Exigncias nutricionais e meio de cultura em microorganismos

Prof. Dra. Adriana Dantas UERGS, Bento Gonalves, RS

Nutrio e crescimento
Nutrio microbiana Componentes necessrios s clulas Meios de cultura Condies ambientais

Crescimento populacional Velocidade de crescimento Tempo de gerao Medidas do crescimento

Proliferao de Microrganismos

As bactrias so microrganismos unicelulares com uma estrutura muito simples, o que lhes permite replicarem-se muito rapidamente caso encontrem nutrientes, temperatura, pH, humidade e concentrao de oxignio favorveis. Alguns casos, apenas 20 minutos so suficientes para que o nmero de bactrias duplique, o que significa que um nmero inicial de 10 bactrias num determinado local em condies favorveis, se multiplicar de tal modo que se tero aproximadamente 16000000 bactrias ao fim de 8 horas.

Proliferao exponencial

Esta proliferao exponencial aliada sua resistncia faz com que as bactrias se espalhem muito rapidamente, estando presentes em todos os locais, no s nosso volta, no meio ambiente, como tambm no nosso prprio corpo: nas nossas mos, nariz, boca, tracto gastrointestinal, etc.

Artificial x Natural

Meios de cultura

At cerca de 1880, os microrganismos eram cultivados em meios lquidos Robert Koch e a sua equipe introduziram os meios de cultura slidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas (culturas puras), separando-as de espcies contaminantes.
Meios de cultura consistem da associao qualitativa e quantitativa de substncias que fornecem os nutrientes necessrios ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural.

Condies favorveis de crescimento

Tendo em vista a ampla diversidade metablica dos microrganismos, existem vrios tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigncias nutricionais.
Alm dos nutrientes preciso fornecer condies ambientais favorveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, presso osmtica, humidade, temperatura, atmosfera (aerbia, micro aerbia ou anaerbia), entre outras...

Consistncia dos meios

Slidos, quando contm agentes solidificantes, principalmente gar (cerca de 1 a 2,0 %); Semi-slidos, quando a quantidade de gar ou gelatina de 0,075 a 0,5 %, obtendo assim uma consistncia intermediria, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tenses variadas de oxignio ou a verificao da motilidade; Lquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para activao das culturas, repiques de microrganismos, provas bioqumicas, entre outros.

Procedncia dos constituintes

Podem ser naturais ou complexos:

Ingredientes com composio qumica no definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubrculos, peptona de soja, etc.), de animais (carne, crebro, fgado, casena, etc.) e de microrganismos (levedura); Composio qumica conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e os seus componentes servem para suprir as exigncias nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, azoto, vitaminas, energia, sais minerais, entre outros, quando so conhecidas as necessidades nutricionais especficas. So os que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigncia em especial; Cumprem com as exigncias vitais de determinados microrganismos, como meio de infuso de crebro e corao, gar sumo de tomate, gar sangue, etc.

Artificiais, sintticos ou ainda quimicamente definidos:

Meios de cultura bsicos

Meios de cultura complexos:

Funes dos meios de cultura

Meios de pr-enriquecimento:

Permitem a dessensibilizao de microrganismos injuriados, i.e., para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (trmico ou qumico). Ex. gua peptonada. Proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos nmeros ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios tm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que tambm podem inibir o crescimento de outros. Contm substncias que permitem estabelecer diferenas entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), gar MacConkey para a diferenciao de enterobactrias, gar sangue, agar Baird-Parker para isolamento e diferenciao de cocos Gram positivos (slidos).

Meios de enriquecimento:

Meios Diferenciais:

Funes dos meios de cultura

Seletivos so os que contm substncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. A maioria deles tambm diferencial, permitindo diferenciar as colnias (slidos) dos microrganismos. Meios de triagem so os meios que avaliam determinadas actividades metablicas permitindo caracterizao e identificao perfunctria ou presuntiva de muitos microrganismos. Identificao, prestam-se para a realizao de provas bioqumicas e verificao de funes fisiolgicas de organismos submetidos a identificao. Dosagem, so empregados nas determinaes de vitaminas, antibiticos e aminocidos Contagem, so empregados para a determinao quantitativa da populao microbiana. Estocagem ou manuteno so utilizados para conservao de microrganismos no laboratrio, i.e., garantem a viabilidade de

Meios de proliferao naturais

No nosso dia-a-dia convivemos com bactrias, dormimos com bactrias, comemos bactrias, e no conseguimos viver sem elas. Elas esto por todo o lado e reproduzem-se em todo o lado, apenas querem um local com condies propcias. Por isso, h que ter muito cuidado nas nossas casas, pois apresentam-se como os melhores locais para a proliferao das bactrias, tendo em conta que nelas podem encontrar alimento, calor, humidade.

Nutrio de microrganismos

Nutricionalmente so os mais versteis e diversificados.

Alguns podem viver com poucas substncias inorgnicas, enquanto outros so to exigentes quanto o homem.

Para caracterizar suas propriedades (morfolgicas, fisiolgicas e bioqumicas) necessrio o cultivo em laboratrio: - Cultivo in vitro: quando se conhece as exigncias nutricionais. - Cultivo in vivo: quando exigncias nutricionais especficas so desconhecidas. Ex: Mycobacterium leprae (causador da hansenase) precisa de hospedeiro para ser cultivado.

Meios de cultura adequados

Para o cultivo laboratorial (in vitro) so utilizados meios de cultura que simulam e at melhoram as condies naturais.

Os elementos qumicos principais para o crescimento das

clulas so denominados macronutrientes (C, N, H, O, S,

P).

O carbono um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano.

Com exceo para CO2, os compostos orgnicos so os que contm carbono

Macronutrientes:

- Necessrios em grande quantidade. - Tem papel importante na estrutura e

metabolismo.
Micronutrientes: - Necessrios em quantidades mnimas. - Funes enzimticas e estruturais das

biomolculas
C N H P, S, K, Na ...

clula
Matria seca gua

Componentes necessrios a clula

Fonte de carbono:
- Compostos orgnicos (microrganismos heterotrficos):
carboidratos lipdeos protenas

- Dixido de carbono (microrganismos autotrficos):

a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou compostos inorgnicos.

Fonte de Nitrognio:
- elemento necessrio em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %.
(constituinte das protenas, cidos nuclicos, etc.) molculas orgnicas (aminocidos, peptdeos) molculas inorgnicas (NH3, NO3-, N2) A capacidade de algumas bactrias em utilizar o nitrognio atmosfrico (FBN) de fundamental importncia para a vida de todos os seres.

Hidrognio:
Principal elemento dos compostos orgnicos e de diversos inorgnicos. (gua, sais e
gases)

Funo: Manuteno do pH Formao de ligaes de H entre molculas Fonte de energia nas reaes de oxi-reduo na respirao

Oxignio:
- Elemento comum encontrado nas molculas biolgicas (aminocidos, nucleotdeos,

glicerdeos)
- obtido a partir das protenas e gorduras.
Na forma de oxignio molecular (O2), requerido por muitos para os processos de gerao de energia.

Outros macronutrientes:

P Sntese de cidos nuclicos, ATP S Estabilidade de aminocidos, componente de vitaminas K Atividade de enzimas Mg Estabilidade dos ribossomos Ca Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de

endsporos

Na

Requerido em maior quantidade por microrganismos

Bactrias haloflicas extremas no crescem

marinhos.

com menos de 15% de sal.

Fe Papel-chave na respirao, componente dos citocromos e das

protenas envolvidas no transporte de eltrons.

Outros componentes

Metais em quantidades muito pequenas (traos) necessrios na composio de

um meio de cultura:
Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B

Exercem funo estrutural em vrias enzimas (ativao)

- Nem sempre sua adio necessria - Meios sintticos com compostos de alto grau de pureza e gua ultra pura podem apresentar deficincias desses elementos.

Ex: Mo+6 necessrio para a nitrogenase, a enzima que converte o N2 para NH3 durante a FBN.

gua e aditivos

gua:
Componente absolutamente indispensvel (com exceo dos protozorios que englobam partculas slidas) No laboratrio de utiliza gua destilada, filtrada e deionizada.

Aditivos:
Funo de aumentar a converso, evitar precipitao de ons, controlar a espuma, provocar inibio, estabilizar o pH:

Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitao dos fosfatos metlicos

EDTA, cido ctrico, polifosfatos.

Inibidores
Ex: produo de cido ctrico por Aspergillus niger Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o cido oxlico

Outros aditivos

Tampes
- Carbonato de clcio - Fosfatos - Protenas (peptona)

Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.

Ex: celulose induz a celulase pectina induz a pectinase amido induz a amilase

Antiespumantes: cultivos com aerao ocorre a produo de espuma

Remoo de clulas, perda do produto, contaminao Reduo do volume do meio

lcoois, cidos graxos, silicones, poliglicis: reduzem a tenso superficial das bolhas

Meios de cultura
Solues de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.

No existe um meio de cultura universal, mas Existem vrios tipos meios para diversas finalidades Para obter sucesso no cultivo de microrganismos necessrio o conhecimento de suas exigncias nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e proporo adequada.
Quimicamente definidos (sais, compostos orgnicos purificados, gua)
Classes Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro,
leite, solo e rmem de bovino)

Meios de cultura

Meios quimicamente definidos so utilizados para determinar as necessidades nutricionais

At 1880 os microrganismos eram cultivados em meios lquidos. Robert Koch introduziu os meios de cultura slidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas (culturas puras).

Meio de cultura solidificad o com 1,5 % de gar.

Controle um meio mnimo com apenas glicose e sais. 3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgnicos.

Meios de cultura

Embora no existam meios especficos para todos os microrganismos, existem centenas de formulaes para inmeras finalidades. Alguns so meios gerais: permitem o crescimento de muitas espcies Outros so meios especficos: servem para identificao de espcies, por ex.

Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey

Microplacas com diferentes meios de cultura para identificao de enterobactrias.

Se a bactria prefere os nutrientes encontrados no sangue, ento o sangue adicionado no meio de cultura. As bactrias podem ser autotrficas ou heterotrficas.
Meio definido para quimioautotrficas Meio definido para heterotrficas Meio complexo para heterotrficas

Meios de cultura para fungos

Todos os fungos so heterotrficos
Geralmente so utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgnicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja.

Tambm so utilizadas maiores concentraes de acares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactrias.
Essa combinao permite inibir o crescimento de bactrias.

Como determinar a composio inicial?

Passo 1: utilizar dados da composio elementar
Composio elementar mdia (% do peso seco)

Ex: Para produzir 10 g de clulas bacterianas so necessrios de 1,3 g (13%) de N ou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N) Obs: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem introduzir o excesso de um deles. Com relao ao carbono considerar tambm frao para energia e manuteno (heterotrficos) Frao para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C)

Elemento
Carbono hidrognio Nitrognio Fsforo Enxofre Potssio Sdio Clcio Magnsio Cloro

Bactria
52 7 13 2,5 0,6 2,5 0,75 0,55 0,25 0,5

Fungo
51 7 8,5 0,4-4,5 0,1-0,5 0,2-2,5 0,02-0,5 0,1-1,4 0,1-0,5 -

Frao para energia e manuteno (45%):

YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose

Relao C:N = 28,9/7,2 = 4:1

Ferro
Relao C:N mdia

0,1
4:1 85:23:4:1

0,15
6:1

e assim por diante. Passo 2: otimizao

Relao C:N:P:S

Condies ambientais (fatores

abiticos)

Temperatura Oxignio pH Presso osmtica, atmosfrica, hidrosttica Radiao eletromagntica

Temperatura
Grupos

1. Psicrfilos temperatura tima abaixo de

15 oC, suscetveis de crescer a 0 oC. 2. Mesfilos temperatura tima 20o - 40 oC, maioria dos patgenos humanos. 3. Termfilos temperatura tima acima de 45 oC.

Efeito do oxignio no crescimento microbiano

Durante as reaes de reduo do O2 so formados vrios intermedirios txicos. Ex: H2O2, OH, O2Os microrganismos aerbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas txicas

Meio gelatinoso com indicador redox:

Rosa quando oxidado Incolor quando reduzido

Aerbio Anaerbio Facultativo Microaerfilo Anaerbio aerotolerante

Sistema para cultivo de anaerbios

Sistema para cultivo de aerbios

Equipamentos que transferem oxignio ao meio de cultura

pH

Ao contrrio da temperatura, o pH timo para o crescimento encontrase no valor mdio da variao sobre o qual o crescimento acontecer,

Os microrganismos so encontrados em todos os ambientes e portanto em todas as condies de pH.

Quando cultivados in vitro, o meio sofrer alteraes medida que os metablitos cidos ou alcalinos so produzidos.

Necessrio a adio de um tampo ao meio.

Presso osmtica

No devem existir grandes diferenas na concentrao de solutos dentro e fora da clula, pois podem desidratar-se ou romper-se.

Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais mais elevados.