibiótico
(p.e., ampr) Origen de replicación
del DNA de levadura
(ARS)

Origen de replicación Región centromérica

bacteriano (ori) (CEN)

Linealización (con
endonucleasas) y adición
de extremos teloméricos

Telómero ampr ori CEN ARS Telómero

26
 Separación fragmentos

Reptación
de los
fragmentos
a través del
gel de
agarosa

27
 DNA teñido
con bromuro
de etidio
emite
fluorescencia
con luz UV

28
 Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto
heterogéneos de fragmentos
Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes
fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

•Transferencia en Southern (Southern blotting)

•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con
RNA

29
Mapas de restricción
mediante
enzimas de restricción

30
La reacción
en cadena
de la
polimerasa
(PCR)

31
32
33
 Usos de la PCR
•Secuenciación

•DNA fósil (evolución,

arqueología, historia) DNA traza

Fósiles
Mamut lanudo (40000

años)

Abraham Lincoln

(síndrome de Marfan,

afecta tejido conectivo,

fribrilina)

Hombre Neandertal ->

Hablaba como nosotros?

34
 Secuenciación de DNA
La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA
permite un conocimiento más completo de la estructura y
función de un gen.

•La base molecular de mutaciones específicas

en un gen pueden investigarse
•Las secuencias del DNA han revelado regiones
reguladoras comunes a todos los genes
•La comparación de secuencias de diferentes
especies provee estimas de las tasas de
evolución molecular
•Secuenciación de genomas: estructura del
genoma Disoxi

Métodos:
Secuenciación manual (inicial)
Químico (Maxam y Gilbert 1977)
Didesoxi (Sanger 1977)

Secuenciación automatizada (1986,…)

Didesoxi35
Secuenciación del DNA

36
Secuenciación automatizada del DNA

37
38
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