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TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

Conjunto de procedimientos utilizados para el estudio microscópico (histológico) de las piezas anatómicas.

No los va a realizar el estudiante, pero debe conocer sus fundamentos, la ejecución, la interpretación de los resultados para una mejor comprensión del estudio histológico.
Todas tienen en común el que requieren de un corte muy delgado del tejido y montarlo en una lámina de vidrio antes de observarlo al microscopio. Dos técnicas principales: la de la parafina y la de la congelación.

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 Sección.  Montaje y tinción.  Fijación.TÉCNICA DE LA PARAFINA:  Obtención de la muestra.  Aclaración. .  Deshidratación. y.  Inclusión.

Los fijadores son antisépticos  matan cualquier germen presente.Obtención de la muestra Tomar pequeño fragmento de pocos milímetros de tejido de cadáver (necropsia) o del vivo (biopsia) en un acto quirúrgico. Se coagulan las proteínas  aldehído fórmico al 4%. Requiere de movimientos delicados y de aparatos afilados. Fijación de la muestra Objetivo: endurecer el tejido obtenido que es muy blando y detener la degeneración postmortem. .

Lavado de la muestra con alcoholes de grado más superior cada vez. aclaración de la muestra Es la eliminación del alcohol y la inclusión de la parafina en su reemplazo. . hasta llegar al grado absoluto.deshidratación de la muestra Consiste en reemplazar el agua del tejido con la parafina líquida. Se emplea el xilol como solvente.

Se emplea el MICRÓTOMO que permite obtener una cinta de cortes sucesivos. . una vez que se ha enfriado.inclusión de la muestra Es la introducción de la muestra en parafina líquida  se reemplaza al xilol. sección de la muestra Corte muy delicado de la muestra.

Montaje y tinción de la muestra Montaje de las cintas del espécimen sobre un portaobjetos para someterlo a tinción. Se invierten los pasos de la técnica. lo cual permite «pintar» el tejido con colorantes solubles en agua. .

Criostato permite la congelación de la muestra y corte a igual temperatura  abrevia el tiempo de preparación del corte. Consiste en la solidificación del fragmento  corriente de bióxido de carbono  hielo seco.TÉCNICA DE LA CONGELACIÓN: Es una técnica más usada que la anterior. .

. de plata y oro. de alumbre de cromo. Igual que las técnicas histológicas. de azul de isamina. Hay varios tipos de técnicas: hematoxilina-eosina. de azul de metileno. de Sudán negro y osmio. de tricrómico de Masson.Técnicas de coloración Técnicas que permiten diferenciar los distintos componentes de las células y de los tejidos. de Nissl. de Giemsa. de azul alcián. de azul de toluidina (metacromasia). debieron atravesar por varias etapas históricas hasta llegar a perfeccionarse. tricrómica de Mallory. de Van Gieson. del ácido peryódico de Schiff. de reticulina. y de Feulgen. de Azán. Se usan dos tipos de colorantes: uno ácido cuya afinidad es por los elementos citoplasmáticos y uno básico cuya afinidad es por los elementos nucleares.

proporciona color azul purpúreo a los constituyentes tisulares con los cuales se combina (núcleos. Un corte teñido con este método se denomina un corte de H y E (o simplemente HE). ribosomas. y retículo endoplásmico rugoso  debido al alto contenido de ADN y ARN).Los colorantes de hematoxilina y eosina: La combinación más empleada de colorantes. da color rosa o rojo a los constituyentes tisulares con los cuales se combina  los tejidos que se tiñen en color rosa o rojo con la eosina se dice que son aidófilos o eosinófilos (mayoría de proteínas citoplasmáticas y citoplasma). . La eosina es un colorante ácido. Los tejidos que se tiñen en color azul con la hematoxilina son basófilos. La hematoxilina es un colorante básico.

Arriba a la derecha se observa la misma célula tenida con la técnica de PA-Schiff (que tiñe algunas macromoléculas e hidratos de carbono de color carmesí) y hematoxilina. . La proteína del citoplasma se tiñe de rojo. El citoplasma se pinta de rosado. coloreada con HE. teñidas con la técnica de PA-Schiff y hematoxilina.Arriba a la izquierda se observa una célula hepática. La imagen de abajo muestra a varias células epiteliales sinuadas sobre tejido conectivo laxo. dependiente del DNA y sensible a la hematoxilina. Los espacios vacíos dependen del depósito de glucógeno. por la proteína que se tiñe con la eosina. donde el núcleo muestra un borde color azul. Dos de las células que se ven son caliciformes y secretan moco (que es una glucoproteína).

Pertenecen a este tipo de agentes ciertos colorantes básicos. se modifica el color azul a púrpura o rojo violáceo por unión con el tejido. con el colorante azul de toluidina.LA METACROMASIA: Cuando se tiñen ciertos componentes tisulares. de los cuales los más importantes son los derivados tiazínicos azul de toluidina y tionina. . la matriz cartilaginosa. Fotomicrografía de un corte de tráquea teñido con hematoxilinaeosina. Los colorantes capaces de sufrir esta transformación se denominan colorantes metacromáticos. que muestra un ejemplo de metacromasis. como por ejemplo. La ancha zona. cuya sustancia basal se tiñe por metacromasia. intensamente rojo violácea de la mitad inferior de la imagen es cartílago hialino.

01. ( 02. (

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12. (

) Las técnicas histológicas permiten el estudio de las piezas anatómicas. ) Fijar una muestra quiere decir aplicar las coloraciones adecuadas de acuerdo a lo que se quiere observar. ) De los colorantes que se emplean en el laboratorio de histopatología, uno es ácido para los elementos nucleares y otro es básico para los elementos citoplasmáticos. ) La técnica de radioautografía permite que el MO tenga un poder de resolución de una micra y el ME de 0,1 micras. ) Al igual que la técnica de Van Gieson, la coloración tricrómica de Masson se emplea mejor, para ver los tejidos conectivos. ) La principal característica de los colorante metacromáticos es que son aquellos que principalmente se emplean para colorear las grasas. ) Aclarar una muestra de tejido es reemplazar el agua del tejido con parafina líquida. ) Entre tantos métodos de coloración existentes, en el caso de la coloración tricrómica de Mallory no se conoce el fundamento químico de unión entre colorantes y componentes tisulares. ) El tomar una pequeña muestra para estudio histológico se lo puede hacer por necropsia o por biopsia. ) El criostato lo es a la técnica de congelación, como el micrótomo lo es a la técnica de la parafina. ) La reacción del ácido peryódico de Schiff tiñe carbohidratos complejos de un color magenta oscuro. ) Una gran cantidad de técnicas de coloración pintan los hematíes de naranja o rojo.

Técnicas de observación
Una de las más empleadas actualmente es la RADIOAUTOGRAFÍA.
Permite identificar:
El sitio exacto de la célula donde se sintetiza un producto; Los componentes químicos que lo forman; Los desplazamientos de la sustancia dentro de la célula; y, Las localizaciones del organismo después de salir de la célula.

Se basa en dos principios fundamentales: en una radiación ionizante y en un precursor biológico con marca radiactiva.

♣ Radiación ionizante tiene el mismo efecto sobre una emulsión fotográfica que la luz visible. ♣ Marca radiactiva es el reemplazo de un átomo de una molécula determinada por su isótopo radiactivo correspondiente.

El producto radiactivo inyectado a un animal, finalmente se transformará en una sustancia que irá a formar parte de los tejidos que requieren de él y, con una coloración especial se observa dichos tejidos.
Se puede obtener un poder de resolución de una micra con el MO y de 0,1 micras con el ME.

Una importante aplicación, es el marcado de núcleos celulares y por ende el estudio de la histogénesis (desarrollo de células embrionarias indiferenciadas a células especializadas de un tejido).

LA MICROSCOPÍA
Técnica para observar materiales diminutos utilizando un microscopio.
Basados en el microscopio común se han desarrollado varios tipos de microscopios:  Simple,  Óptico o compuesto,  De campo oscuro,  De contraste de fases,  De interferencia,  De luz polarizada,  De fluorescencia (o de inmunofluorescencia),  De barrido confocal,  De luz ultravioleta,  Operatorio,  Esterescópico,  Polarizante,  De reflexión,  De rayos X,  Microscopio electrónico.

.MICROSCOPIO SIMPLE: Lente de aumento muy potente. provisto de un sostén que permite mantenerlo cómodamente de modo que se observe sobre una «platina» agujereada (de modo que pueda ser iluminada desde debajo por un espejo inclinable) una preparación colocada en la platina.

cuando se acciona el tornillo micrométrico. en cuyo extremo superior se encuentran el tubo óptico con el sistema de lentes y el ocular. formación pesada que proporciona estabilidad al aparato. El tubo óptico termina en el sistema de revólver de cuatro lentes objetivos. o se desplaza a uno u otro lado para precisar el enfoque. en la parte media presenta un orificio para el paso de la luz emitida por una lámpara situada en el pie o estativo. y de la cual sube el brazo. Por debajo del condensador. . hay un filtro llamado diafragma. nace la platina. que al abrirlo y cerrarlo regula el paso de la luz.El microscopio óptico (MO) Partes mecánicas: El pie o estativo. movible de acuerdo a las necesidades  baja o sube cuando se acciona el tornillo macrométrico. De la parte inferior del brazo y por debajo del tubo óptico.

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objetivo y ocular. 40 X y de inmersión (de 100 X y que para utilizarlo se requiere de una gota de aceite de cedro. colocada en el portaobjetos sobre el espécimen). .  El condensador concentra el haz de luz que ilumina el objeto estudiado. de acuerdo al poder de cada uno. destinado a concentrar los rayos luminosos a través el orificio de la platina.  El objetivo aumenta el objeto y proyecta la imagen sobre el ocular. 10 X. lo cual permite cambiarlos a voluntad. se encuentra una lente llamada condensador. denominados respectivamente 4 X.Componentes ópticos: Tres sistemas de lentes: condensador. El objetivo está constituído por un conjunto de lentes situados en el extremo inferior del tubo óptico y accionados por un sistema de revolver.  El ocular aumenta aun más la imagen y la proyecta sobre la retina del ojo del observador. Existen cuatro tipos de lentes. Por debajo de la platina.

(12) regulación micrométrica. (10) base. . (9) lámpara. (6) condensador. (11) regulación macrométrica.Esquema de un microscopio óptico: (1) ocular. (5) platina portaobjetos. (4) objetivo. (3) portaobjetivos en revólver. (2) posición del ojo del observador. (7) regulación del condensador. (8) colector.

cubren el preparado. . El aumento total resultante del microscopio se determina en diámetros con la letra X mediante el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular (eventualmente se debe multiplicar por un factor que depende del tubo). el empleo del objetivo de 10 X y del lente de 10 X. dará un aumento total de 100 X (10 x 10).Sobre la platina y por encima de su orificio. El portaobjetos es sujetado por unas pinzas que le aseguran a la misma platina. unas laminillas más delgadas –cubreobjetos . así por ejemplo. se colocan unas lá-minas de vidrio llamadas portaobjetos.

El poder de resolución: distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se visualicen separados.
La calidad de una imagen (claridad y riqueza de detalles) depende del poder de resolución de un microscopio.

El poder de resolución depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de las aberturas numéricas del objetivo y del condensador (el ocular sólo actúa aumentando la imagen del objetivo, no mejora el poder de resolución). El máximo poder de resolución que se puede obtener es de 0,2 μ, pero con los preparados de rutina habituales rara vez se excede de 0,5 μ.

Existe una relación inversa entre la longitud de onda de la luz empleada por un microscopio y el poder de resolución del mismo.

El microscopio de luz ultravioleta
 Con el empleo de luz ultravioleta con longitud de onda de alrededor de 250 nm (casi la mitad de la luz visible que se utiliza habitualmente en el microscopio óptico), es posible duplicar el poder de resolución;  El microscopio de luz ultravioleta, cuyo sistema óptico suele estar construído en cuarzo, permite el paso de la luz ultravioleta, que es invisible;  La formación de la imagen se registra en una película fotográfica;  Principal importancia del microscopio de luz ultravioleta: ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta  se pueden detectar con facilidad.

Microscopía electrónica
El microscopio electrónico representa un verdadero logro en cuanto a incrementos del aumento y del poder de resolución; Se reemplaza la luz visible, de longitud de onda de alrededor de 500 nanómetros, por un haz de electrones de longitud de onda del orden de 0,005 nanómetros; Como los electrones no pueden atravesar las lentes de vidrio, es necesario reemplazarlas por bobinas electromagnéticas (denominadas lentes electromagnéticas), en cuyos campos electromagnéticos o electrostáticos modifican el trayecto del haz de electrones.
Se han inventado varios tipos de ME  vamos a analizar dos: ME de transmisión; y, ME de barrido.

El microscopio electrónico de transmisión (MET):

 ME en vez de los rayos luminosos utiliza haces de electrones producidos por un filamento incandescente;
 Electrones llevan cargas negativas y pueden por tanto ser refractados o concentrados por lentes «electromagnéticas»;  Cortes ultrafinos obtenidos se colorean con una solución que contenga átomos pesados  tetróxido de osmio;  Se pueden alcanzar aumentos de orden de 100.000-200.000  se pueden distinguir dos puntos que se encuentren a la distancia de 5-10 millonésimas de milímetros.

 Técnica de la coloración negativa no es utilizable en muchas muestras.  Muestras a examinar al microscopio electrónico deben colocarse en soportes especiales. son detenidos por las moléculas del aire  es preciso hacer el vacío más absoluto.  Electrones no pueden recorrer en el aire ninguna distancia útil. .Desventajas:  Electrones son absorbidos muy fácilmente por la materia.  Las muestras biológicas deben ser extraordinariamente delgadas.

 Haz de electrones producido es concentrado por un sistema de lentes electromagnéticas.El microscopio electrónico de barrido (MEB):  Representa uno de los últimos progresos ya que permite conseguir una imagen de la muestra biológica en tres dimensiones. .  Impacto de los electrones del haz primario sobre la superficie en examen induce la emisión de electrones secundarios  son recogidos por un sistema de revelado y transformados en señales eléctricas. barre superficie del objeto en una fracción de segundo.  Haz muy fino (primario)  cepilla.000 aumentos. Inconveniente: sólo se pueden alcanzar los 100.  Señales son amplificadas por un aparato apropiado y enviadas a un tubo de rayos catódicos.

.IMÁGENES OBTENIDAS CON ME (1) Muestras del inmenso poder de apreciación que se puede tener con el ME. Izquierda: célula cancerígena entre glóbulos rojos de la sangre humana. derecha: bacteria de la cavidad oral.

derecha: virus bacteriófagos teñidos negativamente con acetato de uracilo. .000X).IMÁGENES OBTENIDAS CON ME (2) Izquierda: aspecto microscópico de la estructura trilaminar de la membrana del pulmón humano (250.

) La distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que ellos se visualicen separados.CUESTIONARIO 01. ( 08. ( 07. ) Además de otros factores. el campo electrostático puede alterar las características del haz de electrones que se produce. es que éste último utiliza un condensador especial que impide que llegue la luz directa al objetivo. ) La luz polarizada permite obtener información de la estructura molecular de las sustancias. ( 05. ) El microscopio de reflexión puede funcionar con radiaciones de cualquier longitud de onda y por lo tanto. ) En el microscopio electrónico. ( 04. lograr poderes de resolución bastante grandes. ) El objetivo del MO concentra el haz de luz y permite ver al objeto con el ocular. ( 03. ( 02. ( (2) 09. ) El microscopio de barrido confocal ya no requiere del uso de la fluoresceína. ( 10. se llama longitud de onda. ) La diferencia entre un microscopio común y uno de campo oscuro. ) La fluorescencia es el fenómeno que permite absorber energía radiante de determinada longitud de onda y volver a emitir luz con menor longitud de onda que la absorbida. ( 12. ( 06. ) En el MO. ) El portaobjetos es asegurado en la platina por una pinzas que dependen del estativo. . ( ) El microscopio óptico está formado por piezas mecánicas y por partes ópticas. la platina se encuentra entre el tubo óptico y la fuente de luz. el aumento del lente ocular también se toma en cuenta para determinar el poder de resolución de un microscopio. ( 11.

( 06. la platina se encuentra entre el tubo óptico y la fuente de luz. ) La luz polarizada permite obtener información de la estructura molecular de las sustancias. de la fisiología normal y de los tratamientos científicos que se puedan aplicar a las estructuras anatómicas femeninas se entienden mejor por el estudio microscópico de ellas. ( 08. ( 05. ( 09. ( 04. ) La histología se relaciona con la histopatología. ( 07. ( .IMÁGENES OBTENIDAS CON ME CUESTIONARIO: 01. ( 02. ) El portaobjetos es asegurado en la platina por una pinzas que dependen del estativo. ) El microscopio de reflexión puede funcionar con radiaciones de cualquier longitud de onda y por lo tanto. ) En el microscopio electrónico. ) La esplacnología es el estudio de los distintos aparatos y sistemas del cuerpo. ) En el MO. 03. toda vez que para poder apreciar los estudios anormales. lograr poderes de resolución bastante grandes. el campo electrostático puede alterar las características del haz de electrones que se produce. ( ) Los aparatos y sistemas son producto de la formación de tejidos y órganos. ) La obstetricia y la ginecología se relacionan con la histológica ya que la comprensión de los estados patológicos. ) El microscopio óptico está formado por piezas mecánicas y por partes ópticas. se hace indispensable el conocimiento de los estudios normales. ( 10.

) El microscopio de barrido confocal ya no requiere del uso de la fluoresceína.IMÁGENES OBTENIDAS CON ME CUESTIONARIO: 11. uno es ácido para los elementos nucleares y otro es básico para los elementos citoplasmáticos. ( . ( 18. el aumento del lente ocular también se toma en cuenta para determinar el poder de resolución de un microscopio. ) El objetivo del MO concentra el haz de luz y permite ver al objeto con el ocular. ( ) La distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que ellos se visualicen separados. ) De los colorantes que se emplean en el laboratorio de histopatología. ( 17. se llama longitud de onda. ) Las técnicas histológicas permiten el estudio de las piezas anatómicas. ( 16. es que éste último utiliza un condensador especial que impide que llegue la luz directa al objetivo. ( 19. ( 14. ) Además de otros factores. 13. ) La fluorescencia es el fenómeno que permite absorber energía radiante de determinada longitud de onda y volver a emitir luz con menor longitud de onda que la absorbida. ) Fijar una muestra quiere decir aplicar las coloraciones adecuadas de acuerdo a lo que se quiere observar. ) La diferencia entre un microscopio común y uno de campo oscuro. ( 12. ( 15.

) Entre tantos métodos de coloración existentes. ( 22.1 micras. para ver los tejidos conectivos. ) Aclarar una muestra de tejido es reemplazar el agua del tejido con parafina líquida. ( 23. ) La reacción del ácido peryódico de Schiff tiñe carbohidratos complejos de un color magenta oscuro. ) Al igual que la técnica de Van Gieson. ) El tomar una pequeña muestra para estudio histológico se lo puede hacer por necropsia o por biopsia.IMÁGENES OBTENIDAS CON ME CUESTIONARIO: 20. ) Una gran cantidad de técnicas de coloración pintan los hematíes de naranja o rojo. en el caso de la coloración tricrómica de Mallory no se conoce el fundamento químico de unión entre colorantes y componentes tisulares. ( ) La técnica de radioautografía permite que el MO tenga un poder de resolución de una micra y el ME de 0. ( 27. ( . 24. como el micrótomo lo es a la técnica de la parafina. la coloración tricrómica de Masson se emplea mejor. ( 21. ( 25. ) El criostato lo es a la técnica de congelación. ) La principal característica de los colorante metacromáticos es que son aquellos que principalmente se emplean para colorear las grasas. ( 26. ( 28.