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Mecanismos de Splicing

Introduo
Objectivo dos Mecanismos de Splicing? O nosso DNA constitudo por 25 000 genes distribudos pelos 23 pares de cromossomas. O DNA transcrito no ncleo dando origem a um pr-mRNA que posteriormente ser processado por vrios mecanismos, um dos quais o Splicing, antes de se tornar num RNA maduro ou funcional. Mas nem todo o DNA codifica protenas, apenas 5% do DNA total codificante, os exes. O restante 95% corresponde a DNA que no codificado que tanto se pode encontrar fora dos genes (sequncias no codificantes), como dentro dos genes (intres). Logo, os mecanismos de Splicing so de extrema importncia porque seleccionam as partes codificantes do gene de forma a facilitar a traduo dos pptidos e protenas nos ribossomas (processo de traduo), pois existem em mdia, nos humanos, 10 vezes mais intres que exes. Qual o papel dos Intres? Os intres so variveis tanto em tamanho como em nmero e so as partes no codificantes que, aps serem retiradas do prRNA, so destrudas dentro do ncleo gerando nucleotdeos livres que so reciclados. Pensa-se que a grande quantidade de intres deve-se acumulao de genes (outrora importantes) ao longo da evoluo, o que no implica forosamente que os seres mais evoludos tenham mais intres que os seres menos complexos. Podem tambm ter funo reguladora ou simplesmente no apresentar qualquer funo. Mas desengane-se quem pensa que no tm utilidade, pois a sua grande diversidade que permite a caracterizao individual ou de determinados grupos. Esta diferena na sequncia intrnica reflecte a diversidade gentica humana, permitindo-nos realizar coisas to extraordinrias como os testes de paternidade ou a identificao de indivduos envolvidos em acidentes e crimes. Qual o papel dos Exes? Os exes constituem o RNA funcional e so sequncias semelhantes entre indivduos, pois codificam as protenas bsicas sobrevivncia humana. Assim, no podem apresentar grande variabilidade, contrariamente aos intres, porque manifestam-se fenotipicamente, o que significa que qualquer alterao pode tornar-se incompatvel com a vida.

Claudia Junqueira, Nuno Couto, Pedro Reis , Pedro Sousa Orientadora: Professora Delminda Neves Disciplina de Biologia Celular e Molecular, 2004/2005 Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Splicing nos Spliceossomas


Onde ocorre? O Splicing do mRNA ocorre no Spliceossoma (fig.2) que composto por protenas e RNAs. Os componentes de RNA so 5 tipos de small nuclear RNAs (snRNAs) ricos em Uracilo chamados U1,U2,U4,U5 e U6. Estes snRNAs tm entre 107 e 210 nucleotdeos e esto associados a protenas para formar small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) que tm papel central no processo de Splicing, ou seja, os snRNPs so snRNAs ligados a cerca de 6 e 10 protenas (algumas comuns a todos, outras especficas de cada um). Os snRNPs U1,U2 e U5 contm uma nica molcula de snRNA, enquanto que o U3 nucleolar e o U4 e o U6 formam um nico complexo de snRNP (podem aparecer por isso com a seguinte notao U4/U6) Como ocorre? O primeiro passo a ligao do snRNP U1 extremidade 5 do splice site do pr-mRNA. A seguir, o snRNP U2 liga-se ao branch point (ponto de reconhecimento). Ambas as ligaes se do por complementaridade de bases, dado que a sequncia de nucleotdeos volta destas regies muito conservada (fig.3). Em seguida, um complexo pr-formado de snRNP U4/U6 + snRNP U5 incorporado no Spliceossoma. O U5 liga-se ao exo na extremidade 5 e o U4 dissocia-se do U6. O U4 sai juntamente com o U1 e o U6 liga-se ao U2 para a primeira reaco de transesterificao que converte o intro numa estrutura em forma de lao (lariat). Entretanto h a clivagem do exo na extremidade 5 e o U5 passa para a extremidade 3. Por fim, ocorre a clivagem do exo na extremidade 3 e a segunda reaco de transesterificao unindo os dois intres. Os snRNPs dissociam-se do intro que vai ser degradado e ficam disponveis para novo processo.
Fig.3 - Sequncias determinadas volta das extremidades 5 e 3 nos pre-mRNA dos vertebrados onde ocorre o Splicing.

Fig.1 - Processo geral do Splicing nos Spliceossomas

Fig.2 - Um Spliceossoma visto ao ME

Auto-Splicing
Apesar da na maioria dos eucariontes o Splicing ocorrer nos Spliceossomas, encontra-se tambm um mecanismo de AutoSplicing que pode ocorrer no ncleo, nas mitocndrias, nos cloroplastos e nas bactrias. Este mecanismo catalisado pelos seus intres que agem como uma ribozima (RNA com funo cataltica) levando sua auto-exciso. Existem dois grupos de Auto-Splicing (fig.4):

Grupo I de Auto-Splicing de Intres


Onde ocorre? Nos genes nucleares de rRNA de protozorios (exemplo: pr-RNAr de Tetrahymena thermophila). Como ocorre? Por duas transesterificaes, sendo a primeira entre o grupo 3-hidrxilo do cofactor Guanosina livre (que no interior cadeia de RNA) e o Fsforo da extremidade do intro; e a segunda entre a extremidade 3 do exo livre e a extremidade 3onde ocorre Splicing para retirar o intro sob forma de molcula de RNA aberta.

Grupo II de Auto-Splicing de Intres


Onde ocorre? Em genes que codificam protenas e alguns genes tRNA da mitocndria e cloroplastos de plantas e fungos. Como ocorre? Tambm por duas transesterificaes, mas que apresentam algumas diferenas. A primeira ocorre entre o grupo 2-hidroxilo de um nucletido de Adenina reactivo (interior cadeia de RNA) e o Fsforo da extremidade do intro; e a segunda anloga do grupo I sendo, no entanto de salientar que neste caso, o intro removido em forma de lao (lariat).
Fig.4 - Os dois diferentes tipos de Auto-Splicing

Splicing Alternativo
Onde ocorre? Este processo frequente em eucariontes complexos, permitindo ampliar a diversidade de protenas. Como ocorre de forma diferente em cada tecido importante na diferenciao tecidular (exemplo: cnase da tirosina). Como Ocorre? A existncia de mltiplos intres e exes num gene abre a possibilidade de combinar os vrios exes em mais do que um mRNA. Isto significa que um pr-mRNA pode originar mltiplos mRNA e consequentemente vrias protenas (fig.5). Para que serve? Mltiplos mecanismos esto envolvidos na regulao do Splicing Alternativo que, por permitir grande variabilidade, contribui para a multiplicidade de protenas expressas durante o desenvolvimento e diferenciao (exemplo: o mesmo mecanismo, no mesmo pr-RNA, pode dar origem tanto a um inibidor como a uma activador do mesmo processo).

Splicing dos tRNA


Onde ocorre? Ocorre no ncleo, em alguns tRNA mas est presente em todos os eucariontes. Pensa-se estar relacionado com mecanismos de regulao, embora esta matria no esteja bem esclarecida. Como ocorre? O mecanismo de Splicing dos pr-tRNA difere em certos aspectos dos outros mecanismos. Durante o processo de Splicing o intro "retirado" da sequncia havendo uma clivagem em ambos os lados do mesmo. Forma-se ento um 2',3'-fosfomonoester cclico na extremidade 3' do exo 5'. Este processo efectuado por enzimas em vez de RNA. Posteriormente, para a reaco de "ligao" dos dois exes, so necessrios dois nucleosdeos trifosfatos: um GTP que contribui com um grupo fosfato para a ligao 3 - 5' no final da molcula de tRNA e um ATP que forma um intermedirio da AMP-ligase activa. No passo final, o 2'-fosfato da extremidade 5 do exo removido.

Fig.5 - Diferentes protenas resultantes do mesmo gene por Splicing alternativo

Auto-Splicing Splicing nos Spliceossomas Grupo I Grupo II Sequncias de intres libertadas sob forma linear Sequncias de intres libertadas em lariat Cofactor nucletido G livre Cofactor nucletido Adenina reactivo Duas transesterificaes sem consumo de energia Precisam de intres para manuteno da sua forma tridimensional que lhe atribui actividade cataltica para a reaco Onde ocorre X X X X X X X

CURIOSIDADES
- Um exemplo especfico de Splicing Alternativo o caso da determinao do sexo na espcie Drosophila,

onde o Splicing do mesmo pr-mRNA determina se a mosca macho ou fmea. - Num caso extremo, um gene de Drosophila pode produzir 38 000 protenas diferentes a partir de um nico gene atravs de Splicing alternativo, apesar de apenas alguma combinaes terem sido observadas experimentalmente. - Nos vertebrados e nos insectos o mRNA forma-se a partir de um nico pr-mRNA, enquanto que em dois tipos de protozorios (tripanossomas e euglenides) a molcula de mRNA construda por Splicing de molculas de RNA separadas: Trans-Splicing. - Splicing normal de DNA ocorre nos linfcitos B e T, apesar de ser muito mais raro.
Referncias: Fig.6 - Processo geral do Splicing dos pre-RNAt

ALBERTS Bruce, JOHNSON Alexander, LEWIS Julian, RAFF Martin, ROBERTS Keith, WALTER Peter, Molecular Biology of the Cell, 4th ed, Garland Publisher, New York, 2002, pp 454-458. LODISH Harvey, BERK Arnold, ZIPURSKY S. Lawrence, MATSUDAIRA Paul, BALTIMORE David, DARNELL James E., Molecular Cell Biology, 4th ed, W. H. Freeman & Co., New York, 2000, pp 527-528. COOPER Geoffrey M., HAUSMAN Robert E., The Cell - A Molecular Approach, 3rd ed., Sinauer Associates, Inc, 2004, pp 139-151, 261-280.

No ncleo, Ncleo, mitocndrias, Spliceossoma cloroplastos e bactrias

DA SILVA AD., GRAMAXO F., SANTOS, M.E., MESQUITA A.F., BALDAIA L., Terra, Universo de Vida, 1 parte Biologia, 11 ano, Porto Editora, Porto, 2001, pp 101-114. BROWN T. A., Genomes, 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd, Oxford, UK, 2002.