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Herramientas de Biología Molecular para el diagnóstico de Enfermedades

Prof. José Antonio Nastasi Catanese

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

DESNATURALIZACION.- La ruptura de los puentes de hidrógeno que mantienen unida la doble cadena de un ácido nucleico, dando origen a dos cadenas simples, complementarias entre sí, pero separadas. Usualmente la ruptura de la doble cadena se basa en el uso de calor, elevación de pH, modificaciones de la fuerza iónica del medio o una combinación de esos factores. RENATURALIZACION.- l proceso inverso a la desnaturalización.

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

Hibridación.- La unión entre dos mol!culas simples "single stranded# a traves de puentes de hidrógeno entre bases complementarias $%-&'(-)* para formar una mol!cula doble "doble stranded#. La unión puede ser entre %+,-%+,' %+,-%-,' %-,%-,. La estabillidad de la doble mol!cula formada dependerá de la perfección de la complementaridad entre las bases de las dos cadenas. La rapidez . precisión de la formación de la doble cadena dependerá de la concentración de las cadenas simples . de las condiciones del medio $pH' /uerza iónica, etc.*

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.- nzimas de origen bacteriano, que reconocen secuencias específicas en el %+,, usualmente "secuencias palindrómicas# . lo cortan a ese nivel. 0ueden dar origen o no a "e1tremos pega2osos#. 0or e2emplo, co-3 es una enzima aislada a partir de scherichia coli que reconoce la secuencia 45-)%%&&(-65 . corta ambas "hebras# del %+, entre los nucleótidos ) . %.

Enzimas de Restricción Enzima de Restricción BamHI EcoRI HaeIII HindIII NotI Sau3A SstII Fuente 7acillus am.d .tius Haemophilus influenzae .loliquefaciens H scherichia coli -9 :6 Haemophilus aeg.treptom.ces stanford Secuencia de rec n cimient 45-)8) %&( (-65 65-( (&%)8) -45 )8%%&& ( ( &&%%8( )) 8(( ((8) ) %8%) (& & & &()%8% )(8)) (( )( () (() )8() 8)%&( (&%)8 (( )(8)) )) 8() (( .lococcus aureus 6% .ocardia otitidis-cavarium .taph.

cor-3 < 4 = ---) % % & & (-----( & & % % )--- 6 : > % % & & (-----) )-----( & & % % .

cor-3 < 4 = : < 6 = 6 : > 4 > .

cor-3 < 4 )%%&%( (& &%&) 6 : > = : < 6 = 4 > 4?> .

@ : < 6 = 4 > 4?> : < 6 = 4 > : < 6 = 4 > 4?> : < 6 = 4 > .

9%(. de origen distinto al del vector . n su mol!cula se puede insertar otras mol!culas de %+. HUESPED. replicar asi abundantemente dicha mol!cula "e1traAa#. . (ósmidos.HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR VECTOR. del cual puede ser posteriormente aislada en forma pura.Una mol!cula de %+. Usualmente una bacteria $ scherichia coli* o una levadura $. que se puede replicar de forma autónoma en un huesped $bacteria o levadura*.l organismo que se usa para mantener .. Los vectores pueden serB 0lásmidos.. propagar una mol!cula de %+..ces cerevisiae*. /agos. etc.acarom. recombinante.

ADNc ADN Genómico. ADNc ADN Genómico ADN Genómico ADN Genómico Tamaño del inserto Usualmente < 5 – 10 Kb asta !0 Kb" asta 50 Kb" 100 a #00 $b 100 a 1000 Kb" . Levadura Bacteria Bacteria Bacterias Levadura Tipo de Clonación ADN Genómico.Vectores Vector Plasmidos Bacteriagos lambdas Cosmidos Cromosomas artificiales de bacterias cromosomas artificiales de levaduras Huesped Bacteria.

te2ido o cromosoma original.%g humana# . Una biblioteca de "+. . usualmente un vector. 2emplo. Una biblioteca de # genoma humano#. que contiene un gene u otra secuencia de inter!s..Una colección de clones que contienen gran parte o todo el genoma de una c!lula. CLONAR. recombinante.Una mol!cula de %+..)enerar un clone.HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR CLONE.. BIBLIOTECA GENOMICA .

Clonación Molecular %+. Humano o porción de %+. ligasa 3nserción en Hu!sped (recimiento selectivo %islamiento en grandes cantidades . a (lonar $inserto* Cector %+.

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ticas. usada -ara detectar su secuencia com-lementaria -or .ibridi+ación molecular" . natural o sint&tica de secuencia conocida o no.HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR SONDA "% Una mol&cula de ADN o A'N. *luorescentes o en+im. (marcada) con sustancias radioactivas.

itio de una mutación 0rimer O!i" nuc!eótid ti# sa!$a%e O!i" nuc!eótid mutante .Detección de Mutaci nes .ano Het Dut .

.o ADN en -rocesos de desnaturali+ación.ibridi+ación 1 renaturali+ación 2ue ser3an im-osibles de reali+ar en los 0eles" . a *in de -oder utili+ar dic. usualmente de N1lon.TERMINOS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR SOUTHERN BLOT"% /&cnica -ara trans*erir ADN desde un 0el de A0arosa o -oliacrilamida a una membrana.

Digración %lto peso molecular +enaturar por calor %dicionar la sonda radiactiva ? 7a2o peso molecular Hibridar en el %+. colocar placa de ra. a la membrana. : < 6 = -evelar Lavar el 1ceso de sonda .onda de %+. +igestión con una nzima de restricción (olocar muestras en cada pozo de un gel de agarosa & ' ( ) .Duestra de %+.os E . inmobilizado &ransferir el %+.

Procedimientos de Blotting Método del Blot Southern Northern Western o Inmunoblot Material fraccionamiento Detección analizado ADN ARN Electroforesis Electroforesis Hibridización de Acidos Nucleicos Hibridización de Acidos Nucleicos Inmunológico Proteínas Electroforesis .

.TECNICAS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA .&!cnica que permite la amplificación de un determinado segmento de %+. .. a partir de una sola mol!cula original pueden obtenerse millones de copias al final de la reacción. l segmento especificado es copiado repetidas veces .

0olimerasa +. Dolde ? &aq. 6er. . 0asoB 1tensión. :er 0asoB +esnaturalización.*CR %+. 0asoB %lineación.&0s 0rimers <do.

*CR Al cabo de 1 ciclo Al cabo de 1 ciclo .

FH6.I<= .PCR <6FG:.H=:.

. +esarrolladas independientemente por Kalter )ilbert . . /red . (U ..obel en :LIF por su descubrimiento. quienes compartieron el premio ..&!cnicas que permiten determinar la secuencia nucleotídica de una mol!cula de %+.(3%(3J. + %+.TERMINOS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR .anger .

AM Y GIL-ERT & % ) & ( ) ( % ) & & % & ) ) % & ( % ) ( ) & ( % % & % ( ( Las hebras se separan % & ( % ) ( ) & ( % % & % ( ( Dás grande ) %) &( ( .ecuencia % & ( % ) ( ) & ( % % & % ( ( : ) < %?) 6= ( &?( Un agente químico destru.e una o dos bases de el total de cuatro bases nitrogenadas Dás pequeAo .Secuenciación del A N M+TODO DE MA.

e colocan en el termociclador. d(&0. Dás pequeAo .ecuencia & % ) & ( ) ( % ) & & : dd)&0 < dd%&0 6 dd&&0 = dd(&0 . d%&0.Secuenciación del A N M+TODO DE SANGER % & ) ) % & ( % ) ( ) & ( % % & % ( ( %+.&0 $d&&0. luego se separan con una electroforesis de ácidos nucleicos. 0olimerasa = d. d)&0 ) Dás grande % & ( .

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.Digración de mol!culas de ácidos nucleicos en un campo el!ctrico . en un medio $%garosa o poliacrilamida* que los separa de acuerdo a su tamaAo $0eso molecular* .!ERRAM"EN#AS $ #ERM"N%S E &ENE#"CA M%'EC('AR Electr ! re"i" de #cid " n$cleic ".

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!(&% " EN#"*"CAC")N E "N "V" (%S  #ERAP"A &+N"CA  C'%NAC")N  M%'EC('AR  "N "V" (A'  AN"MA'ES #RANS&EN"C%S. .AP'"CAC"%NES E 'A !ERRAM"EN#AS E B"%'%&"A M%'EC('AR  MAPE% E &ENES  "A&N)S#"C% E EN*ERME A ES  &EN+#"CAS  M"CR%B"ANAS  S(SCEP#"B"'" A ES A EN*EREME A ES  PR%$EC#% &EN%MA !(MAN% .

Detección de Mutaci nes %&())&(%(&)(%%&() &%)((%)&%%()&&%)(%)&((&))%)&%()& 0rimer tipo salva2e %&())&(%(&)(%%&(& &%)((%)&%%()&&%)%%)&((&))%)&%()& %&())&(%(&)(%%&( E &%)((%)&%%()&&%)%&(%))%((&(%&)(% 0rimer mutante %&())&(%(&)(%%&( E &%)((%)&%%()&&%)%&(%))%((&(%&)(% & ) .ormal Heterocigoto Dutante .

itio de -estricción creado por una mutación 0rimer : < 6 .Detección de Mutaci nes .

itio de una mutación O!i" nuc!eótid ti# sa!$a%e O!i" nuc!eótid mutante .ano Het Dut .Detección de Mutaci nes 0rimer .

Medicina F rense 4adre 5adre i6o 4adre 5adre i6o :4 :I <F <6 :4 :I <F Exclusión Inclusión .A#!icaci nes.

Medicina F rense 73ctima 8emen 8an0re 5iel 7ictimario 73ctima 8emen 8an0re 5iel 7ictimario :6 :> <: <6 :6 :> <: <6 Inclusión <I Exclusión .A#!icaci nes.

(oli Levadura .eptiembre de :LLH.< < )enomas .ecuenciado =.> :6 :FF :6F 6FFF 6FFF =.< =.ecuenciados para .> :6 H: I > >F M finalizado :FF :FF :FF H: > F.< =. .ematodo +rosofila -aton Humano &amaAo .*r /ect Gen ma Jrganismo Dicrobios .

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posteriormente detectado mu f!cil r!pidamente" Incluso simult!neamente se puede detectar el serotipo o cual#uier variante del virus" . siendo. Dia"nóstic de micr &omado de cualquier te2ido corporal r"anism s0 0rimers specíficos para el agente Amplifica millones de veces el ADN o ARN viral.A#!icaci nes.

C'%NAC")N Los cinco primeros cerdos clonados <H de febrero .D%DN/ -J +JLL9 . (LJ.J %L 0-3D .

C'%NAC")N Li!/1 Da22 di!1 Cr cus1 F rs/3tia / R se s n !as cuatr $acas c! nadas en Estad s Unid s1 cu/as c4!u!as se $en m5s %ó$enes 6ue ! n rma!0 .

C'%NAC")N .

.Animales . /egetales transgénicos.

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Susce0ti1ilidad genética .